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Fijador de Nitrógeno Azospirillum sp.

El Salvador

Asociación Azucarera de El Salvador

Fijador de Nitrógeno © Azospirillum sp

Esta edición y publicación se hace gracias al apoyo del proyecto BID FOMIN administrado por la Cámara Agropecuaria y Agroindustrial de El Salvador (CAMAGRO) y la Asociación Azucarera de El Salvador. Autoría de los Contenidos: Esta publicación utiliza extractos del documento “El Género Azospirillum” de Jesús Caballero-Mellado. Gustavo Saura Laria, Ramona Fernández Hernández: Elaboración de Contenido. Juan Carlos Hidalgo: Elaboración de conclusiones y recomendaciones. Edición Formato FIAGRO, Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria Samuel Salazar Genovez Mayuly Ferrufino Juan Carlos Hidalgo Publicación F IA GRO San Salvador, diciembre de 2003 Fundación para la Innovación Tecnológica Agropecuaria Alameda Dr. Manuel Enrique Araujo Edificio Century Plaza, Nivel 4 San Salvador, El Salvador Tel: 267-0069 Fax: 267-0069 [email protected] www.fiagro.org.sv

Fijador de Nitrógeno Azospirillum sp.

Índice

Resumen...1 Antecedentes...2 Características...3 Biología del organismo…3 Mecanismos de estimulación del Crecimiento de las Plantas…3 Distribución…4 Interacción con la Planta…4 Experimentos de Inoculación…5

Aislamiento...6 Aplicación...7 Métodos de Propagación y/o crecimiento de la bacteria…7 Aplicación en Forma Sólida…7 Aplicación en forma seca…8 Aplicación en forma Granulada…8

Experiencia cubana con Azospirillum...9 Factibilidad de la Aplicación en Caña de Azúcar…9 Cultivos de papa, camote y tomate…10 Factibilidad de la Aplicación en Arroz…10

Proceso tecnológico...11 Capacidad Instalada y producción Mundial...12 Aspectos Económicos…12

Conclusiones...13 Recomendaciones…14 Anexos…15 18

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Resumen

Azospirillum sp. es el nombre científico con el que se designa a un grupo de bacterias que tienen la capacidad de promover el crecimiento de los cultivos y cuyas propiedades se han estudiado intensamente en los últimos 20 años. Aunque no se sabe a ciencia cierta como funciona el mecanismo responsable del rápido desarrollo de las plantas, sí se ha comprobado que los cultivos en los que se aplica Azospirillum crecen mejor y de forma más rápida.

Los análisis hechos en los últimos años, indican que el Azospirillum tiene la habilidad de tomar el nitrógeno atmosférico y transformarlo en un nutriente aprovechable por las raíces de la planta. A esto se suma el hecho de que la bacteria causa un ensanchamiento y elongación de las raíces, lo que aumenta significativamente la superficie de absorción de los nutrientes que se encuentran en el suelo. Este tipo de tecnología microbiológica es interesante para la agricultura salvadoreña, ya que su aplicación implicaría una reducción en los costos de fertilizantes químicos y un beneficio directo para el medio ambiente. A esto se agrega el hecho de que El Salvador cuenta con las principales materias primas para la producción industrial del Azospirillum y con productores interesados en hacer uso de esta tecnología para la obtención de cultivos libres de químicos.

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Antecedentes

La Spirillum lipoferum, ahora llamada Azospirillum, fue descrita por primera vez en 1925 por Martinus Willem Beijerinck, luego de lo cual la bacteria permaneció en el olvido por varias décadas. Las observaciones de Juan José Peña-Cabriales y Johanna Döbereiner, en 1973, inician la época moderna de este microorganismo. Actualmente, se reconocen seis especies en el género Azospirillum1. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo estas las más ampliamente estudiadas. Posteriormente, fueron descritas las especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largimobile.

