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1 LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA CELULA POS MORTEN (FIJACIÓN)

UNIVERSIDAD NACIONAL SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO FACULTAD DE CIENCIAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA

LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR TEMA: TECNICAS DE ESTUDIO POST-MORTEN (FIJACION) DOCENTE: M. Cs. R. GUSTAVO QUISPE MONTOYA ALUMNOS: HOLGADO CHALLCO RUTH NURIA ALEXANDRA

101095

QUISPE TTITO HESIL MANUELA

150500

SULLCA TORRES WHEN DENNIS

124889

TEJADA MOREANO ESTEFANY ISABEL

151477

SEMESTRE 2018-I CUSCO – PERÚ

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PRACTICA N° 03 TÉCNICAS DE ESTUDIO DE LA CÉLULA POST-MORTEM INTRODUCCIÓN El estudio celular ha evolucionado a lo largo del tiempo, tendiendo a mejorar y adaptarse a los diferentes tejidos que se requieren estudiar. Para poder estudiar una célula o un conjunto de ellas y poder conocer su estructura microscópica, se requieren de técnicas y artificios que puedan ayudar a su estudio de manera especial y única, no solo basta con la observación microscópica sino que las células requieren de un preparado especial para poder evitar su lisis celular que se presenta después de que esta ha abandonado su medio natural. A lo largo del tiempo se han desarrollado diversas formas de estudio celular que permiten mantener a las células lo más intactas e iguales a cómo eran antes de ser extraídas y muertas. GENERALIDADES Historia Los orígenes de la momificación en Egipto se deben a las condiciones climáticas y orográficas de sus tierras. El ambiente seco y ardiente absorbía el agua de los tejidos en los cuerpos y así se conservaban convirtiéndolos en momias naturales. En épocas posteriores, hasta el siglo XIX la conservación de piezas anatómicas incluyó diferentes agentes como alcoholes, sales de arsénico y mercurio así como otras sales metálicas En el siglo XVIII las técnicas de conservación del cuerpo humano experimentaron un importante desarrollo debido principalmente a los siguientes investigadores: -

Guillermo Hunter (1718-1783) utilizó el alcohol como medio de fijación y conservación. Pierre Dionis (1643-1718) empleó el ácido tánico con el fin de evitar el crecimiento de hongos. François Chaussier (1746-1828) se sirvió del sublimado o bicloruro de mercurio para evitar la putrefacción y favorecer la momificación. Johann Jacob Ritter (1714-1784) utilizó el arsénico. Karl Wilhelm Scheele (1742-1786) aplicó la glicerina para la conservación de cadáveres.

Con el tiempo el salto definitivo se dio con el descubrimiento del formaldehído (1859) por parte del científico alemán William Hoffman a partir de ese momento se empieza a pensar en la conservación de cadáveres y piezas anatómicas con fines didácticos y académicos En la actualidad en las salas de disección se utiliza el formol como medio químico básico de las innumerables fórmulas de conservación de cadáveres y piezas anatómicas asociado a otras sustancias como: la glicerina, alcohol, fenol, timol, arsénico, cloruro de sodio, cloruro de zinc, sulfato de potasio, hidrato de cloral, ácido acético, bicarbonato de sodio, por citar los más importantes. En 1883 J. Jacobson propuso el uso de ácido crómico para tratar las piezas que iban a ser observadas con el objeto de endurecerlas y poder observarlas por microscopía lo que favoreció a los estudios en histología, esta técnica fue considerada la primera fijación histológica (Diana Mejia, 2016). Posteriormente se desarrollaron más técnicas de fijación y procedimientos de las muestras histológicas hasta que el doctor F. Blum en 1893 mientras estudiaba las propiedades antisépticas del formaldehído se dio cuenta de la capacidad de preservación tisular del mismo. Técnica histológica Se denomina técnica histológica al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder

