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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS

Género: Azospirillum I.

INTRODUCCIÓN: El suelo es una fuente rica de minerales y nutrientes que la planta necesita para poder subsistir, desde hace miles de años los microorganismos presentes en el suelo empezaron a generar nutrientes y enzimas que favorecían al crecimiento de las plantas, estos microorganismos benéficos formaron simbiosis con las plantas o las plantas se adaptaron a ellos. Además cumplen un rol fundamental en el mantenimiento del ecosistema. Los microorganismos presentes en el suelo ejercen una acción específica cuando se relacionan con una especie vegetal. El estudio de la relación microorganismo-planta es muy importante ya que permite establecer una relación entre el tipo de suelo, la variedad de planta y la micro-biota asociada. Estas interacciones naturales dependen en gran parte del correcto mantenimiento de los ciclos biológicos que se realicen a este nivel (sistema radicular). El suelo es un substrato imprescindible de la vida en el medio terrestre, pues en el se encuentran los macronutrientes como el nitrógeno, carbono, hidrogeno y oxigeno, los cuales son los componentes principales de proteínas, coenzimas, nucleótidos y clorofila. Estos macronutrientes y las fitohormonas reguladoras del crecimiento desempeñan un rol importante en el desarrollo vegetativo y rendimientos de cultivos. Hoy en día se ve la necesidad de fertilizar los suelos por el desgaste que han ido sufriendo durante todos los años que la agricultura mal organizada y mal practicada ha sido empleada por las personas, en la obtención de alimentos. Frente a esta necesidad de suelos infértiles con bajo índice de nitrógeno, se emplea fertilizantes químicos, sin embargo estos no son muy aprovechados por la planta o cultivos, y aproximadamente un 67% se pierde, quedando un exceso de compuestos nitrogenados en el ecosistema que representan la mayor fuente de cintaminacion e la atmosfera (oxido de nitrógeno) y en las aguas superficiales y profundas (nitratos) (Collados, 2006).

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS Como una alternativa al uso de fertilizantes químicos y reguladores sintéticos del crecimiento vegetal, se emplean microorganismos presentes en el suelo como Azospirillum spp., que incrementa la fertilidad natural de suelo y benefician el desarrollo vegetal a través de diferentes mecanismos como la fijación no simbiótica de nitrógeno y protección frente al ataque de plagas y patógenos. Se considera a Azospirillum spp. como uno de los géneros de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal más estudiados en la actualidad debido a su capacidad de mejorar significativamente el crecimiento y desarrollo, así como el rendimiento de numerosas especies vegetales de interés agrícola (Bashan et al. 2004). Uno de los principales mecanismos propuestos en la actualidad para explicar la promoción del crecimiento vegetal en plantas inoculadas con Azospirillum sp., se relaciona con su capacidad de producir y metabolizar compuestos reguladores del crecimiento vegetal o fitohormonas (Okon and Labandera Gonzáles 1994). II.

MARCO TEÓRICO: A. Historia de Azospirillum spp. En un principio fue llamado Spirillum lipoferum que fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las observaciones de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 las que iniciarían la época moderna de esta bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum conducen a su reclasificación en un género nuevo, Azospirillum. Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense, siendo éstas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense, A. halopraeferans, A. irakense y A. largomobile siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile. Pocos años después del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este género fue el más estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial comienza a extenderse en diferentes países.

B. Características Culturales  Características Generales: El genero Azospirillum es una proteobactria, Gram negativa que utiliza como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminoácidos y nitrógeno molecular. Tiene forma bacilar pleomorfica, se puede apreciar en algunas cepas la forma de C, con un diámetro de 0.8 a 1 um de largo y 2 a 4 um de ancho. Tienen una cantidad de G+C equivalente al 68% a 70%.

Son

microaerofilos, presentan movilidad en espiral por flagelos peritricos o polares. Habitan comúnmente en el suelo y rizosfera, asociado a plantas, tiene la capacidad de fijar el N₂. Almacena como reserva poli-B-hidroxibutirato, observándose al microscopio las células jóvenes con abundantes gránulos refringentes.

Fig. 1 Microscopia electrónica de Azozpirillum spp.  Características Diferenciales Requiere una Tº optima de crecimiento de 30ºC a 32ºC, un pH de 7.0 – 7.3 (neutro), presenta la enzima oxidasa (oxidasa +), para su cultivo requiere de biotina. En el medio Nfb semisólido desarrolla una película blanquecina y Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS densa debajo dela superficie (3 a 5mm), con viraje del indicador al azul; en medio Nfb solido se desarrollan colonias circulares, planas blanquecinas de 2 a 3 mm, con superficies lisas o rugosas y bordes enteros, con viraje del verde al azul.

Fig. 2- Placas con medio Nfb (solido). A la izquierda de color verde claro una placa con medio Nfb sin inoculación de Azospirillum. A la derecha placa de medio Nfb con colonias blanquecinas y con el viraje a color azul. En cultivos semigelificados y gelificados con más de 24 h de incubación se presentan frecuentemente células refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas similares a quistes.

Fig. 3.-Formación de "velo" a 5 mm de la superficie en medio semi-solido selectivo para Azospirillum"

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS Una de las características fenotípicas más ampliamente usada como criterio para el reconocimiento tentativo del género Azospirillum es el color rojo escarlata que toman las colonias al crecer en un medio adicionado del colorante rojo Congo.

Fig.4--Colonias Rojo escarlata de Azospirillum en placa con medio rojo de congo con acido malico. Azospirillum presenta quimiotaxis positiva hacia ácidos orgánicos, azucares, aminoácidos, compuestos aromáticos y hacia exudados radicales (Crozier et at 1988; López de Victoria y Lovell, 1993). Este genero migra hacia lugares del suelo donde la concentración de oxigeno es la adecuada ubicándose en nichos ecológicos apropiados en la rizosfera donde realiza la fijación biológica del nitrógeno y sintetiza sustancias estimuladoras del crecimiento.

C. Clasificación: La clasificación del Genero Azospirillum spp. Se realizo en función de las características morfológicas y fisiológicas según el Manual de Bergey:  Reino: Bacteria Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS  Phylum: Proteobacteria  Clase: Alpha Proteobacteria  Orden: Rhodospirillales  Familia: Rhodospirillaceae  Genero: Azospirillu  Especies: A. amazonense, A. halopraederans, A. lipoferum, A. brasilienses.

D. Aislamiento de Azospirillum: 1. Zona de recolección de muestreo: Azospieillum spp. Tiene como habitad el suelo de cultivos, específicamente en la zona denominada rizosfera, en cultivos de Tomate (Lycopersicon sculentus) o de Maiz (Zea mays). 2. Obtención de muestras de raíces: se recolectan las raíces del tomate o maíz, al final del ciclo vegetativo aproximadamente un mes antes de la cosecha. Luego se lavan las raíces con agua potable, hasta eliminar

el

suelo

remanente.