Pocos años después del redescubrimiento del Azospirillum y hasta 1993, este género fue el más estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. Esto se debió a la capacidad del Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y aumentar el rendimiento de los cereales, lo cual promovió numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria. En la actualidad, los beneficios de su uso se han documentado ampliamente en Cuba, donde se han obtenido buenos resultados con Azotobacter en caña de azúcar, (Pérez y Roldos, 1994) en arroz (Socorro y Quesada, 1994) y con Azospirillum en caña de azúcar (Roldos, Casas y Delgado, 1994) en maíz (Mascar y Carcaño, 1994) y en tomate (Medina, 1994). Su uso comercial comienza a extenderse en diferentes países, entre ellos, México. Los experimentos de inoculación en campo con Azospirillum han demostrado que estas bacterias son capaces de promover el rendimiento de las cosechas en diferentes suelos y regiones climáticas. Varias cepas de Azospirillum brasiliense y Azospirillum lipoferum se han utilizado para inocular cultivos de diferentes especies de plantas. Los datos indican que del 60 al 70 % de los experimentos son exitosos y se obtienen incrementos de rendimiento estadísticamente significativos en el orden del 5 a 30 %. Se reporta una gran cantidad de microorganismos cuya aplicación al suelo es beneficiosa, como fijadora de nitrógeno (Rhizobium, Azospirllum, Franlda), promotora del crecimiento de las plantas (Pseudomonas, Azospirillum Azotobaaer), para el incremento de la asimilación de fósforo en el suelo por las plantas (Badllus Polymyxa, Pseudomonas fluorescens). Sin embargo, solamente los formulados de rhizobium para la fertilización (fijación de nitrógeno) en leguminosas como la soya han alcanzado un amplio desarrollo en cuanto a niveles de producción, comercialización y aplicación.

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El Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias. Las características útiles en su identificación rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral. Las células contienen cantidades elevadas de poli-ß-hidroxibutirato (PHB). Diversas pruebas bioquímicas y fisiológicas son utilizadas rutinariamente para el reconocimiento de las especies de Azospirillum. La diferenciación de especies del género Azospirillum se logra evaluando la capacidad de usar diversos aminoácidos y su efecto sobre la fijación de nitrógeno (N), recomendándose el uso de la histidina para la caracterización y aislamiento selectivo de la especie A. lipoferum.

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Características

Se considera que uno de los principales mecanismos de acción del Azospirillum radica en su capacidad de producir sustancias promotoras durante la colonización de las raíces. Esto estimula la longitud, la densidad de las raíces laterales y el incremento del área superficial de las raíces. Estos y otros cambios fisiológicos favorecen la mayor absorción de agua y nutrientes minerales que ayudan al rápido crecimiento de las plantas.

También, se plantea como factor decisivo la fijación no simbiótica de nitrógeno por parte de esta bacteria. Para lograr estos efectos positivos, el microorganismo debe infestar las raíces. Esto se consigue cuando se garantiza un elevado número de bacterias por gramo del formulado a aplicar y una alta viabilidad del microorganismo en el suelo que le permita sobrevivir aún en condiciones adversas y colonizar las raíces. Biología del organismo Forma de reproducción: División celular Patogenicidad, toxicidad y alergenicidad y clasificación en grupos de riesgos: No procede. Mecanismos que utiliza el organismo para sobrevivir, multiplicarse, difundirse y competir en el medio ambiente. Azospirillum produce y acumula gránulos de poli-beta-hidroxibutirato los cuales son empleados por la propia célula como fuentes de carbono y energía durante períodos de inanición e incluso son capaces de formar quistes en condiciones muy desfavorables. Predadores y competidores:El crecimiento de este microorganismo en la rizosfera viene determinado fundamentalmente por la disponibilidad de sustratos que esten presentes en el medio rizosférico y que sean necesarios para su desarrollo. También diversas sustancias de origen vegetal y microbiano que esten presentes en la rizosfera pueden afectar el desarrollo de estas bacterias mediante efectos estimuladores e inhibidores. Se considera que los aminoácidos derivados de las plantas pueden estimular o reprimir la actividad de la enzima nitrogenasa en ciertas cepas de Azospirillum . De igual forma las condiciones ambientales ( clima, tipo de suelo, temperatura y humedad del mismo) influyen en los procesos interactivos que determinan la estructura de la comunidad microbiana así como también en la asociación Azospirillum-planta , la fijación del nitrógeno y su contribucióna la nutrición vegetal. Resistencia a la desinfección en el caso de los microorganismo:Practicamente nula. Capacidad de transferencia de material genético a otros organismos. Especificar los parentales que existan en el medio ambiente y posibilidad de cruzamiento:No se han realizado estudios. Capacidad de mutación y adaptabilidad a condiciones medio ambientales: Adecuada adaptabilidad al medio ambiente. Ciclo productivo: 24 horas Mecanismos de estimulación del crecimiento de las plantas La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas se ha demostrado en decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero. En numerosos estudios de inoculación con Azospirillum, además del mejor crecimiento de las plantas, fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno total de las plantas inoculadas. No obstante, en la mayoría de estos estudios, no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de nitrógeno o en el contenido de proteína entre plantas inoculadas y no inoculadas. Esto contribuyó a desechar la idea de que la fijación biológica de nitrógeno era el mecanismo 3