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observar, examinar y analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios (ARENAS, 2010). Es el conjunto de operaciones a que se somete un tejido para poder facilitar su estudio mediante el microscopio así posibilitar la observación de sus estructuras. Examen post-mortem El termino post-mortem nos hace referencia que el tejido debe ser tomado después de la muerte del organismo, este estudio exige la muerte de las células y seguir una serie de pasos que constituyen la técnica histológica universal utilizada en los laboratorios. Tiene como finalidad preparar células y tejidos procedentes de organismos cuyos procesos vitales sean detenidos y para alcanzar este fin es necesario seguir los siguientes pasos: toma de muestra, fijación, inclusión, microtomia, tinción y montaje (Gorodner, 2013). Obtención de la muestra La muestra puede obtenerse de las siguientes maneras: Biopsia.- consiste en tomar un trozo de tejido de un ser vivo, es de uso frecuente en la medicina y requiere el cuidado de asepsia que se utiliza en todo acto quirúrgico. Necropsia.- procedimiento en el cual se extrae el material a estudiar de un cadáver. Autopsia.- es el estudio analítico y sistemático competo, macroscópico y microscópico de los órganos y sistemas de n cadáver, se realiza para establecer la causa de muerte del individuo. Fijación Es un proceso de preservación físico-química cuya finalidad es detener la vida de las células e impedir las modificaciones post-mortem tanto estructural como química que pueda sufrir la célula debido a los procesos autolíticos, manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que ocurran cambios notables en ellos conservando de la manera más fidedigna el estado y la situación en que se encontraban los tejidos en vida y lograr una estabilidad de los componentes tisulares debido a la interrupción de las reacciones enzimáticas. Esto se consigue inmovilizando (por coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la integridad de las células y tejidos, se efectúa mediante sustancias químicas o agentes físicos denominados fijadores, un buen fijador tiene las siguientes cualidades: -

Actuar con rapidez, matando y fijando las células antes de que aparezcan los fenómenos post mortem (autolisis, desintegración). Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las capas profundas de la célula o tejido. Conservar en lo posible los detalles estructurales que presentaban in vivo. Favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (ejecución de cortes, coloración). Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.

La interacción del fijador con los componentes moleculares de los tejidos para su ulterior procesamiento histológico y estudio microscópico mantiene estables las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas y al respecto son las moléculas grandes, particularmente aquellas que forman complejos con otras de gran tamaño para producir compuestos macromoleculares las que mejor se conservan por el contrario las proteínas y ácidos nucleicos

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“pequeños” como el ARN de transferencia se pierden durante la preparación de la muestra, no obstante también puede pasar esto con moléculas grandes como el glucógeno, los proteinglicanos y los glucosaminoglicanos, así como con lípidos neutros (Silvia Verdin, 2013). En un organismo muerto pueden tener lugar varios tipos de desintegración, como por ejemplo, “la autolisis” que consiste en la destrucción delos tejidos por sus propias enzimas locales producidas por los lisosomas. El segundo tipo de desintegración consiste en la “putrefacción” en donde se produce la destrucción de los tejidos en acción conjunta con las bacterias (Gorodner, 2013). Los objetivos de la fijación son: -

Mantener las estructuras en el estado más parecido al que poseían in vivo. Evitar la lisis celular y la proliferación bacteriana. Dar cierta solidez o dureza al tejido o material.

Clasificación general de los fijadores A.- Fijadores físicos.- Los principales agentes fisicos utilizados para fijar material biologico son el calor y la congelacion. Calor: Es el más simple de los métodos, produce coagulación de las proteínas y licuefacción de los lípidos. La fijacion por calor no es frecuente en histologıa puesto que produce deterioros de los tejidos. Sin embargo se emplea para la observacion de microorganismos ya que preserva la forma de estos y sirve para su identificacion mediante extenciones celulares o frotis por medio de la extencion de las celulas sobre la llama de un mechero. De esta forma el calor coagula las proteinas y produce una fijacion casi instantanea . Para lograr fijaciones rapidas se calentaba el fijador para su rapida penetracion a ala muestra ,pero actualmente se estan utilizando hornos microondas comercializados ,ya que tienen amplia rapides en la difusion. Húmedo.- En forma de agua hirviente es utilizado en algunas investigaciones microquímicas o para fijar invertebrados. Seco.- Es utilizado a menudo en bacteriología sobre extendidos desecados, poco empleado en histología. Se utiliza un horno y se lleva a temperaturas de hasta 55 °C, esta temperatura incremente la velocidad de fijación disminuyéndola en horas o varios días. Frio: No es un verdadero fijador pero detiene los procesos vitales, la necrosis y autolisis, pero en cuanto deja de actuar se reanudan las actividades vitales si la célula no ha muerto o se desarrollan los procesos de autolisis, bajas temperaturas de –190ºC a 70 °C con (Nitrógeno líquido, dióxido de carbono) permiten excelentes fijaciones. (Congelación.- mediante el criostato). B.- Fijadores químicos: La mayor parte de los fijadores químicos son líquidos que afectan física y químicamente un tejido o sea su endurecimiento y contracción, su rango de penetración es muy importante pues es el que determina el tiempo y tamaño máximo de la muestra. Simples: Los que en su fórmula llevan una sola solución fijadora (Formol al 10%, El glutaraldehido y tetróxido de osmio (ácido ósmico), Alcohol etílico, absoluto y de 96 %, El alcohol metílico). Compuestos: los que en su fórmula presentan varias soluciones fijadoras (Líquido de Bouin, Líquido de Carnoy, Líquido de Zenker madre, Liquido de Helly, Líquido de Fremming).

