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• Javier Galvan

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AC PEA DE lOS OS UNIDOS ME IC N UNDECIMA EDICICN VOlUM N II

SECRETARIA DE SALUD

FEum FAR mAC 0 PEA de los Estados Unidos Mexicanos

VIGENCIA: ESTA PUBLICACION ENTRARA EN VIGOR 60 DIAS NATURALES POSTERIORES A LA PUBLICACION DEL AVISO DE VENTA RESPECTIVO EN EL DIARIO OFICIAL DE LA FEDERACION ESTA EDICION ABROGA A LA ANTERIOR

MEXICO

2014

/

Datos de catalogacion bibliografica

Mexico. Secretaria de Salud. Comisi6n Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. -- Undecima edici6n. -Mexico: Secretaria de Salud, Comisi6n Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 2014. 2 volumenes : ilustraciones ; 28 cm. Incluye indice ISBN 978-607-460-454-2 CObra completa) ISBN 978-607-460-455-9 (volumen 1) ISBN 978-607-460-456-6 (volumen 2)

1. Mexico. Ley General de Salud. 2. Farmacopeas - Mexico. 1. titulo. 615.11n-scdd21

Biblioteca Nacional de Mexico

FARMACOPEA DE lOS ESTADOS UNIDOS MEXICANOS Undecima edicion DERECHOS RESERVADOS SECRETARIA DE SALUD liEJA 7, COL. JUAREZ

2014

©

C. P. 06696 MEXICO, D. F. ISBN: 978 - 607 - 460 - 454 - 2 ISBN: 978 - 607 - 460 - 455 - 9 ISBN: 978 - 607 - 460 - 456 - 6

Obra completa (dos volumenes) Volumen I Volumen II

Actualizacion y revision del contenido. Secretarfa de Salud Ueja 7, Col. Juarez C. P. 06696 Mexico, O. y Comision Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Rio Rhin 57, Colonia Cuauhtemoc C. P. 06500, Mexico, D. F. [email protected] Impreso en junio de 2014 Publicaciones e Impresiones de CaUdad, S. A. de C. V. Ignacio Mariscal 102, Colonia Tabacalera C. P. 06030, Mexico, D. F. Tiraje 2 000 ejemplares. Todos los derechos reservados. Ninguna parte de esta publicacion puede ser reproducida, almacenada en sistema alguno de tarjetas perforadas 0 transmitidas por otro medio -electronico, mecanico, fotocopiador, registrador, etcetera- sin permiso previo por escrito de la Secretarfa de Salud. All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by means, electronic, mechanical, photocopying, recording or otherwise, without the prior permission in writing form of Secretarfa de Salud. Impreso y hecho en Mexico Printed and made in Mexico

EJEMPLAR NUMERO

9786074 604542

186074 (,04566

r

5

RETA

D

LUD

. Mercedes Juan Lopez de Salud

Mtro. Mikel Andoni Arriola Penalosa Comisionado Federal para la Protecci6n contra Riesgos Sanitarios

M. en C. Roclo del Carmen Alatorre Eden-Wynter Comisionada de Evidencia y Manejo de

Q. Marfa del Carmen Becerril Martfnez Directora Ejecutiva de Farmacopea y Farmacovigilancia

CONTENIDO Volumen I Pr610go..........................................................................................

XI

Directorio. Comisi6n Permanente de 10 Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos..................... .........

XIII

Creditos y agradecimientos................................................... .........

XXV

Novedades de esta edici6n....................................................... .....

XXXI

Generalidades...............................................................................

1

Soluciones y reactivos.....................................................................

49

Metodos generales de analisis............................................... ..........

197

Envases primarios...........................................................................

525

Sistemas crfticos ..................................'............................................

551

Aditivos............................................................................. ..............

575

Farmacos....................................................... ...............................

777

fndice de soluciones y reactivos......................... .................. ...........

i3

fndice analftico..............................................................................

i17

Volumen II Radiofarmacos..............................................................................

1403

Gases medicinales.......................... ..............................................

1439

Pruebas basic as para sustancias farmaceuticas...............................

1465

Preparados farmaceuticos.............................................................

1489

Pruebas de intercambiabilidad.................................................. .....

2395

Metodos de productos bioI6gicos...................................................

2425

Productos bioI6gicos......................................................................

2487

Productos biotecnoI6gicos..................... ........................................

2579

Hemoderivados................................................. ........................ ....

2623

Estadfstica para ensayos bioI6gicos................................................. 2653 Apendice I. Historia de 10 Farmacopea mexicana............................

2743

Apendice II. Regulaci6n farmaceutica...........................................

2753

Apendice III. Validaci6n de metodos analfticos. Recomendaciones para su presentaci6n ante 10 FEUM.......... .........

2787

Apendice IV. Estimaci6n de 10 incertidumbre de metodos analfticos farmacopeicos.................................. ..........................

2801

Apendice V. Principios generales de buenos practicas de laboratorio............................................................... 2823 Apendice VI. Conservaci6n, mantenimiento y manejo de cultivos microbianos de referencia: sistema lote semilla........... ........

2841

Apendice VII. Analisis microbiol6gico de productos farmaceuticos no esteriles............................................................

2845

fndice de soluciones y reactivos........ ..............................................

i3

fndice analftico..............................................................................

i17

-----

--------------------...................

RADIOFARMACOS

INTRODUCCION .............................................................................

1405

GENERALIDADES .............................................................................

1405

REQUISITOS DE CONTROL DE CALIDAD .................................. :......

1408

RADIOFARMACOCINETICA .............................................................

1413

APLICACIONES DIAGNOSTICAS Y TERAPEUTICAS ..........................

1413

GUfA DE NIVELES DE ACTIVIDADES PARA RADIOFARMACOS EN PACIENTES ADULTOS EN ESTUDIOS DE MEDICINA NUCLEAR.....

1415

MONOGRAFfAS ...............................................................................

1418

Radiofarmacos

INTRODUCCION La radiofarmacia en Mexico se inicio en el ano 1965; esta rama de las ciencias farmaceuticas se ocupa del diseno, preparacion, control de calidad y dispensacion de los radiofarmacos. Con su desarrollo y apoyando el "Programa de Acuerdos Regionales Cooperativos para la Promocion de la Ciencia y la Tecnologia Nuclear en America Latina", ARCAL, patrocinado por el Organismo Internacional de Energia Atomica, a traves de su proyecto "Produccion y Control de Radiofarmacos"; la Comision Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos junto con un grupo de expertos en radiofarmacia, se han dado la tare a de elaborar el capitulo de radiofarmacos; relacionando conceptos como son garantia de calidad, buenas practicas de manufactura y control de calidad. Los radiofarmacos son utilizados en la medicina nuclear para el diagnostico y tratamiento de algunas enfermedades por 10 cual, requieren de un especial manej 0 antes de ser administrados en pacientes y normalmente se preparan en el momenta de ser usados. Solo algunos radiofarmacos son enviados al hospitallistos para su uso. La preparacion de radiofarmacos a partir de muestras autologas de pacientes, la marcacion de biomoleculas tales como anticuerpos mono y policlonales, peptidos y la preparacion de radiofarmacos en el hospital, son procedimientos que se realizan en una radiofarmacia hospitalaria. Por 10 tanto la manipulacion de productos radiofarmaceuticos constituye una actividad importante dentro del Servicio de Medicina Nuclear y tiene un papel fundamental en el establecimiento de un programa de calidad. La presentacion de este capitulo es el resultado del intercambio de experiencias nacionales e intemacionales y pretende contribuir a asegurar la calidad de los radiofarmacos usados en el diagnostico y tratamiento de pacientes, contiene definiciones, conceptos sobre radiactividad y recomendaciones de actividad a utilizar en estudios diagnosticos, las buenas practicas de manufactura para asegurar la calidad de los radiofarmacos, y finalmente, monografias de algunos radiofarmacos de uso comun.

GENERAllDADES La manipulacion y el ensayo de radiofarmacos (preparaciones farmaceuticas radiactivas) exigen tecnicas especiales para obtener resultados correctos y reducir al minimo los riesgos para el personal. Todas las operaciones deben ser efectuadas y supervisadas por personas especialmente capacitadas en el manej 0 de sustancias radiactivas. TERMINOS UTILIZADOS

N ucleido. Atomo que se caracteriza por su numero de mas a, su numero atomico y su estado energetico nuclear, con tal

1405

que la duracion media de tal estado sea 10 suficientemente larga para que pueda ser observada. Radiactividad. Es la propiedad que tienen ciertos nucleidos de emitir radiaciones cuando sus nucleos se transforman espontaneamente en los de otros nucleidos. Radionucleido. Nucleido radiactivo. Radiofarmaco. Es toda sustancia conteniendo un radionucleido dentro de su estructura y que, por su forma farmaceutica, cantidad y cali dad de radiacion se administra en seres humanos con fines diagnosticos 0 terapeuticos. Unidades de radiactividad. La actividad de una cantidad detemlinada de material radiactivo se expresa por el numero de trans formaciones nucleares que se producen por unidad de tiempo. La unidad SI de actividad es el becquerel (Bq), nombre para una desintegracion por segundo (S-l). Tiempo de vida media 0 periodo de semidesintegracion. Es el tiempo en el cual la radiactividad decrece hasta la mitad de su valor primitivo. La velocidad de la desintegracion es constante y caracteristica para cada radionucleido. La curva de desintegracion se expresa matematicamente mediante la siguiente ecuacion diferencial: N -N - oe -At

Donde: Numero de atomos que quedan al cabo del tiempo t. Numero de atomos en el momenta inicial t = O. Constante de desintegracion caracteristica de cada radionucleido en particular. e Exponencial.