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responsable de los efectos benéficos observados. Debido a que los efectos de la inoculación con Azospirillum sobre el crecimiento de la raíz y la parte aérea de las plantas son similares a los que se presentan cuando las plantas son tratadas con fitohormonas, se sugirió que estas sustancias podrían ser responsables del mejor crecimiento de las plantas, así como de los incrementos observados en el contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos. Recientemente, ha sido revisada la función de las fitohormonas en las asociaciones plantamicroorganismo. Azospirillum tiene la capacidad de producir auxinas2, citocininas y giberelinas en medios de cultivo. No obstante, el mecanismo analizado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas, que puede modificar el contenido de fitohormonas3 de las plantas conduciendo a la estimulación del crecimiento de las mismas. En cultivos de Azospirillum, se han encontrado otros elementos promotores del crecimiento y maduración de las plantas. Distribución El Azospirillum muestra una amplia distribución geográfica. Aún cuando son más abundantes en las regiones tropicales, también se les encuentra en las regiones templadas, frías y desérticas. El pH del suelo juega un papel importante en la presencia de las especies del género Azospirillum. Las especies de A. brasilense y A. lipoferum se encuentran en mayor abundancia en suelos con valores de pH cercanos a la neutralidad. También se hallan esporádicamente en suelos con un pH abajo de 5, pero cuando el pH es menor a 4.5 no se logra su aislamiento. Un estudio en el que se evaluaron 23 tipos de suelos con características diferentes mostró que el porcentaje de arcilla, contenido de materia orgánica, capacidad de retención de agua y contenido de nitrógeno afectan positivamente la sobrevivencia de A. brasilense, en tanto que el tamaño de las partículas de arena y especialmente la alta concentración de carbonato de calcio afectan negativamente la sobrevivencia de esta especie en ausencia de plantas. No obstante, la sobrevivencia de A. brasilense en la rizosfera es independiente de la aridez del suelo. Interacción con la planta Una vez que las células de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente rizosférico y han logrado llegar a la superficie de las raíces se inicia el establecimiento de la asociación. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad de adherirse a las raíces de plantas gramíneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens, trigo, maíz, así como a las raíces de plantas de otras familias que incluyen al algodón y tomate, e incluso a superficies inertes como poliestireno y arena. La capacidad de Azospirillum para adherirse a las raíces, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad rizosférica como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso que E. coli. La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes. La primera consiste en una absorción rápida, débil y reversible, la cual es dependiente de las proteínas de la superficie bacteriana del tipo, de las adhesinas en conjunto con la participación del flagelo polar.

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El nombre auxina significa en griego "crecer" y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la elongación. La Auxina es miembro de un grupo de hormonas vegetales; son sustancias naturales que regulan muchos aspectos del desarrollo vegetal. 3

Las fitohormonas son potenciadoras de la germinación y estimuladoras del crecimiento.

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La segunda fase consiste en un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su máximo nivel 16 horas después de la inoculación, el cual parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de Azospirillum. Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una proteína de la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las raíces de las plantas. En diversos casos, se ha reportado la aparición de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las raíces de diversas plantas, describiéndose como esencial para el anclaje a las partículas de arena. La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonización son las áreas de elongación celular y las bases de los pelos radicales. Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. En plantas de trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo estos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mínimos. Además, fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz, en tanto que la inoculación de 108 a 109 células causa la inhibición del desarrollo. Aparentemente, el incremento del tamaño del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la división celular y al intenso crecimiento de la zona de elongación de las raíces. Es de interés señalar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz. La capacidad de Azospirillum para colonizar las raíces de las plantas es variable dependiendo de la cepa. See ha demostrado, por ejemplo, que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo la tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente rizosférico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raíz de plántulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas densidades en los espacios intercelulares de la raíz, así como en el interior de los pelos radicales. Experimentos de inoculación Con la inoculación de Azospirillum, se observó frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical el cual se traduce en mayor superficie de absorción de nutrientes, así como en mayor desarrollo de la parte aérea de las plantas. También fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas. Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos países para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos. Una amplia revisión sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre los años 1974-1994 fue realizada por Okon y Labandera. Esta evaluación reveló que el éxito de la inoculación fue en el rango del 60 al 70% de los experimentos realizados en suelos y regiones climáticas diferentes, con incrementos significativos, generalmente en el rango de 5 a 30%, en el rendimiento de los cultivos. Sin embargo, cuando se evaluó el efecto de la inoculación en conjunto con la aplicación de niveles intermedios de fertilización con nitrógeno, fósforo y potasio, el éxito de los experimentos se incrementa hasta 90%. Frecuentemente, se observó que la inoculación de los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los fertilizantes sin que exista disminución en el rendimiento de la cosecha. Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de crecimiento subóptimas.