Se

cortan

en

secciones

de

aproximadamente 5 cm, luego se desinfectan con hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 %, durante 5 minutos y se enjuagaron dos veces consecutivas con agua destilada estéril. Luego se cortaron en secciones de un tamaño aproximado de 2 cm de longitud y se enjuagaron con agua destilada estéril. 3. Enriquecimiento: Para favorecer el crecimiento de bacterias fijadoras de nitrógeno, se realiza el enriquecimiento de cada una de las muestras, depositando las raíces de 10 a 15 mm por debajo de la superficie en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido. Se incuba en aerobiosis a 30 ºC por 5 días. Resultados: Tubos con viraje del color verde asta azul, con una película blanquecina de 3 a 5 mm. 4. Aislamiento Primario: se seleccionan los tubos donde se observa viraje del color verde del medio hacia el azul y la presencia de una película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS toma una alícuota de la película, con la que se obtiene una suspensión en 1 mL de solución salina fisiológica estéril, y se siembra por agotamiento y estría en placas de Petri con medio Nfb sólido con 20 mgL-1 de extracto de levadura. Incubar a 30 ºC durante 3 a 5 días. Resultados: desarrollaran colonias blanquecinas y pequeñas con viraje del verde al azul de 2 a 3mm. 5. Identificación primaria de la Bacteria: seleccionamos una colonia aislada y se realiza la tinción Gram y observar que no este contaminada la muestra. Resultado: bacilos Gram negativos (-). 6. Cultivo puro: de la colonia que se realiza la tinción Gram, cogemos con el ansa en punta un poco de la colonia y la sembramos en un vial con agar nutritivo por el método de estriado Resultados: se obtendrá una estría uniforme con una sola característica para todas las colonias. Para confirmar que no este contaminada el cultivo puro se realiza una tinción Gram. 7. Identificación Bioquímica de la bacteria:  Oxidasa: oxidasa +

 Medio Nfb semisólido: las placas Petri se incuban

en

aerobiosis a 30 ºC por 1 semana. Luego se observara el viraje de verde asta azul, lo que comprueba que se trata del genero Azospirullim spp.

 Medio agar rojo de Congo: las Placas de Petri se incuban a 30 °C por 48 a 72 h. Luego se observaran las colonias de color rojo escarlata. Lo que nos confirma q se trata del genero Azospirillum.

8. Identificacion Molecular:  Prueba de PCR: la identificación genotípica rutinaria de las especies de Azospirillum, así como su detección, se logra fácilmente y en forma reproducible amplificando mediante el Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de los oligonucléotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los productos amplificados con la enzima de restricción AluI. Con esta estrategia se obtienen fragmentos de tamaños específicos para cada especie de Azospirillum, distinguibles fácilmente en geles de agarosa.

FLUJO-GRAMA PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Azospirillum Raíces de Tomate o Maíz

Lavar con agua potable y desinfectar con hipoclorito de sodio al 2% x 5min

Cortar las raíces en trozos de 5 cm, enjuagarlas 2 veces y volver a cortar en 2 cm

Enriquecer en medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido (6ml)

Incubar de 3 a 5 dias a 30ºC

Azospirillum spp.

Incubar Por 5 dias a 30ºC

Sembrar en tubos conteniendo 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) semisólido

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Cultivo puro primario en vial con agar nutritivo

Pruebas Bioquimicas

E. Importancia de Azozpirillum: Las especies microbianas del genero Azospirillum son muy importantes ya que favorecen el crecimiento de la planta lo cual ha sido relacionado con el metabolismo del nitrógeno, a través de la fijación biológica en condiciones de vida libre o por el incremento de la actividad nitrato reductasa en condiciones endofíficas, con relación al metabolismo del nitrógeno, Azospirillum además de fijar el nitrógeno atmosférico en condiciones de microaerofilia que lo asimila como amonio, presenta reducción asimilatoria del nitrato en condiciones aeróbicas. Cuando Azospirillum crece en condiciones anaeróbicas utiliza el nitrato como último aceptor de electrones provocando denitrificacion:

NO3-

NO2-

(NO)

N2O

N2

Azospirillum presenta una nitrogenasa constituida de una ferroproteína y una molibdoferroproteína que reduce el observado

que

la

presencia

N2 a (NH 4+). S e de

sales

de

ha

amonio

(NH4+) inhibe la actividad de la nitrogenasa

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS Glutamino sintetasa (GS), glutamato deshidrogenasa (GDH-NADH) y glutamato sintetasa (GOGAT- NADPH) las cuales incorporan el nitrógeno fijado a la ruta de biosíntesis de a.a., péptidos y proteína. El interés agronómico por dicho género se basa en los beneficios potenciales que presentan algunas cepas para ser utilizadas como biofertilizante. relacionado con la capacidad de este microorganismo para producir o metabolizar compuestos del tipo fitohormonas, tales como ácido indol acético; citocininas (Tien et al. 1979); giberelinas (Bottini et al. 1989) y etileno (Strzelczyk et al. 1994), así como de otras moléculas reguladoras del crecimiento vegetal, tales como el ácido abscísico (ABA)

F. Ambiente rizosférico: Aparentemente, una bacteria del suelo deberá sobrevivir a las múltiples interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interacción con las raíces de la planta. En el inicio de una interacción con las raíces de la planta hospedera, el microorganismo específico deberá llegar a la superficie de las raíces, adherirse y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los tejidos internos, se diseminará en el interior de la raíz e incluso en otros órganos de la planta. La adaptación de Azospirillum al futuro ambiente rizosférico probablemente se inicia con la germinación de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos orgánicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudación de compuestos será a través de las raíces durante el desarrollo de la planta. Aun cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrógeno, estas bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacáridos así como alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos ácidos orgánicos tales como málico y succínico y algunos aminoácidos. Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS enzimas de la vía de Embden-Meyerhof-Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff, así como todas las enzimas del ciclo de los ácidos Tricarboxílicos. Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotróficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa La riqueza en compuestos orgánicos en la espermosfera/rizosfera conduce a intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la quimiotaxis a los exudados de raíz es uno de los factores que influyen en la llegada de los microorganismos a la rizosfera. Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se demostró una fuerte actividad quimiotáctica hacia diversos azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos, así como hacia compuestos aromáticos y exudados radicales. La respuesta quimiotáctica a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de la especie de Azospirillum e incluso es cepa-específica. También una respuesta hacia el oxígeno (aerotaxis) fue observada en A. brasilense. Zonas de baja concentración en oxígeno fueron las preferidas por las células bacterianas para su crecimiento y multiplicación, siendo repelidas por altas concentraciones de oxígeno y condiciones anaeróbicas. La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijación de nitrógeno, permitiéndole a las células de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxígeno lo suficientemente bajas para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y aerotáctica son características que contribuyen en el proceso de colonización de las raíces de las plantas, ya que el consumo de oxígeno durante el crecimiento activo de las raíces enriquece el ambiente con sustratos orgánicos y genera gradientes de oxígeno al consumirse éste durante la respiración. No obstante, la colonización de la rizosfera y la superficie o el interior de las raíces será el resultado del enriquecimiento selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la capacidad para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A. lipoferum podría representar ventajas competitivas sobre las cepas de estas especies o íntimamente relacionadas que sean sensibles a estas biomoléculas. Además, la capacidad de producir sideróforos (agentes quelantes del hierro) por algunas cepas de A. brasilense pudiera ser de gran Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS importancia durante la colonización del ambiente rizosférico y de la superficie de las raíces al ejercer efectos antagónicos contra otros miembros de la comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletéreos o patógenos de las plantas.