N= No = A

El tiempo de vida media se relaciona con la constante de desintegracion mediante la ecuacion siguiente: Tv, = 0.693/ A

Las correcciones correspondientes a la desintegracion se pueden calcular mediante la ecuacion exponencial, tab las de desintegracion 0 una grafica de desintegracion trazada para el radionucleido de que se trate (veasefigura 1). Concentracion radiactiva. La concentracion radiactiva de una solucion se refiere a la radiactividad por unidad de volumen de la solucion (Bq/mL). Como en todas las indicaciones que impliquen radiactividad, es preciso hacer referencia a la fecha de calibracion. Por ejemplo: "37 MBq de cloruro de estroncio-89 en 1 mL de amortiguador de fosfatos 0.01 M (37 MBq/mL) dia 1 de enero de 2008 a las 12:00 h". Radiactividad especifica (0 actividad espedfica). La actividad especifica de una preparacion de material radiactivo es la radiactividad por unidad de masa del elemento 0 del compuesto de que se trate (Bq/mg 0 Bq/mmol).

INTRODUCCION

1406

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

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80 70 60

50 Cl

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Pureza La pureza radioquimica puede ser definida como el porcentaje de la radiactividad total en la forma quimica declarada en el radiofarmaco. Como la pureza radioquimica puede cambiar con el tiempo, principalmente por descomposicion radiactiva, se debe especificar el tiempo a que es aplicable e1limite de pureza radioquimica. Las impurezas presentes pueden ser causadas por descomposicion del radiofarmaco, por accion de la temperatura, luz, radiolisis 0 marcacion de una impureza quimica con el mismo radionucleido, como por ejemplo la presencia de 99mTc-tartrato 0 99mTc reducido hidrolizado en la preparacion de 99mT c-mercaptoacetiltriglicina.

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30

~ 20

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Pureza La pureza quimica se refiere a la proporcion de la preparacion que existe en la forma quimica especificada, prescindiendo de la presencia de radiactividad; puede determinarse mediante los metodos ordinarios de analisis. Por ejemplo, la presencia de oxido de aluminio en el eluato de pertecneciato-99m. Las impurezas qmmlcas pueden ser introducidas inadvertidamente en el radiofarmaco, antes, durante y despues de la marcacion, como por ejemplo impurezas de reactivos, productos de descomposicion no radiactivos, rotura de la estructura quimica del producto, entre otros.

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1\ 10

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0.5

1.5

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2.5

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3.5

PERloDOS DE SEMIDESINTEGRACl6N

Figura. 1. Gnifica general de desintegracion.

Pureza radionudeidica. La pureza radionucleidica de una preparacion es e] porcentaje de la radiactividad total que existe en la forma del radionucleido declarado. La pureza radionucleidica se refiere tanto a radionucleidos de un mismo elemento 0 radioisotopos en preparaciones de 123 I) como a radionucleidos de elementos diferentes (99Mo en soluciones de La pureza radionucleidica no es un fenomeno estacionario sino que depende de los tiempos de vida media de las impurezas y del radionucleido de interes; por ello la pureza radionucleidica al momenta del uso de la preparacion debe ser 99 %. En virtud de que los radionucleidos se diferencian por sus tiempos de vida media, tipo y energia de radiacion, la pureza radionucleidica se determina por el amilisis de una 0 mas de estas caracteristicas. La tecnica mas confiable y comun es por espectrometria gamma. Ejemplo: si en una preparacion de holmio-166 se encuentra que contiene 99.9 MBq de holmio-166 y 0.1 MBq de disprosio-166, se dice que la solucion tiene una pureza radionucleidica de 99.9 %. Debe tenerse en cuenta que las proporciones de 166Ho y 166Dy cambian con el tiempo. Por eso al expresar la pureza radionucleidica debe hacerse una referencia al tiempo en esta forma: "La radiactividad debida al 166Dy no pasa del 0.1 % de la radiactividad total en la fecha que consta en la etiqueta".

GENERALIDADES

Obtendon y de radiofarmacos. Los medios de obtencion, uso y conservacion de radiofarmacos estan generalmente sujetos a licencias concedidas por las autoridades sanitarias. A menudo tienen que ajustarse ados tipos de reglamentos: los recomendados para las preparaciones farmaceuticas y los destinados a las sustancias radiactivas. Todo productor 0 usuario debe conocer y aplicar los sitos nacionales relativos a los productos de que se trate. Vehiculo 0 acarreador. La mas a del elemento radiactivo que habitualmente se encuentra en las farmaceuticas radiactivas, suele ser demasiado pe~:Jm:fia ser medida por los metodos fisicos 0 '-!U"UH"'v,,"-'''' Como cantidades tan pequefias no someterse a los metodos comunes de separacion y purificacion, se afiadir durante las de y distribucion un vehiculo en forma de sustancia inactiva 0 no del radionucleido, pero 10 que permitira una manipulacion mas facil. ciertas preparaciones coloidales de tecnecio-99m se vehiculo al renio estable. Dado que los radiofarmacos son unicos en su capacidad para detectar sitios bioquimicos especificos tales como receptores y enzimas, la practica de adicionar vehiculos es cada vez menos comun puesto que se requiere de altas actividades especificas que permitan obtener imagenes in vivo de los procesos moleculares y metabolicos. Deteccion y medida. Las transformaciones radiactivas pueden entrafiar una emision de particulas cargadas, un proceso de captura de electrones 0 un proceso de transicion isomerica. Las particulas cargadas emitidas por el nueleo pueden ser particulas alfa (nucleos de helio de numero

Radiofarmacos

masico 4) 0 particulas beta (electrones con carga negativa 0 positiva, W0 ~+ conocidos como negatrones y positrones respectivamente). La emision por el nucleo de particulas cargadas puede acompafiarse de rayos gamma, cuya naturaleza fisica es la misma que la de los rayos X pero con diferente energia. Tambien se emiten rayos gamma en el proceso de transicion isomerica (tj.). En el proceso de captura de electrones (c. e.) se emiten rayos X, que pueden acompafiarse asimismo de rayos gamma. Un positron queda aniquilado con un electron (negatron) y la reaccion va acompafiada de la emision de dos fotones gamma, cada uno con una energia de 0.511 MeV. Los metodos utilizados para la deteccion y medida de la radiactividad dependen de la naturaleza y la energia de la radiacion emitida. La radiactividad puede ser detectada 0 medida mediante diferentes instrumentos cuyo funcionamiento se basa en la ionizacion de gases y solidos por las radiaciones, en la fluorescencia de ciertos solidos y liquidos o en los efectos de las radiaciones sobre una emulsion fotografica. En general, los detectores consisten en una unidad sensible y un sistema electronico de recuento. La unidad sensible puede ser un tuba de Geiger-Muller, un contador prop orcional 0 un detector de centelleos acoplado a un fototubo multiplicador 0 a un semiconductor de estado solido. Los detectores de Geiger-Muller y los escaladores se suelen utilizar para la medicion de los emisores beta, mientras que los detectores de centelleos que emplean fosforo liquido 0 solido pueden usarse para medir los emisores alfa, beta y gamma. Tambien se pueden utilizar dispositivos de estado solido para medir emisores alfa, beta y gamma. Los circuitos electronicos de los sistemas de deteccion suelen comprender una fuente de alimentacion de alto voltaje, un amplificador, un selector de altura de impulsos y un aparato de recuento 0 escalador, un activimetro u otro dispositivo de lectura. Cuando el sistema de recuento 0 la escala en un conjunto de recuento se reemplaza por un sistema electronico de integracion, el conjunto que resulta es un activimetro, utilizado para medir la actividad de los radionucleidos emisores de rayos gamma. Existen variaciones en la construccion y el rendimiento de los detectores y sus accesorios. La preparacion de muestras, cuando se usa un instrumento particular, debe modificarse convenientemente a fin de obtener resultados satisfactorios. EI operador debe seguir cuidadosamente las instrucciones del fabricante, a fin de obtener un rendimiento optimo del . instrumento y resultados vaIidos, mediante el examen cuidadoso de muestras conocidas. Debe comprobarse a diario el funcionamiento y la confiabilidad de los aparatos mediante uso de preparaciones secundarias de referencia con trazabilidad demostrable. La radiacion debida a materiales de construccion, radiaciones cosmicas y descargas espontaneas de la atmosfera contribuye a 10 que se llama radiactividad de fondo. Todas las medidas

1407

de radiactividad deben efectuarse sustrayendo la radiactividad de fondo. Un computo de radiactividad es un valor estadistico, es decir, constituye una medida de la probabilidad de desintegracion nuclear y no es exactamente constante para un intervalo de tiempo determinado. La magnitud de la desviacion tipica es mas 0 menos igual a la raiz cuadrada del numero de cuentas. En general son necesarias 10 000 cuentas por 10 menos, para obtener una desviacion tipica dell %.

