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Historia Aún cuando Spirillum lipoferum fue descrito en 1925 por Beijerinck, esta bacteria estuvo olvidada por varias décadas. Son las observaciones de Peña-Cabriales y Döbereiner en 1973 (50) las que iniciarían la época moderna de esta bacteria. Estudios taxonómicos de S. lipoferum (88, 89) conducen a su reclasificación en un género nuevo, Azospirillum (166). Actualmente son reconocidas seis especies en el género Azospirillum. Las dos primeras en ser descritas fueron A. lipoferum y A. brasilense (166), siendo éstas las mas ampliamente estudiadas. Posteriormente fueron descritas las especies A. amazonense (105), A. halopraeferans (141), A. irakense (85) y A. largomobile (26) siendo el nombre de esta especie corregido a A. largimobile (158). Pocos años antes ésta especie fue considerada como un sinónimo de la especie A. lipoferum (57). Recientemente, en honor de quien impulsara los estudios con este género bacteriano y descubriera otros diazótrofos, se ha propuesto la especie candidata A. doebereinerae (70). Pocos años después del redescubrimiento de Azospirillum y hasta alrededor de 1993, este género fue el más estudiado entre las bacterias asociadas a plantas. La capacidad deAzospirillum para estimular el crecimiento de las plantas y de aumentar el rendimiento de los cereales promovió numerosos estudios sobre la ecología, fisiología y genética de esta bacteria. En la actualidad su uso comercial comienza a extenderse en diferentes países, incluído México. Aislamiento El aislamiento de las bacterias del género Azospirillum resulta en lo general muy simple, ya sea a partir de suelo rizosférico o de la superficie de las raíces (rizoplano) de numerosas plantas hospederas. También se le aisla del interior de las raíces o tallos de algunas plantas. El medio de cultivo usado por excelencia para el enriquecimiento de las especies de Azospirillum ha sido el NFb semigelificado "libre" de nitrógeno y con malato como fuente de carbono (52). No obstante, en este medio de cultivo son aisladas predominantemente cepas de las especies A. lipoferum y A. brasilense. El medio NFb con algunas modificaciones en su composición y pH permiten el aislamiento predominante de otras especies de Azospirillum (51). Estos medios son usados frecuentemente para evaluar la actividad reductora de acetileno, como indicativo de la fijación de nitrógeno. Tubos en los cuales se observa el crecimiento bacteriano en forma de sombrilla, la cual se transforma en una película blanca y densa abajo de la superficie del medio de cultivo, y vire del indicador azúl de bromotimol son considerados tentativamente como positivos para el aislamiento en cultivo puro de la bacteria. El cultivo puro se logra en diferentes medios de laboratorio (126), siendo muy comunmente usado un medio adicionado del colorante rojo Congo (146), en el cual A. lipoferum y A. brasilense toman un color rojo escarlata que permite la diferenciación de otros géneros bacterianos. Aun cuando el medio BLCR fue diseñado para mejorar el aislamiento de cepas de Azospirillum brasilense (20), su uso no fue aceptado por haberse demostrado que no era apropiado para el estudio de poblaciones naturales de esta bacteria (73). Posteriormente se observó que la concentración de estreptomicina usada (200 mg/litro) en el medio BLRC era inhibitoria del crecimiento de un gran número de cepas (103).

Además de los medios y métodos descritos, tambien existen reportados algunos medios de cultivo y métodos para el crecimiento de Azospirillum en cultivo puro y en asociación con plantas, así como para su conservación (2, 126). Identificación El género Azospirillum pertenece a la subclase alfa de las proteobacterias (181), siendo A. lipoferum la especie tipo (166). Características útiles en la identificación rutinaria son la forma vibroide, el pleomorfismo y su movilidad en espiral (51). Las células contienen cantidades elevadas de poli-ß-hidroxibutirato (PHB), hasta 50% del peso seco celular (124), observándose al microscopio las células jóvenes con abundantes granulos refringentes. En cultivos semigelificados y gelificados con mas de 24 h de incubación se presentan frecuentemente células refringentes con forma ovoide y de paredes gruesas similares a quistes (96). Una de las características fenotípicas más ampliamente usada como criterio para el reconocimiento tentativo del género Azospirillum es el color rojo escarlata que toman las colonias (Fig. 1) al crecer en un medio adicionado del colorante rojo Congo (146). No obstante, en este medio pueden hallarse colonias mutantes de Azospirillum de color blanco debido a la incapacidad de producir polisacáridos no identificados (25). Diversas pruebas bioquímicas y fisiológicas son utilizadas rutinariamente para el reconocimiento de las especies de Azospirillum. En la Tabla 1 se presentan algunas características fenotípicas que contribuyen a diferenciar las especies de Azospirillum. Adicionalmente, la diferenciación de especies del género Azospirillum se logra evaluando la capacidad de usar diversos aminoácidos y su efecto sobre la fijación de nitrógeno (68), recomendándose el uso de la histidina para la caracterización y aislamiento selectivo de la especie A. lipoferum. Los patrones de proteínas de membrana (8, 48), así como los patrones de proteínas celulares (141), determinados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsulfato (SDSPAGE), permiten una clara diferenciación de las especies A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense y A. halopraeferens. En forma complementaria para la identificación fenotípica de las especies de Azospirillum pueden ser usadas diversas técnicas inmunológicas. La aglutinación en tubo, técnicas de precipitación en capilar, inmunoelectroforesis (44, 46), inmunofluoresencia e inmunodifusión (44, 93) fueron métodos usados exitosamente en la identificación y numeración de Azospirillum spp. El uso de la técnica de ELISA (Enzyme-Linked Immnunosorbent Assay) permite la identificación y numeración específica de cepas de Azospirillum, como fue demostrado con la cepa Cd de A. brasilense (99) permitiendo evaluar la capacidad de colonización de esta cepa en plantas inoculadas. La identificación genotípica específica al nivel de género y especies de Azospirillum se logra en forma reproducible mediante el uso de sondas basadas en secuencias de los genes 23S rRNA (86). Con los oligonucléotidos reportados se logra tanto la identificación específica del género Azospirillum como de las especies A. lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, A. halopraeferens y A. irakense, mediante experimentos tipo "dot blot". Estas sondas también pueden ser usadas para la detección in situ de las especies de Azospirillum. Alternativamente, la identificación genotípica rutinaria de las especies de Azospirillum, así como su detección, se logra fácilmente y en forma reproducible amplificando mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los genes 16S rDNA [p. ej. usando las secuencias de

