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MANUAL DE PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA VETERINARIA

DIANA S. RÍOS DÍAZ [email protected] LADY NIÑO VERA [email protected] CANDELARIA MADRID [email protected]

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINARIA PAMPLONA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA 2016

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INDICE DE CONTENIDO

Introducción Normas de seguridad Practica 1: Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología

pag 4

Práctica 2: Esterilización

12

Práctica 3: Preparación de medios de cultivo

17

Práctica 4: Siembra y características de los cultivos bacterianos

26

Practica 5: Tinciones Simples y Visualización de Bacterias

35

Practica 6: Tinciones Bacterianas Compuestas

46

Practica 7: Medios Selectivos y Diferenciales

56

Practica 8: Metabolismo Microbiano

62

Practica 9: Sensibilidad Bacteriana a los Antibióticos/ Antibiograma

67

Practica 10: Morfología Fúngica

71

INTRODUCCION Las enfermedades infecciosas asociadas a bacterias y hongos son quizá una de las más frecuentes patologías en medicina veterinaria y es preciso reconocer el microorganismo implicado en las mismas. El aislamiento, identificación y la confrontación antibiótica permiten determinar el manejo idóneo del paciente infectado. Con este manual se pretende introducir al estudiante en las técnicas básicas microbiológicas y que tenga una aproximación al diagnóstico de bacterias y hongos de relevancia clínica veterinaria, además de brindarle herramientas para la interpretación de resultados.

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NORMAS DE SEGURIDAD 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.

16. 17. 18. 19. 20.

El acceso al laboratorio estará limitado al personal autorizado El personal que trabaje en el laboratorio es responsable del cumplimiento de las normas de bioseguridad Todas la áreas deben estar señalizadas para el riesgo biológico y el nivel de contención Es obligatorio el uso de bata manga larga, cerrada y limpia. Los libros, abrigos, bolsos y demás elementos en los lugares indicados, NUNCA deben estar sobre los mesones o bancos. Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesión, con el fin de evitar contaminaciones por corrientes de aire. Al iniciar y terminar la sesión, se deben desinfectar las áreas de trabajo El laboratorio debe permanecer LIMPIO y ORDENADO durante el trabajo y al término del mismo, colocar los materiales de descarte y el material limpio en los respectivos sitios. No debe quedar en los mesones Es obligatorio el lavado correcto de las manos al inicio y finalización de cada práctica, se deben secar con toallas de papel Es obligatorio el uso de guantes, cofia, tapabocas y demás barreras de protección según el nivel de riesgo. El cabello debe permanecer recogido Está totalmente prohibido comer, beber, fumar y aplicarse cosméticos en el laboratorio (la pestañina puede acelerar el daño a los oculares), no se deben utilizar lentes de contacto. El calzado debe ser cerrado y el pantalón largo. Se deben usar pipeteadores, nunca utilizar la boca Hablar en tono bajo y no realizar recorridos innecesarios dentro del laboratorio, esto con el fin de evitar distracciones y accidentes Emplear los equipos según las instrucciones de los Procedimientos Operativos Estandarizados POE, emplear las guías de las prácticas. No se deben manejar los equipos si se desconoce su uso Se debe evitar el derrame de muestras, manipulándolas dentro del laboratorio en contenedores como neveras o cajas herméticas, estas deben ser resistentes y con material absorbente en su interior, ser fácilmente desinfectables y no ser empleadas para otros fines Los guantes deben ser descartados correctamente al finalizar cada jornada, nunca serán reutilizados. No se deben manipular objetos como teléfonos con ellos puestos Todo accidente y derrame debe ser informado inmediatamente a la persona encargada del laboratorio Se deben usar gafas y máscaras si existe riesgo de salpicadura y/o aerosoles El personal que presente prueba de mantoux negativa, no puede ingresar a áreas de diagnóstico de tuberculosis Cada estudiante debe contar con el siguiente equipo de trabajo básico: Láminas portaobjetos, laminillas, jabón, tijeras, cinta de enmascarar, lápiz o marcador de vidrio, papel absorbente, algodón, alcohol, frascos para descartar portaobjetos, asas bacteriológicas y micológicas, guantes y pipeteador.

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PRACTICA 1 Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiología 1.Objetivos -

Reconocer los aspectos básicos de bioseguridad y reglas generales del trabajo diario en un laboratorio de microbiología. Preparar soluciones desinfectantes según las concentraciones requeridas en las diferentes aplicaciones. Relacionar la clasificación de los agentes biológicos y los laboratorios, según el riesgo biológico. Hacer correcto uso de los equipos de trabajo, reconocer su fundamento y manejo.

2.Materiales Elementos de Bioseguridad 3. Reactivos No aplica 4.Marco Teórico El personal de los laboratorios de microbiología trabaja con agentes potencialmente infecciosos o materiales que pueden contenerlos. Algunos de estos microorganismos llegan a ser patógenos según las condiciones de exposición, por lo que evitar este escenario es un elemento primordial de la competencia profesional del personal. Es el trabajo seguro responsabilidad del laboratorista, no sólo por autocuidado sino para proteger la salud de los demás y del medio ambiente.

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Agentes desinfectantes de uso común Agente Componentes fenólicos: fenol

Halógenos: Compuestos clorados: Hipoclorito de sodio (NaClO)

Componentes de Yodo: Tintura de Yodo. Solución Povidona-yodo.

Mecanismo de acción Germicida, altera proteína Surfactante Es irritante y tóxico Efecto germicida por la combinación rápida con proteínas. Los clorados reaccionan con el agua para formar ácido hipocloroso, el cual es bactericida. Oxidante, corrosivo para metales, de degradación con el tiempo, se recomienda almacenarlas en frascos color ámbar, guardar las soluciones en frascos herméticamente cerrados, protegidos de la luz, el calor y la humedad; preparar la cantidad para uso. No se tiene claro el mecanismo de acción. Se cree precipita las proteínas. Agente activo de superficies.

Uso Desinfección: solución al 5% Purificación del agua. Sanitación de utensilios en industrias. Microbicida. Para limpieza de superficies se recomienda a una concentración de 1%. Las soluciones pueden varias entre 1g/L y 10g/L Tintura de yodo es empleada como antiséptico (de uso en la piel.) Efectivo contra esporas, hongos y virus.

Una recomendación de concentraciones de hipoclorito de sodio a emplear según el elemento es usar la siguiente fórmula Gramos gr o centímetro cúbicos de la sln concentrada = (Volumen en litros de la solución a preparar) X ppm que se requiere) / (concentración del producto comercial en % x 10)

Elemento a Desinfectar Partes por Millón (ppm) Agua potable 0.2 Desinfección de manos 50 Desinfección: camillas, mesas, camas, instrumental de acero inoxidable 200 Desinfección de pisos, mesones en baldosín, ropa, útiles de aseo, material 500 plástico. Material contaminado (VIH,VHB, VHC) 500 Desinfección de material orgánico. 5000

No olvide las siguientes recomendaciones: Preparar la solución diariamente para su uso Utilizar recipientes que no sean metálicos Mantener el producto en un lugar seco y protegido de la luz Emplear la concentración recomendada No mezclar con otras sustancias (jabón, yodo, etc.)

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Utilizar guantes para su empleo Sumergir el material por 30 minutos, posteriormente lavar con agua, jabón, agua, y posteriormente esterilizar Agentes biológicos según el grupo de riesgo, niveles de contención y medidas según el nivel: Los agentes biológicos se clasifican en 4 grupos de riesgo según la probabilidad de infección: Agentes biológicos de grupo de riesgo 1: De escaso o nulo riesgo individual y comunitario. Microorganismo que tiene pocas probabilidades de causar enfermedad en humanos o animales. Agentes biológicos de grupo de riesgo 2: De riesgo individual moderado y riesgo comunitario bajo. Agentes patógenos que pueden causar enfermedades en humanos y animales, pero que tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposición puede provocar una infección grave, se disponen de medidas eficaces de tratamiento y prevención, y el riesgo de propagación es limitado. Agentes biológicos de grupo de riesgo 3: De riesgo individual elevado y riesgo comunitario bajo. Agente patógeno que suele provocar enfermedades humanas y animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo infectado a otro. Se dispone de medidas eficaces de tratamiento y prevención. Agentes biológicos de grupo de riesgo 4: De elevado riesgo individual y comunitario. Agente patógeno que suele provocar enfermedades graves en las personas o en los animales y que puede propagarse fácilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y prevención. La seguridad biológica se fundamenta en 3 elementos: técnicas de laboratorio, equipo de seguridad y diseño de las instalaciones. Se hace referencia a contención a los métodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. Se diferencian 4 niveles de contención o seguridad biológica con base a los 3 elementos de seguridad y las operaciones que se realizan, las vías de transmisión de los agentes infecciosos que allí se manejan y la función o actividad del laboratorio. Medidas de contención: Medidas de contención 1. El lugar de trabajo se encontrará separado de toda actividad que se desarrolle en el mismo edificio 2. El aire introducido y extraído del lugar de trabajo se filtrará mediante la utilización de filtros de alta eficacia para partículas en el aire (HEPA) o de forma similar 3. Solamente se permitirá el acceso al personal designado

2

3

4

No

Aconsejable

Sí

No

Sí, para la salida de aire

Sí, para la entrada y salida de aire

Aconsejabl e

Sí

Sí, con esclusa de aire

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4. El lugar de trabajo deberá poder precintarse para permitir su desinfección 5. Procedimientos de desinfección específicos 6. El lugar de trabajo se mantendrá con una presión negativa respecto a la presión atmosférica 7. Control eficiente de vectores, por ejemplo, roedores e insectos

No

Aconsejable

Sí

Sí

Sí

Sí

No

Aconsejable

Sí

Aconsejabl e

Sí

Sí

8. Superficies impermeables al agua y de fácil limpieza

Sí, para banco de pruebas y mesa de trabajo

Sí, para banco de pruebas, mesa de trabajo y suelo

Sí, para banco de pruebas, mesa de trabajo, suelo, paredes y techos

9. Superficies resistentes disolventes y desinfectantes

Aconsejabl e

Sí

Sí

Sí

Sí

Sí, almacenamiento seguro

Aconsejabl e

Aconsejable

Sí

Aconsejable Si, cuando la infección se propague por el aire Sí, disponible

Sí

a

ácidos,

álcalis,

10. Almacenamiento de seguridad para agentes biológicos 11. Se instalará una ventanilla de observación o un dispositivo alternativo en las zonas de manera que se pueda ver a sus ocupantes 12. Laboratorio con equipo propio 13. El material infectado, animales incluidos, deberá manejarse en una cabina de seguridad biológica o en un aislador u otra contención apropiada 14. Incinerador para destrucción de animales muertos

No Cuando proceda Aconsejabl e

Sí Sí, en el mismo lugar

Cabinas de Seguridad Biológica (CSB): Son cámaras de circulación forzada que según sus especificaciones y diseño, proporcionan diferentes niveles de protección. Son fundamentales en un Laboratorio de Microbiología Clínica y se clasifican según el nivel y tipo de protección. En principio es necesario distinguir entre las campanas de extracción de gases, las cabinas de flujo laminar y las cabinas de Seguridad Biológica. La campana de gases (o vitrina extractora de gases) es un recinto ventilado que captura los humos y vapores procedentes de la manipulación de los productos químicos en el laboratorio. Si bien constituye un equipo muy útil en la contención del riesgo químico, no ofrece protección alguna frente a riesgos biológicos. Las cabinas de flujo laminar son recintos que emplean un ventilador para forzar el paso del aire a través de un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) barriendo la superficie de trabajo. El flujo de aire puede ser vertical u horizontal. Estas cabinas ofrecen protección únicamente al material que se maneja en su interior, pero nunca al operador, por lo que no son recomendables para el trabajo en un Laboratorio de Microbiología Clínica. Son, sin embargo, un instrumento de trabajo imprescindible en las denominadas "zonas limpias". Las cabinas de Seguridad Biológica son recintos ventilados diseñados para limitar al máximo el riesgo del personal de laboratorio expuesto a agentes infecciosos. Ello es especialmente importante si se tiene en cuenta que muchas de las operaciones realizadas en un laboratorio implican la formación de aerosoles. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona de trabajo que minimice la probabilidad que una partícula transportada por el aire tiene de escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar así al operario y a la zona que le rodea. Además, algunas de ellas, ofrecen protección al material que se manipula.

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Las CSB disponen de dos sistemas que impiden la salida de contaminación: las barreras de aire y los filtros. Las barreras de aire se crean permitiendo que éste fluya en una sola dirección y a una velocidad constante dando lugar a una verdadera "cortina" de aire que se conoce como flujo de aire laminar. Es, por definición, un flujo con ausencia de turbulencias. Los filtros tienen como finalidad atrapar las partículas contenidas en este flujo de aire y los empleados habitualmente son los HEPA, que retienen con una eficacia del 99,97% partículas de hasta 0,3 micras de diámetro. Las CSB se dividen en tres categorías: clase I, clase II y clase III.

4.1

Figura 1. Cabina de seguridad biológica clase I

4.2 4.3 4.4 4.5

4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 Figura 2. Cabina de seguridad biológica clase II

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Figura 3. Cabina de seguridad biológica clase III

Control de Calidad: Para generar un proceso analítico de óptima calidad, con resultados confiables, oportunos y a bajos costos, es necesaria una evaluación

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sistemática del trabajo. Un programa de control de calidad básico microbiológico incluye ciertos puntos específicos como: materiales y medios de cultivo, reactivos, equipos, personal, documentación, buen criterio y constante atención en el proceso. Monitoreo de Medios de Cultivo: aunque los proveedores realizan una evaluación de los medios de cultivo, es necesaria una evaluación interna de cada laboratorio con ayuda de los microorganismos de referencia o cultivos tipo en caso de no contar con ellos, es posible realizar el control con microorganismos recuperados durante el trabajo diario. Algunas colecciones de microorganismos para control de calidad son: ATCC (American Type Culture Collection), DMS, etc. Monitoreo de equipos de Laboratorio: Es necesario un programa de mantenimiento preventivo para asegurar el funcionamiento adecuado de todos los equipos de laboratorio de microbiología. Los equipos deben controlarse en intervalos establecidos, reemplazando piezas que por su uso hayan cumplido su ciclo de trabajo óptimo.

Procedimientos de control de calidad de equipos comúnmente empleados en microbiología: Equipo Refrigeradores Congeladores Incubadoras Incubadoras de CO2 Baños termostatados

Procedimiento Registro de temperatura Registro de temperatura Registro de temperatura Medición de contenido de CO2

Intervalo Diario. Diario. Diario Diario o 2 veces /día

Registro de temperatura

Diario.

Autoclaves

Prueba con esporas de Bacillus stearothermophilus

1 al mes

Potenciómetro

Calibración con soluciones de pH en todos los rangos ( ácido, neutro y básico)

En cada uso.

± 0.1 unidad de pH del estándar empleado.

Jarra para anaerobiosis.

Indicador de anaerobiosis.

Con cada uso

Color según el control empleado.

Centrifugas

Controlar revoluciones con tacómetro.

Mensual

5% de lo indicado.

Semestral o trimestral. Con cada uso.

Flujo de 50 pies de aire/minuto ± 5 pies/minuto. ± 10 r.p.m. El crecimiento indica una muy baja tensión de O2. Incolora con baja tensión de O2.

Campana de seguridad. Rotador Cabina de anaerobiosis

Medir la velocidad del aire. Conteo de r.p.m. Cultivo de Clostridium novy tipo B. Solución indicadora de azul de metileno.

Periódicamente. Diario.

Límites de tolerancia 2-8°C. -8 a -20°C. 35.5 ± 1°C. 5-10%. 36 a 38°C o 55 a 57°C según corresponda. Subcultivo de esporas, después del ciclo de esterilización, sin crecimiento indica corrida estéril.

Personal: El laboratorio de microbiología debe ser dirigido por un profesional en el área. Todo el personal debe asistir a programa de educación continuada. Documentación: es importante la existencia de protocolos de operación, donde se clarifique los objetivos, métodos, y ejecuciones de las actividades. Los procedimientos operativos estandarizados o normalizados (POE) son una herramienta en la cual se consigna paso a paso la operación y el control. Se utiliza para minimizar errores.

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5.Procedimiento Revise y discuta la guía en grupo 6.Cuestionario Desarrolle el siguiente taller: 1. Defina y dé ejemplos de soluciones referentes al término: a. Antiséptico: b. Desinfectante: c. Bacteriostático: d. Bactericida: e. Germicida:

2.Complete los datos de la siguiente tabla: Nivel de Seguridad biológica

Tipo de Laboratorio

Microorganismos procesados (escribe 3 nombres)

Normas especiales

2 3

4

7. Bibliografías 1. Centers for Disease Control and Prevention CDC, (2012). Pautas para prácticas laborales seguras en laboratorios de diagnóstico médico para humanos y animales. Recuperado de: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su6101a1_ensp.htm 2. Ministerio de Salud, (1997). Manual de Normas técnicas, científicas y administrativas para laboratorio clínico. Bogotá. 3. Luna, J. (1995). Memorias Curso Taller de Garantía de Calidad en Laboratorios de Microbiología. Universidad de Pamplona. 4. Escobar, R. Prácticas de Laboratorio, (1998). Fundamentos de Microbiología. Bogotá. Centro Editorial Javeriano (CEJA) 5. Organización Mundial de la Salud OMS, (2005). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Recuperado de: http://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf

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PRACTICA 2 Esterilización 1.Objetivos -

Aplicar algunos métodos utilizados para la esterilización de medios de cultivo, materiales y accesorios utilizados en el Laboratorio de Microbiología.

-

Enumerar los diferentes métodos que existen para realizar los procedimientos de esterilización usados en microbiología.

-

Preparar el material para esterilizar y hacer uso del autoclave para el procedimiento de esterilización.