Absordon. La radiacion ionizante es absorbida por el material que rodea a la fuente radiactiva. Tal absorcion se produce en el aire, en la propia muestra (autoabsorcion) y en los recipientes que la contienen, en la ventana del aparato de deteccion yen todo absorbente especial colocado entre la muestra y el detector. Dado que, las particulas alfa tienen un debil poder de penetracion en la materia, las particulas beta tienen un poder algo mayor y que los rayos gamma son muy penetrantes, la identificacion del tipo y de la energia de la radiacion emitida por un radionucleido particular puede efectuarse por medio de absorbentes de espesor variable. En la practica ese metodo se utiliza poco, y solo en combinacion con emisores beta. Sin embargo, con esos emisores y con los rayos X (como por ej emplo los del yodo-125), las variaciones del recuento debidas al diverso grosor y densidad de los recipientes que contienen la muestra pueden constituir un problema importante. En consecuencia, a menudo se emplean tubos de plastico, en los que las variaciones de densidad y espesor son minimas. Para caracterizar la radiacion beta emitida por un radionucleido se utiliza generalmente el coeficiente de absorcion (/-1), que es el valor reciproco del espesor expresado en miligramos/centimetro al cuadrado 0 el semiespesor que ha de tener el absorbente para que la radiactividad sea reducida ala mitad. DE LAS RADIACIONES

Espectrometria en cristal de centelleo. Cuando la energia de la radiacion gamma interacciona con el cristal de centelleo, se produce luz en cantidad proporcional a la energia disipada. Esta luz 0 foton puede medirse con medios apropiados y es proporcional a la energia absorbida en el contador de centelleo. El foton se convierte en un impulso electrico mediante un fotomultiplicador. Si se registran los impulsos producidos con un analizador de altura se obtiene el espectro energetico de la fuente . Los detectores de centelleo mas empleados consisten en un cristal de yo duro sodico activado con talio. El espectro de centelleo de los rayos gamma muestra uno 0 varios picos fotoelectricos agudos caracteristicos que corresponden a las divers as energias de las radiaciones gamma de la fuente. Son utiles con fines de identificacion y tambien para detectar en una preparacion impurezas que emitan radiaciones gamma.

GENERAUDADES

SST

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Estos picos estim acompafiados de otros debido a efectos secundarios de radiaci6n en el contador de centelleo y en los materiales circundantes, como por ejemplo retrodispersi6n, aniquilamiento de positrones, suma de coincidencia y rayos X fluorescentes. Ademas, la dispersi6n de los fotones gamma en el contador de centelleo y en los materiales circundantes produce bandas anchas denominadas "continuos de Compton". Ciertos radionucleidos, como el yodo-129, emiten rayos X caracteristicos, de energias bien definidas que producen picos fotoelectricos en un espectr6metro gamma adecuado. La radiaci6n beta tambien produce interferencias en los aparatos de centelleo, pero los espectros son continuos y difusos, y no sirven generalmente para identificar radionucleidos ni para detectar en una preparaci6n impurezas que emitan radiaciones beta.

at6mico 0 la densidad de la sustancia absorbente, por 10 cual se emplean como blindaje, materiales de numero at6mico bajo 0 de poca densidad, tales como aluminio, vidrio 0 plastico transparente. La radiaci6n gamma es mas penetrante y su atenuaci6n es exponencial y se expresa en terminos de semiespesor. El semiespesor es el espesor del material atenuador necesario para que disminuya la intensidad de la radiaci6n a la mitad de su valor inicial. Una placa de siete semiespesores reducira la radiaci6n a menos del 1 % de la intensidad. La intensidad de la radiaci6n gamma disminuye en raz6n inversa al cuadrado de la distancia que existe entre la fuente y el punto de referencia.

Espectrometria con detector semiconductor. Utilizando detectores de estado s6lido puede obtenerse espectros de rayos gamma y particulas beta. Los picos obtenidos no sufren en la misma medida el ensanchamiento que se observa en la espectrometria en cristal de centelleo, y la resoluci6n de fotones gamma de energias similares mejora considerablemente sin embargo, su eficiencia es mucho menor. Actualmente existen equipos con detectores de estado s6lido como yoduro de mercurio, telurio de cadmio 0 bien de cadmio-zinc-telurio (CZT), operando a temperatura ambiente. La energia necesaria para crear un par "electr6n-vacante" 0 para hacer pasar un electr6n de la banda de valencia a la banda de conducci6n en un semiconductor es mucho menor que la que se precisa para producir un fot6n en un cristal de centelleo. En espectrometria de rayos gamma, un detector de germanio-litio hiperpuro puede proporcionar resoluci6n de energia del 0.33 % para el fot6n de l.33 MeV del cobalto-60, mientras que con un cristal de yoduro s6dico activado con talio, se obtiene una resoluci6n del 5.9 %.

Los radiofarmacos no tienen acci6n farmacol6gica, pero su administraci6n en humanos hace imperativo que se cumplan los requisitos exigidos a los productos farmaceuticos convencionales, ademas de los especificos por tratarse de sustancias radiactivas. Luego de la preparaci6n de un radiofarmaco y previo a su utilizaci6n en pacientes, es necesario verificar la calidad del mismo, para 10 cual deben ser sometidos a una serie de controles.

HH.ndaje contra las radiaciones. Deben utilizarse blindajes adecuados para proteger al personal del laboratorio contra las radiaciones ionizantes y a los instrumentos de medida contra la radiaci6n de fondo. El blindaje para las radiaciones alfa y beta es facil de conseguir, debido a su limitada capacidad de penetraci6n y su alcance varia de acuerdo con su energia cinetica. Las particulas alfa son monoenergeticas y no recorren mas que algunos centimetros en el aire y se detienen con una hoja de papel. La absorci6n de las particulas beta, como consecuencia de su espectro energetico continuo y de su dispersi6n, obedece a una funci6n aproximadamente exponencial. La penetraci6n de las particulas beta esta entre varios centimetros y algunos metros y se detienen facilmente con plastico 0 vidrio. La radiaci6n beta produce una radiaci6n secundaria por absorci6n en la materia conocida como Bremsstrahlung, semejante a los rayos X blandos por su poder de penetraci6n. Su intensidad es directamente proporcional al numero

REQUISITOS DE CONTROL DE CAUDAD

REQUISITOS

CONTROL

INSPECCION VISUAL. La apariencia fisica de un radiofarmaco es importante tanto en el momenta de la recepci6n del producto como antes de ser administrado. El profesional radiofarmaceutico deb era estar familiarizado con el color y estado fisico de los diferentes radiofarmacos. en una soluci6n verdadera no deben detectarse particulas visibles a la observaci6n a simple vista 0 por medio de iluminaci6n con lampara de tungsteno, sobre fondo blanco y negro. Se recomienda efectuar la observaci6n directa del producto marc ado interponiendo un vidrio plomado 0 indirectamente a traves de un espejo. Cualquier desviaci6n de color y claridad de una soluci6n debe ser analizada exhaustivamente, ya que puede reflejar cambios en el radiofarmaco que podrian eventual mente alterar su comportamiento bio16gico. TAMANO Y NUMERO DE Las suspensiones coloidales 0 preparaciones de agregados deben poseer un determinado tamafio de particulas de acuerdo al 6rgano que se desea estudiar. El tamafio de las particulas coloidales se determina par filtraci6n a traves de membranas de diferentes diametros de porosidad, se calcula el parcentaje de la radiactividad retenida por cada filtro. Este metodo no se aconseja para particulas menores de 0.05 )lm. EI control del numero y tamafio de los macroagregados y microesferas se efectua en un microscopio 6ptico con un ocular micrometrico calibrado y una camara de Neubauer 0 camara cuenta g16bulos. En el caso de nanocoloides el

Radiofarmacos

tamafio se puede caracterizar a traves de microscopio electronico. pH. Todos los radiofarmacos deb en poseer una concentracion apropiada de iones hidrogeno, para su estabilidad e integridad. El pH ideal de un radiofarmaco para administracion endovenosa debe ser alrededor de 7.4 (pH de la sangre), aunque puede variar de 2 a 9, debido a la alta capacidad reguladora de la sangre y al pequefio volumen inyectado. Esto no es valida para la via de administracion intratecal. El pH de una solucion es universalmente me dido con un electrodo de vidrio y potenciometro. En el caso de radiofarmacos preparados a nivel radiofarmacia hospitalaria, la evaluacion colorimetrica con papel pH, es el metoda de eleccion.

DETERMINACION DE LA PUREZA RADIONUCLEiDICA. EI metodo mas utilizado para examinar la pureza radionucleidica en los emisores gamma es la espectrometria gamma. En el caso particular del eluato de un generador de 99Mo/ 99mTc se deb era verificar la ausencia de 99 Mo . El metodo comunmente utilizado a nivel de la radiofarmacia hospitalaria es por atenuacion gamma en un calibrador de dosis. Para ella se utiliza un blindaje de Pb de 6 mm de espesor con 10 que se atenuan las emisiones del 99mTc en un porcentaje mayor a un 99 %, mientras que las emisiones de 99Mo son atenuadas en un 50 %, aproximadamente. Se mide la actividad del eluato del generador con y sin blindaje de Pb y se determina la relacion. 99

Mo

199m Tc =

Actividad medida con blindaje x 2 Actividad medida sin blindaje

La presencia de impurezas radionucleidicas puede causar error de dosificacion, incremento de radiacion absorbida y/o error diagnostico.