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Aislamiento

El aislamiento de las bacterias Azospirillum es, por lo general, bastante simple. El procedimiento puede hacerse ya sea a partir de suelo rizosférico4 o de la superficie de las raíces (rizoplano) de numerosas plantas hospederas. También se le aisla del interior de las raíces o tallos de algunas plantas.

El medio de cultivo usado por excelencia para el enriquecimiento del Azospirillum ha sido el NFb5 semigelificado "libre" de nitrógeno y con malato6 como fuente de carbono. No obstante, en este medio de cultivo son aisladas predominantemente cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense. El medio NFb con algunas modificaciones en su composición y pH permiten el aislamiento predominante de otras especies de Azospirillum. Estos medios son usados frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno7, como indicativo de la fijación de nitrógeno. El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio. Se usa comúnmente un medio adicionado del colorante rojo Congo8, en el cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que permite la diferenciación de otros géneros bacterianos. Además de los medios y métodos descritos, también existen reportados algunos medios de cultivo y métodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en asociación con plantas, así como para su conservación.

4 Parte del suelo que se encuentra alrededor de las raíces de la planta a no más de 15 o 20 cms de profundidad. 5 Medio de cultivo sin nitrógeno. Se llama nfb por su significado en inglés: nitrogen fixation biological. 6

Llamado también Ácido Málico. Es un compuesto orgánico que se encuentra en algunos frutos ácidos.

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Gas ligero que impide la fijación de nitrógeno atmosférico en las plantas y que en su estado puro es incoloro e inodoro (C2 H 2). 8 El Rojo Congo es un colorante aniónico o ácido que tiene afinidad por la celulosa.

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Aplicación

La forma más simple de emplear la bacteria es, tal cual sale del fermentador, pero implica un gran obstáculo que es la remoción de grandes volúmenes de líquido con peligro de contaminación en el transporte y almacenamiento. Por otro lado y lo más importante, es que el microorganismo llega al suelo desprovisto de protección, expuesto a los rigores del medio: calor, humedad, microflora, entre otros lo que disminuye considerablemente sus posibilidades de supervivencia. La aplicación del inoculante en forma líquida puede ser, sin embargo, deseable cuando no es posible tratar la semilla botánica y es necesario aplicar el biofertilizante directamente al suelo. Métodos de propagación y/o crecimiento de la bacteria La mayoría de las bacterias producidas en la industria agroalimentaria y en la farmacéutica se obtienen por fermentación sumergida en biorreactores de diversas escalas con la aereaciónagitación adecuada a los requerimientos del microorganismo cultivado y con los accesorios y la automatización necesaria que garanticen las condiciones de fermentación (pH, temperatura, etc.). Debido a sus requerimientos nutricionales las bacterias del género Azospirillum pueden producirse económicamente por el método de fermentación en templas o discontinuo (batch). Para la producción por el método de fermentación batch que es el más convencional, el primer paso es la optimización del medio y condiciones de cultivo. Esto es también extensivo a la fermentación incrementada (fed-batch) y continua. Sorpresivamente, pocos estudios se han dedicado a la fisiología de Azospirillum propagado en fermentadores para la producción de biomasa. Para la producción de biomasa, el crecimiento no debe estar limitado por nitrógeno, lo que implica una adición de sales de nitrógeno al medio de cultivo. También se requiere un control estricto de la esterilidad puesto que el pH y la temperatura óptimos de Azospirillum permiten el desarrollo de todo tipo de contaminantes potenciales. Los parámetros claves que deben controlarse son: La composición del medio de cultivo La temperatura El suministro de oxígeno El contenido intracelular de polibetahidroxibutirato (PBH) (material de reserva) El estado fisiológico de la bacteria al detener la fermentación El desarrollo de estrategias de fermentación optimizadas conllevará a un mejoramiento de la producción de biomasa. El método de fermentación incrementado (fed-batch) en el que los nutrientes se añaden en el medio durante el transcurso de la fermentación pueden ayudar a alcanzar el estado fisiológico deseado en el medio, incrementándose también la productividad de biomasa. Aplicación en forma Sólida El soporte sólido mayoritariamente empleado es la turba, aunque se ha ensayado e investigado la aplicación de otros como carbón mineral, suelo mineral, cachaza, arcillas, Bentonita, vermiculita, soportes sintéticos, lignito, Bagazo, compost de suelos, zeolita, cáscaras de maní, tuzas de maíz, aserrín, cáscaras de arroz y cáscara de café entre otros. La turba se ha impuesto gracias a sus favorables características tales como alta capacidad de absorción y retención de agua, contenido natural de nutrientes, no formación de grumos, facilidad de molida y la naturaleza biodegradable, no tóxica ni contaminante de este material. La búsqueda de otros materiales como soportes está dada por no contar con yacimientos de turba o no disponer de esta con la calidad requerida. 7

