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UNIVERSIDAD

MAYOR

DE SAN SIMÓN

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA LIC. EN INGENIERÍA QUÍMICA

PRACTICA Nº2 PRODUCCIÓN DE LEVADURAS

MATERIA: Laboratorio de introducción a la ingeniería bioquímica CARRERA:

Ing. Química

DOCENTE:

Lic. Ruder

UNIVERSITARIOS: Chambi Licona Nelson Freddy Cordova Herbas Pablo

COCHABAMBA – BOLIVIA

I.- MARCO TEÓRICO 1.1 ANTECEDENTES Las levaduras se han utilizado desde la prehistoria en la elaboración del pan y del vino, pero los fundamentos científicos de su cultivo y uso en grandes cantidades fueron descubiertos por el microbiólogo francés Louis Pasteur en el siglo XIX. Hoy se utilizan en distintos tipos de fermentación. Los diferentes usos de las levaduras son: como fuente de vitaminas del complejo B y de tiamina, en algunas fases de la producción de antibióticos y hormonas esteroides, y como alimento para animales y seres humanos. Las cepas puras de levaduras se cultivan en un medio con azúcares, compuestos nitrogenados, sales minerales y agua. El producto final puede aparecer en forma de células secas de levadura o prensado en pastillas con algún material excipiente. Cuando se termina de utilizar un lote de levaduras destinadas a la fabricación del pan, a usos médicos, o para fabricación de alimentos, el medio de cultivo en el que han crecido se desecha. Sin embargo en la elaboración de vinos, cervezas, licores y alcoholes industriales, el medio de cultivo es el producto final, y en este caso son las propias levaduras las que se desechan, o bien se utilizan como pienso o alimento para animales. 1.2 DEFINICION DE LEVADURA Levadura, cualquiera de los diversos hongos microscópicos unicelulares que son importantes por su capacidad para realizar la fermentación de hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias. Las levaduras son abundantes en la naturaleza, y se encuentran en el suelo y sobre las plantas. La mayoría de las levaduras que se cultivan pertenecen al género Saccharomyces, como la levadura de la cerveza, que son cepas de la especie Saccharomyces cerevisiae. I.2.1 MORFOLOGÍA

Suelen ser esféricos, alargados, medida, color, diámetro. Tienen tendencia a depositarse en el fondo del líquido o flotar. Suelen formar cápsula (tinción negativa con tinta china à separación entre la tinta y la célula). La mayoría de las levaduras tienen un ciclo de reproducción asexual por gemación. Algunas tienen una reproducción asexual por fisión binaria. Cuando la célula se separa de la madre, deja una cicatriz. Las gemas se pueden hacer en un determinado polo o a lo largo de toda la superficie. Algunas levaduras tienen gemación unipolar à siempre geman sólo por un polo. Es muy característico de Malassezya pachydermatis que es un agente etiológico de otitis en perros y dermatitis crónica en gato y perro. Tiene como característica que tiene una base muy amplia. Otras levaduras pueden dividirse bipolares o multipolares. Algunas levaduras no separan la célula hija (gema o blastospora o blastoconidio) y forman pseudomicelio. La célula hija va unida y se va alargando. Es importante saber si puede o no formar pseudomicelio para clasificar una levadura. La prueba de filamentación va muy ligada a la identificación de Candida albicans, porque sólo da positiva ella. A partir de una muestra aislada, la levadura se siembra en un tubo con 1 ml de suero bovino. Se incuba a 37ºC durante 3-4 horas y después se hace una preparación microscópica y se mira. Si es positiva, algunas levaduras producen 1 tubo de germinación o sedimentación. Crecen más rápido que los hongos miceliares pero hace falta 48 horas como mínimo. 1.2.2 CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS Son pruebas que tardan 24-48 horas y que muchas son parecidas a las de las bacterias. 

Crecen a 32ºC.



Resistencia a actidiona o ciclohexidina.



Fermentación de carbohidratos.



Pruebas de asimilación de carbohidratos.



Están muy estandarizadas las pruebas de asimilación.



Sólo sirven para identificar algunas levaduras de interés clínico.

1.3 JUSTIFICACION DEL TEMA Durante el aislamiento se diluirá una muestra del fermento en agua salada para asegurar la esterilidad de la muestra, es por esto que se realizara la dilución 8 veces, de esta manera se obtendrá una muestra pura de levadura, la cual posteriormente será sembrada para observar el crecimiento de las colonias, las colonias con mejor crecimiento de levaduras serán aisladas y vistas al microscopio. El medio de cultivo universal para las levaduras es el agar-malta, el mejor lugar para sacar levaduras es de la flora epifitica por este motivo trabajaremos con un fermento para lograr aislar las cepas de levaduras que se encuentren presentes en el fermento. 1.4. OBJETIVOS 1.4.1. OBJETIVO GENERAL 

El aislamiento y purificación de levaduras partiendo de la flora epifítica que se encuentra en el fermento.