Picos caracteristicos de identidad. En el espectro de energia gamma los fotopicos caracteristicos de identidad para algunos de los radionucleidos mas utilizados en la preparacion de radiofarmacos son: 18p (0.511 MeV), 670a (0.093 MeV y 185 MeV), 99mTc (0.140 MeV), 131 1 (0.364 MeV), 1231 (0.159 MeV) u1 In (0.173 MeV y 0.247 MeV), 188Re (0.155 MeV), 153Sm (0.103 MeV) y 201 T l (0.135 MeV y 0.167 MeV). DETERMINACION DE LA PUREZA RADIOQufMI.CA. La pureza radioquimica puede estudiarse mediante divers as tecnicas, pero tienen particular importancia la cromatografia de liquidos en papel, en capa delgada (CCD), en capa delgada instantanea (CCDI) y la cromatografia de liquidos de alta resolucion (CLAR), MGA 0241. La CCDI utilizada Por 10 general es microfibra de vidrio impregnada de gel de silice (SO) 0 acido polisilicico (SA). Despues de terminar la separacion, se determina la distribucion de la radiactividad en el cromatograma. El peso de la sustancia utilizada en el cromatograma suele ser extraordinariamente

1409

pequefio (debido a la gran sensibilidad de las tecnicas de deteccion radiactiva) y, en consecuencia, hay que extremar el cuidado en la interpretacion de los resultados por la posibilidad de que aparezcan artefactos. Para la separacion puede utilizarse tambien la electroforesis MGA 0311, en vez de la cromatografia. Como ya se ha indicado antes, algunas veces es util afiadir acarreadores (esto es, los compuestos correspondientes no radiactivos), tanto para el propio radiofarmaco como para las presuntas impurezas. Sin embargo, existe el peligro de que el vehiculo inactivo del radiofarmaco, una vez afiadido, pueda interactuar con las impurezas radioquimicas y de lugar asi a una subestimacion de esas impurezas. Otra tecnica util se basa en la vigilancia de la distribucion biologica del radiofarmaco, inyectado en animales de laboratorio apropiados. A nivel de radiofarmacia hospitalaria los radiofarmacos de 99mTc a partir de juegos de reactivos se preparan diariamente, debiendose determimir la eficiencia de marcacion. Los metodos usualmente empleados en este caso son cromatografia en papel 0 en capa delgada (CCD), preferiblemente en capa delgada instantanea (CCDI). En la cromatografia planar una pequefia cantidad de la muestra de la preparacion del radiofarmaco se coloca sobre una tira de soporte cromatografico. La cromatografia se lleva a cabo introduciendo el soporte en un recipiente que contenga el disolvente indicado en la monografia correspondiente. En este tipo de cromatografias cada componente de una determinada muestra es caracterizada por un valor de R F, el cual se define por la relacion de la distancia recorrida por cada componente y la distancia recorrida por el disolvente. Distancia recorrida por la muestra

= Distancia recorrida por el disolvente F

R

Algunas consideraciones deberan ser observadas antes y durante la realizacion de los cromatogramas: •

La gota de la muestra debe ser pequefia (1 a 5 ilL).

"

El soporte cromatografico debe estar en optimas condiciones para ser usado (control de humedad si es gel de silice, que no este dafiado, quebrado, doblado).

1&

EI 0 los disolventes que compongan la' fase movil deben ser de alta pureza, teniendo especial precaucion en absorcion de humedad 0 descomposicion por efecto de la luz .

Despues de la adicion de la gota, se introduce el soporte en el recipiente que contiene el disolvente, tomando la precaucion de que solamente la parte inferior de la tira, debajo del punto de aplicacion, entre en contacto con el disolvente y que los bordes de la tira no contacten el recipiente. Cuando el disolvente migra hasta la distancia deseada, se remueve la tira, se seca y se mide la radiactividad en un radiocromatografo, bajo la gammacamara 0 se corta en segmentos y se mide la radiactividad en un contador apropiado.

REQUISITOS DE CONTROL DE CAUDAD

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

La impureza radioquimica se calcula en funcion de la relacion (en porcentaje) de la radiactividad del componente no deseado y la actividad total de la muestra. Debe tenerse especial cuidado en descontar la radiactividad asociada al fondo antes de calcular esta relacion. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD. El amilisis se realiza usando equipos de deteccion seleccionados en base al tipo y energia de la radiacion emitida siendo pnictica comun en radiofarmacia hospitalaria el empleo de un calibrador de dosis 0 activimetro. Por ser un resultado variable en funcion del tiempo, la radiactividad de un radioDirmaco debe referirse a la fecha y hora de la determinacion. La radiactividad de un radiofarmaco a ser administrado a un paciente, representa la dosis. Su calculo sera dependiente del radiofarmaco, proposito del estudio, caracteristicas del paciente y otros. Para especificar el radionucleido a que se refiere, es necesario expresar el tiempo (fecha y hora) en esta forma, por ejemplo: "37 MBq de yodo-131 por miligramo (37 MBq/mg) de meta-yodobencilguanidina el dia 1 de enero de 2008 a las 12:00 h" 0 "20 GBq de fluor-I 8 por milimol (400 GBq/mmol) de fluor-2-desoxi-D-Glucosa el dia 4 de enero de 2008 a las 05:00 h". La actividad especifica no suele determinarse directamente; mas bien se calcula a partir de la concentracion radiactiva de la solucion, que es conocida, y de la concentracion quimica del elemento 0 del compuesto, aunque siempre debe tomarse en cuenta la pureza radioquimica de la preparacion. DETERMINACION DE LA PUREZA QUIMICA. Las impurezas quimicas pueden ser introducidas inadvertidamente en el radiofarmaco, antes, durante y despues de la marcacion, por ejemplo impurezas de reactivos, productos de descomposicion no radiactivos, rotura de la estructura quimica del producto entre otros. Fundamentalmente importan las impurezas que puedan alterar el comportamiento fisicoquimico y/o biologico del radiofarmaco 0 producir efectos toxicos en el paciente. As! por ejemplo, exceso del ion aluminio eluido del generador, de 99 Mol 91U Tc; en 99lUTc-azufre coloidal; pequefias cantidades de globulinas en preparaciones de albumina dan origen a impurezas del producto final. La determinacion de las impurezas quimicas se realiza por colorimetria, ensayos a la gota 0 analisis por activacion. PRUEBAS DE ESTERILIDAD Y ENDOTOXINAS BACTERIANAS. Algunas monografias de radiofarmacos precisan que el producto debe ser esteril y estar exento de pirogenos. La presencia de pirogenos se mide a traves de la prueba de endotoxinas bacterianas. La semivida de los productos farmaceuticos radiactivos es tal que, de ordinario, antes de poner el producto en circulacion solo se pueden practicar las pruebas de endotoxinas bacterianas. En general, las pruebas de esterilidad han de completarse retrospectivamente.

REQUISITOS DE CONTROL DE CAUDAD

Esterilidad. La verificacion de esterilidad se efectua por incubacion de una muestra en medios de cultivo que sean capaces de ofrecer condiciones ideales para la multiplicacion de los mas diversos microorganismos. Los medios de cultivo utilizados son: medio fluido de tioglicolato que permite el crecimiento de aerobios y anaerobios a una temperatura de incubacion de 32.5 ± 2.5 °C entre 7 y 14 dias; medio digerido de soya y caseina para microorganismos aerobios, a temperatura ambiente de 22.5 ± 2.5 °C entre 7 y 14 dias. Se siembra como minimo, un volumen de muestra igual 0 mayor a la dosis a administrar. Para asegurar la esterilidad de un radiofarmaco es necesario aplicar las Buenas Practicas Radiofarmaceuticas, que inc1uyen la utilizaci6n de tecnicas asepticas para la produccion, control de calidad y fraccionamiento de dosis, asi como recomendaciones para trabajar en campanas de flujo laminar, limpieza y saneamiento de areas, especialmente cuando se trate de marcacion de celulas autologas. El fabricante debe emprender las pruebas de esterilidad 10 antes posible y leer los resultados despues de haber expedido el producto. Sobre el fabricante de radiofarmacos recae la total responsabilidad de asegurarse por todos los medios posibles de la validez de su metodo de esterilizacion, 10 que puede abarcar e] empleo de indicadores biologicos y quimicos y la comprobacion meticulosa y frecuente del metodo. Endotoxinas bacterianas. MGA 0316. Los pirogenos son proteinas y polisacaridos de 0.05 a 1 /-lm de tamafio, producto del metabolismo de los microorganismos y que en su gran mayoria son endotoxinas. Existen ciertos compuestos quimicos que pueden actuar como sustancias hipertermizantes, general mente solubles y termoestables. Por ello, la esterilidad no garantiza la apirogenicidad. La fuente mas comun de pirogenos es el agua, los productos quimicos y el material de vidrio, por 10 que se recomienda el uso de soluciones esteriles recientemente preparadas, reactivos de alta pureza, material despirogenizado y una correcta metodologia de trabajo. La presencia de endotoxinas bacterianas produce diversos sintomas como fiebre, escalofrio, malestar, leucopenia, dolor en las articulaciones, dolor de cabeza, rubor, dilatacion de las pupilas y transpiracion. Las reacciones .pirogenicas se manifiestan en el paciente entre los 30 min y las 2 h despues de su administracion. Los metodos usuales para la determinacion de pirogenos son el metodo in vivo usando conej os y el metodo in vitro usando lisado de amebocitos de Limulus polyphemus (LAL), oficialmente conocido como prueba de endotoxinas bacterianas (MGA 0316). La sensibilidad del metodo se expresa en unidades de endotoxina (UE). El limite de endotoxina aceptado para administraci6n parenteral (excepto para intratecal) es de 5 DE/kg, siendo 0.2 DE/kg para administracion intratecal.