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Aplicación en forma seca Los formulados secos se preparan mediante la deshidratación de las bacterias. Esto suprime su actividad metabólica, lo que mejora su resistencia al estrés externo y disminuye su sensibilidad a la contaminación. Estos inoculantes pueden ser preparados a partir de un liofilizado de bacterias, por separación de los microorganismos del medio de cultivo y posterior secado del inoculante, encapsulamiento de las bacterias en alginato y posterior deshidratación. Muchos de estos formulados se presentan en forma de polvos humedecibles, que luego de ser suspendidos en agua se pueden emplear en el tratamiento de semillas o ser asperjadas en el campo. Para su preparación se emplean además otros ingredientes como dispersantes, adhesivos, protectores celulares e inertes. Aplicación en forma Granulada Se preparan también inoculantes granulados para su uso directo en el campo. Formulados granulados de se preparan a partir de turba con tamaño de partícula entre 40 y 60 mesh. Las dosis de este tipo de inoculante, en dependencia del cultivo y tipo de suelo, pueden estar entre 5 y 60 kg ha-1. El Instituto Cubano de Investigación de Derivados de la Caña de Azúcar (ICIDCA) ha desarrollado una tecnología que permite la obtención de dos formas terminadas: Polvo húmedo para impregnación de semillas: Este producto se emplea para cultivos que se siembran con semillas botánicas tales como arroz, maíz, sorgo, etc. La semilla se recubre con una capa de inoculante que debe contener entre 103 Y 107 ufc/semilla en dependencia del tamaño de la semilla. En este caso, la dosis de inoculante adecuada es de alrededor de 0.5 kg ha-1. Polvo humedecible para la aspersión al suelo: Se puede emplear para cualquier tipo de cultivo, aunque preferiblemente para aquellos en los que no se puede emplear la impregnación, como es el caso de la caña de azúcar y plantas de semillas muy pequeñas, que tienden a aglomerarse. La dosis depende del tipo de cultivo y puede fluctuar entre 107 Y 1015 ufc/ha-1 para aplicación en surcos y entre 104 y 109 ufc/ha-1 de suelo para semilleros.

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Experiencia con Azospirillum

El Instituto Nacional de la Caña de Azúcar de Cuba (INICA)9 reporta ensayos de campo con Azospirillum en caña de azúcar. En estos experimentos, se empleó el inóculo líquido, sin formular, con concentraciones de bacterias activas en el orden de 1.2-3.5 X 109 ufc ml-1. Se encontró que, para caña de retoño, las dosis más eficaces están entre 75 y 100 l/ha-1. En algunos casos, los rendimientos fueron similares a los obtenidos con las dosis de fertilización mineral recomendadas. No se han ensayado formulados sólidos en caña de azúcar por lo que se ha recomendado su estudio, ya que esto posiblemente disminuya la dosis de inóculo y mejore la efectividad del biofertilizante. Otras experiencias con Azospirillum se han realizado en el cultivo del tomate donde se obtuvieron rendimientos similares a los que se alcanzan con aplicaciones de dosis completas de fertilizantes minerales. En la biofertilizadón de Guinea (Panicum máximum) se observó un incremento del rendimiento al inocular con Azospirillum. Adicionalmente, el ICIDCA ha desarrollado una tecnología de producción del biofertilizante la cual brinda la posibilidad de cuatro formas terminadas del mismo en dependencia de las demandas del cultivo: Inoculante líquido ( 60-90 días de vida a 10 °C) Formulación líquida concentrada (90-180 días de vida útil a 10°C) Formulación sólida para impregnación de semilla (60-90 días de vida útil a temperatura de 25 ºC ) Formulación sólida para preparación asperjable (60-90 días de vida (mI a temperatura de 25°C) Características de los productos diseñados por el ICIDCA: Polvo húmedo para la impregnación de semillas Soporte: Turba o Cachaza Viabilidad: > 109 ufc g-1 Humedad: 60 ± 2 % Granulometría: < 140 mesh (0.07 mm) Polvo humedecible para aspersión Soporte: Turba o Cachaza Viabilidad : > 109 ufc g-1 Humedad: 60 ± 2 % Granulometría: < 200 mesh (0.074 mm) Factibilidad de la Aplicación en Caña de Azúcar El inoculante Azospirillum como licor del fermentador (sin formular) ha sido aplicado al cultivo de la caña de azúcar en experiencias realizadas por el INICA. Se reportan resultados satisfactorios con el empleo de 75-100 l/ha-1 de licor (109 ufc m-1) y sustitución del 70 % o más del fertilizante químico. Los rendimientos, en este caso, han sido similares a cuando se aplica la dosis completa de Nitrógeno. Dado que la caña de azúcar no se siembra con semilla botánica es imposible la impregnación de semillas y debe por tanto aplicarse el inoculante directamente al suelo como spray o granulado.