los oligonucléotidos 27f (5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG) y 1495r (5'CTACGGCTACCTTGTTACGA)] y cortando los productos amplificados con la enzima de restricción AluI (63, 66). Con esta estrategia se obtienen fragmentos de tamaños específicos para cada especie de Azospirillum, distinguibles fácilmente en geles de agarosa Ambiente rizosférico Aparentemente, una bacteria del suelo deberá sobrevivir a las múltiples interacciones que se presentan con la compleja comunidad microbiana que habita el mismo microambiente, antes de que ocurra cualquier interacción con las raíces de la planta. En el inicio de una interacción con las raíces de la planta hospedera, el microorganismo específico deberá llegar a la superficie de las raíces, adherirse y multiplicarse para colonizarla. Si la bacteria tiene la capacidad de invadir los tejidos internos, se diseminará en el interior de la raíz e incluso en otros órganos de la planta. La adaptación de Azospirillum al futuro ambiente rizosférico probablemente se inicia con la germinación de la semilla, la cual exuda infinidad de compuestos orgánicos que forman parte fundamental de la espermosfera. Posteriormente, la exudación de compuestos será a través de las raíces durante el desarrollo de la planta (43). Aun cuando las especies de Azospirillum difieren en su capacidad para utilizar diferentes compuestos como fuentes de carbono y nitrógeno, estas bacterias usan para su crecimiento unos pocos mono y disacáridos asi como alcoholes polihidroxilados, y principalmente diversos ácidos orgánicos tales como málico y succínico y algunos aminoácidos (68, 166). Para el uso de diferentes fuentes de carbono, tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen todas las enzimas de la via de Embden-Meyerhof-Parnas y de la vía de Entner-Doudoroff (108, 177), así como todas las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (108). Tanto A. lipoferum como A. brasilense tienen la capacidad de crecer autotróficamente con H2 y CO2, proceso en el que participa la ribulosa-1,5-difosfato carboxilasa (106, 168). A pesar de que el uso de ácido poligalacturónico y pectina fue reportado en A. brasilense Sp7 (170, 171) y que se detectó actividad pectato liasa (167), existen evidencias contradictorias en cuanto al uso de polisacáridos por esta especie. A. brasilense puede metabolizar varios mono y disacáridos constituyentes de la pared celular de las raíces de Pennisetum americanum (118). Sin embargo, estos autores no pudieron confirmar que la cepa Sp7 fuera capaz de usar ácidos poligalacturónicos, o pectina, ni otros polisacáridos tales como xilanos, polipectatos y celulosa. La riqueza en compuestos orgánicos en la espermosfera/rizosfera conduce a intensas actividades e interacciones microbianas. Algunos estudios indican que la quimiotaxis a los exudados de raíz es uno de los factores que influyen en la llegada de los microorganismos a la rizosfera (154). Tanto en A. lipoferum como en A. brasilense se demostró una fuerte actividad quimiotáctica hacia diversos azúcares, ácidos orgánicos y aminoácidos (13, 15, 71, 140), así como hacia compuestos aromáticos (102) y exudados radicales (5,61, 71). La respuesta quimiotáctica a diferentes fuentes de carbono es variable dependiendo de la especie de Azospirillum e incluso es cepa-específica (140). También una respuesta hacia el oxígeno (aerotaxia) fue observada en A. brasilense (14, 15). Zonas de baja concentración en oxígeno fueron las preferidas por las células bacterianas para su crecimiento y multiplicación, siendo repelidas por altas concentraciones de oxígeno y condiciones anaeróbicas (14, 139). La aerotaxia parece ser especialmente importante bajo condiciones de fijación de nitrógeno, permitiéndole a las células de Azospirillum alcanzar concentraciones de oxígeno lo suficientemente bajas para que se exprese la actividad nitrogenasa. Se sugiere que tanto la respuesta quimio y aerotáctica son características que contribuyen en el proceso de colonización de las raíces de las plantas, ya que el consumo de oxígeno durante el crecimiento activo de las raíces enriquece el ambiente con sustratos orgánicos y genera gradientes de oxígeno al consumirse éste durante la respiración (112). No obstante, la