Radiofarmacos

Para productos radiofarmaceuticos que no se administran por via intratecal, el limite se calcula mediante la siguiente formula: Limite de endotoxina = 1751V Donde: Dosis maxima recomendada por mililitro. V Limite maximo permitido de VE en el volumen de 175 administracion.

ESTABILIDAD. La naturaleza particular de los radiofarmacos exige establecer un periodo de utilizacion 0 una fecha de caducidad, sobrepasada la cual no se recomienda su empleo. Por esta razon, todos los radiofarmacos tienen una fecha de expiracion luego de la cual no podran ser utilizados. Existen sustancias tales como ascorbato de sodio, acido ascorbico y acido gentisico que a menudo se agregan a fin de garantizar la estabilidad del radiofarmaco. Muchas preparaciones se almacenan en la oscuridad y en refrigeracion para disminuir la radiolisis. Los procesos de dilucion, fraccionamiento, esterilizacion y el uso de diferentes tipos de viales y tapones pueden alterar el pH, la pureza radioquimica, el tamafio de las particulas y la absorcion. La dispensacion de dosis sucesivas a partir de un vial multi -dosis puede muchas veces afectar la estabilidad del producto que permanece en el vial original, especialmente 5i este es muy sensible a la presencia del oxigeno en el aire. Esto es particularmente . Importante cuan d 0 se trata d e rad'10 f:'armacos d e 99mT c. El periodo de tiempo aprovechable comienza en la fecha en la cual se expresa 1a radiactividad en la etiqueta, y se especifica en dias, semanas 0 meses. Para los radionucleidos de vida mas larga, el periodo de utilizacion no excede de 6 meses. Dicho periodo depende de 1a estabilidad radioquimica y de la cantidad de impurezas radionucleidicas de larga vida que contenga la preparaci6n. En 1a fecha de caducidad, la radiactividad habra descendido de tal modo que 1a que conserva resulta ya insuficiente para los fines a los que se destina. Ademas la descomposicion quimica 0 radioquimica pueden haber reducido la pureza radioquimica hasta limites inaceptables. Por otra parte, es posible que el contenido en impurezas radionucleidicas sea tal que 1a dosis de radiaciones resulte excesiva para el paciente. Por todo ello, el empleo de productos mas alIa de su fecha de caducidad es imprudente. En radiofarmacia industrializada se debe llevar a cabo un programa anual de estabilidad de acuerdo a 10 indicado en la NOM-073-SSAl-vigente, aplicando 10 referente a 1a forma farmaceutica correspondiente. Las pruebas de estabilidad deb en de llevarse a cabo en el mismo sistema contenedorcierre y a las condiciones de almacenamiento establecidas en el marbete del producto terminado. Cuando un requerimiento no pueda ser aplicado, debe justificarse tecnica y adecuadamente. Se debe elaborar un protocolo de estabilidad que indique como minimo los siguientes parametros:

e

.. ell

• e

1411

Nombre del producto. Forma farmaceutica. Presentacion y concentracion. Tipo, tamafio y numero de lote. Descripcion sistema contenedor-cierre.

• • • • •

Condiciones del estudio. Tiempos de muestreo y analisis. Parametros de prueba. Especificaciones de estabilidad. Referencia de los metodos analiticos por parametro y su validacion, si procede. .. Disefio reducido de analisis, cuando se justifique. ., Nombre y firma del responsable sanitario. El informe del estudio debe contener: • ED

.. • .. 6\

6\

• •

•

N ombre del fabricante. Nombre del producto. Forma farmaceutica, presentacion y concentracion. Numero y tamafio del (los) lote( s) y fecha de fabricacion. Descripcion del sistema contenedor-cierre. Datos analiticos tabulados por condicion de almacenamiento y fecha de inicio y termino del estudio. Cromatogramas 0 espectrogramas representativos de los lotes en estabilidad al inicio y fin del estudio, si procede. Conclusiones. Propuesta del periodo de caducidad (para radiofarmaco nuevo a solicitud de modificaci6n de fecha de '"'''',. . ''''"''''_''-',..... ,. Nombre y firma del reSpOlt1Same sanitario.

ISOTONICIDAD. Se llama isotonica a las soluciones que tienen igual osmotica. En el caso de una soluci6n a1 inyectable se debe considerar 1a isotonicidad con suero U~"'h~.H"'~' En la mayoria de los radiofarmacos que se administran por via el volumen uti liz ado es tan que ~ pueden tolerarse desviaciones importantes de 1a sin que ella ocasione inconvenientes a los 1-' ........,. "',,,,,'u , rapida dilucion en la sangre. En cambio, la iso~onicidad es esencial en aquellos estudios clinicos en los que se realice la marcacion de globulos rojos y se deba mantener la dad de las membranas ejemplo, determinacion de volumen globular total, sobrevida de eritrocitos etc.). El control se puede realizar por diversos metodos, siendo los mas practicos aquellos que determinan la presion osmotica por medio del descenso crioscopico. Debido a que la fuerza ionica y el pH son factores importantes en la estabilidad de un radiofarmaco, cuando se deba diluir el producto final, se deb era usar un diluyente apropiado, de preferencia el mismo disolvente utilizado en 1a preparacion original. AUV ...JLlvLa"". calcular su peso promedio, triturar hasta polvo fino y pesar una cantidad del polvo equivalente a 250 mg de alopurinol, pasar a un matraz volumetrico de 10 mL, disolver y llevar al aforo con una mezcla de 9 volumenes de solucion de hidroxido de amonio al 45 % y 1 volumen de solucion de hidroxido de sodio 1 mezc1ar y filtrar. Procedimiento. a la cromatoplaca, en carriles sepalOde la preparacion de referencia, 10 de la solucion de hemisulfato de 3-amino-4-carboxamidopirazol y lOde la de la muestra. Desarrollar el cromatograma dejando correr la fase movil hasta 1 cm antes de la superior de la placa. Retirar la cromatoplaca de la camara, marcar el frente de la fase movil y secar con corriente de aire seco. Observar bajo lampara de luz UV. La mancha ,-,V"·"-.",. indicada en el marbete.

SUSTANCIAS RELACIONADAS. MGA mancha ot)lEefllGa en el "¥~.~r·.rn.,>Y"n~~ delgada. de Identidad con la ", .. de la muesdel tra, diferente de la mancha principal, no es mas ni mas intensa que la mancha obtenida en el cromatograma con la solucion de hemisulfato de 3-amino-4-carboxamido10 que corresponde a no mas del 0.2 % de sustancias relacionadas. ,"-,UCHI.IUll..d

",.n",rClf'lArI

MGA 0241, CLAR. Fase movil. Pesar 5.75 g de fosfato monobasico de amonio, pasar a un matraz volumetrico de 1 000 mL, disolver y llevar al aforo con agua, mezclar. Filtrar y desgasificar. Patron interno. Pesar 10 mg de hipoxantina, pasar a un matraz volumetrico de 10 agregar 2 mL de solucion de

Preparados farmaceuticos

hidroxido de sodio O.l N, agitar mecanicamente hasta disolver, aproximadamente 10 min, llevar al aforo con agua y mezclar. Esta solucion contiene 1 mg/mL de hipoxantina. Preparar el dia de su uso. Preparacion de referencia. Pesar una cantidad de la SRef-FEUM de alopurinol equivalente a 10 mg de alopurinol, pasar a un matraz volumetrico de 10 mL, agregar 2 mL de solucion de hidroxido de sodio O.l N, agitar mecanicamente durante 10 min, llevar al aforo con agua y mezclar. Pasar una alicuota de 4 mL de esta solucion a un matraz volumetrico de 200 mL, agregar una alicuota de 2 mL de patron intemo, llevar al aforo con fase movil y mezclar. Esta solucion contiene 20 ~g/mL de alopurinol y se preparar el dia de su uso. Preparacion de la muestra. Pesar no menos de 20 tabletas y calcular su peso promedio, triturar hasta polvo fino y pesar una cantidad del polvo equivalente a 50 mg de alopurinol, pasar a un matraz volumetrico de 50 mL, agregar 10 mL de solucion de hidroxido de sodio 0.1 N, agitar mecanicamente durante 10 min, llevar al aforo con agua y mezclar. Desde este momenta conducir la prueba sin demora. Filtrar descartando los primeros 10 mL del filtrado, pasar una alicuota de 4 mL del filtrado a un matraz volumetrico de 200 mL, agregar una alicuota de 2 mL de patron intemo, llevar al aforo con fase movil y mezclar. Condiciones del equipo. Detector de luz UV; longitud de onda 254 nm; columna de 30 cm x 4 mm; empacada con L1; velocidad de flujo 1.5 mL/min. Procedimiento. Inyectar al cromatografo, repetidas veces, volumenes iguales (15 ~L) de la preparacion de referencia, ajustar los parametros de operacion y el tamano de los picos. El coeficiente de variacion no es mayor del 3 % y el factor de resolucion no es menor de 5. El valor de retencion relativo es de 0.6 para hipoxantina y 1.0 para alopurinol. Una vez ajustados los parametros de operacion, inyectar al cromatografo, por separado, volumenes iguales (15 ilL) de la preparacion de referencia y de la preparacion de la muestra. Obtener sus respectivos cromatogramas y calcular las areas relativas. Calcular la cantidad de CsH 4N 4 0, en la porcion de muestra tomada por medio de la siguiente formula: CD

Am ) ( Are!