2.Materiales 1.Cajas de petri 2.Tubos de ensayo 3.Pipetas 4.Erlenmeyer 5.Papel kraft 6.Autoclave 7.Horno de aire caliente. 8.Cinta de enmascarar 9.Gasa 10.Algodón 11.Asa bacteriológica 12.Mechero de Bunsen 13.Hisopos 14.Estufa eléctrica Bajalenguas 3. Reactivos No aplica 4.Marco Teórico Introducción En un análisis microbiológico es importante identificar en forma precisa el microorganismo involucrado, siendo entonces indispensable un resultado veraz por parte del laboratorio. Generalmente se debe obtener un cultivo axénico y evitar la contaminación de origen ambiental. Es necesario descartar o eliminar falsos positivos causados por esta clase de microbiota. Para realizar una excelente práctica es fundamental comprender los principios básicos de la esterilización.

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Esterilización La esterilización es la eliminación o muerte de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia, por lo general se acondicionan de tal forma que no puedan contaminarse nuevamente. El material que se utiliza para determinación de microorganismos debe esterilizarse previamente para liberarlo de la microbiota ambiental. Existen varios métodos de esterilización: los agentes físicos (Calor seco, calor húmedo, radiaciones) y agentes químicos (cloro y compuestos clorados, aldehídos, óxido de etileno, compuestos fenólicos, ácidos y álcalis). El agente más empleado es el calor, ya sea húmedo o seco; la efectividad del calor depende de la temperatura y el tiempo de exposición. Todos los microorganismos son susceptibles en distinto grado a la acción del calor.

Esterilización por contacto directo Acción directa de la llama

Flameado

Acción directa por los generadores de calor

Incineración Estufa de calor seco Baño de agua hirviente

Acción del agua caliente

Calentamiento repetido

Acción del vapor de agua Ionizantes

Ebullición directa Autoclave Rayos X y gamma.

No Ionizantes

Ultravioleta

CALOR SECO

CALOR HÚMEDO

RADIACIONES

Métodos Físicos Calor seco: produce desnaturalización de proteínas, efectos tóxicos por desecación de la célula alcanzando niveles elevados de solutos, procesos oxidativos irreversibles, fusión y desorganización de las membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con éstos. El horno de aire caliente es el equipo utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor seco; Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que los métodos por calor húmedo. La temperatura varía entre 120 y 180 ºC, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140ºC se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que entre 160ºC a 180ºC se requieren al menos 2 horas de exposición. Sirve para esterilizar material de vidrio. Se recomienda NO abrir la puerta del horno inmediatamente después del tiempo de esterilización, pues ello puede ocasionar rotura del material de vidrio. El papel y algodón no pueden ser esterilizados a más de 160ºC. Ventajas del calor seco: no es corrosivo para metales e instrumentos, permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias viscosas no volátiles. Desventajas: Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo, debido a la baja penetración del calor.

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Incineración: Se utiliza para destruir el material descartable contaminado. Ej. Horno de incineración a nivel hospitalario, muflas, etc. Acción directa de la llama: se lleva al rojo el material de metal como asas, lancetas, agujas de disección etc. Calor húmedo: produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones: 1.El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (ARN, ADN, proteínas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto reacciones inversas podrían dañar a la célula por causar generación de productos tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan mediante puentes de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos por el agua a altas temperaturas. 2. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que el aire. Por lo que los materiales húmedos conducen el calor más rápidamente que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación. El Autoclave es el equipo utilizado comúnmente en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y no se desnaturalicen a temperaturas mayores de 100ºC. Una temperatura de 121ºC (Una atmósfera de sobrepresión) con un tiempo de exposición mayor a 15 minutos sirve para destruir microorganismos formadores de esporas. Es necesaria la acción combinada del calor, tiempo y presión para conseguir la destrucción celular. Ventajas del calor Húmedo: rápido calentamiento y penetración, destrucción de formas vegetativas y esporas en corto tiempo, no deja residuos tóxicos, hay un bajo deterioro del material expuesto, es posible por este método esterilizar materiales que no resisten el calor seco (material plástico). Desventajas: no permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua, es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos. INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL AUTOCLAVE 1. Colocar agua en la olla hasta cubrir la resistencia (no colocar agua en la camisa), el nivel del agua debe mantenerse en cada ciclo de esterilización. 2. Colocar el material a esterilizar dentro de la camisa, colocando previamente la rejilla en el fondo. 3. Introducir la camisa. 4. Tapar la olla haciendo coincidir las flechas impresas en la tapa y la olla, insertando el tubo flexible en el canal dispuesto en la pared interior de la camisa. 5. Apretar los tornillos haciendo cierre lateral, simultáneo y uniforme. No use llaves para apretar y mantenga las superficies de contacto de la tapa y el borde interno de la olla perfectamente limpio y lubricado. 6. Abrir la válvula de seguridad colocándola en posición vertical. El vapor generado en la base del esterilizador, pasa hacia arriba y por fuera del recipiente y luego hacia abajo a través de los paquetes, hasta la base del recipiente, empujando hacia afuera desde la base a través del tubo flexible de

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escape y la válvula de seguridad; es muy importante que la corriente de vapor elimine por completo el aire de la cámara de lo contrario la temperatura alcanzada es mucho menor. 7. Cuando el vapor escapa vigorosamente se debe colocar la válvula en posición horizontal. 8. A partir de entonces la presión y la temperatura empezarán a aumentar, lo cual se verá indicado en la aguja del manómetro. 9. Permitir que la aguja llegue a 121 grados centígrados y 15 libras de presión, es a partir de este momento que se empieza a cronometrar el tiempo de esterilización. 10. De 10 a 15 minutos para material limpio. 11. De 30 a 40 minutos para material contaminado. 12. Al finalizar el periodo de esterilización, apagar el autoclave y permitir que el manómetro baje a cero, levante la válvula para que escape el vapor restante y proceda a destapar la olla desenroscando los tornillos de manera enfrentada. Radiaciones: La energía se transmite a través del espacio en gran variedad de formas, generalmente llamadas radiaciones. Su acción depende del tipo de radiación, el tiempo de exposición y las dosis de radiación. Radiaciones no Ionizantes: La luz ultravioleta (UV) tiene como limitante no penetrar el vidrio, la suciedad, el papel, la pus, etc. Su efecto destructor se cumple cuando los rayos UV tienen contacto directo con los microorganismos. Se usa para reducir la población microbiana del aire de los quirófanos, pabellones hospitalarios, laboratorios, etc. En microbiología es usada en cámaras de repiques de cultivos y proceso de muestras. Su mecanismo de acción es el daño al ADN, siendo entonces bactericida. Las radiaciones ultravioletas afectan a las moléculas de ADN de los microorganismos debido a que forman dímeros adyacentes que inducen a errores en la duplicación y por lo tanto la pérdida de la viabilidad de las células. Radiaciones Ionizantes: producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras proteicas y lipídicas y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos. Tienen gran penetrabilidad y se utilizan para esterilizar materiales termolábiles (termosensibles), como jeringas descartables, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas por que producen alteraciones de los componentes. Filtración: en algunas ocasiones es necesario esterilizar soluciones como medios de cultivo líquidos, soluciones de sustancias sensibles al calor como azúcares, aminoácidos, antibióticos, sales y similares, sin someterlos a temperaturas de esterilización. Para esto se utiliza la técnica de filtración, esta consiste en pasar las soluciones por filtros con poros de diámetros a escala de micras reteniendo por tamaño a los microorganismos. Este método permite obtener productos solubles como toxinas, antígenos, antibióticos, etc. La siguiente tabla resume algunos tipos de filtros.

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FILTROS BERKEFELD

Constituidos por tierra de Diatomeas. Poros: Intermedio(N), fino (W) y ordinario (V). Después de utilizado se cepilla y se hierve en agua estéril.

FILTROS CHAMBERLAND

Constituidos de porcelana sin vidrio. Varios tamaños de poro. El poro más fino retiene los virus de mayor tamaño.

FILTROS SEITZ

Constituido por filtros de Asbesto insertados en un recipiente metálico conectado a un erlenmeyer. Retienen bacterias.

FILTROS DE VIDRIO

Constituidos por filtros de vidrio insertados en un recipiente metálico conectado a un erlenmeyer.

FILTROS DE MEMBRANA

Constituidos de nitrato de celulosa, acetato de celulosa y politetrafluoretileno. Los poros varían de 8 a 0,01 micras. Normalmente se trabaja con presión positiva o negativa a 100 o 200 mm de Hg.

Preparación del material de vidrio Cristalería nueva: Puede contaminarse con esporas del mismo ambiente por lo tanto debe hervirse con detergente, enjuagarse con agua corriente y luego agua destilada para después esterilizar en horno de aire caliente. Cristalería usada no contaminada: Debe descartarse en solución desinfectante (hipoclorito o cresol al 3%) para destruir los microorganismos, lavarse con detergente y esterilizarse en horno de aire caliente. 5.Procedimiento Dada una lista de materiales, usted debe indicar que método de esterilización es adecuado en cada caso. Siguiendo la demostración práctica dada por el profesor, Usted preparará el material para su posterior esterilización: cajas de petri, pipetas, erlenmeyer, tubos de ensayo, asas etc. Lleve a esterilizar de acuerdo con el agente físico adecuado. Procedimiento 1 1. Recorte el papel para envolver material, de acuerdo a las necesidades. 2. Tome el material correspondiente y envuélvalos según las instrucciones del tutor; por último colóquele un trozo pequeño de cinta control de esterilización. 3. Llévelos al horno de aire caliente y encienda en la temperatura adecuada (180ºC), una vez alcance los 180°C empiece a contabilizar el tiempo de esterilización (2 horas). 4. Finalizado el proceso y luego de bajar la temperatura, verifique la cinta control. Procedimiento 2 1. Asegúrese de que el nivel del agua sea el adecuado para el proceso, coloque la rejilla y sobre ella la canasta y dentro de ella el material a esterilizar (Medios de cultivo, cultivos bacterianos, material biológico).

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2. Cierre correctamente la olla, encienda y controle las condiciones de esterilización. Observe los colores del manómetro y NO deje que la aguja llegue a el rojo pues ocurriría una explosión, esto lo puede controlar con el botón giratorio. 3. Una vez finalizado el tiempo proceda según las instrucciones del uso del autoclave. 6.Cuestionario 1. ¿Qué es esterilización? 2. Dibuje un autoclave con sus partes y describa su función. 3. ¿Qué medidas podría tomar usted para verificar la efectividad de la esterilización por autoclavado? 4. ¿Qué es liofilización? 5. ¿Qué es sonicación? 6. ¿Qué otros procesos físicos permiten disminuir la carga microbiana? 7. ¿Qué otros tipos de rayos a diferentes longitudes de onda se emplean para esterilización? 7.Bibliografías 1. Organización Panamericana de la Salud, (2008). Manual de Esterilización para Centros de Salud. Recuperado de: http://www1.paho.org/PAHO-USAID/dmdocuments/AMRManual_Esterilizacion_Centros_Salud_2008.pdf 2. Universidad Nacional de Colombia, (2012). Manual de Bioseguridad y Esterilización, Facultad de Odontología, Sede Bogotá. Recuperado de: http://www.laboratorios.bogota.unal.edu.co/userfiles/files/manual_bioseguridad%20y %20esterilizacion_abril_2013.pdf 3. CDC, (2008). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. Recuperado de: http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/guidelines/Disinfection_Nov_2008.pdf

PRACTICA 3 Preparación de medios de cultivo 1.Objetivos Reconocer los diferentes medios de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos aplicando los conceptos básicos de nutrición de los mismos. Preparar en pequeños grupos los medios de cultivo, líquido o sólido asignados por el docente; siguiendo las instrucciones dadas en la etiqueta del medio respectivo.

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Almacenar los medios de cultivo (preparados o sintéticos) en el lugar adecuado. 2.Materiales -

Cajas de petri Tubos de ensayo Pipetas Erlenmeyers Autoclave Cinta de enmascarar Gasa Algodón Mechero de Bunsen Estufa eléctrica Balanza Espátulas Frascos tapa azul de 250 ml Probetas Papel filtro

3. Reactivos -

Medios de cultivo deshidratados Agua destilada

4.Marco Teórico Como todos los organismos vivos, los microorganismos requieren ciertos nutrientes básicos y factores físicos para el mantenimiento de su vida, estas necesidades varían según el tipo de microorganismo y es necesario conocerlas para cultivarlos en el laboratorio. Las necesidades nutricionales básicas pueden suministrarse en el laboratorio por la variedad de medios de cultivo; estos en general suministran:  Una fuente de carbono: el carbono es un componente esencial y central para conformar la estructura celular y permitir a la célula realizar todas sus funciones. Según la fuente de carbono los microorganismos se encuentran en dos grupo: autótrofos y heterótrofos. Los organismos autótrofos pueden cultivarse en medios que contengan únicamente compuestos inorgánicos; usan principalmente dióxido de carbono como carbono inorgánico. Los organismos heterótrofos en su lugar necesitan un suministro de carbono orgánico por ejemplo glucosa.  Una fuente de Nitrógeno: elemento esencial para que la célula construya macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Algunos microorganismos usan nitrógeno atmosférico, otros emplean sales de nitrato o de amonio como compuestos inorgánicos así como otras requieren compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como aminoácidos.  Elementos no metálicos: iones no metálicos como el Azufre y el Fósforo. El Azufre puede encontrarse en proteínas, sulfatos o Azufre elemental, mientras el fósforo está formando sales.

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 Elementos metálicos (Ca, Zn, Na, K, Cu, Mn, Mg, Fe +2 y Fe+3): Llamados también micronutrientes, oligoelementos o elementos traza. Encontrados en sales inorgánicas y tomados en bajas concentraciones.  Vitaminas: los microorganismos puede tomarlas del medio, elaboradas o sintetizarlas. Algunos poseen una variedad de vías para sintetizar vitaminas, mientras otros sintetizan un número muy limitado de ellas a partir de componentes del medio; otros las requieren como suministro.  Agua.  Energía: Existen dos tipos bioenergéticos de microorganismos, fotótrofos y quimiótrofos. Los fotótrofos emplean la energía radiante (luz solar) como única fuente de energía. Los quimiótrofos obtienen la energía por oxidación de compuestos químicos los cuales pueden ser moléculas orgánicas o inorgánicas Las necesidades físicas involucran factores como: temperatura, pH y gases, los cuales se encuentran en un rango óptimo específicos para cada microorganismo, por lo tanto su variación puede acelerar o disminuir su crecimiento. El microbiólogo busca satisfacer las necesidades nutricionales para recuperar y crecer los microorganismos; de manera general estos medios pueden ser medios naturales o medios químicamente definidos. Para los químicamente definidos se conocen las cantidades exactas de compuestos químicos puros que los conforman ya sean de tipo orgánico como inorgánico. Los medios naturales están compuestos de un número limitado de sustancias complejas, extractos de plantas, de animales, cuya composición química exacta no se conoce. Los microorganismos en general pueden tomar los requerimientos nutricionales de los medios de cultivo, ya sean sustancias naturales o artificiales para multiplicarse. MEDIOS DE CULTIVO El conocimiento de la nutrición microbiana permite el cultivo de los microorganismos en el Laboratorio. Un medio de cultivo es una solución acuosa (bien como tal, o bien incorporada a un coloide en estado de gel) en las que están presentes todas las sustancias necesarias para el crecimiento de un (os) determinado(s) microorganismo(s). PROPIEDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Humedad: Indispensable para el crecimiento de microorganismos, su carencia (desecación) puede llevar a la muerte del microorganismo. Fertilidad: Se refieren a los elementos o compuestos básicos que permiten el crecimiento bacteriano. pH: Se refiere al pH óptimo para el desarrollo bacteriano, indispensable para su aislamiento; variaciones ácidas o alcalinas, pueden inhibir su crecimiento. Transparencia: Permite la observación bacteriológica, evidenciar morfológica y físicamente su crecimiento en medios de cultivo adecuado.

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CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Según su estado físico

Sólidos

1.5 a 2.0 % de agar – agar

Semisólidos

0.5 % de agar – agar

Líquidos

No contienen agar

Bifásico

Contiene fase sólida y fase liquida (listos para utilizar)

Naturales Según su naturaleza o composición

Sintéticos Vivos

Asilamiento de microorganismos

Según su propósito

Utilizados para cultivar microorganismos tal y como se encuentran en la naturaleza. Se usan con base a la experiencia y no a su composición. Ej: Sangre diluida, leche, jugos vegetales. De composición exactamente conocida. Los más utilizados son los medios comerciales deshidratados. Contienen células u organismos vivos, como las células de riñón de mono o huevos embrionados. Con adición de sangre, suero o extractos de tejidos de animales o plantas al caldo o Medios enriquecidos agar, proporcionando sustancias nutritivas complementarias para el crecimiento de microorganismos exigentes Con adición de algunas sustancias que no permiten el desarrollo de un grupo de microorganismos sin afectar el desarrollo Medios selectivos* de los grupos de interés. En principio se pueden seleccionar los microorganismos que se desarrollan en medios orgánicos poco comunes, caso en el cual se omiten otros compuestos de carbono. Contienen reactivos químicos que traen como resultado determinado tipo de Medios diferenciales* crecimiento bacteriano después de la incubación (observación de hemólisis y coloraciones de las colonias). Para determinar el tipo de crecimiento producido por los microorganismos, así Medios para como la capacidad para producir cambias identificación químicos, se utiliza de manera convencional una amplia variedad de medios de cultivo.

* Existen medios que pueden cumplir funciones mixtas es decir permiten aislar organismos y muestran una reacción o cambio químico especifico de metabolismo como coloraciones de colonias o cambios de color del medio, es decir selectivos y diferenciales al tiempo. La presentación comercial de los medios sintéticos y deshidratados puede ser en polvo o granulados. En el mercado se pueden encontrar medios listos para fundir o medios servidos en placas petri o tubos. 4.18 Medios de cultivo granulados Son medios de cultivo elaborados a partir de materias primas sometidas a molienda, mezclado, pulverización y granulación (Aglutinación de la mezcla polvorienta) Este tipo de medios tienen algunas ventajas frente a los medios tradicionales en polvo, como lo es:  Reduce alergización o respiración de sustancias tóxicas por producción de polvo.  Menor adherencia a las paredes de los recipientes  Mayor facilidad de pesaje.