1.4.2. OBJETIVO ESPECÍFICO 

Trabajar con precisión y orden en el laboratorio para evitar la contaminación de las cepas.



Lograr Obtener cepas puras de levaduras a partir de La flora epifitica.



Observar las levaduras en el microscopio.

II MARCO PRÁCTICO 2.1. MATERIALES DE LABORATORIO 

1 Vaso de precipitado de 1000 o 600ml



1 Matraz Erlenmayer de 250 o 600ml



Cajas petri



Tubos de ensayo



4 Pipetas de 1 ml



1 Pipeta de 10ml



Porta y cubreobjetos



Gotero



Asa



Algodon

2.2. EQUIPOS DE LABORATORIO 

Autoclave



Microscopio

2.2.3 REACTIVOS 

Agar-agar



Malta

2.2.4 PROCEDIMIENTO

a) Preparación del mosto de malta 200g de malta en 1500ml de agua. Se caliente la muestra en las siguientes condiciones:

Almidón 10min Agua

15min 62ºC

10min 52ºC 42ºC

10min 72ºC

b) Filtración (centrifugación) c) Agregar Agar-agar al mosto Se preparan aproximadamente 30 tubos (5ml/tubo). Pesar Agar-agar 5% en 150ml de mosto. Se calienta en hornilla hasta disolución de Agar y se pasa a cada tubo 5ml. Se tapa con algodones y se lleva a autoclave 15min a 121ºC y 1,2atm. Se deja secar los tubos en posición inclinada para obtener pico de flauta. d) Aislamiento Una ves se han formado en los tubos de ensayo los picos de flauta, se toma aproximadamente 1ml de Agar malta estéril en un tubo de ensayo1 y se le agrega 9ml de agua salada al 5%. Del tubo de ensayo1 se toma un mililitro de muestra y se lleva al tubo de ensayo2 al cual también se le añaden 9ml de agua salada. Este procedimiento se repite hasta obtener un octavo tubo de ensayo con una dilución de 108, será con este último tubo que se trabajara para realizar el sembrado. El sembrado se realizara en cajas petri con Agar-agar el tiempo de espera puede variar de 1 a 5 días. Para el sembrado se toma una muestra con un aza, previamente esterilizada y enfriada, y se la depositara en la caja petri sobre el Agar-agar extendido, todo este procedimiento debe ser realizado frente a un mechero para evitar contaminar la muestra con microbios que se encuentren presentes en el aire. e) Crecimiento de colonias

Después de 5 días se revisara el crecimiento de las colonias, forma, tamaño y color, para proceder al aislamiento de las colonias. Solo se aislaran las colonias que hayan tenido un crecimiento correcto y libre de impurezas. f) Aislamiento de colonias De las cajas petri que hayan tenido un crecimiento correcto de las levaduras, se seleccionaran las colonias mas grandes, marcándolas por debajo de la caja petri con un marcador, de esta forma se evitara también tomar muestras de la misma colonia. Las muestras tomadas serán sembradas en los tubos de ensayo con pico de flauta anteriormente usados, cada toma de muestra y siembra serán marcadas con el mismo nombre tanto en el tubo de ensayo como en la caja petri. Es importante tapar los tubos de ensayo con algodón pues de esta manera se evita que los tubos de ensayo exploten debido a la presión del CO2, y dejar las cajas petri envueltas en papel y en un lugar oscuro para ayudar al crecimiento de las levaduras. Observación microscópica o Seleccionamos alrededor de 15 colonias. o Confirmamos la pureza de las levaduras de las colonias que elegimos: En un portaobjetos tomamos solo la mitad de la colonia (cada colonia mide aproximadamente 3 a 5 mm) con ayuda de un asa la mezclamos con una gota de agua destilada tapamos con un cubreobjetos y observamos en el microscopio. o Elegimos 5 colonias, las más puras (que tienen menos tipos de levaduras máximo 2 a 3 tipos). IV.- CONCLUCIONES



Durante la práctica se realizaron muchos errores, en especial debido a la falta de experiencia, una gran parte de las muestras en las cajas petri no crecieron adecuadamente o fueron contaminadas por la mala manipulación de las mismas mayormente en el proceso de sembrado.



De la misma forma las muestras con pico de flauta no fueron bien manipuladas, no se sostuvo de manera correcta, pues al realizar la toma de muestra en ningún momento se debe soltar el algodón y antes de tapar el tubo de ensayo el algodón debe ser a la flama del mechero para eliminar microbios.



Todo el trabajo de la siembra y la dilución debe ser realizado frente a un mechero para evitar contaminar las muestras con nuestro aliento.



El aza a utilizar para tomar las muestra debe ser esterilizado y cada ves que se lo reutilice debe ser expuesto a la flama del mechero para desinfectarlo, sin olvidar dejarlo enfriar antes de tomar la muestra pues de no hacer lo mataríamos a la levadura.