Donde: C= Cantidad de alopurinol por mililitro de la preparacion de referencia. D= Factor de dilucion de la muestra. Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de la muestra. A ref = Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de referencia.

1515

Contienen no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad de C 17H 13 CIN4 , indicada en el marbete. SUSTANCIA DE REFERENCIA. Alprazolam y triazolam, manejar de acuerdo a las instrucciones de uso. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0241, CLAR. Pro ceder como se indica en la Valoracion. El tiempo de retencion obtenido en el cromatograma con la preparacion de la muestra, corresponde al obtenido con la preparacion de referencia. B.MGA 0351. Preparacion de Preparar una dispersion de la SRef de alprazolam con bromuro de potasio siguiendo el proeedimiento para la preparaeion de la muestra. Preparacion de la muestra. Pesar no menos de 10 tabletas ealcular su peso promedio, triturar hasta polvo fino y pesa; una eantidad del polvo equivalente a 15 mg de alprazolam, disolver en 10 mL de solueion de earbonato de sodio (1 en 100) adicionar 15 mL de cloroformo y agitar vigorosamente durante 30 min. Centrifugar, eliminar la eapa aeuosa y pasar la eapa clorofonniea a un reeipiente limpio, adicionar 200 mg de bromuro de potasio, evaporar el cloroformo de la mezcla hasta sequedad y seear la dispersion en vacio a 60°C durante 24 h. Procedimiento. Triturar la preparaeion anterior hasta polvo fino y preparar la pastilla eoloeando 100 mg de bromuro de potasio seeo, dentro del dado. Roeiar alrededor de 20 mg del polvo fino de la dispersion de alprazolam-bromuro de sio sobre la eapa de bromuro de potasio y eubrir con otra porcion de 100 mg de bromuro de potasio seeo. El espeetro de absoreion infrarroja de la preparaeion de la muestra exhibe las mismas earaeteristieas de alprazolam en eomparaeion con la preparaeion de referencia, en las siguientes longitudes de onda: a 1 609; 1 578; 1 566; 1 539; 1 530; 1. 487; 1 445; 1 428; 1 379; 1 337 Y 1 320 longitudes de onda en la region de 1 650 a 1 300 em-I, a 970; 932; 891; 826; 797; 779; 746; 696; 669; 658 y 640 longitudes de onda en la region de 975 a 600 em-I. MGA 0291. Muestra compuesta, Aparato 1.

Q = 80.0 %. Medio de disolucion, SA diluida, preparada como se indica en esta prueba. SA diluida. Preparar una dilueion 1 en 10 de SA eoneentrada pH 6.0 en agua para obtener una solueion que tenga un pH de 6.0 ± 0.1.

ALPRAZOLAM.TABLETAS

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Preparadon de referenda concentrada. Preparar una solucion de la SRef de alprazolam en metanol que contenga 0.05 mg/mL de alprazolam. Preparadon de referenda. Adicionar 50 mL de la SA concentrada pH 6.0 y 250 mL de agua a un matraz volumetrico de 500 mL. Adicionar 5.0 mL de la preparacion de referencia concentrada por cada 0.25 mg de alprazolam contenidos en la tableta de la muestra. Llevar al aforo con agua y mezclar. Fase movil. SA diluida:acetonitrilo:tetrahidrofurano (60:35 :5), filtrar y desgasificar. Hacer los ajustes necesarios para obtener el sistema cromatognlfico adecuado. Condidones del equipo. Detector de luz UV; longitud de onda 254 nm; columna de 4.6 mm x 10 em empacada con L7 y flujo de 1.0 mL/min. Procedimiento. Colocar cada tableta en el aparato con 500 mL del medio de disolucion, accionarlo a 100 rpm durante 30 min, filtrar inmediatamente una porcion de esta solucion. Mezclar alicuotas iguales de cada una de las 6 muestras filtradas. Inyectar al cromatografo, repetidas veces, volumenes iguales (20 ~L) de la preparacion de referencia y registrar los picos respuesta, la eficiencia de la columna no es menor de 500 platos teoricos y el coeficiente de variacion no es mayor del 3.0 %. Una vez ajustados los panimetros de operacion, inyectar al cromatografo, por separado, volumenes iguales (20 ~L) de la preparacion de la muestra y de la preparacion de referencia. Obtener sus correspondientes cromatogramas y medir las respuestas de los picos mayores. Calcular el porcentaje de C 17H 13 CIN4 disuelto por medio de la siguiente formula: 100 CD

M

Donde: C Cantidad de alprazolam por mililitro en la preparacion de referencia. D Factor de dilucion de la muestra. Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de la muestra. Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de referencia. M = Cantidad de alprazolam indicada en el marbete. UNIFORMIDAD DE DOSIS.MGA 0299. Cumple los requisitos. Fase movil. Acetonitrilo:cloroformo:a1cohol butilico:agua:acido acetico glacial (850:80:50:20:0.5), filtrar y desgasificar. Hacer ajustes si es necesario para obtener el sistema cromatografico adecuado. Patron interno. Preparar una solucion de la SRef de triazolam en acetonitrilo que contenga 0.032 mg/mL de triazolam. Preparadon de referenda. Preparar una solucion de la SRef de alprazolam en el patron interno que contenga 0.025 mg/mL de alprazolam.

ALPRAZOLAM.TABLETAS

Preparadon de la muestra. Pasar una tableta a un vasa de precipitados, adicionar 0.4 mL de agua directamente a la tableta, dejar reposar durante 2 min y agitar hasta dispersion de la tableta. Por cada 0.25 mg de alprazolam contenidos en la tableta, adicionar 10 mL de patron intemo, agitar y centrifugar si es necesario. Condidones del equipo. Detector de luz UV; longitud de onda de 254 nm; colunma analitica de 4.6 mm x 30 em empacada con L3 y flujo de 2.0 mL/min. Procedimiento. Inyectar al cromatografo, repetidas veces, volumenes iguales (20 ~L) de la preparacion de referencia y registrar los picos respuesta, la resolucion R entre el patron intemo y Alprazolam no es menor de 2.0 y el coeficiente de variacion no es mayor del 2.0 %. Una vez ajustados los parametros de operacion, inyectar al cromatografo, por separado, volumenes iguales (20 ~L) de la preparacion de referencia y de la preparacion de la muestra. Obtener sus correspondientes cromatogramas y medir las respuestas de los picos mayores. Calcular la cantidad de C 17 H 13 CIN 4 en la tableta, por medio de la siguiente formula:

cv

Am ) ( A ret

Donde: C Cantidad de alprazolam por mililitro en la preparacion de referencia. V = Volumen en mililitros de patron interno en la preparacion de la muestra. Am Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de la muestra. Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparacion de referencia. MGA 0241, CLAR.

Fase movil y sistema cromatognifico. Pro ceder como se indica en la prueba de Un([ormidad de dosis. Patron interno. Preparar una solucion de la SRef de triazolam en acetonitrilo que contenga 0.25 mg/mL de triazolam. de referenda. Preparar una solucion de la SRef de alprazolam en patron intemo que contenga 0.25 mg/mL de alprazolam. Pasar una alicuota de 5.0 mL de esta solucion a un matraz volumetrico de 50 mL, llevar al aforo con acetonitrilo y mezclar. Esta solucion contiene 0.025 mg/mL de alprazolam. de la muestra. Pesar no menos de 20 tabletas, calcular su peso promedio, triturar hasta polvo fino, pesar una cantidad del polvo equivalente a 5 mg de alprazolam, pasar a un matraz volumetrico de 200 mL, adicionar 2 mL de agua y 20 mL de patron interno, agitar vigorosamente durante 10 min, llevar al aforo en acetonitrilo y mezclar. Procedimiento. Nota: usar las areas donde los picos respuesta son indicados.

Preparados farmaceuticos

Inyectar al cromatografo, por separado, volumenes iguales (20 /-lL) de la preparacion de referencia y de la preparacion de la muestra. Obtener sus correspondientes cromatogramas y medir las respuestas de los picos mayores. Calcular la cantidad de alprazolam (C 17H 13 CIN4), en la porcion de muestra tomada por medio de la siguiente formula: CD

Am ) ( Are!

Donde: C Cantidad de alprazolam por mililitro en la preparacion de refere1JCia. D Factor d~ disolucion de la muestra. Am Area bajo el pico respuesta de alprazolam relativo al pica del patron intemo obtenido en el cromatograma con la preparacion de la muestra. A rel = Area bajo el pica respuesta de alprazolam relativo al pica del patron interno obtenido en el cromatograma con la preparacion de referencia.

AlQUITRAN DE HUllA SUSPENSION DERMICA Contiene no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de las cantidades de C4 H 6N 4 0 3 y alquitran de hulla, indicadas en el marbete. ASPECTO. Vaciar completamente el contenido de 10 envases de la muestra previamente agitados, a probetas escrupulosamente limpias y secas, provistas de tapon, un envase a cada probeta y observar inmediatamente bajo condiciones adecuadas de visibilidad. El contenido se vacia con fluidez y la suspension es homogenea, libre de grumos y de particulas extrafias. Despues de 24 h de reposo, puede presentar ligera sedimentacion que al agitarse resuspende. ENSAYOS DE IDENTIDAD

A. Alquitnin de hulla. MGA 0361. El espectro de absorcion en la region ultravioleta de la solucion de la muestra obtenida como se indica en la Valoracion de alquitrim de huZZa, corresponde al obtenido con la solucion de referencia, empleando celdas de 1 cm y metanol como blanco de ajuste. B. Alantoina. MGA 0241, CLAR. El tiempo de retencion obtenido en el cromatograma con la preparacion de la muestra, en la Valoracion de alantoina, corresponde al obtenido con la preparacion de referencia. C. Pasar un volumen de la muestra, previamente agitada, equivalente a 10 mg de alantoina, a un tuba de ensayo, agregar 2 mL de etanol, 1 mL de SR de fuscina acido sulfuroso y mezclar. La muestra desarrolla color rojo.