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Ver otro resultados de experimentos en Anexos, p. 17.

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El costo de la fertilización con NH3 anhidro de una hectárea es de 23 USD (100 kg ha-1), luego para obtener efecto económico positivo, el costo del inoculante Azospirillum más el del 30 % de la dosis de NH3 debe ser inferior a ese valor. Cultivos de Papa, Camote y Tomate Dosis del inoculante entre 40 y 80 L.ha -1 compensan la reducción del 25 % de la fertilización nitrogenada, así como estimulan los rendimientos cuando es aplicado con la fertilización completa. Factibilidad de la Aplicación en Arroz Tabla 2. Costos de inversión y producción Azospirillum (Estimados) Costo de Inversión Proceso

Variante

Polvo húmedo. Impregnación de semillas Polvo húmedo .Impregnación de semillas Polvo humedecible. Aspersión del suelo Polvo humedecible Aspersión al suelo Licor del fermentador

de

Inoculante

de

Costo de Producción

USD

USD kg

-1

Turba

Cachaza

Turba

Cachaza

I

69,523

84,514

0.36

0.34

II

57,890

69,855

0.27

0.25

I

69,523

84,514

0.'12

0.40

II

57,980

69,855

0.33

0.31

-

que corresponde a 1 ha de siembra.

0.12

El licor de Azospirillum ha sido probado con resultados satisfactorios en la sustitución de parte del fertilizante químico. Los mejores resultados se obtienen con aplicación de 13 l ha-1 del licor de Azospirillum y 70 % de la dosis de urea. El arroz es ideal para el empleo de polvo húmedo para la impregnación de semillas. La dosis que se reporta para cereales es 500 g para el tratamiento de semillas

Las dosis tan bajas de inoculante que se requieren en la impregnación de semillas implica una gran ventaja económica para la fertilización de cultivos que admiten este método de inoculación

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Proceso Tecnológico

La experiencia indica que en un producto comercial es aconsejable proteger los microorganismos en un medio que les permita sobrevivir largo tiempo antes de ser introducidos en el suelo y que, una vez allí, les asegure una supervivencia que les garantice una rápida penetración y reproducción en las raíces para cumplir su cometido. Los productos se pueden obtener en dos variantes tecnológicas: I. Polvo húmedo para impregnación de semillas II. Polvo humedecible para aspersión en suelo La Variante I10 se caracteriza por el preempaquetamiento del soporte y la inoculación y homogenización manual. Mientras que en la variante II estas dos últimas operaciones se realizan de manera mecánica. Existen instalaciones para la producción de inoculantes comerciales para la variante I. La Variante II11 requiere un alto grado de hermeticidad del equipamiento para evitar la contaminación y es interesante ya que no requiere de tanta fuerza de trabajo.

Servicios

Nutrientes

FERMENTADOR

Miel Final de Caña. Hidrolizado de Levadura. MgSO4. Na2HPO4. (NH4)2HPO4

Agua. Vapor. Electricidad

Caldo Fermentado Rico en Bacterias

10 Detalle de la Operación tecnológica y Equipamiento para una Planta de 500 t según la Variante I en Anexos, p. 16. 11 Detalle de la Operación tecnológica y Equipamiento para una Planta de 500 t según la Variante II en Anexos, p. 17.