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  

Mejor humectabilidad (grumos fácilmente solubles) No se produce disociación de todos los componentes, en el almacenamiento prolongado. Mejor conservación. ALMACENAMIENTO Y CONSERVACIÓN

Los medios de cultivo deshidratados se deben conservar en lugar seco, protegidos contra la luz, a una temperatura entre 15 a 30ºC y en envases bien cerrados. Después de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben cerrarse firmemente. Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos cortos, máximo de una semana y lo más conveniente es almacenarlos a temperatura de refrigeración (máximo 4ºC), aunque algunos medios que contienen tioglicolato se conservan mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por un tiempo máximo de 4 días. Bajo condiciones óptimas de almacenamiento los medios deshidratados conservan sus cualidades durante el tiempo indicado y hasta la caducidad impresa en la etiqueta del recipiente. A los medio de cultivos se les realiza Test de esterilidad, ya sea cuando están deshidratado (Ecométrico), o preparados. En el último caso se toma del lote una muestra no inferior al 5%, incubándose estas muestra a 37ºC/24h. Finalizado el tiempo de incubación se observa si presenta crecimiento microbiano con el fin de descartar los medios contaminados. En que cosiste el método ecometrico para evaluación de medios de cultivo PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Es un proceso clave en el trabajo de rutina e investigación bacteriológica. Para obtener un producto final bien terminado (medio de cultivo) deberá contarse con la habilidad, destreza, conocimientos básicos en fisicoquímica y bacteriología. 1. Disolución del medio de cultivo deshidratado: Se debe emplear agua limpia, recién destilada o desmineralizada y con pH lo más cercano posible al neutro. Los recipientes a usar deben ser lo suficientemente grandes para que el medio sea agitado con facilidad. Inicialmente se añade la mitad de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensión homogénea; después se incorpora la cantidad de agua restante. Todo tipo de medio de cultivo es sensible al calentamiento, no debe calentarse más de lo estrictamente necesario. Leer siempre la etiqueta del envase, en caso de que no deba ser sometido a ulterior esterilización en autoclave, es imprescindible prestar atención en su disolución completa, esto se confirma cuando al agitar no se adhiere a la pared interna del recipiente ninguna partícula de agar o medio y la solución resbala libremente. Si la preparación es de más de 2 litros, se recomienda disolver el medio de cultivo en una décima aproximada a la cantidad prevista de agua y dejarla irrigar durante 15 minutos; calentar a ebullición el agua restante, agregar ésta agua con constante agitación al medio humedecido, y calentar hasta su completa disolución.

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2. Esterilización: Antes de su esterilización y después de su completa disolución se debe repartir el medio de cultivo en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo de investigación, Excepto si corresponde a cajas de petri. La esterilización, si así lo indica la etiqueta, se lleva a cabo en el autoclave a 121ºC a 15 libras de presión por 15 minutos. Tras la esterilización y después de haber alcanzado el equilibrio de presiones (válvula abierta) y para evitar la sobrecarga térmica del medio de cultivo, este debe sacarse enseguida del autoclave y enfriar los recipientes rápidamente a temperatura de vertido entre 45 y 50º C, así se evitará alterar el medio de cultivo. 3. Vertido en placa: Previamente remover el medio de cultivo oscilando el recipiente en sentido circular para entremezclarlo de manera uniforme. Verter el medio a las cajas de petri a la temperatura de vertido evitando la formación de humedad en la tapa de la caja de petri. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente con la llama no luminosa de un mechero de bunsen. 4. Tubos de agar inclinado y sin inclinación: Los tubos llenos de medio de cultivo esterilizado, todavía líquido, se colocan en una posición inclinada de tal forma que se forme una placa de aproximadamente 3 cm. y una superficie inclinada de iguales dimensiones. (Agar inclinado en pico de flauta). En los casos en los cuales se requiere el medio sin inclinar, estos deben dejarse solidificar en posición vertical sobre una gradilla. POSIIBLES DEFECTOS EN LA MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO  Apelmazamiento de los medios de cultivo deshidratados. Se debe a una conservación en ambiente exclusivamente húmedo, puede ser la causa de envase abierto por tiempo prolongado o dejar mal cerrado el envase después de su uso o por último que el medio de cultivo este pasado de fecha. Se recomienda después de usarlos, cerrarlos muy bien y almacenarlos en posición horizontal.  Desviación del pH. Causado por utilización de agua no neutra, envase mal cerrado, sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparación o medio pasado de fecha.  Turbidez. Precipitación causada por uso de recipientes incorrectamente limpios, sobrecalentamiento, pérdida de agua por evaporación del medio.  Escasa estabilidad del gel. Debido a la proporción inadecuada del medio de cultivo deshidratado, mala disolución, ineficiencia en la agitación.  Medios de cultivo contaminados: por esterilización deficiente o contaminación ulterior a su preparación.  Colonias inconcretas o desleídas. Causada por superficie del medio húmeda y por demasiado inóculo en la siembra.

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CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO Medios simples:  Agar Nutritivo: Contiene extracto de carne, peptona, agar.  Caldo Nutritivo: Contiene extracto acuoso de carne adicionado de peptona al 1% y cloruro de sodio al 0.5%. Por ejemplo, BHI (Brain Heart Infusion), TSB (caldo se soya tripticasa), Nutrient broth.  Blood Agar Base o Trypticasa Soya Agar: Medio sólido que contiene peptona, enriquecido con sangre desfibrinada de conejo al 7%. Usado para el desarrollo de todo tipo de bacterias y especialmente para observar la actividad hemolítica. MEDIOS ENRIQUECIDOS:  Agar Sangre: Al medio agar sangre se le añade sangre de conejo desfibrinada al 7% estéril cuando este tenga una temperatura de 45º C luego de su esterilización.  Agar Chocolate: Consiste en un agar sangre que antes de su solidificación se lleva a 100º C por 1 minuto (ebullición), así se rompen los glóbulos rojos tomando un color marrón. Se usa para el aislamiento de Haemophilus y Neisseria sp.  Medio Tioglicolato: Permite el aislamiento de aerobios tolerante y anaerobios. Debe conservarse en la oscuridad, en tubos tapa rosca, de manera que la anaerobiosis se mantenga en el fondo y la aerobiosis en la superficie. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES:  Agar Mac Conkey: Medio selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa, y rojo neutro.  Agar SS: Contiene sales biliares en mayor concentración que el agar Mac Conkey y verde brillante que impide el crecimiento de bacterias coliformes pero permite el crecimiento de Salmonella y Shigella sp.  Agar EMB (Eosina Azul de Metileno): Contiene colorante que impide el crecimiento de bacterias Gram positivas. E. coli crece dando colonias con brillo metálico característico.  Medio Telurito: Permite el crecimiento de Corinebacterias, Staphylococcus, Listerias. El telurito de potasio al 2% es reducido por las Corinebacterias reductoras apareciendo colonias de color gris-negro.  Medio Sabouraud: Contiene dextrosa peptona o maltosa agar, pH entre 5 - 5.5 inhibiendo el desarrollo de microorganismos que no sean hongos. MEDIOS DE TRANSPORTE  Mantienen viables los microorganismos de una muestra antes de que se procesen, los conserva evitando su multiplicación y su muerte.  Medio de Stuart: Se utiliza para transportar muestras de materiales purulentos

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recogidos con escobillón estéril.  Medio de Buffer Glicerinado: Permite el transporte de muestras de materia fecal para coprocultivos manteniendo la viabilidad de la Shigella. MEDIOS BIOQUÍMICOS DIVERSOS: Son aquellos que demuestran características bioquímicas particulares de las bacterias. Son: medios para fermentación de azucares, algunos como: TSI, Citrato, SIM, Caldo MR-VP, caldo malonato, etc. Comercialmente pueden encontrarse sistemas multipruebas bioquímicas con 10 o más parámetros que permiten una más rápida y precisa identificación de las propiedades metabólicas del microorganismo y su consiguiente identificación. También existen sistemas automatizados para la identificación bacteriana. 5.Procedimiento Procedimiento para preparación medios de cultivo 1. Haga el cálculo correspondiente para la preparación del medio de acuerdo con las indicaciones del profesor. 2. Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos. 3. Teniendo en cuenta el volumen de agua que debe utilizar, haga la relación de medio a pesar de acuerdo a lo especificado por la etiqueta del medio. 4. Pese la cantidad de medio necesaria de acuerdo a sus cálculos 5. Mezcle el medio deshidratado con la mitad del agua, agite suficientemente y agregue el agua restante. Lleve a ebullición si es necesario (en el caso de agares.) 6. Esterilice en autoclave según las indicaciones que mencione la casa comercial. 7. Finalizada la esterilización sirva asépticamente aproximadamente 15 o 20 ml. del agar en la caja de petri o el volumen adecuado según el tamaño de los tubos. 6.Cuestionario Complete la información del siguiente cuadro MEDIO DE CULTIVO CALDO TETRATIONATO

BISMUTO SULFITO

COMPOSICIÓN

PREPARACIÓN

USO

INTERPRETACIÓN

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MEDIO LOWESTEIN JENSEN

–

MEDIO THAYERMARTIN

BAIRD PARKER

LMX/FLUOROCU LT

READYCULT

CHROMOCULT

AGAR/CALDO BHI

7.Bibliografías Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana. Pg. 24-32 Disponible en: https://books.google.com.co/books? id=TdsoWPEYaoUC&pg=PA24&dq=medios+de+cultivo&hl=en&sa=X&ved=0ahUKE wjX1JeOjZLPAhXJJB4KHe6nDF4Q6AEIKzAC#v=onepage&q=medios%20de %20cultivo&f=false López T., Torres C. Trabajo Práctico 4, Medios de Cultivo. Universidad Nacional del Nordeste, 2006. Disponible en: http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf

PRACTICA 4 Siembra y características de los cultivos bacterianos 1.Objetivos -

Practicar

las

diferentes

técnicas

de

siembra

para

el

cultivo

de

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microorganismos. -

Identificar los diferentes aspectos morfológicos en los cultivos de las bacterias como una de las herramientas guía para la identificación.

2.Materiales -

Asas bacteriológicas. Hisopos esterilizados

3. Reactivos -

Tubo con agar nutritivo inclinado. Tubo con agar nutritivo sin inclinar Tubo con caldo tioglicolato. Cajas de agar nutritivo Cultivos de 24 horas en caldo nutritivo, en agar nutritivo inclinado y en caja de petri de: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, y Bacillus sp.

4.Marco Teórico El proceso de colocar las bacterias en medios de cultivo recibe el nombre de siembra, esta la podemos realizar a partir de muestras biológicas (orina, pus secreciones, etc.), de análisis para control de calidad (alimentos, aguas, cosméticos, medicamentos, etc.) o de un cultivo bacteriano a otro; si la realizamos de un cultivo a otro la denominamos subcultivo o repique. Para el estudio de las bacterias es necesario además de conocer su morfología microscópica conocer su morfología macroscópica a partir de su crecimiento en medios de cultivo; esta se observa en las colonias bacterianas; adicionalmente es posible evaluar el comportamiento de ellas frente a los diferentes compuestos nutritivos o proporcionarles aquellos nutrientes adecuados para favorecer su desarrollo. Existen técnicas adecuadas para realizar estos cultivos. Algunos elementos importantes para realizar siembras son: el mechero (de alcohol o de bunsen), el asa bacteriológica y los medios de cultivo ya preparados y atemperados a 37ªC en la incubadora; contando con estos implementos podemos realizar la siembra.

SISTEMAS DE SIEMBRA La técnica más usada en el laboratorio de microbiología es probablemente la transferencia de microorganismos de un ambiente a otro con el propósito de cultivarlos. Para determinar los caracteres de cultivo de las bacterias, es preciso obtenerlas en cultivo puro. Existen varios métodos para aislar las bacterias en cultivo puro con el fin de evaluar sus características en estos medios.

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Se entiende por cultivo puro (axénico) una población de células, las cuales todas proceden de una misma célula. Existe gran variedad de técnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas en cultivo puro.

TIPOS DE SIEMBRA 1. Siembras en cajas de Petri: AGOTAMIENTO

Siembra por Agotamiento: Es un buen método para el aislamiento de colonias, mediante ella buscamos obtener colonias separadas a partir de un inóculo. Para su realización se toma la caja de petri en la palma de la mano (aquella que utilice con mayor frecuencia) ligeramente inclinada; con la mano contraria se manipula el asa de argolla previamente esterilizada por flameado directo a la llama del mechero y con ella se recoge el material de cultivo para colocarla en un área periférica de la caja haciendo movimientos circulares para homogeneizar el inóculo, en caso de utilizar escobillón se inocula con este el material, posteriormente se trazan estrías paralelas con mayor separación hasta la mitad o tercera parte de la caja, se esteriliza el asa y se hace girar la caja en sentido contrario a las manecillas del reloj, se procede ahora en la superficie libre a trazar estrías en la misma forma ocupando

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la mitad de este espacio; se esteriliza nuevamente el asa y se gira la caja nuevamente, trazando estrías perpendiculares con mayor separación a las realizadas previamente en el cuadrante libre. Finalmente se esteriliza el asa antes de descartarla (Ver esquema). Siembra masiva: Este método es muy utilizado para obtener un gran número de microorganismos. Esta técnica de siembra utiliza un hisopo el cual se pasa por toda la superficie de la placa en distintas direcciones y finalmente por el borde para que el crecimiento de los microorganismos sea total en la superficie de la placa. Siembra por punción: Método de siembra utilizado para observar el crecimiento de hongos y así más adelante establecer su morfología. Consiste en tomar parte de micelio con un asa micológica y por una punción suave en el centro de la caja inocular el microorganismo a estudiar.

Siembra masiva

Siembra por punción

2. Siembra en tubos: La siembra de medios contenidos en tubos requiere mayor cuidado puesto que un solo organismo contaminante del aire puede superar en crecimiento al microorganismo de interés, por lo tanto se deben tener las siguientes precauciones:  Mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes externas del tubo y no en la boca de éste.  Los tapones se deben mantener en la mano contraría a aquella que contiene el tubo, sosteniéndolos entre el dedo meñique, el anular y el dedo del corazón. Nunca deben colocarse sobre la mesa de trabajo o algún otro lugar.  Flamear la boca del tubo.  Esterilizar el asa.  Sumergirla en el medio sin tocar las paredes del tubo.  Enfriarla en una parte del medio.  Tomar el inóculo con el asa.  Después de practicar la siembra, esterilizar el asa y flamear nuevamente la boca del tubo.

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CLASES DE SIEMBRA EN TUBO Estría

Mixta

Picadura

Siembra en estría: Se realiza en un tubo, con medio sólido inclinado en bisel y deslizando el asa sobre la superficie de manera que se marquen surcos o estrías. Siembra en picadura: Se designa con este nombre a la siembra que se realiza con asa recta en tubos con medios sólidos y semisólidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa cargada con el microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa al fondo del tubo. Siembra mixta: se realiza igualmente siembra en picadura hasta el fondo del tubo y luego siembra en estría, deslizando el asa por la superficie en bisel marcando estrías. Siembra en tubo en medio líquido: Para transferir material a partir de un medio líquido o sólido a otro líquido, puede usar el asa bacteriológica o en algunos casos pipetas estériles o en otros escobillones. Si usted utiliza asas bacteriológicas inocule el asa en el medio líquido haciéndola rotar. NOTA: en cualquier siembra que usted realice debe marcar previamente las cajas de Petri o los tubos de manera clara, completa, legible, con la identificación respectiva y la fecha. Para análisis clínico marcar siempre las cajas en la base de la placa petri y para análisis de control de calidad de alimentos u otros materias primas, marcar las cajas en la tapa de la placa o caja petri. Luego de realizada la siembra, usted debe proporcionar la temperatura y el tiempo adecuado para la proliferación o crecimiento bacteriano, para ello dispone de la incubadora o en dado caso, un lugar adecuado a temperatura ambiente. RECUERDE QUE LAS CAJAS DE PETRI SE INCUBAN INVERTIDAS, SI EL INOCULO NO SE HA ADSORBIDO ESPERE 10 MINUTOS, SI ESTE TIEMPO NO ES SUFICIENTE, INCUBE LAS PLACAS CON LA TAPA HACIA ARRIBA POR 30 MINUTOS ANTES DE INVERTIRLAS. Para impedir que el agua de condensación que pueda formarse en la tapa de la caja y caiga sobre el medio dispersando el crecimiento bacteriano y evitando la formación clara de las colonias.

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MORFOLOGIA MACROSCÓPICA Cuando los microorganismos crecen sobre medios de cultivo exhiben diferencias en la apariencia macroscópica de su crecimiento, estas diferencias llamadas características culturales son la base para la separación de ellos en grupos taxonómicos. Las características culturales de los microorganismos conocidos son consignadas en Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology y determinadas por el cultivo de los microorganismos en agar nutritivo inclinado y en placas de petri, en caldo nutritivo y en gelatina nutriente.