1517

V ARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. LIMITES MICROBIANOS. MGA 0571. La muestra no contiene mas de 100 UFC/mL de organismos mesofilicos aerobios. No mas de 10 UFC/mL de hongos filamentosos y levaduras. Libre de patogenos. DE ALQUITRAN DE HULLA. MGA 0361. Nota: proteger las soluciones de la luz. Preparadon de referenda. Pesar el equivalente a 9 mg de alquitran de hulla, pasar a un matraz volumetrico de 100 mL, llevar al aforo con metanol y mezclar. Pasar una alicuota de S mL de la preparacion anterior a un matraz volumetrico de 100 mL, llevar al aforo con el mismo disolvente y mezclar. Esta solucion contiene 4.S ~g/mL de alquitran de hulla. Preparadon de la muestra. Pasar una alicuota de la muestra, previamente agitada, equivalente a 28.2 mg de alquitran de hulla, a un matraz volumetrico de 2S0 mL, agregar 200 mL de metanol, agitar mecanicamente durante 30 min, llevar al aforo con metanol, mezclar y filtrar, desechar los primeros mililitros del filtrado. Pasar una alicuota de 4 mL del filtrado a un matraz volumetrico de 100 mL, llevar al aforo con metanol y mezclar. Procedimiento. Determinar la absorbancia de la preparacion de referencia y de la preparacion de la muestra, a la longitud de onda de maxima absorbancia de 2S0 nm aproximadamente, empleando celdas de 1 em y metanol como blanco de ajuste. Calcular la cantidad en miligramos de alquitran de hulla en el volumen de muestra tomado, por medio de la siguiente formula: CD

Am ) ( Are!

Donde: C = Cantidad par mililitro de alquitran de hulla en la preparacion de referencia. D = Factor de dilucion de la muestra. Absorbancia obtenida con la preparaci6n de la muestra. Absorbancia obtenida con la preparaci6n de referencia. VALORACION DE ALANTOiNA. MGA 0241, CLAR. Fase movil. Solucion de acetonitrilo al 70 % (v/v), filtrada a traves de un filtro de O.S ~m, desgasificada con vacio durante 2 min. Preparadon de referenda. Pesar el equivalente a 20 mg de alantoina, pasar a un matraz volumetrico de SO mL, disolver y llevar al aforo con solucion de metanol al 70 % (v/v), mezclar y si es necesario someter a la accion de un bafio de ultrasonido hasta completa disoluci6n. Filtrar a traves de un

ALQUITRAN DE HULLA Y ALANTOiNA. SUSPENSION DERMICA

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

filtro de porosidad de 0.5 flm. Esta soluci6n contiene 400 flg/mL de alantoina. de la muestra. Pasar un volumen de la muestra, previamente agitada, equivalente a 20 mg de alantoina, a un matraz volumetrico de 50 mL, disolver y llevar al aforo con soluci6n de metanol al 70 % (v/v), mezclar y si es necesario someter a la acci6n de un banD de ultrasonido hasta completa disoluci6n del principio activo, filtrar a traves de un filtro de porosidad de 0.5 flm. Condiciones del Detector de ultravioleta, a una longitud de onda de 220 nm; columna de 25 cm x 4.5 mm, empacada con gel de silice totalmente porosa, de 5 flm de diametro, quimicamente recubierta con una capa esencialmente monomolecular de aminopropilsilano. Procedimiento. Inyectar al cromat6grafo por quintuplicado, volumenes iguales (10 flL) de la preparaci6n de referenda, registrar los picos respuesta y calcular el coeficiente de variaci6n, el cual no es mayor dell. 7 %. Una vez ajustados estos panimetros, inyectar al cromat6grafo por separado, volumenes iguales (10 flL) de la preparaci6n de referenda y de la preparaci6n de la muestra, obtener sus correspondientes cromatogramas y medir el area bajo los picos. Calcular la cantidad de C4H 6N 4 0 3 , en el volumen de muestra tornado, por medio de la siguiente f6rmula:

CD

Am ) ( Are!

Donde: C Cantidad por mililitro de alantoina en la soluci6n de referenda. D Factor de diluci6n de la muestra. bajo el pico obtenida en el cromatograma con la preparaci6n de la muestra. Area bajo el pico obtenida en el cromatograma con la nrf'n~r~r.10'11 de referencia.

ASPECTO. Vaciar por separado el contenido de 10 envases de la muestra a probetas escrupulosamente limpias y secas; observar bajo condiciones adecuadas de visibilidad. El contenido es una soluci6n y estar libre de particulas visibles. DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. MICROBIANOS. MGA 0571. La muestra no contiene mas de 100 UFC/mL de organismos mesofilicos aerobios; no mas de 10 UFC/mL de hongos filamentosos y levaduras y libre de pat6genos.

ALQUITRAN DE HULLA. SOLUCI6N DERMICA

La suspensi6n oral de hidr6xido de aluminio e hidr6xido de magnesio contiene el equivalente de no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad indicada en el marbete de hidr6xido de aluminio (AI(OH)3) y no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad indicada en el marbete de hidr6xido de magnesio (Mg(OHh). Puede contener agentes saborizantes y antimicrobianos adecuados. ASPECTO. La suspensi6n es homogenea, viscosa, de color blanco, opaca, libre de grumos y de particulas extranas. Se vacia con fluidez, despues de 24 h de reposo puede presentar ligera sedimentaci6n que al agitarse resuspende. DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0511, Magnesia. A una soluci6n de 5 mL de la muestra en 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 N, adicionar 5 gotas de SI de rojo de metilo, calentar hasta ebullici6n, agregar soluci6n de hidr6xido de amonio 6 N hasta que el color de la soluci6n cambie a amarillo intenso, continuar la ebullici6n durante 2 min y filtrar. El filtrado responde a las pruebas para magnesio. B. MGA 0511, Aluminia. Lavar el precipitado obtenido en el Ensaya de Identidad A con soluci6n caliente de cloruro de amonio (1 :50) y disolver el precipitado en soluci6n de acido clorhidrico 3 N. La soluci6n responde a laspruebas para aluminio.

MGA 0701. Entre 7.3 y 8.5. CLORUROS. MGA 0161. No mas del 0.14 %. Disolver 5 g de la muestra homogeneizada en la minima cantidad de acido nitrico, pasar a un matraz volumetrico de 100 mL, agregar un exceso de 1 mL de acido nitrico, llevar al aforo con agua, mezclar y filtrar. Pasar una alicuota de 10 mL del fiItrado a un tuba de Nessler, diluir a 40 mL con agua y proceder como se indica enMGA 0161. No muestra mas cloruros que los correspondientes a 1 mL de soluci6n de acido clorhidrico 0.02 N. SULFATOS. MGA 0861. No mas del 0.1 %. Disolver 5 g de la muestra homogeneizada en 5 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 calentar ligeramente, enfriar y pasar a un matraz volumetrico de 250 mL, llevar al aforo con agua, mezclar y filtrar. Pasar una alicuota de 20 mL del filtrado a un tuba de Nessler, diluir a 40 mL con agua y proceder como se indica en MGA 0861. No muestra mas sulfatos que los correspondientes a 0.4 mL de soluci6n de acido sulfurico 0.02N.

Preparados farmaceuticos

ARSENICO. MGA 0111. No mas de 0.6 ppm. Preparar una solucion patron que contenga 5 I-lg de arsenico en lugar de 3 I-lg Y preparar la solucion de la muestra, disolviendo 8.3 g de la suspension previamente agitada, en 20 mL de solucion de acido sulfurico 7 N. METALES PESADOS. MGA 0561. No mas de 5 ppm. Disolver 4 g de la muestra en 10 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N con ayuda de calentamiento, filtrar si es necesario y diluir con agua a 25 mL. Emplear 2 mL de la solucion tipo de plomo de 10 I-lg/mL, para realizar la prueba. CAPACIDAD DE NEUTRALIZACION. MGA 0701. 0c. Calibrar el potenciometro con soluciones de biftalato de potasio 0.05 My tetraoxalato de potasio 0.05 M, usar un agitador magnetico de 40 x 10 mm centrado en el vaso, a una velocidad de agitacion de 300 rpm ± 30 rpm. Preparacion de la muestra. Homogeneizar la muestra y determinar la densidad como se indica en MGA 0251. Pasar una alicuota de la muestra homogeneizada, equivalente a la dosis minima etiquetada, a un vasa de precipitados de 250 mL, agregar agua hasta un volumen de 70 mL y mezclar con un agitador magnetico durante 1 min. Procedimiento. Mantener la preparacion de la muestra en agitacion, mediante el agitador magnetico, adicionar una alicuota de 30 mL de SV de acido clorhidrico 1 N, agitar durante 15 min exactamente. Despues de la adicion del acido y en un periodo que no exceda de 5 min adicionales, titular el exceso de acido clorhidrico con SV de hidroxido de sodio 0.5 N hasta tener un pH estable de 3.5, durante 10 a 15 s, como se indica en MGA 0701. Calcular el numero de miliequivalentes de acido consumido, considerando que cada mililitro de SV de acido clorhidrico 1 N es igual a 1 miliequivalente de acido consumido y expresar el resultado en terminos de miliequivalentes de acido consumido por gramo de muestra. El acido consumido por la dosis minima recomendada en el marbete, no es menor de 5 miliequivalentes y no es menor del numero de miliequivalentes calculado por la formula siguiente:

A 37 ± 3

0.SS(0.038SA)

+ 0.8(0.0343M)

Donde: 0.0385 = Capacidad teorica de neutralizacion en miliequivalentes del hidroxido de aluminio. 0.0343 = Capacidad teorica de neutralizacion en miliequivalentes de magnesio. A Cantidad en miligramos de hidroxido de aluminio en la dosis minima etiquetada. .M = Cantidad en miligramos de hidroxido de magnesio en la dosis minima etiquetada.