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FIJACION POR FRIO: Congelacion (cryostato) Los metodos histologicos comvencionales empleados para preparar muestras biologicas tienen un tratamiento agresivo a las celulas y los tejidos (Alzola, 2001). En cuanto son sometidos a temperatura ambiente,todos estos procedimientos alteran la estructura de la celula y tejidos Mediante la congelacion de muestras biologicas ,se utiliza para la concervacion durante largos periodos mediante la criopreservacion ,esta es una forma de fijacion alternativa La congelación rápida es un buen método de preservación, puesto que no se verán alteradas las características moleculares por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido. Por ello es conveniente no usar piezas mayores a 2 mm para que no se retarde la congelación de las zonas centrales de la pieza. Asimismo, cuando sea posible, es conveniente embeber la muestra en anticongelantes, también llamados crioprotectores (Manuel Mejias, 2018). Ejm: Nitrógeno líquido (-190ºC) -

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No es aconsejable realizar una inmersión directa en él, ya que se forman gases de nitrógeno alrededor de la muestra que enlentece el proceso de congelación y se pueden formar cristales gruesos en el interior de la célula, que distorsionan la morfología. Se obtiene una congelación más rápida y mejor morfología congelando en metilbutano (isopentano), previamente congelado en nitrógeno líquido. Otra opción es espolvorear la muestra en polvo talco, previamente a su inmersión en nitrógeno líquido.

La crioprotección es siempre recomendable, aunque no siempre es posible. Normalmente se emplean como agentes crioprotectores al dimetilsulfóxido, el glicerol y la sacarosa, bien solos o mezclados en diferentes concentraciones. Hay que tener en cuenta, sin embargo, que una vez que el tejido se haya cortado se vuelve a descongelar y hay que protegerlo de los procesos de degradación. Existen variantes a la técnica de congelación como son la criodesecación o liofilización y la criosustitución.

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La criodesecación o liofilización El tejido previamente congelado al que posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se impide que se den reacciones químicas, por lo que, además de la fijación, este método preserva el tejido en el tiempo. La criosustitución El tejido congelado pero en este caso se produce una sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido deterioro puesto que está congelado. Usos: -

Biopsias intraoperatorias. Inmunoinflorescencia: biopsias de piel y de riñón. Muestras para algunas técnicas moleculares (ARN). Muestras de banco de tumores.

FIJADORES QUÍMICOS La mayor parte de los fijadores químicos son líquidos que afectan física y químicamente un tejido o sea su endurecimiento y contracción, su rango de penetración es muy importante pues es el que determina el tiempo y tamaño máximo de la muestra. Simples: Los que en su fórmula llevan una sola solución fijadora. -

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Formol al 10 % es el más utilizado su acción fijadora se ejerce coagulando las proteínas. Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión, mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los componentes celulares y tisulares, endurece bien las muestras, conserva bastante bien a las grasas, conserva bien los tejidos y por ello está indicado en el estudio del sistema nervioso y es muy utilizado en anatomía patológica para la fijación de piezas operatorias o de biopsias. El formol comercial consiste en una solución acuosa del gas formaldehido al 39 - 40%. Se presenta como un líquido claro, incoloro, que emite vapores sumamente irritantes para los ojos y la mucosa respiratoria. Ácido acético no fija directamente a las proteínas sino que su proceso de fijación consiste en cambiar el estado coloidal de las proteínas. Se utiliza a una concentración que varía entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos nucleicos y nucleoproteínas. Como inconvenientes cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y mala fijación de membranas y citoplasma. El glutaraldehido y tetróxido de osmio (ácido ósmico) son muy buenos fijadores muy utilizados en microscopía electrónica ya que preservan las estructuras finas y algunos sistemas enzimáticos. Ácido pícrico la fijación la produce gracias a que las sales del tipo picrato coagulan las proteínas de los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una solución saturada de ácido pícrico. Preserva bien la estructura celular, no produce retracciones cuando el tiempo de fijación es óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos.