5

Agar Nutritivo Inclinado: Los cultivos en este medio se inoculan en una sola línea recta y se evalúan de la siguiente manera

1. Abundancia de crecimiento: la cantidad de crecimiento es designada como ninguna, leve, moderada o abundante. 2. Pigmentación: Los microorganismos cromogénicos pueden producir pigmentos intracelulares que son responsables de la coloración de las colonias; otros microorganismos producen pigmentos solubles extracelulares que son excretados en el medio y también producen un color; sin embargo la mayoría de los microorganismos son no cromogénicos y aparecerán desde el blanco al gris. 3. Las características ópticas pueden evaluarse con base en la cantidad de luz transmitida a través del crecimiento, estas características con descritas como opaca (ninguna transmisión de luz), translúcida (transmisión parcial) o transparente (transmisión total de la luz). 4. Forma: la apariencia del crecimiento de la siembra en una sola línea sobre la superficie del agar inclinado se designa así: a. Filiforme: crecimiento en forma de hilo con bordes lisos continuos. b. Equinulado: crecimiento en forma de hilo con bordes irregulares continuos. c. Barbado: colonias semiconfluentes o no confluentes. d. Difuso: Crecimiento difuso y reducido. e. Arborescente: crecimiento en forma de árbol. f. Rizoide: crecimiento en forma de raíz.

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Cultivos En Caldo Nutritivo: Son evaluados según su distribución y apariencia del crecimiento como sigue, A. B. C. D.

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Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y totalmente disperso. Floculante: crecimiento en agregados escamosos totalmente disperso. Película: crecimiento en la superficie como plataforma, grueso. Sedimento: Concentración del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o floculante.

Placas de Agar Nutritivo: Su descripción se realiza de colonias (agrupamiento bacteriano originado por su crecimiento y observable macroscópicamente) aisladas, se evalúa de la siguiente manera,

a. Tamaño: Grande, mediano, pequeño y puntiforme. b. Forma: Borde: * De borde regular: continuo. * De borde irregular: lobulado, ondulado, dentado, filamentoso, festoneado y arborescente. Elevación: * No elevada: plana. * Elevada: convexa, mamelonada, umbilicada y papilar. c. Superficie: Lisa o Rugosa. d. Consistencia: Blanda, dura o mucoide. e. Aspecto: brillante u opaco y mate o translúcido. f. Pigmento: amarillo, rojo, verde, etc. g. Hemólisis: parcial o alfa; total o beta y no hemólisis o gamma. La morfología de las colonias es un parámetro importante en el proceso de identificación bacteriana siendo las características comunes entre cada género bacteriano. Sin embargo la morfología puede alterarse por el tiempo de incubación, composición del medio de cultivo (excesiva desecación o humedad), etc.

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5. Procedimiento Procedimiento para siembras: 1. Siembre por picadura en un tubo de agar nutritivo sin inclinar. 2. Siembre por estría en un tubo de agar nutritivo inclinado. 3. Siembre de manera mixta en un tubo de agar nutritivo inclinado. 4. Siembre por agotamiento en una caja de agar nutritivo. 5. Siembre en forma masiva en una caja de agar nutritivo. 6. Siembre en un tubo de caldo tioglicolato o caldo nutritivo. Procedimiento para características de las bacterias en los diferentes medios: escriba cada una de las bacterias dada de acuerdo a las figuras. 6. Cuestionario 1. ¿Cuál es el objetivo o finalidad de una siembra por agotamiento? 2. ¿Cuáles son las condiciones que deben tenerse en cuenta para hacer una siembra? 3. Describa de manera ordenada los pasos a seguir para realizar una siembra. 4. En que agar realizó la siembra y cuál es su composición? 5. Qué es un inóculo? 6. Según los requerimientos de O2 como se clasifican los organismos? Explique cada una de estas clases. 7. El medio de tioglicolato permite el crecimiento de microorganismos aerobios, facultativos y anaerobios. Explique cómo se observa el crecimiento de cada uno de ellos en el caldo de tioglicolato. 8. En una caja de Petri con agar nutritivo como crecen las colonias de un bacilo, de un coco y de un rizobium -----registro fotografico

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9. Nombres de microorgamismos que presenten formas redondeadas, con pigmentación naranja, ejemplos de las imagines que mostro en la presentación. 7. Bibliografías Aquiahualt M., Volke T., Manual de Prácticas de laboratorio de Microbiología General, Universidad Autónoma Metropolitana, 2012, México. Disponible en: http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general. pdf Quiroz A., (2015). Microbiología 3-G Equipo #2. Disponible en: http://microbiologia3g128.blogspot.com.co/2015/11/patrones-de-crecimiento-enagar.html 8. Anexos ANEXO A. Morfología Celular (forma, tamaño y disposición bacteriana) COCOS: Son células esféricas, generalmente de 1  de tamaño. La división celular da lugar a una distribución característica de las células hijas. En el caso más simple las células hijas se separan resultando células aisladas. DIPLOCOCOS: Son pares de células que no se separan. ESTREPTOCOCOS: Cadenas de células esféricas que no se separan. TÉTRADAS: En las células aisladas se presentan divisiones en ángulo recto (como el género Gaffkya sp), formando cuadros de cuatro células. ESTAFILOCOCOS: Las células presentan un eje de división al azar, dando como resultado la agrupación de las bacterias en racimos. SARCINA: Las células presentan tres planos de división en ángulos rectos, produciéndose paquetes regulares de 8 a 16 bacterias cada uno. Esto solo ocurre en el género Sarcina sp. BACILOS: Bacterias cilíndricas en forma de varilla. Estas células presentan tamaños aproximadamente de 0,5 a 1  de ancho por 2 a 3  de largo. Se pueden encontrar aislados, en cadenas cortas y largas o en pares paralelos lo que en algunos casos facilita su clasificación. BACTERIAS EN FORMA DE COMA Y ESPIRAL: Se encuentran como células aisladas de variedad de tamaños, número de espiras y rigidez de la pared. Ejemplo: Campylobacter sp. Vibrio sp. Borrelia sp. y Treponema sp.  Las espiroquetas presentan forma de sacacorchos, son flexibles y pueden llegar a medir hasta 250 µ de largo.  Los espirilos son microorganismos gram negativos, móviles y flagelados.  Los vibrios o vibriones se presentan como bacilos curvos en forma de coma. BACTERIAS FILAMENTOSAS Y RAMIFICADAS: Los actinomicetos en un principio se consideraron hongos por su tipo de crecimiento, pero en realidad difieren en la composición de su pared y en el núcleo. Nocardia sp. (de importancia médica e industrial), presenta un crecimiento de filamentos compactos; Streptomyces sp. (de

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igual importancia), forma filamentos ramificados que dan origen a un micelio de dimensiones bacterianas. BACTERIAS CON YEMAS y/o APÉNDICES (PROSTECADAS): Presentan un crecimiento y división celular característico, al darse de una manera desigual en la célula, originándose una célula hija sin que la célula madre pierda su identidad. Como Rhodomicrobium sp. Pirella sp y Blastobacter sp. FORMAS DE INVOLUCIÓN: Es una morfología anormal que se encuentra a menudo en cultivos viejos (Típicos en Pasteurella pestis y Neisseria sp.). Estos tipos de células suelen no ser viables, pero sí lo son, al ser transferidas a un medio favorable, se dividen dando origen a células de morfología normal. Dentro de la morfología debe tenerse en cuenta la presencia de cápsula y endosporas, así como su posición dentro de la célula (terminal, subterminal, central).

PRACTICA 5 Tinciones Simples y Visualización de Bacterias 1.Objetivos -

Reconocer el microscopio óptico, su funcionamiento y las recomendaciones necesarias para lograr un mayor tiempo de vida útil del equipo.

-

Diferenciar e identificar aspectos morfológicos microscópicos de los microorganismos con el empleo de algunas tinciones simples.

-

Realizar algunas técnicas de tinción simple utilizadas en microbiología, su fundamento y aplicación.

2.Materiales Microscopio óptico. Portaobjetos y cubreobjetos. Solución salina estéril. Aceite de inmersión. Mechero de Bunsen. 3. Reactivos Soluciones colorantes: Cristal violeta, safranina, azul de metileno y carbol-fuschina. Cultivos bacterianos. 4.Marco Teórico MICROSCOPÍA

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Para todos los investigadores, estudiantes, y personal interesado en las ciencias biológicas es fundamental el conocimiento y manejo adecuado de equipos de magnificación como microscopios simples, compuestos, binoculares, electrónicos, microscopios estereoscópicos, entre otros, ya que estos instrumentos son parte fundamental del trabajo de campo y laboratorio de la Biología y ciencias afines. Principios de microscopía: El poder de resolución y el aumento (magnificación) son dos de las características del microscopio. Resolución: Es la capacidad que posee el microscopio de separar dos objetos adyacentes, es decir, es la capacidad que tiene un microscopio de poder distinguir dos objetos que se encuentran muy cercanos uno al otro, y depende de la longitud de onda de luz empleada, la densidad del medio circundante, y las aperturas numéricas de los lentes empleados en los objetivos y condensador, esto último hace referencia a la capacidad que tienen estos lentes para recibir el cono de luz que pasa a través de la muestra y proveniente de la fuente. Mientras menor sea la distancia que puede medirse entre dos puntos en un campo microscópico, mayor es el poder de resolución. La capacidad de aumento y resolución del microscopio depende del tipo de luz que se emplea. Los microscopios de luz permiten la resolución de objetos de tamaño mayor a la mitad de la longitud de onda de la luz utilizada, por tanto los microscopios ópticos que utilizan luz visible (La luz visible va del violeta 390 nm al rojo 780 nm) de 500 nm no permiten resolver objetos separados por distancias inferiores a 250 nm = 0,25 micras. Entre menor sea la longitud de onda de luz empleada, mayor poder de resolución logra un microscopio, entre mayor apertura numérica tenga, mayo será el poder de resolución. El ojo humano, en comparación, sólo puede resolver puntos separados por 25 a 100 micras que en promedio daría resoluciones 250 veces menores que el microscopio de óptico. El poder de resolución (d) de un microscopio se calcula a partir de la siguiente fórmula:

d= En donde:

 AN  an

λ= longitud de onda de luz empleada. AN = apertura numérica del objetivo. an = apertura numérica del condensador.

En la práctica la AN es igual a an, y por lo tanto la fórmula se resume así:  d= 2 AN

La apertura numérica se obtiene de la fórmula siguiente:

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AN = i senθ

En donde:

i = índice de refracción del medio que rodea la lente. Θ = mitad del ángulo de entrada del cono de luz que llega al condensador.

Entre mayor sea el índice de refracción del medio circundante (aire, vidrio, aceite de inmersión, etc.), mayor será el cono de luz originando un mayor poder de resolución. Si el medio circundante es el aire i = 1; si es el aceite de inmersión i = 1.56. Cuando se utiliza aceite de inmersión entre el portaobjetos y el objetivo, la apertura numérica puede aumentarse desde 0.65 (cuando el aire es el medio circundante y se emplea un objetivo de 40) hasta 1.25 (cuando se emplea aceite de inmersión y objetivo de 100), aumentando de esta manera el poder de resolución. Lo anterior lo podemos comprobar mediante un ejemplo sencillo:

Observación sin aceite de inmersión.

 = 500 nm. AN = 0,8. d= 500 d= 2 x 0,8

d= 312,5 nm.

Observación con aceite de inmersión.



 = 500 nm. AN = 1,3.

2 AN

d=

500 2 x1,3

d= 192,3 nm.

Mientras más pequeños sean los valores números de d, más grande será el poder de resolución de un microscopio, en el ejemplo anterior cuando se emplea aceite de inmersión d = 192,3 nm; es posible ver, como dos puntos separados, objetos entre los cuales existe una distancia mayor o igual a 192,3 nm los cuales no son resueltos como puntos separados en la observación sin aceite de inmersión, en donde solo se pueden resolver objetos distantes 312,5 nm o más. El aumento o magnificación: Es la capacidad que posee un microscopio de amplificar una imagen resuelta varias veces su tamaño original, esta propiedad es independiente del poder de resolución de un microscopio y está ligada con el poder de aumento de los lentes objetivos y oculares. El aumento de cualquier combinación de objetivo y ocular es el producto de los aumentos de estos componentes por separado, es decir, multiplicando el aumento de cada uno por el valor del otro. Este

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aumento es expresado generalmente en diámetros. Ej.: Una observación a través de un ocular de 10X y un objetivo de 40X pueden dar un aumento total de 400 diámetros (veces). Figura 1. Objetivos A = 60 indicando sus características.

Partes de un microscopio óptico compuesto: La mayoría de los microscopios compuestos tienen los mismos componentes básicos. Sin embargo, la disposición de muchos de esos componentes varía según el modelo y la marca, así como la posibilidad de presentar otras piezas que son opcionales. La mayoría de microscopios actuales están constituidos por tres componentes fundamentales, La óptica (Conjunto de lentes), la mecánica (Soportes del sistema óptico, iluminación y otras funciones) y el sistema de iluminación. Veamos cada uno de ellos: Partes

Oculares

Objetivos

Partes

COMPONENTE ÓPTICO Función El papel de los oculares consiste en aumentar, a manera de lupa, la imagen real proyectada por el objetivo tantas veces como indique el número inscrito en ellos. Posee dos lentes: la que queda cerca del ojo se llama ocular, la que queda en e! extremo inferior se llama colectora. Hay oculares de diferentes aumentos. En uno de los oculares (generalmente el izquierdo) se encuentra un anillo de Dioptrías, que sirve para ajustar la visión binocular. Son un conjunto de lentes que producen imágenes de la muestra aumentadas 4, 10, 40 o 100 veces, según se indique en los mismos. Constan de dos lentes, la que queda más cerca de la preparación se llama lente frontal y la que queda en la parte superior se llama lente posterior. La denominación de los objetivos se efectúa indicando su aumento propio, el cual se halla grabado en cada pieza. Se distinguen dos clases de objetivos los secos y el de inmersión; al primer tipo pertenecen los objetivos de aumento débil o mediano (5. 10, y 40). Los de inmersión son los de mayor aumento (100) con mayor poder de resolución. El poder de resolución está condicionado por la apertura numérica (AN). El objetivo de inmersión tiene una distancia focal muy corta y una AN muy limitada. Actúa a una distancia de solo 1 a 2 mm del objetivo

COMPONENTE MECÁNICO Función

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Base Brazo o columna Revólver Platina

Carro mecánico

Tubo o cabezal Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico

Partes Condensador

Diafragma (iris)

Filtro Foco o fuente emisora de luz

Parte inferior en la cual se apoya el microscopio. Es la porción central de la cual se debe tomar el microscopio Es la parte donde se ubican los objetivos. Está construido de manera que un sistema rotatorio engrane automáticamente. Se pueden rotar los objetivos simplemente girando el revólver. Placa cuadrada firmemente montada sobre el microscopio en forma horizontal. Presenta un orificio central para permitir el paso de la luz y sobre la cual se coloca la muestra que se va a observar. Sistema de 2 pinzas, ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la muestra en el eje X y el eje Y (izquierda – derecha y adelante – atrás respectivamente) mediante una serie de perillas ubicadas en el costado de la platina. Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y en la parte inferior se ubica el revólver. El cabezal puede ser monocular o binocular. En estos últimos se encuentra una escala de ajuste interpupilar, que permite mover los oculares hacia los lados y hacia el centro, con el fin de ajustar a la distancia de los ojos de quien usa el microscopio. Sirve para localizar la imagen, se acciona por medio de dos tornillos de cremallera que se encuentran a ambos lados del microscopio. Se utiliza para dar el enfoque adecuado a la imagen localizada con el tornillo macrométrico. Lleva un tambor graduado que se desplaza sobre un Índice fijo que sirve para indicar su posición. Es de extraordinaria precisión y por lo tanto muy delicado. Una vez enfocada la imagen con el lente de menor aumento solo se debe usar el tomillo micrométrico para cambiar de aumentos y dar la nitidez necesaria a la imagen.

SISTEMA DE ILUMINACIÓN Función Es un sistema de lentes convergentes entre la fuente de luz y la platina. Estos lentes concentran los rayos luminosos sobre la preparación (condensador de abertura). El condensador de campo está ubicado en la base del microscopio y su función es concentrar la luz proveniente de la fuente hacia el condensador de abertura, Está formado por un conjunto de láminas falciformes las cuales por medio de una palanca lateral se pueden cerrar concéntricamente regulando la cantidad de luz proveniente del condensador. El diafragma se estrecha en preparaciones no coloreadas para aumentar la profundidad de enfoque, en tanto que en preparaciones coloreadas que absorben luz, tiene que dilatarse. Usualmente los rayos luminosos emergen de la cara superior del condensador como un cono de luz con el vértice hada abajo. Los rayos no muy divergentes pasan a través del objetivo y cuanto más amplio es el alcance de la apertura numérica más amplio es el ángulo que puede investigarse pues mayor es el número de rayos divergentes que puede recoger. Es un disco de vidrio mate o de diferente color que se puede ubicar en la parte inferior del diafragma sobre un anillo transportable, este filtro permite seleccionar la longitud de onda de luz a emplear. Proporciona la luz necesaria para la observación de la muestra. Esta puede ser o bien espejos, Lámparas o bombillas. Si emplea espejos los cóncavos se usan cuando la luz requerida es menor (con lentes de 4, 10 y 40) y el espejo plano para mayor iluminación.

Unidades de medida utilizadas en microscopia simple: Las unidades de medida que utilizará normalmente son el milímetro (mm), el micrómetro (m) y el nanómetro (nm). 1mm = 1000 m = 1000000 nm.