colonización de la rizosfera y la superficie o el interior de las raíces será el resultado del enriquecimiento selectivo de los microorganismos mejor adaptados a estos ambientes. Por ejemplo, la capacidad para producir bacteriocinas por algunas cepas de A. brasilense y A. lipoferum (129, 130, 157, 165) podría representar ventajas competitivas sobre las cepas de estas especies o íntimamente relacionadas que sean sensibles a estas biomoléculas. Además, la capacidad de producir sideróforos (agentes quelantes del hierro) por algunas cepas de A. brasilense (9, 155, 165) (Fig. 3) pudiera ser de gran importancia durante la colonización del ambiente rizosférico y de la superficie de las raíces al ejercer efectos antagónicos contra otros miembros de la comunidad microbiana, incluyendo a microorganismos deletéreos o patógenos de las plantas (Fig. 4). Es concebible que en el ambiente rizosférico las especies de Azospirillum puedan ser antagonizadas. Alrededor de la tercera parte de más de 400 actinomicetos aislados de la rizosfera del centeno fueron reportadas como antagonistas de Azospirillum spp. y A. lipoferum (92). Esta actividad antagonista correlaciona con la alta sensibilidad de A. brasilense a los antibióticos estreptomicina, tetraciclina y cloranfenicol (103) producidos por actinomicetos del suelo, en comparación a la elevada resistencia a los antibióticos del tipo β-lactámicos producidos por hongos. La expresión constitutiva de la actividad β-lactamasa fue observada entre numerosas cepas de A. brasilense (103). Estos resultados sugieren que el antagonismo causado por hongos contra Azospirillum es limitado. También es concebible que se presenten efectos sinérgicos entre Azospirillum y otros miembros de la comunidad rizosférica. Por ejemplo, el filtrado de un cultivo de Phialophora radicicola, hongo usado como agente de biocontrol, promueve el crecimiento de A. lipoferum y A. brasilense (58). De manera similar, la interacción entre A. brasilense y Azotobacter chrococcum o Streptomyces mutabilisconduce a incrementos de sus respectivas poblaciones en la rizosfera de trigo (53). Diversas condiciones tales como el envejecimiento celular y la presencia de metales pesados provocan que las células vibroides de Azospirillum cambien su morfología y tomen la forma de "quistes" (conocidos como formas C), conduciendo a la agregación celular y formando grumos visibles de gran tamaño (19). Aparentemente, residuos de arabinosa presentes en el exopolisacárido y en el polisacárido capsular estan involucrados en la agregación de A. brasilense (31). La agregación y la formación de quistes mejora la sobreviviencia de Azospirillum, situación en la que la acumulación de poli-β-hidroxibutirato (PHB) parece desempeñar una función importante al servir como almacen de carbono y energía (125). Además, diversas funciones fisiológicas son atribuidas al PHB, destacándose la mayor resistencia a la desecación (96, 147, 148), a la luz ultravioleta y al choque osmótico (164). Se ha sugerido que la formación de quistes pudiera desempeñar una función importante en la sobreviviencia de Azospirillum en el ambiente rizosférico, e.g., cuando los nutrientes son limitados, previo a la asociación con las raíces de la planta (164, 127). Recientemente, ha sido publicada una amplia revisión sobre las características de A. brasilense en relación con la agregación celular (29). Interacción con la planta Probablemente, una vez que las células de Azospirillum se han adaptado a las condiciones del ambiente rizosférico y han logrado llegar a la superficie de las raíces, debido a sus características quimio y aerotácticas, se iniciará el establecimiento de la asociación. Diferentes estudios han mostrado que A. brasilense tiene la capacidad para adherirse a las raíces de plantas gramíneas como el mijo (Pennsisetum purpureum) y Digitaria decumbens (171), trigo (77), maíz (61), así como a las raíces de plantas de otras familias que incluyen al algodón y tomate ( 98), e incluso a superficies inhertes como poliestireno y arena (22, 23, 98). La capacidad de Azospirillum para adherirse a las raíces, al menos a las de mijo, es significativamente mayor que la mostrada por

otras bacterias de la comunidad rizosférica como Rhizobium, Azotobacter, Klebsiella o Pseudomonas, e incluso que E. coli (171). La asociación de Azospirillum con las raíces de las plantas se desarrolla en dos etapas completamente independientes (111). La primera consiste en una adsorción rápida, débil y reversible, la cual es dependiente de proteínas de la superficie bacteriana del tipo de las adhesinas en conjunto con la participación del flagelo polar (40, 111). La segunda fase consiste de un anclaje lento pero firme e irreversible que alcanza su máximo nivel 16 h después de la inoculación, el cual parece ser dependiente de un polisacárido extracelular de Azospirillum (111). Los resultados de un estudio reciente sugieren la posibilidad de que una proteína de la membrana externa deAzospirillum participe en el proceso de adherencia a las raíces de las plantas (31). El proceso de adherencia de Azospirillum a las raíces de las plantas ha sido revisado recientemente (29). En diversos casos se ha reportado la aparición de material fibrilar que contribuye al anclaje de Azospirillum a las raíces de diversas plantas (98, 171), describiéndose como esencial para el anclaje a las partículas de arena (23). Aún en la actualidad, la naturaleza del material fibrilar no ha sido elucidada (47, 161), aunque parece ser de origne bacteriano. Recientemente se ha publicado una revisión sobre la capacidad de Azospirillum para adherirse a superficies abióticas del suelo (18). La inoculación de diversas plantas con Azospirillum ha mostrado que los principales sitios de colonización son las areas de elongación celular y las bases de los pelos radicales (98, 82). Sólo algunas células de Azospirillum llegan a adherirse a la cofia o a los pelos radicales (82). Sin embargo, fue observada la presencia de Azospirillum dentro del mucigel que se acumula en la cofia (171). La inoculación de raíces de trigo con una cepa de Azospirillum que expresa constitutivamente el gen reportero gusA mostró que en los primeros días de la asociación las células bacterianas colonizan específicamente los sitios de emergencia de las raíces laterales y las regiones de los pelos radicales, tanto de la raíz primaria como de las raíces secundarias y posteriormente la superficie de la raíz (172). En plantas de trigo fue observado que la inoculación de Azospirillum induce cambios en la morfología de los pelos radicales, siendo éstos cambios significativamente mayores que los causados por Rhizobium leguminosarum o Azotobacter chrococcum, los cuales son mínimos (77, 80). Además, fue observado que la inoculación con 105 a 106 células de Azospirillum causa tanto la elongación como el aumento de la superficie total de la raíz (Fig. 5), en tanto que la inoculación de 108 a 109 células causan la inhibición del desarrollo de ésta (82). Aparentemente, el incremento del tamaño del sistema radical se debe, al menos parcialmente, al aumento de la división celular y al intenso crecimiento de la zona de elongación de las raíces (97). Es de interés señalar que los sitios que coloniza Azospirillum lipoferum son diferentes, dependiendo de la variedad de la planta, al menos en el caso del arroz (116). La capacidad de Azospirillum para colonizar las raíces de las plantas es variable dependiendo de la cepa. Con el uso de microscopia confocal de rayos lasser y sondas de oligonucleótidos fluorescentes (6) y con el uso de anticuerpos monoclonales cepa-específicos (153) ha sido mostrado que algunas cepas de A. brasilense, incluyendo a la cepa tipo Sp7, se encuentran restringidas al ambiente rizosférico y son capaces de formar colonias solamente en la superficie de la raíz de plántulas de trigo, en tanto que otras cepas son encontradas frecuentemente en altas densidades en los espacios intercelulares de la raíz, así como en el interior de los pelos radicales. Resultados similares, usando otras metodologias, habian sido reportados con algunas de las mismas cepas de Azospirillum inoculadas en trigo creciendas en condiciones de campo (11). Experimentos de inoculación