Fiq. 5. Inhibicion del crecimiento y la esporulacion de un hongo fitopatogeno causada por A. brasilense.

Esta actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los antibióticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol producidos por actinomicetos del suelo, en comparación a la elevada resistencia a los antibióticos del tipo β-lactámicos producidos por hongos. La expresión constitutiva de la actividad β-lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense. Estos resultados sugieren que el antagonismo causado por hongos contra Azospirillum es limitado. También es concebible que se presenten efectos sinérgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad rizosférica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola, hongo usado como agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A. lipoferum y A. brasilense. De manera similar, la interacción entre A. Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS brasilense y Azotobacter

chrococcum o Streptomyces

mutabilis conduce

a

incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo. Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de metales pesados provocan que las células vibroides de Azospirillum cambien su morfología y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C), conduciendo a la agregación celular y formando grumos visibles de gran tamaño. Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacárido y en el polisacárido capsular están involucrados en la agregación de A. brasilense. La agregación y la formación de quistes mejoran la sobrevivencia de Azospirillum, situación en la que la acumulación de poli-β-hidroxibutirato (PHB) parece desempeñar una función importante al servir como almacén de carbono y energía. Además, diversas funciones fisiológicas son atribuidas al PHB, destacándose la mayor resistencia a la desecación, a la luz ultravioleta y al choque osmótico. Se ha sugerido que la formación de quistes pudiera desempeñar una función importante en la sobrevivencia de Azospirillum en el ambiente rizosférico, cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociación con las raíces de la planta. Recientemente, ha sido publicada una amplia revisión sobre las características de A. brasilense en relación con la agregación celular.

G. Interacción con la planta: Probablemente, una vez que las células de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente rizosférico y han logrado llegar a la superficie de las raíces, debido a sus características quimio y aerotácticas, se iniciará el establecimiento de la asociación. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para adherirse a las raíces de plantas gramíneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens, trigo, maíz, así como a las raíces de plantas de otras familias que incluyen al algodón y tomate, e incluso a superficies inertes como poliestireno y arena. La capacidad de Azospirillum para adherirse a las raíces, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por otras bacterias de la comunidad Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS rizosfera como

Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso

que E. coli. La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes. La primera consiste en una adsorción rápida, débil y reversible, la cual es dependiente de proteínas de la superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en conjunto con la participación del flagelo polar. La segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su máximo nivel 16 h después de la inoculación, el cual parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de Azospirillum. Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una proteína de la membrana externa de Azospirillum participe en el proceso de adherencia a las raíces de las plantas. El proceso de adherencia de Azospirillum a las raíces de las plantas ha sido revisado recientemente. En diversos casos se ha reportado la aparición de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las raíces de diversas plantas, describiéndose como esencial para el anclaje a las partículas de arena. Aún en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido elucidada, aunque parece ser de origen bacteriano. Recientemente se ha publicado una revisión sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a superficies abióticas del suelo. La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonización son las áreas de elongación celular y las bases de los pelos radicales. Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales. Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia. La inoculación de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la asociación las células bacterianas colonizan específicamente los sitios de emergencia de las raíces laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raíz primaria como de las raíces secundarias y posteriormente la superficie de la raíz. En plantas de trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo éstos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS chrococcum, los cuales son mínimos. Además, fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz, en tanto que la inoculación de 108 a 109 células causa la inhibición del desarrollo de ésta. Aparentemente, el incremento del tamaño del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la división celular y al intenso crecimiento de la zona de elongación de las raíces. Es de interés señalar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz. La capacidad de Azospirillum para colonizar las raíces de las plantas es variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia con focal de rayos láser y sondas de oligonucleótidos fluorescentes y con el uso de anticuerpos monoclonales cepa-específicos ha sido mostrado que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente rizosférico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raíz de plántulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas densidades en los espacios intercelulares de la raíz, así como en el interior de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologías, habían

sido

reportados

con

algunas

de

las

mismas

cepas

de Azospirillum inoculadas en trigo creciendo en condiciones de campo.

Azospirillum spp.

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Fig. 5. Estimulación del crecimiento de las raíces de maíz inocuilado con A. brasilensis

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Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS H.

Mecanismos de estimulación del crecimiento de las plantas:

 Auxinas Tiene la capacidad de inducir la elongación de las células del tallo en la región subapical y que logran reproducir el efecto fisiológico del ácido indol 3acético (AIA).

Estos compuestos han sido vinculados a procesos de

orientación del crecimiento de tallos y raíces en respuesta a la luz y gravedad, diferenciación de tejidos vasculares, dominancia apical, iniciación de las raíces laterales y adventicias, estimulación de la división celular y elongación de tallos y raíces (Ross et al. 2000). La producción y metabolismo bacteriano de auxinas ha captado la atención de los investigadores desde dos puntos de vista: a nivel metabólico, por la capacidad del microorganismo para producir estos compuestos y regular su producción en diferentes condiciones ambientales (Costacurta and Vanderleyden 1995) y a nivel morfofisiológico por el efecto que ocasiona su producción en asociación con distintas especies vegetales (Falik et al. 1989). En cultivos puros de Azospirillum sp., además de la forma principal, el ácido indol3-acético (AIA), se han identificado otros compuestos indólicos de interés, tales como el ácido indol-butírico (IBA) (Costacurta et al. 1994), indol láctico (Crozier et al. 1988), indol acetamida (Hartmann et al. 1983), indol acetaldehído (Costacurta et al. 1994), indol etanol e indol metanol (Crozier et al. 1988), triptamina, antranilato y otros compuestos indólicos no caracterizados aún (Hartmann et al. 1983).