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1 m = 0.001 mm = 1000 nm. 1 nm = 0.001m = 0.000001 mm. Cuidados con el microscopio: Para que este valioso equipo funcione adecuadamente y podamos sacar el mayor provecho de él, debemos tener en cuenta algunas medidas antes, durante y después de su uso. Solo de esta forma conservamos este instrumento para nuestro posterior uso y el de futuras generaciones.  Cuando transporte el microscopio, sujételo siempre con las dos manos (por la base y por la columna).  Sitúe el microscopio a unos 10 cm de la orilla de la mesa.  Para cambiar de objetivo, utilice la rosca estriada del revólver, no lo haga tirando de los objetivos, pues de esta manera se desajusta los sistemas de lentes y la propiedad parafocal (propiedad de mantener más o menos enfocada y en el mismo campo focal al cambiar de objetivo).  No use demasiado aceite de inmersión. Solo bastará una pequeña gota para realizar la observación.  Asegúrese siempre de haber limpiado el lente de inmersión después de usarlo, con papel especial para lentes. Si no se limpia el lente, después del uso del aceite, queda un residuo pegajoso que reduce la eficiencia del lente y puede permitir el crecimiento de mohos.  Cuando ya no se vaya a utilizar el microscopio o se desee cambiar de muestra, debe colocarse en el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, y con la platina abajo.  Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de enfoque.  Aprenda a mirar por el microscopio con los dos ojos abiertos.  No desarme ninguna parte del microscopio para limpiarlo, solo lo debe hacer personal capacitado.  Evite tocar con los dedos las lentes del microscopio. Evite emplear el microscopio si usted tiene pestañina ya que esta se acumula en los oculares reduciendo su eficacia, en cuyo caso deberá emplear los capuchones protectores de oculares.  No deje placas montadas en el microscopio  Prenda la bombilla únicamente en el momento de hacer las observaciones.  Al momento de apagar definitivamente el microscopio: Coloque el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, retire la muestra, limpie el objetivo de inmersión con papel especial o gasa y alcohol isopropílico sin frotar el lente, seque de inmediato el lente con otro papel, baje completamente la platina, ubique en 0 (cero) la perilla de intensidad de luz, apague el interruptor de la fuente y desconecte del toma corriente. Deje enfriar el bombillo dejando el microscopio en la mesa, para que el responsable del equipo lo revise y lo guarde en el sitio adecuado y NUNCA enrolle el cable sobre el microscopio.  Cubra el microscopio con el forro protector. RECUERDE seguir todas las recomendaciones dadas por el instructor de la práctica. Observando los microorganismos a través de un microscopio podemos apreciar su morfología (tamaño, forma y disposición). Si observamos con mayor número de aumentos podemos apreciar, tanto en la superficie como dentro de la célula, un mayor número de estructuras. La ausencia o presencia de ciertas estructuras nos

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van a servir para clasificar los microorganismos.

Figura 2. Partes del microscopio compuesto binocular.

MORFOLOGÍA MICROSCOPICA DE LAS BACTERIAS Tamaño: Las bacterias, Invisibles al ojo humano, se miden en µm que equivale a 10-3 mm. El tamaño de las bacterias varía dependiendo de las especies entre menos de 1µm y 250 µm; siendo lel promedio entre 1 y 10µm. Una característica de las células bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de la superficie y el volumen de la célula. Esto significa que poseen una gran superficie a través de la cual pueden entrar nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual pueden realizar muchas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. Así, por ejemplo Escherichia coli tarda 20 minutos en dividirse mientras que una célula de mamífero en laboratorio tarda de 13 a 24 horas. Forma: La forma de una bacteria viene determinada por la rigidez de su pared celular. Las bacterias poseen una de tres formas fundamentales: esférica, cilíndrica o espiral. Las células esféricas se denominan cocos y suelen ser redondeadas aunque pueden ser ovoides o elípticas. A las de forma cilíndrica se les denomina bacilos. Los extremos de estas células suelen ser redondeados, rectos, en forma de huso o cuerno. Las de forma espiral o helicoidal se las denomina espirilos y se caracterizan por su forma de sacacorchos. Existen modificaciones a estas tres formas fundamentales y aunque la mayor parte de las bacterias mantienen su forma constante, algunas especies pueden variar la forma, por lo que se les llama pleomorficas. Arthrobacter es un ejemplo de pleomorfismo debido a que su forma cambia en función de la edad del cultivo.

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También exhiben pleomorfismo aquellas bacterias que no poseen pared celular como es el caso de los micoplasmas. Otro ejemplo son las formas de L, ellas corresponden a bacterias que carecen de pared celular debido a una situación de estrés (choque térmico u osmótico, antibióticos, etc.), pero cuando cesa el estrés sintetizan de nuevo la pared celular. Debido a que la forma es un carácter taxonómico, el pleomorfismo puede inducirnos a confusión ya que podemos pensar que un cultivo está contaminado con otro tipo de bacteria. Sin embargo el pleomorfismo no suele ser lo más frecuente. Disposición: Muchas veces al mirar al microscopio se observan células unidas unas a otras. Mientras que las bacterias de forma espiral (espirilos) suelen ser células separadas, otras especies suelen crecer en una disposición característica, disposición que va a depender del plano en el que se realice la división celular y si la célula hija permanece junto a la madre una vez realizada la división celular. Cada una de estas disposiciones es típica de una especie particular y puede usarse en identificación. Hay que tener en cuenta que raramente todas las células de una especie se disponen exactamente de la misma manera, por lo cual se toma en cuenta la disposición predominante cuando se describe esta cualidad en las bacterias. Cuando un coco se divide en un plano forma un diplococo o dos células juntas (Neisseria). Cuando un coco se divide en un plano y permanece unido después de varias divisiones formando una cadena se denomina estreptococo (Streptococcus). Si las células se dividen en más de un plano o dimensión, la disposición es más complicada. Cuando un coco se divide en ángulo recto al primer plano de división forma tétradas (Pediococcus). Una posterior división en el tercer plano puede resultar de un paquete cúbico de ocho células conocido como sarcinas (Sarcina). Si la división en los dos planos es de forma irregular se forman racimos de uva (Staphylococcus). Los bacilos generalmente no se agrupan en disposiciones características, aunque hay excepciones. Por ejemplo, el bacilo de la difteria tiende a agruparse en empalizada. Dentro del género Bacillus algunas especies forman cadenas y se llaman estreptobacilos. METODOS DE TINCIÓN Debido al tamaño de los microorganismos y su protoplasma, el cual posee un índice de refracción cercano al agua, se requiere generalmente de tinciones biológicas para visualizarlos adecuadamente. Las tinciones se preparan en soluciones acuosas y orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que confieren una variedad de colores a los microorganismos. Los colorantes no solo sirven para la tinción directa de materiales biológicos, sino que también se pueden emplear a fin de demostrar las funciones fisiológicas de los microorganismos con el empleo de tinciones supravitales. Así mismo los colorantes sirven como indicadores de cambio de pH y como indicadores redox para demostrar la presencia o ausencia de condiciones anaerobias. Casi todos los colorantes biológicos son derivados del alquitrán. La

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estructura fundamental alrededor de la cual están construidos químicamente la mayoría de los colorantes es el anillo bencénico. En términos generales la clasificación de los colorantes es convencional y se basa en la presencia de grupos cromóforos. Son ácidos o básicos no necesariamente ligados con el pH, sino más bien, si un parte de la molécula es iónica, o catiónica; así los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear; los ácido por su parte reaccionan con sustancias básicas como las estructuras del citoplasma y poseen además una elevada afinidad por el hidrógeno. Cuando todos los sitios moleculares aceptores de hidrógeno están ocupados, el colorante se halla en su estado reducido y es generalmente incoloro y se denomina "Leucocompuesto". Teniendo en cuenta este concepto desde un criterio opuesto, un colorante retiene su color en tanto sus afinidades por el hidrógeno no estén completamente satisfechas. Dado que el oxígeno posee generalmente mayor afinidad por el hidrógeno que muchos colorantes, el aire retiene el color. Esta es la razón por la cual ciertos colorantes como el azul de metileno, se utilizan como indicadores aerobios, ya que el indicador se vuelve incoloro en ausencia de oxígeno. 5. Procedimiento Preparación de frotis para tinción 1. Limpie las láminas. Esta es esencial ya que grasa o aceite de los dedos no permiten una buena elaboración de frotis. 2. identifique su lámina con nombre o numeración de la muestra. 3. Si la muestra es de cultivo en caldo:  tome una o dos asadas de células suspendidas y aplíquelas directamente sobre la lámina con un asa de inoculación previamente esterilizada y extienda el volumen allí aplicándolo de forma circular. Si la muestra de cultivo sólido:  Coloque una gota de solución salina estéril sobre la lámina o portaobjetos.  Transfiera una pequeña cantidad de células de desde el cultivo a la lámina con el asa de inoculación estéril, emulsionando con la solución salina estéril obteniendo así una suspensión semitransparente de forma circular.  Permita que el extendido se seque al aire. NO SOPLE U ONDULE LA PREPARACIÓN EN EL AIRE.  Fije la preparación al calor para evitar lavar el frotis durante la tinción. Realizar esta fijación pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un mechero de Bunsen. Si la muestra proviene de un raspado con escobillón:  Tome uno de los hisopos estériles y realice un raspado de las diferentes superficies que le indique su profesor.  Coloque una pequeña gota de solución salina estéril.  Homogenice uniformemente el contenido del hisopo con la gota de agua.  Permita que el extendido se seque al aire.  Fije la preparación al calor para evitar lavar el frotis durante la tinción. Realizar esta fijación pasando el extendido seco dos o tres veces sobre la llama de un mechero de Bunsen. Procedimiento para tinciones simples 1. Realice el frotis con la técnica adecuada y fíjelo al calor con la llama del mechero

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de bunsen. 2. Coloque la lámina en la rejilla de coloración y vierta sobre el frotis uno de los siguiente colorantes usando el tiempo de exposición adecuados en cada caso según la coloración que desee: *carbol-fuschina, 15 a 30 segundos *cristal violeta, 20 a 60 segundos. *azul de metileno, 1 a 2 minutos. 3. Lave el frotis con agua de la llave y remueva el exceso de colorante. 4. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada. 5. Observe al microscopio. Observación al microscopio 1. Coloque siempre el objetivo de menor aumento; ponga la preparación fijándola por medio de las pinzas del carro sobre la abertura de la platina, ajuste la fuente hasta que el haz de luz este en el centro del campo. 2. Asegúrese de que el diafragma esté abierto y subido contra la platina. Súbalo tan alto como se pueda. 3. Para enfocar el objeto pase al objetivo de 10X y suba primero la platina tan cerca del objetivo como se pueda con ayuda del tornillo macrométrico, mirando de lado. Tenga cuidado de no “clavar” el objetivo sobre la lámina ya que se corre el riesgo de dañar el lente como la preparación. Luego mirando por el ocular vaya bajando y/o subiendo muy lentamente la platina hasta que el objeto se haga visible (enfoque grueso). Si es necesario ajuste la iluminación. Mueva los oculares, para ajustar la visión a su distancia interpupilar. 4. Ajuste la visión binocular con el anillo de dioptrías de la siguiente manera: 5. Mire con el ojo derecho por el ocular respectivo, cubriendo el ocular izquierdo, y enfoque con la perilla micrométrica lo mejor posible (enfoque fino). Ahora proceda a ajustar el izquierdo así: Cubra el ocular derecho, mire con el ojo izquierdo por el respectivo ocular y enfoque con el anillo de dioptrías hasta obtener una imagen lo más clara posible. 6. Luego cambie el lente, por el siguiente de mayor aumento seco (40X) esta quedará casi en el foco, suba ligeramente el condensador. Para enfocar definitivamente la imagen, use el tomillo micrométrico muy despacio. Si la imagen no queda enfocada devuélvase al lente de 10X y repita la operación. Tenga cuidado de no “clavar” el objetivo sobre la preparación, ya que el lente de 40X trabaja muy cerca de la misma. 7. Para la observación en lente de mayor aumento (Lente de inmersión 100X), gire el revólver medianamente hasta que el lente de 100X quede a mitad de camino, coloque una pequeña gota de aceite de inmersión en el sitio de la lámina que se va a examinar sobre el punto de luz. Evite colocar un exceso de aceite. Gire el resto del revólver hasta que el objetivo de inmersión toque el aceite y se enfoque el campo total (la preparación debería estar prácticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso y correcto con el lente de 40X, de no ser así es preferible realizar de nuevo el enfoque en otro campo y partiendo desde el lente de 10X). Gire muy lentamente el tomillo micrométrico ya que debido a la corta distancia que hay entre la lámina y el lente el objeto podría salir del foco muy fácilmente y se podría estropear la preparación. RECUERDE: Una vez haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación ya no

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puede volver a enfocar el objetivo de 40X sobre el mismo campo, ya que impregnaría el lente de aceite estropeándolo. En este caso es preferible emplear otro campo de enfoque. 6. Cuestionario 1. ¿Cuál es la utilidad de los colorantes en microbiología? 2. ¿Qué son químicamente los colorantes? 3. ¿Cuál es el propósito de la fijación de un frotis bacteriano? 4. ¿Según su morfología, cuantas clases de bacterias se conocen? ¿Qué nombre reciben? Dibújelas. 5. Nombre todos los tipos de agrupación bacteriana de manera sistemática. 6. Completa el siguiente

cuadro dibujando

la morfología y/o agrupación

correspondiente, recuerda emplear el color respectivo según la tinción

COCOS

ESTREPTOBACILOS

DIPLOCOCOS

BACILOS

ESTREPTOCOCOS

ESPIRILOS

TÉTRADAS

ESPIROQUETAS

SARCINAS

VIBRIOS

ESTAFILOCOCOS

YEMAS Y/O APÉNDICES

BACTERIAS FILAMENTOSAS

BACILOS EN EMPALIZADA

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7. Bibliografía 1. Narváez J., La Microscopía, herramienta para estudiar células y tejidos. Universidad de los Andes, Venezuela. Recuperado de: http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/introduccion.ht m Sánchez R., Oliva N. (2015). Historia del microscopio y su repercusión en la Microbiología, Rev Hum Med vol.15 no.2 Ciudad de Camaguey. Recuperado de: http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1727-81202015000200010

PRACTICA 6 Tinciones Bacterianas Compuestas 1.Objetivos -

Aplicar algunos de los métodos de coloración, basándose en las propiedades estructurales de las bacterias para observación de estructuras internas y externas de los microorganismos.

-

Familiarizarse con las bases químicas y teóricas de la técnica de coloración diferencial de Gram.

-

Describir las características morfológicas y tintoriales de las estructuras observadas.

-

Adquirir destreza en la preparación de frotis bacterianos.

2.Materiales Microscopio. Papel para limpiar lentes. Láminas o portaobjetos. Asas bacteriológicas. Mechero de bunsen. Bandeja de coloración. Baño serológico. Pinzas de madera. Papel absorbente. Solución Salina estéril. Hisopos.

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Goteros. Aceite de inmersión. 3. Reactivos Reactivos de coloración de Gram. Reactivos para coloración de Ziehl-Neelsen. Reactivos para coloración de esporas. Reactivos para coloración de cápsula. Reactivos para coloración de flagelos. Reactivos para coloración de gránulos. Cultivos bacterianos de 24 horas. Vacuna de BCG. 4. Marco Teórico La morfología de los microorganismos puede ser observada a partir de preparados frescos o fijados y teñidos por algunos de los métodos de tinción conocidas, ya que por su misma estructura son difíciles de visualizar en su estado natural. Las tinciones biológicas y los procedimientos de tinción en unión con la microscopía de luz son una herramienta básica importante en microbiología, permitiendo estudiar las propiedades de los microorganismos y su división en grupos específicos para propósitos diagnósticos. En algunas ocasiones se hace necesario fijar los microorganismos y durante este proceso se produce la muerte celular debido a la coagulación del protoplasma, preservándose la morfología celular además de adherirlos a la lámina. El agente más utilizado para fijar es el calor, aunque puede también utilizarse alcohol y otros compuestos químicos que frecuentemente permiten una mejor diferenciación de los detalles como las soluciones de etanol-éter, alcohol sublimado (Cloruro de Mercurio II, Etanol absoluto y agua destilada), y solución de ácido Ósmico (vapores). En el laboratorio de microbiología se utilizan diversos métodos de tinción o coloración para visualizar los detalles morfológicos de las bacterias, algunas de las coloraciones más empleadas en microbiología son: coloración de Gram, coloración de Ziehl-Neelsen, coloración de Alberth, Coloración de Stoltemberg, coloración de Hiss, coloración de Dorner, etc. Químicamente un colorante se define como un compuesto orgánico que contiene un grupo benceno más un grupo cromóforo y un auxocromo. Un cromóforo es un grupo químico que imparte color al benceno (solvente orgánico) mientras un auxocromo es un grupo químico que le confiere la propiedad de ionización al cromógeno, capacitándolo para formar sales y unirse a fibras o tejidos. La habilidad de un colorante para unirse a macromoléculas de componentes celulares (proteínas, ácidos nucleicos, etc.) radica en la carga eléctrica tanto de la porción cromogénica como del componente celular a teñir. Los colorantes ácidos son aniónicos, es decir que en forma ionizada la porción cromogénica exhibe una carga negativa que tendrá afinidad por los constituyentes

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de la célula cargados positivamente. Las proteínas, componentes celulares cargados positivamente se unirán y aceptarán el color de un cromógeno aniónico cargado negativamente de una tinción ácida. Los colorantes básicos son catiónicos, es decir la ionización de la porción cromogénica exhibe una carga positiva lo cual permite una fuerte afinidad por los constituyentes de la célula cargados negativamente. Los ácidos nucleícos, componentes celulares cargados negativamente, se unirán y aceptarán cromógenos catiónicos cargados positivamente; un ejemplo es el azul de metileno. Los colorantes básicos son los más comúnmente empleados para tinciones bacterianas, la presencia de carga negativa en el exterior celular, repele los colorantes ácidos y evita su penetración en la célula. La siguiente tabla resume algunas técnicas de tinción y los propósitos de cada una: TIPOS DE TÉCNICAS DE TINCIÓN Tinciones Diferenciales Tinciones Simples Emplea dos colorantes: tinción y contraste Usa un solo colorante Separación en Grupos Visualización de Estructuras Para visualización de: Tinción de flagelos. Morfología microscópica (cocos, Tinción de Gram. Tinción de cápsula. bacilos, espirales) y arreglos o Tinción ácida-rápida. Tinción de esporas. agrupaciones (cadenas, pares, Tinción nuclear. tétradas, etc.)