Considerando la capacidad de Azospirillum para asociarse con plantas de interés agrícola, así como su capacidad para fijar N 2 en medios de cultivo, se diseñaron numerosos experimentos para evaluar el efecto de la inoculación sobre el crecimiento de las plantas. No existen reportes que indiquen efectos patogénicos en las plantas causadas por la inoculación de Azospirillum. El único reporte existente en esta dirección indica que ninguna de las especies de Azospirillum causa sintomas visibles de enfermedad sobre la raíz o las hojas de plantas de trigo, algodón o tomate (17). Con la inoculación de Azospirillum se observó frecuentemente un mayor desarrollo del sistema radical (Fig. 6) (123, 133,135, 174) el cual se traduce en mayor superficie de absorción de nutrientes, así como en mayor desarrollo de la parte aérea de las plantas ( Figs. 7 y 8) (7, 117, 123, 133, 135,150). También fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno, fósforo, potasio y otros minerales en las plantas inoculadas (32, 101, 117, 133, 149, 160). Principalmente con A. brasilense y A. lipoferum se llevaron a cabo gran cantidad de experimentos en muchos países para evaluar su efecto sobre el rendimiento de los cultivos (3, 10, 11, 27, 32, 37, 56, 60, 80, 83, 110, 114, 119, 123, 134, 145, 149, 159, 176). Una amplia revisión sobre los resultados de los experimentos desarrollados entre los años 1974-1994 fue realizada por Okon y Labandera (128). Esta evaluación reveló que el éxito de la inoculación fue en el rango del 60 al 70% de los experimentos realizados en suelos y regiones climáticas diferentes (Fig. 9), con incrementos significativos, generalmente en el rango de 5 a 30%, en el rendimiento de los cultivos (Fig. 10). Sin embargo, cuando se evaluó el efecto de la inoculación en conjunto con la aplicación de niveles intermedios de fertilización con nitrógeno, fósforo y potasio, el éxito de los experimentos se incrementa hasta 90% (128). Frecuentemente se observó que la inoculación de los cultivos con Azospirillum permite reducir en 40-50% el nivel de los fertilizantes sin que exista disminución en el rendimiento de la cosecha. Recientemente fueron observados incrementos en la biomasa de pastizales naturales inoculados con A. brasilense aun bajo condiciones de crecimiento subóptimas (75). Mecanismos de estimulación del crecimiento de las plantas La capacidad de Azospirillum para estimular el crecimiento de las plantas ha sido demostrado en decenas de experimentos, tanto de campo como de invernadero. Varios son los mecanismos que se han sugerido como responsables del efecto estimulatorio observado en las plantas inoculadas. En numerosos estudios de inoculación con Azospirillum, además del mejor crecimiento de las plantas, fueron observados incrementos en el contenido de nitrógeno total de las plantas inoculadas respecto a las testigo (10, 37, 81, 80, 117, 122, 133, 152, 160) y en la incorporación de 15N (90, 142, 143). No obstante, en la mayoría de estos estudios no fueron observadas diferencias significativas en el porciento de nitrógeno o en el contenido de proteína entre plantas inoculadas y no inoculadas, razón que contribuyó a desechar la idea de que la fijación biológica de nitrógeno fuera el mecanismo responsable de los efectos benéficos observados. Debido a que los efectos de la inoculación conAzospirillum sobre el crecimiento de la raíz y la parte aérea de las plantas son similares a los que se presentan cuando las plantas son tratadas con fitohormonas (144, 167) fue sugerido que estas sustancias podrían ser responsables del mejor crecimiento de las plantas, así como de los incrementos observados en el contenido de minerales y en el rendimiento de los cultivos (10, 27, 32, 80, 114, 119, 122, 135, 160) Recientemente ha sido revisada la función de las fitohormonas en las asociaciones plantamicroorganismo (72). Azospirillum tiene la capacidad de producir auxinas, citocininas y giberelinas en medios de cultivo (28, 55, 74, 109, 132, 144, 167). No obstante, el mecanismo analizado con mayor amplitud ha sido la producción de auxinas, especialmente la del ácido indol acético (AIA)