 Biosíntesis bacteriana de auxinas En microorganismos se han propuesto, al menos tres vías metabólicas para la biosíntesis del ácido indol acético (AIA) a partir de triptofano (Trp), denominadas vía del indol 3-piruvico (AIP), ácido 3-acetamida (AIM) y la vía de la triptamina (Tam) (Cheryl and Glick 1996). Adicionalmente se ha descripto una vía que no requiere de este precursor para la biosíntesis del AIA y que se denominada vía independiente del Trp. A pesar de esta diversidad, en el metabolismo procariótico la biosíntesis parece seguir dos rutas predominates: la Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS ruta de la indol 3-acetamida (IAM) y la del ácido indol 3- pirúvico (IPA) por encima de la vía de la triptamina (Tam) y de la vía independiente de triptofano. Lambrecht et al. (2000) han encontrado un patrón de biosíntesis de AIA característico

de

la

interacción

planta-microorganismo

que

depende

específicamente de rol ecofisiológico de la especie bacteriana que interactúa, siendo estas fitopatogénicas o promotoras del crecimiento. Tal es el caso de Agrobacterium

tumefaciens,

Agrobacterium

rhizogenes,

Pseudomonas

savastanoi y Erwinia herbicola, todas especies fitopatogénicas que sintetizan el AIA de manera inducible por la vía de la indol 3- acetamida (IAM) y de manera constitutiva por la vía del indol 3-piruvico (IPA). La expresión del gen clave de la vía de la indol acetamida (iaaM), es predominante cuando la bacteria se encuentra en el apoplasto vegetal en forma invasiva, mientras que la expresión del gen clave de la vía del indol 3- piruvico (ipdC) es predominante cuando la bacteria se encuentra en la superficie de la hoja de manera saprofítica. En contrapartida, la mayor parte de las bacterias promotoras del crecimiento, tales como Azospirillum sp. o Bacillus sp. Sintetizan AIA de manera inducible a través de la vía del IPA (Patten and Glick 1996). Abdel-Salam and Klingmüller (1987) lograron aislar once mutantes (Tn-5) de Azospirillum lipoferum capaces de producir entre el 45-90% menos de AIA, comparados con sus cepas isogénicas salvajes. La capacidad residual de estos mutantes, sugirió en ese momento dos explicaciones posibles: la existencia de varias rutas de síntesis de AIA ó la presencia de múltiples copias de genes codificantes de transferasas de aminoácidos aromáticos con baja especificidad por el sustrato. En la actualidad sabemos que al menos cuatro vías de síntesis diferentes han sido descriptas para el género Azospirillum (Prinsen et al. 1993), tres dependientes del Trp: Indol 3pirutato (AIP), Indol 3-acetamida (AIM) y Triptamina (Tam) y una que no utilizaría a este aminoácido como precursor (Costacurta and Vanderleyden 1995). La magnitud de expresión de cada vía depende fundamentalmente de las condiciones de crecimiento bacteriano y en general se considera que la síntesis mayoritaria depende de la disponibilidad del Trp en el sustrato. En este sentido, la evidencia establece que si el aminoácido se encuentra disponible, la vía Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS predominante es la del acido indol-3-piruvico (IPA) y de manera secundaria la vía de la de la indol 3-acetamida (IAM). La vía del ácido indol 3-pirúvico (AIP) parece tener gran homología a la descripta en plantas superiores (Nonhebel 1993) y su secuencia comienza con la conversión del Trp a AIP por una transferasa de aminoácidos aromáticos, seguida por decarboxilación del producto a indol 3acetaldehído, a cargo de una indol piruvato decarboxilasa y posterior oxidación a AIA por una indolacetaldehído dehidrogenasa (Costacurta et al. 1994). La vía del IPA fue confirmada inicialmente en A. brasilense Sp245 cuando se clonó por primera vez el gen ipdC que codifica para una IPyA decarboxilasa (Costacurta et al. 1994). La posterior caracterización molecular descripta por Van de Broek et al. (1999), determinó que la expresión de este gen era regulada corriente arriba por el mismo IAA, lo cual representó la primera descripción de un gen bacteriano especificamente regulado por auxinas. El promotor del gen ipdC contiene un elemento de respuesta a auxinas (AuxRE), el cual es similar al AuxRE encontrado en los promotores de los genes inducibles por auxinas de plantas superiores (Lambretch et al. 1999). Por su parte, la vía de la indol 3-acetamida (IAM) ha sido una de las más estudiadas en bacterias fundamentalmente fitopatogénicas e involucra la acción consecutiva de dos grupos de enzimas: Trp-monooxigenasas responsables de la oxidación del Trp a indol 3-acetamida y AIM-hidrolasas responsables de la subsecuente hidrolisis del precursor a AIA, y para las que sendos genes ya han sido clonados en Pseudomonas syringae (Yamada et al. 1985) y Agrobacterium tumefaciens (Klee et al. 1984). La existencia de esta vía en A. brasilense fue sugerida en los trabajos de Prinsen et al. (1993) y en los ensayos de Bar and Okon (1993). Posteriormente, en ensayos realizados con varias cepas de A. brasilense y mutantes con reducida capacidad de sintetizar AIA, en medio de cultivo químicamente definido, Prisen et al. (1993), determinaron la existencia de Indol 3-acetamida en la fracción sobrenadante del medio de crecimiento, con lo que se presentaba evidencia directa de la capacidad bacteriana de síntetizar este precursor. Una tercera vía de menor importancia ha sido descripta para este género, la vía de la Triptamina, en la que los eventos bioquímicos involucran la Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS conversión inicial del Trp a triptamina, catalizada por enzimas tipo Trpdecarboxilasas dependientes del piroxidal fosfato, seguida de la conversión a indolacetaldehído por aminaoxidasas. Aunque esta vía esta presente en plantas (Conney and Nonhebel 1991) y hongos (Frankenberger and Arshad 1995) se ha puesto muy poca atención en bacterias y solo fue sugerida para dos especies en particular. Bacillus cereus (Perley and Stowe 1996) y Azospirillum brasilense (Hartman et al. 1983), quienes comprobaron la capacidad bacteriana de producir AIA a partir de triptamina en medio de cultivo químicamente definido. Posteriormente, Ruckdäschel and Klingmüller (1992) detectaron compuestos intermediarios y confirmaron esta vía de síntesis en sobrenadantes de cultivos de Azospirillum lipoferum. Desde el punto de vista molecular, ni las enzimas, ni los genes de la vía han sido caracterizados para este género. Finalmente se ha descripto una vía independiente del Trp en la que trabajando con precursores metabólicos marcados, Prinsen et al. (1993) sugirieron que la conversión de AIA (en ausencia de Trp) en diferentes cepas de Azospirillum brasilense seguía una distribución del 0,1; 10; y 90% para las vías de la IAM, AIP y la Independiente del Trp respectivamente; sin embargo, esta vía habría sido desestimada recientemente para este microorganismo y solo se considerarían aquellas dependientes del Trp (Yaacov Okon)