TINCIÓN DE GRAM Nombrada así en honor al bacteriólogo Christian Gram. Clasifica y diferencia las bacterias en dos grupos principales: Gram positivas y Gram negativas. La tinción emplea 4 reactivos diferentes: 1. Cristal Violeta: Colorante primario de color violeta, su función es dar color a todas las células. 2. Yodo de Gram (Lugol): Reactivo que sirve como mordiente, formando un complejo cristal violeta-yodo (CV-I) insoluble por unión al colorante primario. Sirve para intensificar el color en la tinción. En este punto todas las células permanecerán violeta oscuro. Solo en células Gram positivas, el complejo se une al componente ácido ribonucléico-magnesio de la pared celular (Mg-ARN-CV-I), este complejo resultante es más difícil de remover que el complejo más pequeño cristal violeta-yodo. 3. Alcohol etílico al 95% o Alcohol-acetona (etanol 95% y acetona 70:30): Agente decolorante. Un agente decolorante puede o no remover el colorante primario de la célula entera o solo de ciertas estructuras celulares. Tiene doble función, como solvente de lípidos y como agente deshidratante de proteínas. Su acción en el procedimiento está determinada por la cantidad de lípidos de la envoltura celular. En células Gram positivas, la baja concentración de lípidos es importante para retener el complejo Mg-ARN-CV-I, siendo los lípidos disueltos por el agente decolorante, formándose pequeños poros de pared celular que son cerrados por la acción deshidratante del alcohol. Como consecuencia la tinción primaria se une fuertemente y es difícil de remover, permaneciendo las células de color púrpura. En células Gram negativas, la alta concentración de lípidos en la capa externa es disuelta por el alcohol formándose

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grandes poros que no cierran a causa también de la deshidratación de las proteínas. Así se facilita la liberación del complejo CV-I dejando a las células decoloradas o desteñidas. 4. Safranina: reactivo de contratinción. Tiene un color de contraste al colorante primario (rojo). Si después de la decoloración el colorante primario ha sido lavado los componentes decolorados de la célula tomarán el color del colorante de contraste. Solo las células Gram negativas, que se decoloran, absorben el color rojo del colorante de contraste, mientras las células Gram positivas retienen el color púrpura del colorante primario. Recuerde:  Lo más crítico del procedimiento es el paso de decoloración, si el este paso no se remueve completamente los complejos CV-I, organismos Gram negativos aparecerán falsamente como Gram- positivos.  Es imperativo remover completamente con agua el reactivo anterior de manera que se preparare la lámina para el subsiguiente reactivo.  Preparaciones teñidas con Gram se realizan con cultivos frescos, es decir hasta con 24 horas de cultivo. Cultivos viejos y especialmente de bacterias Gram positivas tienden a perder la habilidad para retener el colorante primario apareciendo “Gram variables”, es decir algunas células púrpura y otras rojas.  Un frotis grueso causa decoloración inadecuada.  Un tiempo excesivo de decoloración puede llevar a la observación errónea del color tomado por las bacterias.  La remoción de frotis durante el secado puede eliminar la muestra de la lámina. Procedimiento Para Tinción De Gram: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Realice el frotis con la técnica adecuada y fíjelo al calor. Vierta sobre el frotis cristal violeta y déjelo actuar por 1 minuto. Lave con agua de la llave y escurra. Cubra ahora el frotis con Lugol (iodo de Gram) y deje actuar por 1 minuto. Lave con agua de la llave y escurra. Cubra ahora con solución decolorante (alcohol-acetona) por 30 segundos. Lave con agua de la llave y escurra. Cubra ahora con colorante de contraste (Safranina o fuschina) y deje actuar por 45 segundos. 9. Lave con agua de la llave y escurra 10. Permita que se seque al aire dejando la lámina en posición inclinada. 11. Observe al microscopio. TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (ZN) Se usa para bacterias que no se tiñen fácilmente por los colorantes corrientes debido a su alto contenido de lípidos en la pared celular (Mycobacterium). Se fundamenta en que las bacterias ácido-alcohol resistentes, en especial las Mycobacterias por su composición de pared, difícilmente toman los colorante, pero una vez teñidas, retienen el color y no lo pierden aún por la acción energética de los ácidos. Los bacilos ácido alcohol resistentes se tiñen de rojo por la carbol-fuscina y los microorganismos restantes se tiñen de azul por el colorante de contraste.

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7.1.1

Técnica De Coloración de Z-N: 1. Cubrir la preparación con fuschina y calentar hasta la emisión de vapores. Mantener así por 10 minutos evitando el secado del colorante sobre la preparación. 2. Lavar con agua. 3. Decolorar completamente con alcohol-ácido. 4. Lavar con agua. 5. Cubrir con azul de metileno por 2 minutos. 6. Lavar con agua y colocar en posición vertical, dejar secar y observar al microscopio con el objetivo de 100X. NOTA: la coloración de KENYOU es igual que la coloración de Ziehl-Neelsen, sólo difiere en que no es necesario calentar la fuschina la cual es más concentrada, los demás colorantes son exactamente iguales TINCIÓN DE ESPORAS Cuando el medio ambiente de las bacterias se torna desfavorable, muchas de ellas entran en latencia, algunas especies bacterianas forman esporas, para contrarrestar la adversidad del medio con la deshidratación, el calor, el frío, o la escasez de nutrientes. Si las condiciones ambientales retornan a la normalidad, la espora absorbe agua, rompe la pared interna y la célula bacteriana viva vuelve a surgir por el proceso de germinación. Las esporas están formadas por una cubierta alrededor del ADN y una pequeña porción de citoplasma dentro de ella; esta estructura posee una mayor resistencia a los agentes físicos y químicos que la célula vegetativa. El diámetro de la espora con respecto a la célula bacteriana y la posición que ocupa dentro de ella son características distintivas de las especies. Las esporas no se colorean por métodos corrientes por consiguiente se recurre a métodos de coloración especiales para su observación. Algunas coloraciones para esporas son: Coloración de Möller y de Schaeffer-Fulton. Schaeffer Fulton: En este tipo de tinción se utiliza como colorante primario el Verde de Malaquita y uno de contraste (Safranina o Fucsina). Por medio de esta técnica se pueden diferenciar las endosporas producidas por algunos géneros de bacterias y la célula vegetativa. De acuerdo con ella, se aplica el colorante primario en solución acuosa al espécimen y se le hace vaporizar para incrementar la penetración de los recubrimientos relativamente impermeables de las esporas. Las esporas sometidas correctamente al método resistirán la sustitución por el colorante de contraste y a menudo se podrán observar ESPORAS VERDES DENTRO DE CÉLULAS ROJAS. En esta forma se puede determinar la ubicación intracelular (terminal, subterminal y central), de la endospora de ciertos microorganismos y usarse también con fines taxonómicos. Técnica de coloración de Schaeffer Fulton: 1. Prepare el frotis y fíjelo al calor 2. Agregue unas gotas de Verde de malaquita hasta cubrir totalmente la preparación; caliente por 5 minutos hasta que se observe la emisión de vapores

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3. 4. 5. 6. 7.

pero sin dejar hervir ni secar el colorante. La placa puede ser cubierta con papel filtro para evitar salpicaduras y siempre tenga en cuenta que el montaje debe estar lo suficientemente húmedo. Deje enfriar y lave con agua destilada Contracolorear con Safranina al 0,5 % por 1 minuto Retire el exceso de colorante lavando con agua destilada Deje secar al aire Realice la observación al microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo observado. Técnica De De Coloración De Método De Möller:

1. Realice un frotis de la muestra en estudio, déjelo secar al aire y fíjelo 2. Cubra el frotis con fuschina carbólica de ZN y caliéntelo hasta que desprenda vapores. Tenga cuidado de no dejar secar ni hervir el colorante. Continúe este proceso por 5 minutos. 3. Lave con agua 4. Decolore con ácido sulfúrico al 1%. 5. Lave con agua. 6. Cubra con azul de metileno de Löeffler durante 2 minutos. 7. Lave con agua, deje secar y observe al microscopio en objetivo de inmersión. Las esporas aparecen rojas y las células vegetativas de color azul TINCIÓN DE CÁPSULA Tinción negativa: En esta tinción se puede identificar la estructura externa que envuelve a algunas bacterias como Klebsiella sp, Streptococcus pneumoniae y Clostridium perfringens. Utiliza como colorante primario tinta china o nigrosina La técnica de tinción negativa incorpora materiales como la tinta china, que se compone de partículas demasiado grandes para penetrar en la célula; después de haber utilizado el colorante primario se adiciona el de contraste que penetra fácilmente a la célula bacteriana. Al examinar la preparación, la cápsula aparecerá como una zona transparente que rodea a la pared celular. No se puede afirmar con certeza absoluta que todas las regiones claras observadas sean cápsulas, debido a que el encogimiento de las células o la recesión o separación de la tinta china pueden producir resultados anormales. Sin embargo, en general, cuando un frotis tratado presenta muchas zonas transparentes con siluetas uniformes, es posible que sean reales y no artificiales. Técnica de tinción de Negativa: 1. Sobre un portaobjetos limpio y desengrasado deposite en un extremo una gota de tinta china. 2. Tome una gota del cultivo y mezcle a lo largo del portaobjetos (técnica del frotis sanguíneo). También puede mezclar en un tubo, partes iguales de cultivo y tinta china. 3. Tome la muestra, suspéndala sobre la lámina y realice el extendido. 4. Deje que el extendido seque naturalmente (nunca fije al calor). 5. Cubra con Safranina por 10 segundos y luego retire el exceso de colorante con

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agua destilada muy cuidadosamente para no eliminar el frotis. 6. Deje secar al ambiente. 7. Realice la observación bajo el microscopio con objetivo de inmersión y dibuje lo observado. Tinción de Hiss: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias. Las células se ven teñidas intensamente y la cápsula de azul o rosado según se use violeta o fuscina. Técnica De Coloración de Hiss: 1. Previamente se cultivan las bacterias para el desarrollo máximo de cápsula. 2. Fijar los frotis con vapores de ácido ósmico durante 10 a 20 seg. 3. Dejar secar sin calentar. 4. Fijar con alcohol flameándolo. 5. Cubrir son una solución de fucsina básica o cristal violeta calentando ligeramente hasta la emisión de vapores. 6. Retirar el colorante mediante solución al 20% de sulfato de cobre en agua. 7. Secar con papel filtro y examinar al microscopio. Si emplea cristal violeta la cápsula aparecerá azul claro en contraste con el color púrpura oscuro de la célula. Tinción de Rojo Congo: Se emplea para coloración de cápsula en las bacterias.

Técnica de tinción de Rojo Congo:  En un tubo de ensayo coloque 0.5 de colorante de rojo congo.  Con el asa previamente esterilizada tome una colonia y emulsiónela en el colorante.  Deje actuar por 20 minutos.  Con el asa esterilizada emulsione de nuevo y tome una gota, extendiéndola sobre la lámina y deje secar a temperatura ambiente.  NO FIJE AL CALOR, y observe luego del secado bajo el objetivo de inmersión. TINCIÓN DE FLAGELOS Los flagelos son órganos de locomoción delgados, de naturaleza proteica que se originan en la región protoplásmica inmediatamente debajo de la pared celular. No todos las bacterias poseen estas estructuras y en consecuencia, la presencia de flagelos, al igual que la distribución y las cantidades en que están presentes en ellas son características útiles para su clasificación (patrones de flagelación: polar, peritricos, monotricos, lofotricos, anfítricos). La observación de flagelos se realiza comúnmente en microscopios electrónicos, sin embargo, con la técnica adecuada se pueden observar en microscopios ópticos, cuando se aplican mordientes y colorantes alrededor de ellas, ya que estas incrementan el diámetro de los flagelos (Los flagelos se observan de color rosado y la célula de color rojo). Técnica de Tinción de Flagelos modificada de Loeffer:

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1. Coloque una gota de un cultivo bacteriano de 18 horas cerca de un extremo de la lámina. 2. Incline el portaobjetos para que la muestra se deslice a lo largo de él. 3. Deje secar al aire. 4. Cubra la extensión con el mordiente de Loeffer para flagelos por un tiempo de 5 minutos. 5. Lave cuidadosamente con agua destilada. 6. Adicione colorante de Loeffer en caliente y deje actuar por 30 minutos. Durante este tiempo mantenga la preparación sobre un baño serológico para que el vapor de agua actúe calentando el montaje. 7. Lave con agua destilada cuidadosamente y deje secar al ambiente. 8. Realice el montaje al microscopio y esquematice lo observado.

TINCIÓN DE GRÁNULOS Tinción de Alberth: Se usa para teñir gránulos metacromáticos de Babest-Ernst los cuales se tiñen de color rojizo mientras el cuerpo de la célula se tiñe de color azulverdoso, es una técnica de tinción útil para observar los gránulos de las Corynebacterias. Técnica de Coloración de Alberth: Se cubre la preparación con el colorante y se deja obrar por 15 a 20 minutos; si se desea acelerar el proceso se calienta por 5 minutos, se lava y se le adiciona lugol por 30 seg. Tinción de Stoltemberg: Tiene el mismo fundamento que la coloración de Alberth.

REACTIVOS PARA COLORACIÓN COLORACIÓN DE GRAM 1. Cristal Violeta (Hucker’s) Solución A Cristal violeta (90% de contenido seco) Alcohol etílico (95%) Solución B Oxalato de amonio Agua destilada

2.0gr 20mL 0.8gr 80mL.

Solución de Trabajo: diluir la solución A en proporción 1:3 con agua destilada y mezclarla con 4 partes de solución B. Guardar en un frasco ámbar y conservar por 24 horas antes de utilizarse. Filtrar cuando se observe formación de precipitado. 2. Yodo de Gram (Lugol) Yodo 1gr. Yoduro de Potasio 2gr. Agua destilada 300mL Colocar el yoduro de potasio en un mortero, agregar yodo y triturarlo perfectamente.

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Agregar el agua en poca cantidad, mezclar y envasar en frasco ámbar. Lavar cada vez el mortero con poca cantidad de agua hasta completar el volumen de 300mL. 3. Alcohol etílico (95%) Alcohol etílico (100%) Agua destilada

95mL 5mL

4. Safranina Safranina O Alcohol etílico (95%) Agua destilada

0.25mL 10mL 100 mL (completar a este volumen).

COLORACIÓN DE ZIEHL NEELSEN 1. Fucshina Solución Madre de Fucshina fenicada de Ziehl: Fucshina básica para microscopía C22H24CIN3 10gr. Etanol 95° 100mL. Triture la fucshina en un mortero con el alcohol, agregándolo poco a poco; trasvase a un frasco ámbar. En caso que no disponga de un mortero, coloque directamente la fucshina y el alcohol en el frasco ámbar y agite hasta su completa disolución. Coloque la solución madre de fucshina a 37°C por 8 días, para su maduración: agite diariamente para extraer la mayor cantidad de colorante procedente del polvo de fucshina. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar. Solución de fenol al 5%: Fenol 5mL. Agua destilada 95mL. Funda los cristales de fenol en baño maría; utilice cámara de extracción; mida en probeta los 5 ml y complete con agua destilada a 100mL. Envase, rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Solución de trabajo de fucshina fenicada: Solución de fucshina filtrada 10mL. Solución de fenol al 5% 90mL. Envase en frasco ámbar. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegido de la luz. 2. Alcohol ácido al 3% Ácido clorhídrico 37% 3mL Etanol 95° 97mL. Agregue lentamente el ácido sobre el alcohol. Envase, rotule y almacene a temperatura ambiente. 3. Azul de Metileno Solución Madre de azul de metileno: Azul de metileno para microscopía C16H18CIN3S.2H2O 10gr. Etanol 95° 100mL. Coloque la solución madre de azul de metileno a 37°C por 8 días, para su maduración; agite diariamente para extraer la mayor cantidad del colorante procedente del polvo de azul de metileno. Rotule y almacene a temperatura ambiente protegida de la luz. Filtre con papel filtro antes de usar.

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Solución de trabajo de azul de metileno: Solución madre filtrada 30mL. Agua destilada 70mL. COLORACIÓN DE SCHEFFER-FULTON 1. Verde de Malaquita: Verde de Malaquita 5.0gr. Agua Destilada 100mL. 2. Safranina: la misma de la tinción de Gram COLORACIÓN DE MÖELLER Fuschina carbólica de Zeehl-Neelsen, ácido sulfúrico al 1%, azul de metileno de Zeehl-Neelsen. COLORACIÓN DE HISS 1. Fuscina Fuscina básica 0.15-0.30gr. Agua destilada 100ml. 2. Sulfato de cobre al 20% en agua destilada. 3. Cristal violeta Cristal violeta 0.05-0.1gr. Agua destilada 100ml. COLORACIÓN DE ROJO CONGO En un frasco color ámbar adicione: Rojo congo. 1gr. Etanol 10ml. Agua destilada 90ml. Antes de usar mezcle y filtre. COLORACIÓN DE FLAGELOS MODIFICADA DE LOEFFER 1. Fascina básica al 1.2% en Etanol al 95%. 2. Ácido tánico al 3% en agua destilada. La suspensión debe tener un color amarillo para ser satisfactoria, se agrega fenol en una proporción 1 a 2000 para evitar la aparición de mohos durante el almacenamiento. 3. Cloruro de sodio al 1.5% en agua destilada. 4. Para preparar la solución colorante se mezclan volúmenes iguales de los tres stocks anteriores. El colorante está listo para ser usado después de la preparación y debe almacenarse en frascos bien cerrados. La vida útil de la solución tintorial es de una semana a temperatura ambiente, un mes en el refrigerador e indefinida si se congela. COLORACIÓN DE ALBERTH Azul de toluidina Verde de malaquita Ácido acético glacial Alcohol etílico (95%) Agua destilada

0.15gr. 0.02gr. 1ml. 2ml. 100ml.