(16, 67, 69, 78, 115, 182). El AIA producido por las bacterias puede modificar el contenido de fitohormonas de las plantas conduciendo a la estimulación del crecimiento de las mismas (12). En cultivos de Azospirillum, además de AIA se han encontrado otros compuestos indólicos y metabolitos relacionados tales como el ácido indol pirúvico (38), indol láctico (39, 42), indol acetamida (12, 39, 69), indol acetaldehído (38), indol etanol e indol metanol (42), triptamina, antranilato y otros compuestos indólicos no identificados (69). En diferentes estudios se ha tratado de obtener mutantes incapaces de sintetizar AIA, sin embargo, en el mejor de los casos solamente se logró obtener mutantes hipoproductoras de este compuesto. Esto sugirió la existencia de más de una vía biosintética del AIA en Azospirillum (1, 69). Actualmente se conoce que Azospirillum puede sintetizar AIA a través de tres vías. En tanto que las vías del ácido indol pirúvico (38) y la del indol acetamida (12) son dependientes del triptofano, la tercera es una vía independiente de este aminoácido (137), desconociéndose el precursor del AIA. Resultados recientes permiten sugerir que la indol piruvato descarboxilasa es una enzima común tanto a la vía del indol pirúvico como a la vía no dependiente de triptofano (95). A pesar de que existe la tendencia de atribuir a las fitohormonas, especialmente al AIA, los efectos benéficos de la inoculación con Azospirillum, también existe la propuesta de que tales beneficios son el resultado de diversos mecanismos (21, 101, 133, 135, 174). Se han sugerido otros mecanismos como responsables de los efectos estimulatorios causados por la inoculación de Azospirillum (183) y algunos de éstos han sido revisados por Bashan y Holguin (19). Aplicación Algunas compañias en diferentes países han registrado inoculantes de Azospirillum para maíz y otros cultivos (75, 128). Burdman y col. (30) refieren que en Sudafrica se lleva a cabo la producción de inoculantes a base de Azospirillum para 150,000 hectáreas de maíz y 12,000 de trigo. Algunas características de la producción de inoculantes a base deAzospirillum han sido discutidas (54, 76, 128). Aun cuando el uso de Azospirillum como bioestimulante del crecimiento de las plantas no se ha generalizado mundialmente, en México la aplicación de ésta bacteria en diferentes cultivos ha revasado con mucho lo hecho en otros países. En el ciclo agrícola primavera-verano (PV) del año 1999 la Secretaría de Agricultura, a través de su Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Fundación Mexicana para la Investigación Agropecuaria y Forestal, A.C., en colaboración con el Centro de Investigación sobre Fijación de Nitrógeno-UNAM, llevó a cabo la inoculación de alrededor de 450,000 hectáreas de maíz y 150,000 hectáreas de sorgo, cebada y trigo, empleando cepas de Azospirillum seleccionadas por su capacidad para promover el crecimiento de las plantas e incrementar el rendimiento de los cultivos. La evaluación del rendimiento de grano en alrededor de 675 hectáreas de los diversos cultivos, que comprendieron cerca de 170 sitios de México con características edáficas en regiones climáticas diferentes mostró el éxito de la inoculación en el rango de 62 a 95% de los casos analizados, con incrementos que fluctuaron en el rango de 6 a 98%. En laTabla 2 se presenta un resumen de los resultados obtenidos en el ciclo agrícola PV-1999. El incremento promedio en la producción de los cultivos de maíz, trigo, cebada y sorgo bajo las diferentes condiciones evaluadas fue del 26%. Los resultados fueron dependientes de la variedad y cultivo, tipo de suelo, uso y nivel de fertilizantes (35). La mejor respuesta a la inoculación se presentó en suelos de tipo ligero (arenosos), con niveles intermedios de fertilización en el rango de 45-90 Kg N/ha, y con las

variedades "criollas" de maíz. Considerando la cantidad de variedades, cultivos, suelos y condiciones climáticas evaluadas, los resultados de la inoculación con Azospirillum reflejan claramente la capacidad de la bacteria para promover el desarrollo de las plantas y el impacto positivo sobre el rendimiento de los cultivos de grano. El programa de "Biofertilización" se continuó durante el ciclo PV-2000, inoculándose alrededor de un millón y medio de hectáreas. El temor o las precauciones expresadas en algunas revisiones sobre el tema, por cierto muy escasas, para extender el uso de Azospirillum a niveles comerciales debido a la "inconsistencia de la inoculación" tienen poco valor ante los resultados de producción obtenidos en decenas de experimentos, así como los obtenidos en miles de hectáreas con diferentes cultivos, variedades y condiciones edáficas y climáticas. Aún en la actualidad hacen falta muchos estudios de investigación básica, tanto sobre la bacteria como en su interacción con la planta, para un mejor entendimiento de la asociación Azospirillumplanta. No obstante, en mi opinión, la aplicación de Azospirillum como bioestimulante que incrementa la producción de los cultivos deberia extenderse a todos aquéllos lugares donde la aplicación de fertilizantes es nula o escasa, como lamentablemente ocurre en no pocos países que tienen una agricultura subdesarrollada. En las regiones donde se practica una agricultura moderna, la inoculación con Azospirillum permitiría reducir las elevadas cantidades de fertilizantes que generalmente se aplican y con ello disminuir tanto el costo de producción como los problemas derivados de su uso, principalmente la contaminación, sin detrimento de la producción.

MATERIALES

MEDIO NFb semigelificado "libre" de nitrógeno y con malato como fuente de carbono Rojo Congo

Aislamiento e identificación de cepas de Azospirillum sp. en pasto guinea (Panicum maximum Jacq.) del Valle del Cesar Isolation and identification of Azospirillum sp. in Guinea grass (Panicum maximum Jacq.) of the Valle del Cesar Diana M. Cárdenas1, María F. Garrido2, Ruth R. Bonilla3 y Vera L. Baldani4 1

Departamento de Biología, Universidad Francisco de Paula Santander.