 Giberelinas Las giberelinas (GAs) constituyen un amplio grupo de compuestos naturales (ácidos diterpenos tetracíclicos) que regulan diversos procesos en el crecimiento y desarrollo de las plantas, tales como la germinación, el alargamiento caulinar, la floración y la fructificación (Davies 1995). Desde el punto de vista estructural, las giberelinas libres se dividen en dos grandes grupos: aquellas que poseen un complemento completo de átomos de carbono, (GAs-C20) y aquellas en las que el C20 se pierde (GAs-C19). Todas las GAs están carboxiladas en el C7, con la excepción de GA12-aldehído y pueden tener presentes una (GA4), dos (GA1), tres (GA8) ó cuatro (GA32) funciones hidroxilo. La posición en la molécula que presenta hidroxilación (OH), representa unos de los puntos más importantes en la determinación de la Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS actividad biológica. Así, la hidroxilación de los C3 y C13 en sus posiciones ß y α respectivamente, produce la activación de la molécula, mientras que la hidroxilación del C2 en su posición ß tiene efecto fuertemente negativo sobre su actividad biológica (Pearce et al. 1994). Además de las formas libres, se han identificado formas conjugadas endógenas que incluyen: éter glucosídicos (GAG), donde la glucosa se une a la estructura de la GA por un grupo hidroxílo, y los ésteres glucosídicos (GA-GE), donde la glucosa se une a la molécula de la hormona por medio de un grupo carboxílo del C7 (Sembder et al. 1968).

 Biosíntesis y Metabolismo Las GAs pueden definirse como productos de la vía de los diterpenos y su síntesis, en plantas superiores se inicia con la ciclización de un precursor común de 20 moléculas de carbono, el geranil geranil pirofosfato (GGPP). Este intermediario es sintetizado en plástidos a partir de ácido mevalónico (AM), isopentenil difosfato proveniente de gliceraldehído 3-fosfato ó bien como se comprobó recientemente por piruvato proveniente de la vía de las deoxixulosas 5-fosfato (Litchtenthaler, 1999). En tejidos de crecimiento vegetativo, ocurre la primera fase de síntesis, con la ciclización del GGPP en protoplástidos y resulta en la formación definitiva del ent-kaureno, en dos pasos sucesivos que requieren de la actividad de dos enzimas claves: la copalil difosfato sintasa (CPS), la cual produce el intermediario copalil difosfato y la ent-kaureno sintasa, que sintetiza el producto final ent-kaureno. En una segunda fase de síntesis, el ent-kaureno es convertido en Gas biológicamente activas por una serie de reacciones de oxidación, catalizadas por dos tipos de enzimas. Las primeras reacciones ocurren en membranas extraplastídicas y resultan en una contracción del anillo B de C6 a C5, tomando así la molécula la forma giberelica característica. Estas reacciones son catalizadas por las Citocromo P-450 dependientes monooxigenasas y culminan con la formación de GA12, la que se considera la primera GA, como tal, de la vía. Posteriormente y en una tercera fase de síntesis, este intermediario o bien GA53 (producto de la 13á-hidroxilación de GA12) es metabolizado por enzimas solubles, llamadas dioxigenasas 2-oxoglutarato dependientes, las que utilizan el 2-oxoglutarato como co-sustrato. Dos tipos de dioxigenasas son Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS requeridas para convertir GA12 ó GA53 por vías paralelas en GAs activas. Las C 20-oxidasas y las 3ß-hidroxilasas.

Un tercer grupo de dioxigenasas 2-

oxoglutarato dependientes, las 2ß-hidroxilasas, producen la hidroxilación de la posición 2ß de la molécula, produciendo con ello la pérdida de actividad biológica (Mac Millan 1997).

 Biosíntesis y metabolismo de GAs por Azospirillum sp. en medio de cultivo Bottini et al. (1989) determinaron la capacidad de Azospirillum lipoferum Op33 de producir compuestos tipo GA1, GA3 e iso-GA3 en medio de cultivo químicamente definido. La identificación de estas formas endógenas de GAs se realizó por Cromatografía Gaseosa acoplada a Espectrometría de Masa con Monitoreo Selectivo de Iones (GC-MS-SIM), mientras que la cuantificación se realizó por medio de test biológicos en arroz (Murakami et al. 1972) y determinó una concentración equivalente a GA3 de 20 y 40 pg.ml-1 de GA1 y GA3 respectivamente. La identificación y cuantificación de GA1, GA3 e iso-GA3 se realizó por GC-MS, a partir de cultivos puros y determinó que el patrón de producción era de GA3>iso-GA3>GA1. Piccoli and Bottini (1996) pusieron de manifiesto la capacidad de Azospirillum lipoferum para producir los precursores inmediatos GA9 y GA19 lo cual permitió especular sobre la existencia de por lo menos dos vías de síntesis en la bacteria. La primera mediada por reacciones de 13α-hidroxilación temprana y que involucraría el metabolismo de GA19 a un precursor inmediato GA20 y la segunda mediada por reacciones de 3ß y 13áhidroxilación tardía y que involucraría la conversión de GA9 a formas activas sobre el crecimiento vegetal. Piccoli et al (1996) y Piccoli et al. (1998) confirmaron la capacidad de Azospirillum lipoferum Op 33 de producir GA9, GA20 y GA5 en medio de cultivo químicamente definido, lo cual aporta nuevos elementos para el complejo esquema de síntesis bacteriana. En otros ensayos, Piccoli and Botiini (1994) demostraron la capacidad de A. lipoferum Op33 de metabolizar GA20 a GA1, una molécula biológicamente activa sobre el crecimiento vegetal en medio de cultivo químicamente definido. En este trabajo, Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS no se caracterizó otro metabolito y esto permitió especular sobre la capacidad bacteriana de 3ß-hidroxilar este precursor inmediato solo a esta forma activa por medio de una vía de 13α-hidroxilación temprana que finalizaría con la producción de GA1. Adicionalmente, Piccoli et al (1996) confirmaron la capacidad de la misma cepa bacteriana para metabolizar GA9 a GA3 (otra molécula con actividad biológica). Estos resultados permitirían suponer que la promoción del crecimiento de plantas inoculadas, se debería al menos en parte, a la capacidad bacteriana de metabolizar precursores inmediatos de GAs, a formas biológicamente activas para el crecimiento de la planta. En otros ensayos, Piccoli et al. (1998), Evaluaron exitosamente la capacidad bacteriana de hidrolizar glucosíl conjugados de GAs, en medio de cultivo químicamente definido, modificado por la adición de un glucosíl ester de GA20 ó de 13-O-glucósido de GA20, lo que confirmó la capacidad del microorganismo de aumentar en la planta el pool endógeno de formas activas de giberelinas por la hidrólisis de glucosa a partir de conjugados sin actividad biológica.