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COLORACIÓN DE STOLTEMBERG 1. Verde de malaquita 1.25gr. Agua destilada 500ml. 2. Azul de toluidina 0.25gr. Ácido acético 15ml. 3. Hematoxilina 0.05gr. Alcohol etílico 15ml. Cada colorante se macera en morteros diferentes, se mezclan y se filtran. 5. Procedimiento A partir de las muestra y/o cultivos bacterianos indicados por el tutor realice una cloración para visualización de: bacterias Gram positivas y Gram negativas, bacilos ácido-alcohol-resistentes, esporas, cápsula y para gránulos metacromáticos. Observe cada una al microscopio con el objetivo de 100X detallando cada una de las estructuras que desea resaltar con la coloración, así como el color que estas toman con la técnica respectiva. 6. Cuestionario - Realice dibujos sobre las coloraciones observadas -Indique ejemplos de microorganismos característicos de cada coloración realizada 7. Bibliografía López L., Hernández M. (2014). Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Laboratorio de Infectología, Centro Nacional de Investigación y Atención a Quemados (CENIAQ), Vol. 3. Recuperado de: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf Olivas E. (2001). Manual de prácticas de Microbiología. Juárez, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Pg. 14. Disponible en: https://books.google.com.co/books? id=pWQQxlTIPIsC&pg=PA12&dq=coloraciones+simples+y+compuestas+microbiolog ia&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwiP3Kb4_ZLPAhWHXB4KHYyHDXYQ6AEIKzAC#v=o nepage&q&f=false

PRACTICA 7 Medios Selectivos y Diferenciales 1.Objetivos -

Familiarizarse con el uso y función de medios especializados para la selección y diferenciación de microorganismos.

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-

Identificar los componentes de cada uno de los medios de cultivo ensayados que permiten la selección y diferenciación de microorganismos.

-

Interpretar las reacciones bioquímicas asociadas a los componentes selectivos y diferenciales durante el crecimiento bacteriano.

-

Reconocer las características metabólicas (carácter fenotípico clásico) que permiten una identificación microbiológica preliminar.

2.Materiales Asas microbiológicas Mechero de Busen 3. Reactivos Agar Salado Manitol en caja de Petri Agar Mac Conkey en caja Agar Eosina Azul de Metileno EMB en caja Agar Fluorocult en caja Agar XLD en caja Cultivos de diversos microorganismos 4. Marco Teórico Las bacterias son microorganismos muy versátiles que poseen una enorme capacidad de utilización de diversos compuestos nutritivos como moléculas inorgánicas sencillas hasta compuestos orgánicos complejos. La diferencia en la capacidad de empleo de los nutrientes constituye parte de la base para la identificación tradicional de los microorganismos. Existen numerosos medios que tienen diferentes propósitos:     

Aislar tipos bacterianos de una población mixta de microorganismos Diferenciar grupos bacterianos relacionados, con base en la apariencia microscópica de las colonias y las reacciones bioquímicas con el medio. Identificar microorganismos en alimentos, aguas, lodo, o productos de uso diario. Ensayar el efecto de sustancias sobre microorganismos Caracterizar o identificar los microorganismos según su habilidad para producir cambios químicos en diferentes medios.

Además de permitir al microorganismo su nutrición, y crecimiento, un medio de cultivo puede estar constituido químicamente para obtener un solo propósito o cambiar varios aspectos en un solo medio, aislando microorganismos y diferenciándolos de otros morfológica y bioquímicamente semejantes. Algunos medios empleados para seleccionar y/o diferenciar grupos de bacterias son: Agar Manitol Salado: Este medio de cultivo contiene altas concentraciones de sal (7,5% de NaCl), lo que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias diferentes de estafilococos. El manitol incorporado en el medio realiza una función diferencial

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pues solo algunos estafilococos pueden fermentarlo. La adición de rojo de fenol como indicador de pH permite detectar la producción de ácido como resultado de la vía fermentativa para el metabolismo del manitol, estos microorganismos forman una zona amarilla periférica a su crecimiento. Estafilococos que no fermenten el manitol no producirán este cambio de color. Control positivo S. aureus

Agar Mac Conkey: es un medio de diferenciación selectivo para el aislamiento y la diferenciación de enterobacteriasy diversos otros bacilos gram negativos. A partir de muestras clínicas.

La presencia de cristal violeta en su composición permite una inhibición del crecimiento de organismos gram positivos. La inclusión de lactosa, sales biliares y rojo neutro como indicador de pH, permite la diferenciación de bacterias entéricas con base en su habilidad para fermentar la lactosa en dos grandes grupos fermentadores (bacilos coliformes) y no fermentadores (bacilos disentéricos, tifoideo y paratifoideo) de lactosa. Los estéricos fermentadores de lactosa generan ácido como producto final de su metabolismo, creciendo con formación de colonias de color rojo-rosado, si la cantidad de ácido es producida en grandes cantidades aparecerá en la zona periférica una zona roja causada por las precipitaciones biliares y absorción del rojo neutro. Las bacterias no fermentadoras de lactosa no producen ácido, s verán colonias incoloras y transparentes.

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Agar Eosina Azul de Metileno EMB: Este medio genera aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes. Enterococcus spp. Crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. Y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

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Agar Fluorocult ECD: Mezcla de sales biliares dentro de sus componentes, permite el aislamiento de E. coli e inhibe la microbiota acompañante. Las colonias de E. coli se detectan por fluorescencia azul claro bajo la luz ultravioleta directamente sobre la caja y confirmado con la prueba de indol.

Agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato de Sodio XLD: es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para patógenos entéricos gram negativos (Salmonella y Shigella) especialmente. Utiliza el desoxicolato de sodio como agente selectivo que inhibe los microorganismos Gram positivos. La xilosa se incorpora en el medio dado que la fermentan prácticamente todos los entéricos, excepto Shigella, y esta propiedad hace posible la diferenciación de dicha especie. La lisina se incluye para permitir la diferenciación del grupo Salmonella de los organismos no patógenos, dado que, sin lisina, Salmonella fermentaría rápidamente la xilosa y no se distinguiría de las especies no patógenas. Cuando la Salmonella agota el suministro de xilosa, la lisina es atacada por la enzima lisina descarboxilasa, lo que genera un cambio a un pH alcalino que imita la reacción de Shigella. Para aumentar la capacidad de diferenciación de la fórmula, se incluye un sistema indicador de H2S.

5. Procedimiento

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1. Reconozca e identifique la composición, apariencia y color de cada uno de los medios de cultivo a emplear. 2. Divida imaginariamente cada uno de los medios de cultivo en cuatro 3. Marque cada una de las zonas con el nombre del microorganismo a inocular 4. Siembre realizando una línea como se muestra en el diagrama. 5. Incube a 37°C por 24 horas en aerobiosis. 6. Lea los resultados, analizar el crecimiento observado tomando como referencia el catálogo del proveedor. Diagrama de Siembra

6. Cuestionario De los medios empleados en la práctica indique: a. Clase de medio de cultivo b. Indicador de pH c. Otros indicadores de reacciones bioquímicas (si los hay) d. Fuentes de carbono del medio e. Inhibidor f. Uso g. Tipo de bacteria que puede crecer en él. h. Reacciones bioquímicas que suceden (fermentación, descarboxilación, etc.)

deaminación,

7. Bibliografías Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana. Rodríguez E. (2007). Bacteriología General, Principios y Prácticas de Laboratorio. San Juan de Costa Rica. Universidad de Costa Rica. Pg 133 Washington C. Allen D. Koneman E. (2008). Koneman: Diagnóstico Microbiológico. Buenos Aires. Panamericana. Pg 211

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PRACTICA 8 Metabolismo Microbiano 1.Objetivos -

Evidenciar la diversidad metabólica de los microorganismos como parámetros básicos para su identificación preliminar.

-

Distinguir las principales pruebas bioquímicas utilizadas para su identificación presuntiva de microorganismos.

-

Reconocer el fundamento bioquímico de cada una de las pruebas para su correcta interpretación.

2.Materiales -

Asa Recta Asa redonda Tubos de ensayo medios líquidos

3. Reactivos -

Fermentación de carbohidratos, Rojo de metilo, Voges-Proskauer, urea, nitratos, coagulasa Tubos de ensayo con agar recto para motilidad e indol. Tubos de ensayo con agar inclinado para: TSI, citrato, descarboxilación de lisina (LIA) Cajas de Petri con agar para: almidón, caseína, DNAsa, agar nutritivo (antibiograma), agar sangre. Tiras de oxidasa Peróxido de hidrogeno al 3% KOH al 40% α-naftol, 5% en etanol absoluto Rojo de metilo al 0.033% en etanol absoluto Reactivo de indol según Kovac’s Reactivos de Griess Polvo de zinc Solución de lugol HCl 1M Plasma de conejo o humano Sensidiscos estériles Soluciones de antibióticos

Microorganismos: Bacillus sp. Streptococcus sp. Micrococcus sp. Staphylococcus sp. Escherichia coli. Pseudomonas sp. Klebsiella sp. Salmonella sp. Enterobacter sp. Proteus sp.

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4. Marco Teórico La identificación inicial bacteriana puede hacerse mediante la observación de características de las colonias y morfología con tinción de Gram, sin embargo la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido a nivel de género y especie habitualmente se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y sirven como marcadores de identificación. La actividad más importante del microbiólogo/bacteriólogo clínico es el aislamiento e identificación de agentes de interés infecciosos. Esta área principal de la microbiología se denomina microbiología clínica o diagnóstica. Cada vez resulta más patente la trascendencia que tiene la identificación exacta del patógeno para tratar correctamente una infección, y constantemente se están desarrollando nuevos métodos mucho más sofisticados. El metabolismo denota todas las actividades químicas organizadas de una célula, las cuales comprenden aspectos generales que involucran proceso de degradación de moléculas complejas para la producción de energía así como de precursores para todos sus procesos de síntesis de enzimas, ácidos nucleicos, polisacáridos y otros componentes celulares. Estas reacciones son de dos tipos: Anabólicas: Proceso de síntesis de los constituyentes celulares a partir de moléculas simples y que generalmente requieren energía. Catabólicas: Rompimiento de moléculas orgánicas para obtener energía. La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o metabólica de las bacterias, por medio de la cual puede hacerse una identificación presuntiva adecuada de una especie, se lleva a cabo mediante el subcultivo o siembra del aislamiento primario en una serie de medios diferenciales, cuyos resultados pueden interpretarse después de un periodo de incubación. Las diferencias de la forma como procesan los nutrientes y los desechos que producen y liberan los microorganismos son el resultado de las enzimas que poseen y pueden ser utilizadas para su clasificación. Estas enzimas participan en proceso de oxidación, y fermentación de azucares y de otros compuestos, liberando metabolitos característicos para identificar cada grupo taxonómico. FUNDAMENTOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRUEBA

FINALIDAD

Fermentación de carbohidratos

Utilizando como base el caldo rojo de fenol, determinar la capacidad de fermentar un carbohidrato con producción de ácido (ácido pirúvico y otros ácidos) y eventualmente gas.

KLIGGER. Utilización de carbohidratos, lactosa y glucosa.

Determinar la capacidad de usar lactosa y/o glucosa producción de gas y producción de H2S

INTERPRETACIÓN Los tubos inoculados de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada. Positivo: Amarillo Negativo: Rojo Eventualmente gas en las campanas DURHAM Los tubos se incuban 18-24 horas a la temperatura adecuada. K/A. Rojo/Amarillo: LAC(-) Glu(+)

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TSI – Agar Hierro triple azúcar glucosa, lactosa, sacarosa.

Citrato

Rojo de Metilo (RM)

Voges – Proskauer (VP)

Determinar la utilización de glucosa, lactosa y/o sacarosa, con producción de gas o no y H2S.

Determinar la capacidad para utilizar el citrato como fuente única de carbono. Esta capacidad se mide por la utilización de sales de amono como la única fuente de nitrógeno, liberándose amoníaco. Determinar la capacidad de producir ácido y de mantener estables estos productos de la fermentación de la glucosa, y vencer la amortiguación del sistema. Determinar la capacidad para producir un compuesto final neutro acetoína/acetil, metilcarbinol de la fermentación de la glucosa.

Hidrólisis de Gelatina

Determinar la capacidad de producción de gealatinasas.

Indol

Determinar la presencia de la enzima triptofanasa que hidroliza el triptófano con formación de indol, ácido pirúvico y amoníaco.

Ureasa

Movilidad

Descarboxilación de Lisina

Determinar la capacidad de hidrolizar la urea con producción de NH3 o (NH4)2 CO3 los cuales alcalinizan el medio. Determinar la movilidad o inmovilidad, presencia o ausencia de flagelos, puede leerse en medio SIM o medio MOTILITH. En Agar lisina hierro “LIA”, detecta la capacidad para descarboxiliar la lisina junto con producción H2S. Indicdor: purpura de bromocresol

Catalasa

Detectar la presencia de la enzima, la cual degrada el H2O2 en H2O y O2

Reducción de Nitratos

Determinar la capacidad de reducir los nitratos a nitritos, a nitrógeno elemental o a hidrolamina. NO3 → NO2 → N

Oxidasa

Identificar bacterias que carecen de la enzima citocromooxidasa, la cual transfiere electrones al oxígeno en la cadena de respiración aeróbica, o son anaeróbicas estrictas. El reactivo sustituye al oxigeno como

K/K. Amarillo/Amar: glu(+) LAC(+) Parte interior amarilla, intermedia y superior roja: GLU(+) LAC-SAC(-). Reporte K/A. Todo amarillo: Glu-Lac-Sac(+). Reporte A/A. Todo rojo: Glu-Lac-Sac(-). Reporte K/K. Ennegrecimiento: H2S(+) o H2S(-). Burbujas: Gas(+) o Gas(-) Positivo: Azul intenso o crecimiento Visible sobre el medio Negativo: Verde

Adicionar 4 gotas de rojo de metilo. Positivo: medio rojo. Negativo: medio amarillo. Adicionar 3 ml de reactivo de barrit (αnaftol). 1ml de KOH. Se deja el tubo en reposo por 30 minutos y se realiza la lectura: Positivo: superficie roja – rosada. Negativo: sin cambio Antes de leer los tubos, estos se deben poner en refrigerador por 10-15min. Positivo: medio líquido Negativo: no cambia de estado Adicionar gotas de reactivo de kovac’s (o-Dimetilaminobenzaldehido en alcohol isoamilico.) Positivo: anillo cereza en la superficie. Negativo: anillo amarillo (escatol) Positivo: tubo fucsia Negativo: tubo amarillo Se deben sembrar dos tubos e incubar a diferente temperatura. Positivo: desplazamiento del crecimiento alrededor del inóculo. Positivo: tubo morado Ennegrecimiento: H2S(+) Tonalidades café-rojizas = Deaminación. Colocar sobre una lámina una colonia de un cultivo de 24 horas en Agar nutritivo adicionar dos gotas de peróxido de Hidrogeno al 3%. Positivo: efervescencia antes de 20seg., liberación de O2. Se revela adicionando después de la incubación unas gotas de reactivo de Griess. Positivo: Rojo Si el tubo permanece sin cambios se adiciona un poco de polvo de Zinc, Positivo: Amarillo Negativo: Roj Frotar una muestra de la colonia sobre una tira de prueba para oxidasa. Positivo: Color azul Negativo: Incoloro

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Coagulasa

DESOXIRIBONUCLEA SA (Dnasa)

Hidrólisis De Almidón

Hemólisis

Antibiograma

Caseína

aceptor (reducido es incoloro) Detectar la presencia de coagulasa ligada a la pared o de forma libre presente en el filtrado del cultivo, que actúa sobre el plasma humano o de conejo. Determinar la capacidad de producir DNAsa que hidroliza las moléculas de ADN. El ADN no hidrolizado precipita en presencia de HCl 1M. Se deben sembrar por cada prueba cuatro cajas que se revelan a las 24 horas, 2, 3 y 10 días. Determinar HCl la capacidad de producir alfa o Beta Hemolisinas que actúan sobre los eritrocitos de la sangre, usándolos parcial o totalmente Determinar la sensibilidad o resistencia del microorganismo a la concentración de un antibiótico impregnado en el sensidisco. Determinar la presencia de proteasas que actúan sobre la caseína presente en el medio generando polipéptidos y/o aminoácidos.

Se mezclan 0.3ml, de plasma con 0.3ml, de un cultivo de 18-24 horas del microorganismo. se incuba 4 horas. Positivo: coágulo visible Negativo: medio líquido totalmente. Revelar inundando la caja con HCl 1M. Positivo: Halo claro acreedor de las colonias. Negativo: ausencia de halos. Inundar la caja con solución de lugol. Positivo: halo café alrededor de la colonia Negativo: Azul violeta Positivo: α – Hemólisis: zona circundante verde β – Hemólisis: zona circundante clara Positivo: halo de inhibición del crecimiento alrededor del sensidisco. Negativo: crecimiento masivo de microorganismos. Positivo: halos claros alrededor de la colonia (digestión o coagulación de la caseína). Negativa: ausencia de halo.