Avenida Gran Colombia No. 12E-96 Barrio Colsag. Cúcuta, Colombia. E-mail: [email protected] 2

3

Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria-CORPOICA. Bogotá, Colombia

Laboratorio de Microbiología de Suelos Corporación Colombiana de Investigación AgropecuariaCORPOICA. Bogotá, Colombia

RESUMEN Se evaluó el efecto de factores ambientales del Valle del Cesar y el manejo agronómico del pasto guinea (Panicum maximum Jacq.), sobre la población bacteriana del género Azospirillum en medios de cultivo semisólidos NFb y LGI, para lo cual se utilizó un diseño experimental en parcelas divididas con un arreglo factorial de 2 (épocas climáticas: lluvia y sequía) x 2 (manejos agronómicos: agroecólogico y extractivo) x 3 (muestras analizadas: suelo rizosférico, raíces y hojas). Los resultados no revelaron diferencias estadísticas significativas, lo que indica que esta bacteria puede mantener su población en condiciones de estrés por diferentes mecanismos fisiológicos. A partir de estas muestras se obtuvieron 16 aislamientos pertenecientes al género Azospirillum, a los cuales se les evaluó su actividad de reducción de acetileno como indicador de la fijación biológica de nitrógeno y su capacidad en la producción de compuestos indólicos como promotores del crecimiento vegetal. Se seleccionaron las cepas SRGM2, SRGM3 y SRGM4 obtenidas de muestras de suelo rizosférico de pasto guinea de la Estación Experimental Motilonia de Corpoica, municipio Agustín Codazzi, departamento del Cesar. Estos aislamientos se caracterizaron molecularmente por el gen 16S rRNA y según el análisis BLAST en la base de datos del GenBank y presentaron 93% de similitud con A. lipoferum (SRGM2 y SRGM3) y 94% con A. brasilense (SRGM4). Palabras clave: Crecimiento, fijación del nitrógeno, Azospirillum sp.

ABSTRACT The effect of environmental factors of the Valle del Cesar and the agronomic management of Guinea grass (Panicum maximum Jacq.), on the bacterial population of the Azospirillum genus in semisolid NFb and LGI culture media was evaluated, for which an experimental design was used in divided plots with a 2 (climatic seasons: rainy and dry) x 2 (agronomic managements: agroecological and extractive) x 3 (analyzed samples: rhizospheric soil, roots and leaves) factorial arrangement. The results did not reveal significant statistical differences, which indicates that this bacterium can maintain its population under stress conditions by different physiological mechanisms. From these samples 16 isolations were obtained belonging to the Azospirillum genus in which their acetylene-reduction activity was evaluated as indicator of biological nitrogen fixation and their capacity in the production of indolic compounds as plant growth promoters. The strains SRGM2, SRGM3 and SRGM4, obtained from rhizospheric soil samples of Guinea grass of the Experimental Station Motilonia of Corpoica, Agustín Codazzi municipality, Cesar department, were selected. These isolations were molecularly characterized by the gen 16S rRNA and according to the BLAST analysis in the GenBank database and showed 93% similarity with A. lipoferum (SRGM2 and SRGM3) and 94% with A. brasilense (SRGM4). Key words: Growth, nitrogen fixation, Azospirillum sp.

INTRODUCCIÓN El Cesar es uno de los principales departamentos ganaderos de la región Caribe colombiana y constituye una importante región productora de leche (Gamarra, 2005). Sus suelos se derivan de materiales sedimentarios bien drenados y el pH es cercano a la neutralidad; tienen bajos niveles de materia orgánica, altos contenidos de Ca y bajos niveles de Mg, K y elementos menores; su textura varía de franco a franco-arcillosa. En ellos se cultivan especies forrajeras, entre las cuales el pasto guinea (Panicum maximum Jacq.) alcanza una alta productividad en materia seca, de alrededor de 12 a 18 t/ha (Cuesta-Muñoz et al., 2005). Sin embargo, estos suelos presentan deterioro físico, químico y biológico, lo que afecta severamente su capacidad productiva y compromete la viabilidad económica de los sistemas ganaderos. Lo anterior es ocasionado, entre otros factores, por el uso indiscriminado de fertilizantes químicos principalmente como fuente de N, el cual desempeña un papel importante (junto con el P y el K) para el crecimiento de las plantas (Osorio, 2007; Cordero et al., 2008). La fjación biológica de nitrógeno realizada únicamente por bacterias es una alternativa viable, ambiental y económicamente, para suplir la inclusión de fuentes de N de origen sintético, ya que el nitrógeno molecular (N 2) es la única reserva inagotable en la biosfera. En la rizosfera de los pastos tropicales y subtropicales están presentes microorganismos fijadores de N2; diversos estudios han demostrado que existe una alta especificidad de los aislamientos obtenidos de diferentes raíces de gramíneas con respecto a la especie de diazotrófico encontrado, es decir que los exudados radicales, el pH del suelo y otras características de la especie vegetal y del suelo podrían influir en la presencia de algunos géneros fijadores biológicos (Reis Junior et al., 2004; Radwan et al., 2005). Estudios de más de 20 años indican que las bacterias del género Azospirillum tienen una especial afinidad por las raíces de las gramíneas (Brasil et al., 2005), como es el caso de los pastos que responden con incrementos en su crecimiento y rendimiento cuando son inoculados con Azospirillum spp. La secreción de sustancias promotoras del crecimiento de las plantas (tales como auxinas, giberelinas y citoquininas) por Azospirillum, parece estar involucrada parcialmente en este efecto (Reis Junior et al., 2004; Radwan et al., 2005; Kuss et al., 2007). Teniendo en cuenta que en Colombia no existe hasta el momento ningún registro de la evaluación de poblaciones de esta bacteria asociadas a las pasturas, este trabajo tuvo como objetivo iniciar el estudio de cepas nativas de Azospirillum en el pasto guinea en el Valle del Cesar, como el primer paso hacia la búsqueda de aislamientos con potencial biofertilizante. MATERIALES Y MÉTODOS Determinación del efecto de las épocas de lluvia y sequía sobre las poblaciones de Azospirillum en el pasto guinea. Se tomaron muestras del suelo rizosférico y de la planta completa de guinea en la época de lluvia en septiembre de 2006 (158,6 mm de precipitación y 28,1ºC de temperatura) y en la seca en febrero de 2007 (0 mm de precipitación y 31ºC de temperatura). Los dos sitios seleccionados presentan condiciones contrastantes respecto al manejo del suelo. En la E.E. Motilonia se desarrollan prácticas agronómicas como la incorporación de materia orgánica al suelo, la planificación de la siembra y el pastoreo racional; en la finca Fernambuco se practica el sobrepastoreo y el laboreo intensivo del suelo.