 Citocininas Son un grupo de compuestos naturales que regulan la división y diferenciación celular en tejidos no meristemáticos de plantas superiores. Químicamente son purinas, en su mayoría derivadas de la adenina, que incluyen sus respectivos ribótidos, ribósidos y glucósidos. Estas fitohormonas se han asociado a un gran número de procesos fisiológicos y celulares entre los que se detallan el retardo de la senescencia por acumulación de la clorofila, la formación de órganos en una gran variedad de cultivos de tejidos, el desarrollo de la raíz, la formación de pelos radicales, la elongación de la raíz, la iniciación del tallo, la expansión de las hojas. Por definición, son compuestos que en presencia de concentraciones óptimas de auxinas, inducen la división celular en cultivos o tejidos vegetales. El primer regulador con actividad específica del tipo citocinina, fue descubierto por Miller et al. (1955) y se denominó cinetina (K) la cual fue considerada como una forma no natural de la hormona. En 1963, Letham, identificó una forma natural que denominó zeatina (Z) y desde entonces más de 40 moléculas y sus metabolitos han sido clasificados. La bioactividad no es Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS uniforme en las formas identificadas y en la mayoría de los casos depende del tipo de anillo aminopurina presente en la molécula; de la sustitución del N6 con una cadena simple derivada de una unidad isopurina; de la sustitución de las posiciones 2 y 9 del anillo, por grupos H, CH3-S ó ribosil y de la presencia de una cadena insaturada lateral con un óptimo de 5 carbonos. Las formas con mayor actividad biológica descripta sobre tejidos o cultivos vegetales son la Zeatina (Z), isopentenil-adenina (iP), cinetina (K) y benziladenina (BAP) y todas poseen un doble puente alkilico en la posición N6.

 Producción microbiana de citocininas Muchos microorganismos de la risósfera, entre los que se detallan bacterias y hongos, son capaces de sintetizar citocininas en cultivos químicamente definidos. Barea et al. (1976) encontraron que al menos el 90 % de las bacterias aisladas de la rizósfera de cultivos de interés agronómico, fueron capaces de producir compuestos tipo-citocinas. Como resultado de la íntima relación entre estos organismos y la superficie de la raíz, la producción exógena de esta hormona, puede tener un profundo efecto sobre el crecimiento de la planta. Al igual que lo reportado para las auxinas, la producción microbiana de esta hormona, podría el suplementar el contenido endógeno de la planta y en ciertos casos promover el crecimiento vegetal o resultar fitotóxica. En la actualidad sabemos que las plantas, responden a la adición exógena de citocininas, lo cual representa un punto de gran interés, debido a que no se conoce la significancia ecológica de la síntesis microbiana en los tejidos vegetales. A pesar de que la producción microbiana de citocininas en plantas superiores comenzó con modelos de microorganismos fitopatógenos, en la actualidad los investigadores se han volcado a la comprensión de este proceso en grupos de bacterias promotoras del crecimiento. El modelo mas estudiado en este sentido ha sido el de la simbiosis Rhizobium-leguminosa, donde se ha investigado tanto la producción de la hormona en el microsimbionte como en la planta. Desde el punto de vista fisiológico, existe poca información que pueda relacionar en forma directa el efecto de la inoculación con Azospirillum sp., la promoción del crecimiento vegetal y la producción de citocininas. En este sentido Tien et al. Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS (1979) mostraron que la inoculación con A. brasilense provocaba cambios significativos a nivel de la morfología de raíz de plántulas de pearl millet, observando incremento en el número de raíces laterales y en la densidad de los pelos radicales de cada raíz. La aplicación exógena de auxinas, citocininas y giberelinas produjo cambios en la morfología de la raíz comparables a los obtenidos por la inoculación con la inoculación. En otros ensayos, Cacciari et al. (1989) determinaron que el cultivo mixto de A. brasilense y Arthrobacter giacomelloi mostraba una gran producción de giberelinas y citocininas, comparado con sus respectivos monocultivos, lo cual tendría gran importancia fisiológica, debido a que la presencia de distintas especies microbianas en la rizósfera, induciría la producción de citocininas y otras fitohormonas en bacterias PGPR.

 Etileno Junto con auxinas, giberelinas y citosininas, el etileno es una hormona muy importante en el crecimiento y desarrollo de las plantas (Burg 1962). Debido a su composición gaseosa en condiciones fisiológicas, por mucho tiempo, no se quiso aceptar como una fitohormona; sin embargo diferentes trabajos, demostraron que su síntesis y acción sobre la planta, era crítica para determinados procesos fisiológicos. El etileno es una molécula muy simple y simétrica, compuesta por 2 átomos de C (Unidos en doble ligadura) y 4 átomos de H, soluble en agua en aproximadamente 140 ppm, 25 C y 760 mm Hg (15 veces mas que el oxígeno). Es muy activo y puede ejercer sus efectos fisiológicos a concentraciones muy bajas en el tejido vegetal (0.1 ppm). En plantas superiores, todos los tejidos tienen capacidad de sintetizar esta hormona, pero en general la magnitud de la expresión, se asocia al estado de crecimiento y desarrollo de los mismos, siendo mas activa en aquellos tejidos en activa división celular, que se encuentran bajo condiciones de estrés ó en estado de senescencia (Burg and Burg 1968). Desde que Gane (1934) reportó por primera vez la capacidad de las plantas de sintetizar etileno, una gran variedad de compuestos, que incluyen metionina, ácido linolénico, propanol, ß-alanina, etionina, etanol, glicerol, ácidos orgánicos y Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS hasta glucosa y sacarosa (Yang 1974), han sido propuestos como posibles precursores de la hormona; sin embargo, en un trabajo in vitro de modelaje noenzimático, Abeles and Rubistein (1964), revelaron que la metionina era el precursor natural por exelencia. En el caso de la síntesis microbiana, los precursores propuestos fueron muy variados (Fukuda and Ogawa 1991) pero la L-metionina ha sido el sustrato mayormente descripto en los cultivos bacterianos. La regulación de la producción de etileno en plantas superiores depende mayoritariamente de las enzimas consideradas «clave» de la biosíntesis de esta hormona: S-adenosil-L-metionina (SAM) sintetasa, 1-aminociclopropano-1ácido carboxílico (ACC) intetasa y ACC oxidasa. Tanto los genes que codifican para estas enzimas como sus elementos reguladores han sido caracterizados, modificados y re-introducidos en plantas de interés agrícola con fines agronómicos (Fluhr and Mattoo 1996). La SAM sintetasa cataliza la primera reacción de la biosíntesis a partir de metionina, aumentando el contenido de Sadenosil-L-metionina (SAM) para diversas rutas metabólicas, dentro de las que se detallan la biosíntesis de Etileno (Fluhr and Mattoo 1996) y poliaminas (EvenChen et al. 1982). La segunda reacción es catalizada por la ACC sintasa y determina la hidrólisis de la SAM para formar ACC y 5´-metiltioadenosina (MTA) (Kende, 1989). Finalmente la ACC oxidasa comanda la conversión de ACC a Etileno, CO2 y cianuro (John, 1991). Dentro de los factores que Inducen la producción de Etileno, el estadío de un órgano influye en la tasa de síntesis de esta hormona, siendo mayor en etapas donde las células están en división, maduración ó senescencia (Burg y Burg 1968).