5. Procedimiento Realice la inoculación de cada una de las pruebas con el microorganismo suministrado, de la siguiente forma, incube de acuerdo con las recomendaciones del instructor y revele la prueba siguiendo las indicaciones de interpretación presentadas en el marco teórico. PRUEBA INDOL MOTILIDAD FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS CUTRATO ROJO DE METILO VOGES PROSKAVER UREASA DESCARBOXILACIÓN DE LISINA REDUCCIÓN DE INITRATOS

MEDIO / REACTIVO SIM SIM TSI Caldo rojo de fenol + carbohidrato Agar citrato Caldo RM - VP Caldo RM – VP Caldo UREA

PROCEDIMIENTO Siembra por picadura Siembra por picadura

Agar Lía

Siembra mixta

Caldo mixto

Inoculación del medio con asa de redonda

Siembra mixta Inoculación del medio con asa de redonda Siembra mixta Inoculación del medio con asa de redonda Inoculación del medio con asa de redonda Inoculación del medio con asa de redonda

CATALASA

Peróxido de nitrógeno 3%

OXIDASA

Tiras prueba de oxidasa (o ampollas)

Sobre un portaobjetos limpio realice el frotis de una colonia del microorganismo y adicione 2 gotas del reactivo. Escriba las observaciones Frote una colonia del microorganismo sobre el reactivo y realice las observaciones

HIDRÓLISIS DE GELATINA

Gelatina

Siembra por picadura

COAGULASA

Caldo BHI plasma humano/conejo

Inocule el microorganismo en los 0.3ml de caldo BHI e incube a 37°C/16-24hrs. Pasada la incubación adicione a este tubo

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HIDRÓLISIS DE ALMIDÓN

Agar almidón Lugol de GRAM

HEMOLISIS

Agar sangre

GASEINA

Agar nutritivo con SKIM MILK

DESOXIRRIBONUCLE ASA

Agar DNAsa

ANTIBIOGRAMA

Agar Mueller Hinton, sensidiscos, antibióticos

0.3ml de plasma e incube a 37°C/4hr. (Observe hasta las 18-24hrs), realice la lectura de la prueba. Realice una siembra por agotamiento e incube a 37°C/24hrs. Pasada la incubación inunde las cajas con Lugol de GRAM, realice lectura de la prueba. Siembre el microorganismo por agotamiento e incube a 37°C/24 grs. Pasada incubación realice la lectura de la prueba. Realice una siembra por agotamiento e incube a 37°C/24 hrs. Pasada la incubación realice la lectura de la prueba Realice la siembra por agotamiento e incube a 37°C/24 hrs. Inunde la caja con HCl 1M y realice lectura de la prueba. Siembre masivamente con el hisopo el microorganismo impregne cada sensidisco con un antibiótico diferente y repártalos equitativamente en la superficie de la caja, señalando en la parte posterior la porción de cada antibiótico. Incube a 37°C/24hrs. Y realice lectura.

6. Cuestionario De las pruebas bioquímicas realizadas identifique en cuales se presenta oxidación y en cuales reducción además la vía por la cual se llevó su metabolismo y sus productos de desecho. De los microorganismos utilizados haga una comparación con los datos de los otros grupos y desarrollen un cuadro anotando diferencias entre los microorganismos fermentadores y los microorganismos no fermentadores. Mencione el fundamento y la utilidad de los sistemas “API” y “CRISTAL” ¿Qué tipos de coágulos se pueden presentar al realizar la prueba de coagulasa.? Explique cada una de ellas. Explique los mecanismos por medio de los cuales los antibióticos causan daño a los microorganismos sensibles a ellos. 7. Bibliografías Cercenado E., Cantón R. (2010). Procedimientos en Microbiología Clínica Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. EIMC, Disponible en: https://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiologi a/seimc-procedimientomicrobiologia37.pdf

PRACTICA 9

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Sensibilidad Bacteriana/Antibiograma 1.Objetivos -

Reconocer Los Diferentes Métodos Utilizados Para La Realización De Un Antibiograma.

-

Interpretar Correctamente Los Resultados De Una Prueba De Sensibilidad

2.Materiales -

Asas Hisopos Estériles Pinzas Estériles

3. Reactivos -

Placas Petri Con Agar Muller Hinton Sensidiscos Cepas Bacterianas

4. Marco Teórico Los Antibiogramas Son Métodos In Vitro Que Determinan La Susceptibilidad De Los Microorganismos A Una Variedad De Agentes Antimicrobianos, Bajo Condiciones De Laboratorio Específicas Y Estandarizadas. La Meta Principal Del Estudio De Susceptibilidad Es Proveer Al Clínico Algunas Recomendaciones Sobre La Terapia Que Puede Ser Más Apropiada En Pacientes Con Una Infección Específica. En El Laboratorio De Microbiología Ayuda Al Clínico Haciéndole Conocer La Sensibilidad O Resistencia De Una Determinada Bacteria Por Medio Del Antibiograma. El Antibiograma Puede Realizarse Por Métodos De Dilución O De Disco Difusión. Método Dilución Se Prepara 10 Tubos De Prueba De Caldo Nutritivo, A Cada Tubo Se Le Agrega Una Cantidad De Antibióticos Diluidos En Serie, Desde 100 µg/Ml Hasta 0.05 µg/Ml, El Último Tubo No Contiene Antibiótico Y Sirve Como Control De Crecimiento. Se Inocula Cada Tubo Con Una Suspensión Calibrada De Microorganismos En Estudio Y Se Incuba A 37°C Por 18 Horas. A Partir De Algún Tubo Empezará La Inhibición Del Crecimiento, Este Punto De Ruptura Representa La MIC, Definida Como La Concentración Mínima De Antibiótico En µg/Ml Que Impide El Crecimiento Bacteriano In Vitro.

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Método De Difusión El Método De Prueba De Susceptibilidad Por Difusión En Discos Incluye El Agregado De Una Cantidad Conocida De Agente Microbiana Un Pequeño Disco De Papel Absorbente Que Miden 6 Mm De Diámetro. La Colocación De Este Disco Sobre Una Superficie De Agar Previamente Sembrada Con El Microorganismo Susceptible. La Zona Concéntrica De Inhibición Que Resulta Cuando El Microorganismo A Prueba Se Siembra Sobre La Superficie De La Placa De Agar Antes De La Aplicación Del Disco Tiene Una Relación Lineal Demostrada Con La MIC Para La Mayoría De Los Antimicrobianos, Medidas Por Pruebas De Susceptibilidad Por Dilución. El Método De Disco-Difusión En Agar Es Una Manera Práctica, Fácil Y Rápida De Realizar El Antibiograma.

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El Recomendado, El Bauer-Kirby, Con El Que Se Ha Logrado Uniformizar Criterios Que Toman En Cuenta Los Conceptos De Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) Y De La Concentración Promedio En Sangre De Los Medicamentos Frecuentemente Usados. 5. Procedimiento  

 

Tomar Una Porción De Cepa Bacteriana, Extender Uniformemente En La Superficie De La Placa De Agar Muller-Hinton Colocar Con Ayuda De Pinzas Los Discos Impregnados Con Diferentes Antibióticos Sobre La Superficie De Agar. Escoger Los Antibióticos De Acuerdo Al Tipo De Gérmenes Y La Localización De La Infección. Los Discos Deben Quedar A Una Distancia Mínima 20 Mm Entre Ellos. Incubar A 37C, Durante 24 Horas.

Lectura E Interpretación 

El Diámetro De La Zona De Inhibición Se Mide Con Una Regla Milimetrada Colocada Debajo De La Placa Petri. El Límite Del Área De Inhibición Está Dado Por La Inhibición Completa Del Desarrollo Que Se Puede Apreciar A Simple Vista. Los Milímetros De La Lectura Serán Llevados A La Tabla Para Traducir Su Interpretación A Los Términos SUSCEPTIBLE, INTERMEDIO Y RESISTENTE.

 

GUIA PARA INTERPRETAR EL HALO DE INHIBICIÓN ANTIBIOTICO AMPICILINA CEFACLOR CLORANFENICOL ERITROMICINA GENTAMICINA AC NALIDIXICO TETRACICLINA

CARGA DEL DISCO 10ug 30ug 30ug 15ug 10ug 30ug 30ug

RESISTENTE

INTERMEDIO

SUSCEPTIBLE

11 Ó 14 Ó 12 Ó 13 Ó 12 Ó 13 Ó 14 Ó -

12-13 15-17 13-17 14-17 13-14 14-18 15-18

14 Ó + 18 Ó + 18 Ó + 18 Ó + 15 Ó + 19 Ó + 19 Ó +

*Diámetro Del Halo (Mm) 6. Cuestionario 1. 2. 3. 4.

¿Para Qué Es Útil Un Antibiograma? ¿Cuándo Decimos Que Un Fármaco Es Sensible Al Desarrollo Bacteriano? ¿Cuál Es El Medio De Cultivo Más Utilizado Para Realizar Un Antibiograma? Complete La Tabla Según Sus Resultados

Microorganismo: ___________________________________________

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Antibiótico

Concentración

Diámetro De La Zona De Inhibición

Interpretación

Observación: Compare Los Resultados Obtenidos Por Usted Con Los De Algunos De Sus Compañeros. Anote Sus Conclusiones. 7. Bibliografías Prats, G. (2008). Microbiología Clínica. Madrid, Panamericana. Rodríguez E. (2007). Bacteriología General, Principios Y Prácticas De Laboratorio. San Juan De Costa Rica. Universidad De Costa Rica. Washington C. Allen D. Koneman E. (2008). Koneman: Diagnóstico Microbiológico. Buenos Aires. Panamericana. 8. Anexos Antibióticos que deben ser considerados para pruebas de antibiograma ENTEROBACTERIAS

PSEUDOMONAS

ESTAFILOCOCOS

Amikacilina Azlocilina Carbenicilina Gentamicina Netilmicina Tobramicina

Cefalotina Clindamicina Eriromicina Oxacilina Dicloxacilina Penicilina G Tetraciclina

Ceftazidna Ceftriaxona Cefotaxina Cloranfenicol Imipen

Amikacina Gentamicina Amoxicilina Cloranfenicol TMP-SMX

ENTEROCOCOS

ESTREPTOCOCOS

Penicilina G Ampicilina Vancomicina

Penicilina G

Primario Amikacina Ampicilina Cefazolina Cefalotina Cloranfenicol Gentamicina Tetraciclina Tobramicina Secundario Amoxicilina Ceftazidina Ceftriaxona Carbenicilina TMP - SMX

PRACTICA 10 Morfología Fúngica

Cefalotina Cloranfenicol Clindamicina Eritromicina Tetraciclina

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1.Objetivos -

Realizar observaciones macro y microscópicamente de una muestra de cultivos de hongos: Penicillium spp., Rhizopus spp., Cladosporium spp., Trichoderma spp., Mucor spp., Saccharomyces spp., Candida spp., Geotrichum spp.

-

Identificar las estructuras micóticas macro y microscópicamente.

-

Realizar un cultivo micótico

2.Materiales Microscopio Cajas de Petri Papel filtro Portaobjetos y cubreobjetos (a cargo del estudiante) Cinta Asas micológicas Pitillos 3. Reactivos Azul de lactofenol Glicerina 10% Cepas de Penicillium spp., Rhizopus spp., Cladosporium spp., Trichoderma spp., Mucor spp., Saccharomyces spp., Candida spp., Geotrichum spp., Aspergillus spp. 4. Marco Teórico Los hongos pertenecen al reino Fungi, son células eucariotas, con presentación celular filamentosa (Mohos) y levarudiforme (levaduras). Por su amplia distribución en el ambiente como parásitos de plantas, animales y el hombre, son también de gran importancia clínica al generar varias enfermedades. Es necesario identificar los agentes causales de las micosis en el laboratorio microbiológico: Diagnóstico microbiológico de los hongos: Para el estudio microbiológico de una muestra, se debe realizar la observación directa al microscopio y obtener aislamiento del microorganismo en medio de cultivo. Identificación de hongos por microscopía a. Montaje en portaobjetos: Colocar 1 gota de azul de lactofenol sobre una lámina, tomar la muestra del hongo con un asa, emulsionar y desbridar la muestra con ayuda de otra asa, poner un cubreobjetos encima y observar con objeto de 10 y 40x. A menudo, el rastrillado de la colonia rompe las delicadas estructuras de

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fructificación de los mohos, lo que puede dificultar su identificación definitiva. b. Preparación en cinta engomada: Colocar una gota de colorante azul de lactofenol sobre la superficie de un portaobjetos. Utilizando cinta engomada transparente, presionar con la parte del pegamento suave pero firmemente la colonia, recolectando el micelio aéreo. Pegar la cinta sobre el portaobjeto intentando que el micelio se impregne con el colorante. Se debe evitar la formación de burbujas. Observar en 10x y 40x. c. Técnica de cultivo en microplaca: Se coloca un trozo de 1 cm2 de agar PDA (PapaDextrosa-Agar) sobre la superficie de un portaobjeto estéril. Inocular cada ángulo del bloque con una pequeña porción de la colonia estudiada usando asa recta. Calentar suavemente un cubreobjeto con la llama del mechero y colóquelo sobre el agar inoculado. El leve derretimiento del agar permite que se selle. Colocar en una caja de Petri sobre pitillos con el fin que quede elevado sobre un disco de papel humedecido con glicerina. Tapar e incubar a 30°C de 3 a 5 días. Cuando el cultivo esté maduro, se levanta con suavidad el cubreobjeto, se coloca una gota de azul de lactofenol sobre un segundo portaobjetos y se cubre con el cubreobjeto retirado del cultivo. Observar a 10 y 40x. d. A partir de muestras problema los hongos pueden ser identificados al examen directo usando hidróxido de potasio (KOH), este permite digerir el material proteico, observando con mayor nitidez los elementos fúngicos. Adicionalmente, se puede emplear colorantes para pigmentar la pared de los hongos y mejorar la visualización. - Tinta China: Permite visualizar la cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans - Coloración Giemsa para el diagnóstico de histoplasmosis, neumocistosis y otras micosis. Permite visualizar blastoconidias intracelulares al polimorfonuclear, como la fase tisular del H. capsulatum. - Coloración Gram: Es útil para observar blastoconidias y pseudomicelios de las especies del género Candida, Malassezia y Cryptococcus, las cuales son Gram positivas con variaciones en la intensidad de la coloración. Características generales de hongos importantes en microbiología: Mucor spp.: Las colonias se desarrollan rápidamente a 25°C, cubriendo la superficie del medio de cultivo; crecen pobremente a 37°C. El color de las colonias es blanquecino al inicio, con el tiempo cambia a marrón. El reverso de la colonia es blanquecino. La textura es algodonosa. Microscópicamente presentan hifas aseptadas y gruesas. Se caracteriza por presentar esporangióforos, esporangios Carecen de apófisis, estolón y rizoides. Las columnelas son hialinas, siendo visibles si el esporangio se encuentra intacto. Los esporangios son esféricos o redondos (50–300 mm de diámetro) y de color gris a negro, estando llenos de esporas.

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Rhizopus spp.: Colonias de crecimiento rápido a 37°C, a los cuatro días llegan a ocupar totalmente la placa Petri. Inicialmente son blancas pero luego cambian a gris parduscas. El micelio carece de septos. Presentan estolones y rizoides. Los esporangióforos no son ramificados, tienen una longitud de 2 mm, generalmente están en grupos, formando verticilios en cuya base se sitúan los rizoides. Las apófisis pueden estar presentes pero son poco evidentes. Presentan esporangios esféricos cuyo ancho es de 50 a 300 mm, los cuales son de color gris pardusco a negro. La columela es su esférica abarcando entre 50 a 70% del esporangio. Las esporangiosporas son angulares y con estrías longitudinales, grisáceas, subesféricas o elipsoidales con dimensiones de 6 a 8 x 4 a 5 mm.

Aspergillus spp.: Las colonias desarrollan con rapidez sobre a 25°C, la textura es aterciopelada, afelpada, vellosa o algo plegada, con margen blanquecino o beige. El color inicialmente es blanco virando en aproximadamente siete días a un verde azulado por la producción de conidias. El reverso de la colonia es incoloro. Presentan conidióforo corto, liso de hasta 300 mm de longitud y de 5 a 8 mm de diámetro, vesícula de 20 a 30 mm de diámetro con fiálides (6 a 8 mm de largo), uniseriada, ocupando 2/3 de la vesícula. Los conidios en cadenas forman una compacta columna sobre la vesícula, son de color verde, finamente rugosos, globosos o subglobosos y de 2 a 3 mm de diámetro.

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Penicillium spp.: Colonias de crecimiento rápido, pulverulentas de color verde. microscópicamente presentan conidióforos rectos, hialinos o levemente pigmentados, con fialides que nacen directamente de la hifa o sobre métulas. Conidias producidas en cadena, de forma esféricas o elipsoidales, a menudo con una base trunca, hialinas, de pared delgada y en ocasiones ornamentadas.

Trichoderma spp.: La mayoría de las en su inicio tienen color blanco, que se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. El micelio es raro en su mayoría, y visto al microscopio es fino, los conidióforos son ramificados, parecen un árbol pequeño. Los mismos se presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas irregular de manera piramidal.

Fusarium spp.: las colonias se obtienen en Sabouraud después de 1 a 5 días. Pueden ser algodonosas de color blanco, con diversos pigmentos según la especie (crema, rosado, salmón, amarillo, rojo o morado). Microscópicamente posee células conidiógenas tipo fialides formadas en la hifa aérea. Poseen 2 tipos de conidia: macroconidias y microconidias, que varían en forma y número según la especie: - Macroconidias fusiformes, con septos transversales, producidas por sucesión basipétala en los monofialides y acumuladas en pequeñas masas en la punta de la

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fialide. - Microconidias elipsoidales, ovales, subesféricas, piriformes o en forma de clava, producidas por sucesión basipétala en mono y polifialides y acumuladas formando falsas cabezas o en cadenas.

Candida spp.: Crecimiento de colonias levaduriformes, de bordes enteros, limitadas, poco elevadas y de color blanco. Crecen en un promedio de 3 a 5 días a temperatura ambiente. Al microscopio se identifica como levaduras mitospóricas alargadas o ligeramente redondas de 2 - 6 x 3 - 9 µm que se reproducen por gemación (blastoconidios). A excepción de C. glabrata, el resto de las especies asociadas a candidosis pueden formar pseudomicelios; C. albicans y C. dubliniensis además son formadoras de hifas.

7. Bibliografías: Ministerio de Salud del Perú, Instituto Nacional de Salud. (2010). Manual de procedimientos y técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos oportunistas causantes de micosis humanas. Medicina & Laboratorio, Volumen 16, Números 9-10. Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2010/myl109-10e.pdf Universidad de Antioquia. Aprende en línea. Dermatomicosis y onicomicosis por hongos ambientales. Disponible en: http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/course/view.php?id=743§ion=6

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