El suelo rizosférico se obtuvo al removerlo de las raíces, a partir del cual se realizaron diluciones hasta 10-6 en solución salina al 0,85% de NaCl. Se inocularon 0,1 mL de cada dilución en tres viales de medio semisólido NFb y LGI, para el recuento de Azospirillum spp. y Azospirillum amazonense, respectivamente (Döbereiner et al., 1995). Las raíces del pasto se lavaron y se cortaron en fragmentos de 1 cm y se desinfectaron con alcohol de 70º durante 1 min; después se sumergieron en hipoclorito de sodio al 2% por 2 min y se realizaron dos enjuagues sucesivos en agua estéril. Se pesó 1 g de estas raíces y se maceraron en 9 mL de solución salina estéril (0,85% de NaCl). Las hojas y los tallos se lavaron con agua destilada y se secaron. Se pesó 1 g de este material vegetal cortado en fragmentos de 2 cm, se desinfectaron con alcohol de 70º y se maceraron en 9 mL de solución salina estéril (0,85% de NaCl). Se realizaron diluciones seriadas hasta 10-6 a partir de estos macerados y se inocularon de igual forma que la muestra de suelo rizosférico. Los viales inoculados se incubaron durante 5 días a 32ºC hasta la formación de una película subsuperficial como indicador del crecimiento positivo. Se cuantificó la población mediante el método del Número Más Probable para tres tubos, aplicando la tabla de McCrady (Döbereiner et al., 1995). Se realizaron tres repeticiones y se hizo un análisis de varianza según el diseño experimental en parcelas divididas con un arreglo factorial de 2 (épocas climáticas) x 2 (manejos agronómicos) x 3 (muestras analizadas); se empleó la prueba de comparación de Duncan al 5% de probabilidad, utilizando el programa estadístico SAS versión 9.1.3. Aislamiento e identificación fenotípica de Azospirillum spp. Se seleccionaron los viales de las diluciones más altas con crecimiento positivo y se replicaron en un nuevo medio semisólido. A partir de esta película se hizo el aislamiento en placas de agar Rojo Congo para seleccionar colonias rojo escarlata (Rodríguez-Cáceres, 1982) y en agar Batata para seleccionar colonias rosadas, pequeñas y estructuradas, después de una semana de incubación a 32°C (Döbereiner et al., 1995). Las células bacterianas se observaron en microscopio con un aumento de 1000x y se realizó un frotis en agua destilada para describir la forma y el movimiento de las células. Las características de movilidad en espiral, crecimiento en agar Batata y Rojo Congo, se compararon con las de las cepas de referencia Azospirillum brasilense (Sp7) y Azospirillum lipoferum (Y2). Sus semejanzas se estimaron por el coeficiente de JACCARD y se agruparon por el método del análisis entre grupos para realizar un dendrograma, utilizando el programa SPSS 10.0 para Windows. Selección de las cepas de Azospirillum spp. con potencial biofertilizante. Los aislamientos presuntivos para el género Azospirillum se evaluaron según la actividad de la enzima nitrogenasa y la producción de sustancias indólicas promotoras del crecimiento vegetal. Las cepas se replicaron en agar Rojo Congo y se obtuvieron suspensiones celulares ajustadas a una concentración celular de 1*10 7 UFC/mL. Se inocularon 30 mL de caldo DYGS al 2% y se llevó a incubación durante 48 horas a 32ºC y 120 rpm. La biomasa obtenida se centrifugó a 8 000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó y las células fueron suspendidas en 30 mL de buffer fosfato estéril 0,06 M y pH 7.0. De esta suspensión celular se tomaron 100 mL y se inocularon en 50 mL de caldo NFb sin azul de Bromotimol y solución de vitaminas, con una concentración de 200 mM de triptófano como precursor del ácido indolacético y 0,2 g/L de NH 4Cl como fuente de N. Se incubó en oscuridad por 48 h, 120 rpm y 32ºC (Radwan et al., 2004). Se centrifugaron 10 mL del cultivo a 8 000 rpm por 10 minutos y se tomaron 2 mL del sobrenadante, al cual se le adicionaron 8 mL de reactivo de Salkowsky. Se realizó la lectura de la absorbancia de las muestras a 535 nm en espectrofotómetro Spectronic 601 Milton Roy. La concentración de compuestos indólicos se calculó utilizando la ecuación Y=0,0033X-0,0311 (R 2=0,9855) donde,