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Capacidad Instalada y Producción Mundial

El mercado mundial de inoculantes de Azospirillum, a pesar de que se reporta sobre algunos comerciales como Azospirillum en soporte de vermiculita, que se vende in Italia y Azospirillum lipoferum CTRL microgranulado, registrado en Francia con el nombre Azogreen, Graminosol de la firma Argentina Nltrasoil S.A y algunos otros, se caracteriza por ser aún incipiente, dependiendo su desarrollo comercial significativo de tres factores principales interrelacionados entre sí. El progreso que se espera alcanzar en el conocimiento básico de su asociación con la planta. Una tecnología optimizada de formulación y aplicaci6n Una evolución en la actitud de las industrias agroqufmicas y de semilla hacia los inoculantes microbianos. Recientemente, se han alcanzado avances significativos en cada uno de estos tres dominios y el futuro cercano dirá si existe un nicho de mercado rentable para los inoculantes de Azospirillum. Las tecnologías de formulación y aplicaci6n condicionan varios parámetros de primera importancia para el aseguramiento de una exitosa vida comercial de estos productos. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que una cepa eficiente, una formulación optimizada, un proceso de producción económicamente viable y un sistema práctico de inoculación en el campo no son suficientes para lanzar el producto al mercado, ya que existen otros requerimientos que deben satisfacerse antes de la comercialización tales como: la eficiencia y confiabilidad del producto debe demostrarse estadísticamente en pruebas de campo a gran escala. Los costos de registro y sus demoras deben considerarse, pues este proceso puede variar considerablemente de un país a otro. aún dentro de una misma entidad económica tal como la Comunidad Económica Europea (CEE) por ejemplo, Italia, Alemania y Francia tienen procedimientos totalmente diferentes. las autoridades francesas exigen programas estrictos de pruebas toxicológicas y en campo. El ejemplo francés es bien visto pues muchos países están en el proceso de implementaci6n de reglas de registro y está previsto que en los próximos años la característica más común será la reglamentaci6n estricta. Esto quiere decir que los productos microbianos tendrán que demostrar ambas cualidades, su eficiencia y su inocuidad. Aspectos Económicos Los mayores valores de inversión para la cachaza se deben a que dada la menor densidad de este material deben emplearse equipos de mayor volumen. Los costos de producción de la cachaza son ligeramente menores dado su costo como materia prima con relación a la turba. La efectividad del inoculante se determina al comparar el costo de su aplicación en una hectárea con el de un fertilizante químico tradicional al que sustituye totalmente o en parte. La dosis de inoculante depende del tipo de aplicación y tipo de cultivo, por lo que generalmente debe determinarse experimentalmente. La dosis está ligada estrechamente también al título del inoculante en el momento de la aplicación.

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Conclusiones Por sus propiedades, el Azospirillum se presenta como una opción interesante como biofertilizante en una gran diversidad de cultivos al servir como medio de fijación de nitrógeno atmosférico y El Salvador podría tomar ventaja de ello en las siguientes formas: A nivel mundial, se cuenta con la tecnología apropiada para producir industrialmente este microorganismo y esta podría adaptarse a las condiciones del El Salvador, considerando la disponibilidad de materias primas existentes en el país. Es interesante mencionar el potencial que posee este microorganismo para disminuir la cantidad de fertilizantes utilizadas en los cultivos convencionales, además de ser una fuente de nitrógeno adaptable a los cultivos que quieren certificarse como libres de químicos. Los biofertilizantes son una opción que además es beneficiosa para el medio ambiente. A esto se suma el hecho de que los productos orgánicos tienen un valor agregado que un mercado cada vez más grande está dispuesto a adquirir.

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Recomendaciones Entre las alternativas más interesantes para ser utilizado como biofertilizante se encuentra el cultivo de caña y los cultivos orgánicos, sin embargo habrá que realizar pruebas de campo para asegurar la correcta utilización de este microorganismo. Esto se debe a que el comportamiento del Azospirillum depende en gran medida del suelo en el que se inocule. Habrá que valorar también cuáles serían los efectos en el rendimiento de la caña y los costos de una producción industrial de Azospirillum. Con ello, se aseguraría que la producción es posible y rentable. Se hace necesaria además una campaña de información en la cual se informe a los cultivadores de la caña de qué es el Azospirillum, sus usos y beneficios, con el objetivo de que acepten el producto. Esto, por supuesto, después de realizar las pruebas de campo necesarias que ratifiquen los beneficios otorgados al microorganismo. Sin embargo, es necesario aclarar que la bacterización12 ha presentado resultados extremadamente variables lo que constituye el más grande obstáculo en el desarrollo de una tecnología efectiva y confiable. El principal problema es que el suelo es un medio altamente heterogéneo e impredecible para los microorganismos introducidos.

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Proceso mediante el cual las bacterias se introducen en el suelo e invaden la raíz de la planta.