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Alcohol etílico, absoluto y de 96 % su uso se indica sobre todo en microquímica y en citología pues conserva sin alterarlos a muchos componentes celulares (glucógeno, mucina, etc.). El alcohol metílico se emplea para fijar extendidos de sangre y de líquidos de punción que se colorean posteriormente con métodos especiales.

Compuestos: los que en su fórmula presentan varias soluciones fijadoras -

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Líquido de Bouin.- C Consiste en una mezcla picro-formol-acética (solución acuosa saturada de ácido pícrico 750 ml, solución de formaldehido (37% a 40%) 250 ml, ácido acético glacial 50 m), es el mejor fijador ya que es muy penetrante y permite fijar piezas de hasta 1 cm, se le emplea con resultados óptimos en la fijación de embriones y fetos pequeños pues ejerce cierto poder descalcificaste. La duración de la fijación es de hasta 8 días, pero el tiempo óptimo es 3 días, no se debe lavar la pieza al sacarla del fijador. Líquido de Carnoy.- Posee un excelente poder de penetración y de difusión, las muestras delgadas de tejidos y órganos se fijan en dos o tres horas, produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuado cuando se desea demostrar glucógeno y la tinción de núcleos y especialmente cromosomas, (alcohol etílico absoluto 60 ml, cloroformo 30 ml, ácido acético glacial 10 ml). Líquido de Zenker madre.- la solución “madre” se puede guardar durante mucho tiempo. Cuando a ella se le añade ácido acético forma el líquido de Zenker (bicloruro de mercurio 50 gr, bicromato de potasio 25 gr, agua destilada 1000 ml, ácido acético glacial 5 ml). Liquido de Helly.- si a la solución madre se le agrega formol comercial se convierte en liquido fijador de Helly (solución madre de Zenker 90 ml, solución de formaldehido de 37% a 40% 10 ml). Líquido de Fremming.- Es un buen fijador nuclear, especialmente para las figuras mitósicas, tiempo de fijación de 24-48 horas, lavado de agua durante 24 horas. Se presenta para colorar con violetas de genciana o con hematoxiliana férrica (15 partes de ácido crómico al 1%, 4 partes de ácido ósmico al 2%, 1 parte de ácido acético glacial).

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OBJETIVOS:  Tener en cuenta los requisitos indispensables para lograr una perfecta fijación.  Realizar preparaciones con fijadores ácidos ya que estos producen magníficos resultados en casi todas las células; los fijadores neutros ofrecen buenos resultados y los fijadores alcalinos mayormente provocan alteración. MATERIALES E INSTRUMENTOS:             

Trozos de diversos tejidos;El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm. Solución de formaldehido10%. Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión, mantiene de manera adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los componentes celulares y tisulares, endurece bien las muestras. Cinta indicadora del pH; para determinar el pH del fijador. Papel “canson” ; para anotar los diferentes tipos de tejidos Bolsa de gasa Hilo Aguja Pinza Bisturí Tijeras Cubetas Cajas Petri Frascos con boca ancha

Algunas características de los fijadores que debemos tener en cuenta son: Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser rápido y la velocidad de difusión de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor determinante. Este parámetro condiciona el tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor sea la velocidad de difusión del fijador empleado, y también determina el tiempo de fijación, mayor cuanto menor tiempo de difusión. Velocidad de fijación. Esta característica no depende de la velocidad de difusión sino de las propiedades químicas del fijador y condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador. Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado expuesto a él.

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Osmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en las células producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido. A las alteraciones artificiales producidas durante el procesamiento histológico se les llama artefactos. Por tanto, en muchas ocasiones hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar soluciones tamponadoras a un pH semejante al del tejido e isoosmóticas con dicho tejido. Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difíciles de teñir puesto que tienen poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a ciertas estructuras celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de modificación química se le denomina efecto mordiente. Artefactos. Los procesos de fijación pueden acarrear alteraciones tisulares como variaciones morfológicas, cristalización de compuestos, desplazamiento de sustancias, etc. PROCEDIMIENTO 1. Proceder al sacrificio del animal (cuy)

2. Realizar cortes de disección, comenzando con un corte longitudinal luego transversal a lo largo del cuerpo del hámster, desde el cuello hasta la parte baja del abdomen en forma de “T”.