Y=Absorbancia de la muestra a 535 nm y X=µM de ácido indolacético (AIA). Esta ecuación se obtuvo con la regresión lineal de la curva de calibración en diferentes concentraciones de AIA (25, 50, 100,150, 200, 250 y 300 µM) con la adición del reactivo de Salkowsky (Kuss et al., 2007). Para la cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno in vitro se utilizó el método de reducción de acetileno. Los aislamientos se inocularon en frascos de 10 mL con 3 mL de medio semisólido (NFb o LGI) y se incubaron durante 24 horas a 32ºC. Posteriormente se reemplazó el tapón por uno de caucho sellándolo herméticamente, se sustituyó el 10% de su atmósfera por acetileno y se incubó durante 1 hora a 32ºC. El etileno se midió inyectando 1 mL de la atmósfera del frasco de cultivo en un cromatógrafo de gases Perkin Elmer con detector de ionización de llama y una columna Poropak N 200/300 mesh de 6 pies y 3 mm de diámetro. La actividad de reducción de acetileno para cada aislado se calculó según la altura del pico de etileno en el cromatograma, extrapolando en la ecuación Log10Y = 0,808 Log10X + 9,7 (R2 = 0,997), obtenida de la regresión lineal de una curva de calibración en concentraciones de etileno de 1, 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10 000, en las mismas condiciones del cromatógrafo (Corpoica, 2006). Se comparó la producción de compuestos indólicos y la fijación biológica de nitrógeno, y sus similitudes se estimaron según la distancia euclidiana. Después se agruparon por el método de las medianas y se representaron gráficamente en un dendrograma, utilizando el programa SPSS 10.0 para Windows. Identificación de los aislamientos de Azospirillum spp. por medio del análisis del gen 16S rrna. Las cepas seleccionadas fueron cultivadas en caldo LB por 14 h a 150 rpm y 30ºC. Se tomaron 25µL y se mantuvieron en baño termostatado durante 15 minutos. Después se centrifugó a 13 000 rpm por 1 min. El sobrenadante se descartó y el precipitado se resuspendió en 1 mL de agua Milli-Q estéril. La amplificación de la región 16S rRNA se realizó en 25µL de una mezcla de reacción de Buffer (1x), MgSO4 (1,5 mM), dNTP (0,2 mM), Primer 27F (Edwards et al., 1989) y 1492R (0,2 mM) (Weisburg et al., 1991), 0,25µL de Taq DNA Polimerasa y 1,5µL de DNA molde (muestra del aislamiento). Las condiciones del termociclador fueron: un ciclo inicial de denaturación (94ºC por 5 min), 50 ciclos de denaturación (94ºC por 30 seg), anillaje (66ºC por 30 seg) y extensión (72ºC por 1 min) y tres ciclos de extensión final (72ºC por 10 min). Los fragmentos amplificados se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% en TAE acondicionado con 0,5 µg/mL de bromuro de etidio, para visualizar las bandas resultantes. El ADN amplificado se purificó utilizando QIAquick PCP Purification Kit Protocol de QIAquick® Spin Handbook de QUIAGEN, se cuantificó en un NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 y se analizó en el programa ND-1000 V.3.3.0. a una longitud de onda de 260 nm. El producto amplificado se secuenció en un equipo ABI PRISM Genetic Analyzer, que realiza la secuenciación automática de fragmentos de DNA marcados con fluorocromos. El resultado se analizó a través de BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) en www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Efecto de la época climática y el manejo agronómico del pasto guinea en las poblaciones de Azospirillum. Según el análisis de varianza, el recuento de la población de Azospirillum no presentó diferencias significativas según la época climática y el manejo agronómico de la guinea. Sin embargo, esta población tendió a ser mayor en la época de lluvia bajo un manejo agroecológico del pasto guinea en la E.E. Motilonia con respecto a la época de sequía en las dos localidades, lo que demuestra la influencia de los factores ambientales en la población bacteriana (tabla 1).

Brasil et al. (2005) reportaron una disminución del número de bacterias diazotróficas en las raíces y en el suelo de las gramíneas Axonopus purusii, Elyonurus muticus y Brachiaria humidicola, en la época seca. Por su parte, Reis Junior et al. (2004) obtuvieron poblaciones de A. amazonense de 5,81 unidades log en raíces de Brachiaria spp. en invierno, estadísticamente diferente a 3,67 unidades log en la época seca en una zona tropical con estación seca en el invierno. Sin embargo, cuando evaluaron la población de A. amazonense en una zona tropical sin estación seca no encontraron diferencias significativas. Aunque se evidenció una disminución en la población de Azospirillum spp. en la época de sequía, estas bacterias pueden sobrevivir debido a sus características fisiológicas, ya que presentan una alta capacidad para cambiar su actividad metabólica, cuando varían las condiciones ambientales en el suelo, principalmente la disponibilidad de agua, carbono y nitrógeno y la tensión de oxígeno. De esta forma, las especies de Azospirillum pueden utilizar amonio, nitrato, nitrito, aminoácidos y nitrógeno molecular como fuente de nitrógeno (Steenhoudt y Vanderleyden, 2000) y, en condiciones desfavorables como la sequía y limitación de nutrientes, pueden experimentar ciertos cambios morfológicos y bioquímicos para formar estructuras similares a quistes que les permiten sobrevivir en condiciones físicas adversas, particularmente la desecación (Sadasivan y Neyra, citados por Joe et al., 2009). Por otro lado, cuando se compararon las poblaciones de Azospirillum spp. en el suelo rizosférico, las raíces y las hojas del pasto guinea en medio NFb y LGI, se registraron diferencias significativas (P