 Producción de etileno por Azospirillum Existe muy poca información disponible, relacionada a la producción de etileno por Azospirillum y su efecto sobre el crecimiento vegetal. Trabajos de Primrose and Dilworth (1976) determinaron la capacidad de bacterias promotoras del crecimiento vegetal de vida libre, Azotobacter y Bacillus de producir etileno en medio de cultivo químicamente definido y esto fue un catalizador para que Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS Strzelczyk et al. (1994) testearan la capacidad de Azospirillum de producir este compuesto in vitro sobre diferentes fuentes carbonadas. Sus resultados determinaron que la bacteria podía sintetizar etileno y que la producción dependía de la presencia de metionina en el medio de cultivo. Recientemente, Krumpholz et al. (2006) evaluaron la respuesta de crecimiento de plántulas de tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326 (súper productora de IAA), correlacionando el aumento significativo en el número y longitud de raíces, con la producción vegetal de etileno de hasta 10 veces superiores a los controles. Los cambios morfológicos fueron acompañados de un aumento de actividad de la ACC-sintasa, una de las enzimas clave de la ruta de síntesis de esta hormona. Según Peck and Kende (1995), el paso limitante para la biosíntesis de etileno

es

la

conversión

de

la

S-adenosilmetionina

(SAM)

a

1-

aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), catalizada por la ACC sintasa. La expresión y la actividad de esta enzima, así como la producción de etileno, incrementan por la adición de AIA exógeno. Algunos investigadores proponen un modelo en el que la capacidad de algunas bacterias para promover el crecimiento vegetal sería indirecta y estaría en relación directa a la expresión bacteriana de la enzima 1-aminociclopropano1-carboxilato deaminasa (ACC deaminasa). Esta enzima clave en metabolismo del etileno, hidroliza el 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) que es intermediario de la hormona activa (Glick, 1995). Bacterias que poseen esta enzima pueden clivar el ACC a amonio y alfa-cetobutirato y prevenir la acumulación de etileno y sus efectos tóxicos (Glick et al. 1998). A pesar de que Azospirillum estimula el crecimiento de plantas, los miembros de este género no producen ACC deaminasa, por lo que no pueden regular los niveles de etileno en tejido vegetales. En este sentido Holguín and Glick (2001) comprobaron que la transferencia del gen de la ACC deaminasa de Enterobacter cloacae en Azospirillum brasilense resultó en una mejora considerable del crecimiento de la planta inoculada.

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS

 Acido Abscísico Es una hormona vegetal, involucrada diferentes procesos fisiológicos del crecimiento y desarrollo de la planta, como la dormición de yemas y semillas, la maduración de frutos y en situaciones de estrés ambiental desfavorables como déficit hídricos o estrés salinos. El ácido abscísico (ABA) se forma en plastidios, tanto de hoja como de raíz y su biosíntesis comienza a partir del ácido mevalónico, vía farnesil farnesil pirofosfato (FFPP), dentro de lo que se conoce globalmente como síntesis de los terpenos.

La alternativa más aceptada de

continuación de la ruta metabólica es la síntesis de carotenoides y su posterior clivaje para dar xantoxina y ABA. Este secuenciamiento opera en plantas superiores, especialmente bajo condiciones de estrés hídrico y salino. El ABA está relacionado con la capacidad de plantas superiores para adaptarse a condiciones de estrés, a través de distintos procesos fisiológicos y moleculares que incluyen: alteraciones en la expresión de genes relacionados con estrés hídrico y cierre de estomas. Desde el punto de vista fisiológico, el ABA favorece la economía del agua dentro de la planta, por su efecto regulador sobre la apertura y cierre de estomas a nivel de las hojas (Davies, 1995); además participa en la dormición de yemas y semillas; en la acumulación de proteínas de reserva en semillas (soja); en la inhibición del crecimiento y germinación inducido por auxinas y GAs; en la inhibición del crecimiento foliar en situaciones de estrés y en la regulación de la síntesis proteica en respuestas de aclimatación a diferentes tipo de estrés; sin embargo, todas estas funciones están relacionadas a un objetivo común, la defensa del sistema vegetal en condiciones ambientales desfavorables. Su valor fisiológico más importante ha sido relacionado con la sobrevivencia de la planta y el control de la economía del agua, más que con incrementos de la producción agrícola en sí (Davies and Jones, 1991). La respuesta central de la planta a un déficit hídrico, tiene como resultado un incremento en la síntesis de ABA endógeno, que provoca los efectos fisiológicos y bioquímicos antes mencionados, que son indefectiblemente acompañados de cambios en la

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS expresión de genes, muchos de los cuales son regulados por esta hormona (Bray, 1993). Bajo estas condiciones, las plantas requieren menos agua para su funcionamiento y así sufren menor daño. Un aspecto de sumo interés en la fisiología de esta hormona es que la apertura y cierre estomático en plantas superiores, puede ser regulada a distancia por medio de señales químicas provenientes de la raíz y el tallo, constituyendo la evidencia en tiempo real de la disponibilidad hídrica del suelo

 Producción de Ácido Abscísico por Azospirillum Es muy escasa la información documentada sobre la identificación de ABA en cultivos químicamente definidos de Azospirillum y su correlación al crecimiento de la planta. La mayor parte de los ensayos fueron realizados en sistemas de cultivos e inoculaciones de hongos y bacterias fitopatogénicas ó en asociaciones simbióticas por bacterias nodulantes. Solo un trabajo reportó la producción de ABA por A. brasilense Ft326 en medio de cultivo definido (Kolb and Martin, 1985), sin embargo la identificación se realizó por RIA técnica poco sensible, comparada con la de espectrometría de masas, que se utiliza en la actualidad.