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3. Extraer los diferentes órganos, roturarlos con lápiz en papel canson y asegurarlos con hilo, mientras se manipula se coloca en solución fisiológica, para luego proceder a la fijación. ÓRGANO OBTENIDO Cerebro y médula Cartílago de pabellón auricular Corazón Estómago Intestinos Riñón Hígado Músculo

TEJIDO A OBTENER Nervioso Cartilaginoso Cardíaco Muscular liso Muscular liso Renal Hepático (hepatocitos) Esquelético

4. Determinar el pH del líquido fijador, cualquiera que sea; en este caso será el formaldehido al 10% (ácido)

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5. Mediante la pinza y bisturí, seccionar los diversos trozos de tejidos en cortes pequeños que no deben exceder más de un centímetro aun cuando se utilicen fijadores de gran poder de penetración.

Hígado

Riñón

Corazón

6. Colocar los cortes de tejido, en frascos de vidrio que contengan el fijador (formaldehido al 10%) por lo menos 5 veces al volumen de las piezas a fijar a temperatura ambiente por una hora

NOTA: La fijación en el formaldehido dura entre 12 a 24 horas; dependiendo del tipo de muestreo, pueden haber variaciones desde algunos minutos a algunos días; sin embargo el tiempo puede causar endurecimientos. Los frascos con las muestras se deben mantener a temperatura ambiente durante el tiempo de fijación. Los frascos o recipientes que contengan el fijador, deben estar cerrados para evitar evaporación del fijador, pues de no ser así disminuye la concentración del fijador. 7. Terminado el periodo de fijación, se debe eliminar el exceso de fijador con agua de caño o agua destilada, realizando varios cambios o de lo contrario el material fijado se acomoda en una bolsita de gasa, la cual se coloca en el caño a chorro continuo por unas 12 horas, de esta manera se impide que el fijador impregnado siga actuando.

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CUESTIONARIO 1. ¿En qué consisten los estudios postmortem de las células y cuáles son las principales técnicas de estudio? Los estudios post mortem exigen la muerte de las células y siguen una serie de pasos que constituyen la Técnica Histológica Universal, ya que se utiliza en todos los laboratorios y sus resultados se interpretan de la misma manera. La principal técnica de estudio es la técnica histológica cuyos pasos son los siguientes: obtención del material, fijación, inclusión, corte, coloración, montaje 2. ¿Qué ventajas ofrecen los métodos de fijación por congelación? La congelación rápida es un buen método de preservación de las características moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea rápida puesto que a se impide la formación de grandes cristales de hielo que destrozarían la estructura del tejido. 3. ¿Cómo actúan los fijadores químicos en la célula? Evitar la lisis celular e interactúan con los componentes del tejido, tales como proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos; como así también, la capacidad de preservar la composición y localización de carbohidratos: celulosa y almidón en vegetales, quitina en insectos o glucógeno en tejidos animales y depósitos metálicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2, Pb+2, As-3, Cr+2). La fijación química involucra el uso de soluciones orgánicas e inorgánicas que permiten la adecuada preservación de la morfología tisular y propiedades tintoriales de las macromoleculas del tejido. CONCLUSIÓN Los fijadores cumplen un papel fundamental en el estudio de células post mortem ya que evitan la lisis celular, mantiene las estructuras en el estado más parecido al que poseían in vivo y mantiene las actividades de algunos componentes moleculares.

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BIBLIOGRAFÍA Alzola, R. (2001). guia de estudios: tecnicas histologicas . Obtenido de UNCPBA facultad de ciencia veterinarias departamento de ciencias biologicas : http://www.vet.unicen.edu.ar/ActividadesCurriculares/HistologiaEmbriologiaTeratologia/ima ges/Documentos/2015/Tecnicashistologicas.PDF ARENAS, C. E. (agosto de 2010). tecnica histologia. Obtenido de http://www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/PDF/Portal%20de%20Recursos%20en%20Line a/Apuntes/3_tecnica_histologica.pdf Diana Mejia, F. P. (julio de 2016). HISTOLOGÍA: DESDE SU ORIGEN HASTA LA ACTUALIDAD. Obtenido de ciencias de la salud: http://www.bvs.hn/RCEUCS/pdf/RCEUCS3-1-2016-9.pdf Gorodner, O. (enero de 2013). Metodos e instrumentos de estudio de la histologia. Obtenido de universidad nacional del noreste: https://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/histologia_med_cat2/G UIA%201%20%202013.pdf Manuel Mejias, P. M. (mayo de 2018). tecnicas histologicas fijacion. Obtenido de departamento de biologia funcional y ciencias de la salud: https://mmegias.webs.uvigo.es/descargas/tecnicasfijacion.pdf Silvia Verdin, L. F. (2013). histologia e inmunihistoquimica. Obtenido de manual de metodos: http://antares.iztacala.unam.mx/papime/wp-content/uploads/2014/10/Histologia1.pdf