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Anexos Resultados de Experiencias en Caña de Azúcar El inoculante Azospirillum como licor del fermentador ha sido aplicado al cultivo de la caña de azúcar en experiencias realizadas por el INICA. Se reportan resultados satisfactorios con el empleo de 75-100 L/ha de licor (109 UFC mL-1) y sustitución del 70% o más del fertilizante químico. En la variedad de planta C 266-70, ( provincia Pinar del Río ), los resultados indicaron un efecto positivo cuando se aplica este biopreparado ( 100 L ha-1), los incrementos productivos con esta dosis variaron entre 26.2 y 29.7 % con respecto al testigo sin nitrógeno, sustituyendo todo el nitrógeno que se porta con fuente mineral. En la variedad C 87-51 tercer y cuarto retoño, (provincia Matanzas), la planta respondió positivamente ante la aplicación de los 100L ha-1 y se repitió la sustitución de todo el nitrógeno aplicado en forma general. En la variedad Jaronú 60-5, (provincia Villa Clara), los mejores resultados se obtuvieron cuando se emplearon dosis entre 50-100 L ha-1 que representa aproximadamente el 90% del valor que se obtuvo cuando se aplicó 100 Kg de nitrógeno en forma mineral. En la variedad Jaronú 60-5, C 120-78 (Cienfuegos), los mejores resultados se obtuvieron cuando se aplicaron las dosis de 75 L ha-1 aplicados en retoño, capaz de sustituir 80 Kg de nitrógeno mineral por hectárea. En las variedades Ja 60-5 , C 266-70, C 120- 78, Bj 59-24 (Santi Spiritus), se aplican dosis de 100 L/ ha y los rendimientos se incrementan entre 22- 50 % con relación al testigo . Se sustituye entre el 89 y 100 % de todo el fertilizante mineral aplicado En la variedad Jaronú 60-5 (Ciego de Avila), las dosis de 75 y 100 L ha-1 incrementaron los rendimientos a 20 y 38 % respectivamente con relación al testigo absoluto. En las variedades 266-70 , Jaronú 60-5 , C 87-51, C 266-70 y C 120- 78 (Camagüey), se aplicaron dosis entre 50 y 150 L ha-1 , resultando la mas adecuada 100 L ha-1 para incrementar los rendimientos hasta el nivel de la fertilización mineral ( 33 % como promedio). En la variedad C 568-75, (Granma), las dosis de 100 L ha-1 del inoculante produjo incrementos productivos al mismo nivel que la fuente mineral. En la variedad Jaronú 60-5 (Holguín ), se obtuvieron los mejores resultados para la dosis de 120 L ha-1, produciendo un incremento en la producción de los tallos. En las variedades 687-51, C120-78, Jaronú 60-5 (Santiago de Cuba), se obtuvieron incrementos en los rendimientos agrícolas ( entre un 25 y 32 % con respecto al testigo) empleando dosis de 100 L ha-1.

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Operaciones Tecnológicas y Equipamiento para una Planta de 500 t a-1 de Inoculante Variante I Secado: En instalación de secado a la intemperie Humedad de entrada Turba: 65 % Cachaza: 75 % Humedad de salida Turba: 17 % Cachaza: 12 % Si se emplea otro tipo de secado, la temperatura no puede sobrepasar los 70º C. Molida y Clasificación: Un sistema que permite moler los materiales (turba o cachaza) y clasificarlos hasta los tamaños de partículas deseadas. Capacidad: 40 kg h-1 (turba 17 % o cachaza 12 %) Granulometría Entrada: < 20 mm Salida < 140 mesh (O. 105mm) < 200 mesh (0.0074 mm) Empaquetamiento: Unidad envasadora en bolsas de polipropileno de 0.5 kg de turba o cachaza. Capacidad: 3,334 bolsas de 0.5 kg d-1 Esterilización: Mediante tratamiento con vapor a las bolsas que contienen los soportes. Capacidad: Para esterilizar 3,334 bolsas de 0.5 kg de turba o cachaza en un día Equipamiento: Autoclave provisto con sistema para introducir y sacar las bolsas. Temperatura: 121 ºC (1 kg cm-2 de presión de vapor) Tiempo de esterilización: 90 min. Sistema de inoculación de bolsas: Para inocular el licor del fermentador a razón de 260 ml por bolsa y 3,334 bolsas en el día.

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Variante II Secado: Idem Variante I Molida Y dasificación : Idem variante I Esterilización, enfriamiento e inoculación: Estas tres operaciones se realizan en un aparato provisto de un mecanismo revolvedor y de extracción del material. Capacidad :