 Interacción

de

fitohormonas

producidas

por

Azospirillum sp. y su efecto sobre el crecimiento del sistema vegetal El estudio de las interacciones entre las diferentes hormonas en los sistemas vegetales ha emergido en la actualidad y en este caso, las fitohormonas producidas por microorganismos endofíticos no quedan exceptuadas del análisis. Fulchieri et al. (1993) encontraron que plántulas de maíz (Zea mays L.) inoculadas

con

las

3

cepas

de

Azospirillum

lipoferum

mejoraron

significativamente el crecimiento de la raíz y de la parte aérea. En estos ensayos GA3 fue identificada en la fracción ácida libre del extracto vegetal y estos resultados permitieron especular sobre la capacidad bacteriana de incrementar in

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS vivo el pool de giberelinas con actividad biológica sobre el crecimiento vegetal en las raices de plantas inoculadas. Ross and O´Neill (2001) sugieren que las auxinas podrían promover, al menos en parte, la elongación del tallo por incrementar los niveles de endógenos de giberelinas 3ß-hidroxiladas, lo cual podría tener relación directa con los resultados obtenidos por Fulchieri et al. (1993) ya que ni el contenido endógeno de IAA ni la expresión de los genes que codifican para 3ß-hidroxilasas fueron cuantificados en las fracciones correspondientes. Otro factor a considerar sería que por lo menos dos de las cepas utilizadas para la inoculación (A. lipoferum Op 33, A. lipoferum iaa 320) eran productoras de AIA lo que permitiría especular, que al menos en parte, el aumento en el contenido endógeno de GA3 en la raíz podría deberse al cross-talk del AIA sobre el pool de GAs de la raíz y que parte de la respuesta del crecimiento observado en parte aérea y subterránea se debería al efecto de las GAs producidas por las diferentes cepas de Azospirillum lipoferum ó por las GAs producidas por las plántulas inducidas por el AIA bacteriano, como describen Yaxley et al (2001); Como mencionamos anteriormente, Krumpholz et al. (2006) han evaluado la respuesta de crecimiento de plántulas de tomate inoculadas con Azospirillum brasilense FT326 (súperproductora de IAA), correlacionando el fenotipo vegetal con la producción vegetal de etileno. El aumento en la producción de etileno fue significativamente superior a los controles y los cambios morfológicos fueron acompañados de un aumento de actividad de la ACC-sintetasa tisular. De acuerdo con Peck and Kende (1995), el paso limitante para la biosíntesis de etileno es la conversión de la Sadenosilmetionina (SAM) a 1-aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC), catalizada por la ACC sintetasa y la expresión como la actividad de esta enzima, así como la producción de etileno, incrementa por la adición de AIA exógeno. Estos antecedentes indicarían que el aumento de etileno, al menos en parte de debería a un cross-talk entre el AIA producido por la bacteria en la vía de sintesis del etileno como sugieren Rahman et al. (2002).

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS

I. Aplicación: Algunas compañías en diferentes países han registrado inoculantes de Azospirillum para maíz y otros cultivos. Burdman y col. refieren que en Sudáfrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS de Azospirillum para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo. Algunas características de la producción de inoculantes a base de Azospirillum han sido discutidas. Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en México la aplicación de ésta bacteria en diferentes cultivos ha rebasado con mucho lo hecho en otros países. En el ciclo agrícola primaveraverano (PV) del año 1999 la Secretaría de Agricultura, a través de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la Investigación Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la inoculación de alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000 hectáreas

de

sorgo,

cebada

y

trigo,

empleando

cepas

de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos. La evaluación del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectáreas de los diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de México con características edáficas en regiones climáticas diferentes mostró el éxito de la inoculación en el rango de 62 a 95% de los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. El incremento promedio en la producción de los cultivos de maíz, trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes. La mejor respuesta a la inoculación se presentó en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles intermedios de fertilización en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS variedades "criollas" de maíz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos y condiciones climáticas evaluadas, los resultados de la inoculación con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los cultivos de grano. El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la "inconsistencia de la inoculación" tienen poco valor ante los resultados de producción obtenidos en decenas de experimentos, así como los obtenidos en miles de hectáreas con diferentes cultivos, variedades y condiciones edáficas y climáticas. Aún en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta, para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillum-planta. No obstante,

en

mi

opinión,

la

aplicación

de Azospirillum como

bioestimulante que incrementa la producción de los cultivos deberia extenderse a todos aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos países que tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se practica

una

agricultura

con Azospirillum permitiría

reducir

moderna, las

la

elevadas

inoculación cantidades

de

fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción.

Azospirillum spp.

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MICROBIOLOGÍA DE LOS SUELOS III.

Conclusiones:  El genero Azospirillum: es una proteobactria, Gram negativa que utiliza como fuente nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, aminoácidos y nitrógeno molecular.

 Azospirillum es capas de sintetizar fitohormonas: como auxinas, citosinas, ABA. Las cuales ayudan al crecimiento y mejoramiento de la calidad de la planta.

 Esta bacteria puede crecer en la rizosfera o en el interior de las raíces.  En la rizosfera actúa como in regulador de fitopatogenos pues, inhibe el crecimiento de hongos fitopatogenos y bacterias.

 Mejora el crecimiento de las plantas, pues un cultivo inoculado con Azospirillum spp tiene mejores resultados que otro fertilizado químicamente.  El genero Azospirillum esta conformado por: A. lipoferum, A.

brasilienses, A. amazonense, A. halopraederans. Estos son utilizados como importantes biofertilizantes de suelos desgastados y con baja concentración de nitrógeno. IV. 

Bibliografía: Br. Baiocchi Torres Alberto Alejandro. Br. Saavedra Barreto Ángel Pedro. Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. Y su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo del tomate (Lycopersicon esculentum Mill) en invernadero. Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo. FAcultadad de ciencias Biológicas. Esp. Microbiología y parasitología. 17 de mayo del 2011.

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Morelos,

México;

*E-mail:

[email protected].

USO

DE

Azospirillum En México como biofertilizante y potencial de nuevas especies bacterianas como biofertilizantes, agentes de biorremediación y biocontrol de fitopatógenos. XIII Congreso Nacional De Biotecnología Y Bioingeniería. DISPONIBLE EN: http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/acapulco09/TRABAJOS/simpos ios/simposio_agricola_vegetal/JESUS_CABALLERO.pdf 

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DISPONIBLE

EN

http://www.unne.edu.ar/Web/cyt/cyt2006/05-

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Esp. Microbiología y Parasitología.