LiMITES MICROBIANOS. MGA 0571. No contiene mas de 100 UFC/mL de organismos mesofilicos aerobios y no mas de 10 UFC/mL de hongos filamentosos y levaduras. Libre de patogenos.

1519

DE ALUMINIO. VALORACION DE MGA 0991. V .. 'm"O:.... "I'Ul.1i1I de la muestra. Pasar a un vasa de precipitados una alicuota de la muestra previamente homogeneizada equivalente a 1 200 mg de hidroxido de aluminio. Agregar 20 mL de agua, agitar y agregar lentamente 10 mL de acido clorhidrico, si es necesario calentar suavemente hasta disolucion, enfriar, filtrar y recibir el filtrado en un matraz volumetrico de 200 lavar el filtro con agua, recibir ellavado en el mismo matraz, llevar al aforo con agua y mezclar. Procedimiento. Pasar una alicuota de 10 mL de la solucion de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 300 mL, agregar 20 mL de agua con agitacion continua y adicionar en el siguiente orden: una alicuota de 25 mL de SV de edetato disodico 0.05 My 20 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.8 y calentar casi a punto de ebullicion durante 5 min. Enfriar, agregar 50 mL de alcohol y 2 mL de SR de ditizona y mezclar. Titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M hasta cambio de color de verde violeta a rosa. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la muestra por 10 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulacion tambien puede determinarse potenciometricamente, usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Determinar la densidad de la muestra como se indica en MGA 0251 y convertir los gramos de muestra a mililitros. Calcular la cantidad de hidroxido de aluminio en el volumen tomado de muestra, considerando que cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M es equivalente a 3.9 mg de hidroxido de aluminio. DE MAGNESIO. VALORACION DE MGA 0991. ...... 'orH.... I'U1.n de la muestra. Preparar como se indica en la Valoracion de hidroxido de aluminio. Procedimiento. Pasar una alicuota de la preparacion de la muestra, equivalente a 40 mg de hidroxido de magnesio, a un matraz Erlenmeyer de 500 mL, agregar 200 mL de agua y 20 mL de trietanolamina, agitar. Ag:regar 10 mL de SA de cloruro de amonio-hidroxido de amonio 10.9 y tres gotas de SI de negro de eriocromo T. Enfriar la solucion a 3 0 4 por inmersion del matraz en un bafio de hielo, sacar el matraz del bafio y titular con SV de edetato disodico 0.05 M hasta punto final azul. Correr un blanco de reactivos sustituyendo los mililitros de la solucion de la muestra, por agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulacion, tambien puede determinarse potenciometricamente, usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Determinar la densidad de la muestra como se indica en MGA 0251 Y convertir los gramos de muestra a mililitros. CalcuJar la cantidad de hidroxido de magnesio en el volumen de la muestra tomado, considerando que cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M equivale a 2.916 mg de hidroxido de magnesio.

ALllMINIO, HIDROXIDO DE E HIDROXIDO DE MAGNESIO. SUSPENSION ORAL

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

E

Contienen no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de las cantidades de Al(OH)3 y de Mg(OH)2, indicadas en el marbete. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0511, Magnesio. Pulverizar no menos de 10 tabletas, pesar 7 g del poIvo, agregar 10 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N y 5 gotas de S1 de rojo de metilo, calentar hasta ebullicion, agregar solucion de hidroxido de amonio al 45.0 % (v/v) hasta que el color de la solucion cambie a amarillo intenso, continuar la ebullicion durante 2 min y filtrar. El filtrado da reaccion positiva a las pruebas para magnesio. B. MGA 0511, Aluminio. Lavar el precipitado obtenido en el Ensayo de identidad A, con una solucion de cloruro de amonio al 2.0 % (m/v) caliente y disolver el precipitado con acido clorhidrico. La solucion da reaccion positiva a las pruebas para aluminio. UNIFORMIDAD DE DOSIS. MGA 0299. Cumple los requisitos. CAPACIDAD DE Procedimiento. Pesar no menos de 20 tabletas, determinar su peso promedio, pulverizarlas, pesar una cantidad del poIvo equivalente a tres tabletas, colocar el polvo en un matraz Erlenmeyer de 300 mL provisto de tapon, agregar una alicuota de 50 mL de SV de acido sulfurico 1 N, calentar a 37 agitar continuamente durante 1 h manteniendo esta temperatura, agregar S1 de azul de bromo feno 1 y titular el exceso de acid~ con SV de hidroxido de sodio 0.5 N. Calcular los mililitros consumidos de SV de acido sulfurico 1 N en la porcion de muestra tomada y relacionar el valor obtenido con el peso promedio por tableta, calculado al principio del procedimiento. Cada tableta no consume menos de 10 mL de SV de acido sulfurico 1 N. DE

DE ALUMINIO.

MGA 0991. de la muestra. Pesar no menos de 20 tabletas, calcular su peso promedio, pulverizarlas, pesar una cantidad del polvo equivalente a 1.2 g de hidroxido de aluminio, pasar a un vasa de precipitados de 150 mL, adicionar 20 mL de agua, agitar y agregar lentamente 30 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N, si es necesario calentar hasta disolucion, enfriar y filtrar, recibir el filtrado en un matraz volumetrico lavar el filtro con agua, recibir el lavado en el de 200 mismo matraz, llevar aI aforo con agua y mezclar. "wo" ..... firo

U,...'u·. .

Procedimiento. Pasar una alicuota de 10 mL de la preparacion de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 300 mL, agregar 20 mL de agua y adicionar con agitacion continua, en el siguiente orden, una alicuota de 25 mL de la SV de edetato disodico 0.05 My 20 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.8 y calentar casi a punto de ebullicion durante 5 min. Enfriar, adicionar 50 mL de etanol y 2 mL de SR de ditizona, preparada el dia de su uso, mezclar. Titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M hasta cambio de color de verde violeta a rosa. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la preparacion de la muestra por 10 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulacion, tambien puede determinarse potenciometricamente, usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M consumida es equivalente a 3.9 mg de Al(OHk V ALORACION DE DE MAGNESIO. MGA 0991. Preparacion de la muestra. Preparar como se indica en la Valoracion de hidroxido de aluminio. Procedimiento. Pasar una alicuota de 10 mL de la preparacion de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 500 mL, adicionar 200 mL de agua y 20 mL de trietanolamina, agitar. Agregar 10 mL de SA de cloruro de amonio-hidroxido de amonio pH 10.9 y tres gotas de SI de negro de eriocromo T. Enfriar la solucion entre 3 y 4°C, por inmersion del matraz en un bafio de hielo, sacar el matraz del baiio y titular con SV de edetato disodico 0.05 M hasta punto final azul. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la preparacion de la muestra por 10 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El pun to final de la titulacion, tambien puede determinarse potenciometricamente usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Cada mi1ilitro de SV de edetato disodico 0.05 M es equivalente a 2.916 mg de

La suspension oral de hidroxido de aluminio y trisilicato de magnesio, contiene no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad indicada en el marbete de Al(OH)3 y no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad indicada en el marbete de Mg2Sh08' Puede contener agentes saborizantes y antimicrobianos adecuados. ASPECTO. La suspension es homogenea, viscosa, de color blanco, opaca, libre de grumos y de particulas visibles. Se vacia con fluidez; despues de 24 h de reposo puede presentar ligera sedimentacion que al agitarse resuspende.

ALUMINIO, HIDROXIDO DE E HIDROXIDO DE MAGNESIO. TABLETAS

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Preparados farmaceuticos

VARIAC ION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos.

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valentes de acido consumido por gramo de muestra. No menos de 5 miliequivalentes de acido son consumidos por la dosis minima recomendada en el marbete.

ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0511, Magnesio. Adicionar a una alicuota de 5 mL de la muestra previamente agitada, 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 N, agitar hasta disoluci6n, agregar 5 gotas de S1 de rojo de metilo, calentar hasta ebullici6n, adicionar soluci6n en hidr6xido de amonio 6 N hasta que el color de la soluci6n cambie a amarillo intenso, continuar la ebullici6n durante 2 min y filtrar. El filtrado da reacci6n positiva a las pruebas para magnesio. B. MGA 0511, Aluminio. Lavar el precipitado obtenido en el Ensayo de Identidad A, con soluci6n caliente de cloruro de amonio (1: 50), adicionar al precipitado 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 N, mezclar y filtrar. El filtrado da reacci6n positiva a las pruebas para aluminio. C. Pasar el papel filtro y su contenido, obtenido en el Ensayo de identidad B, a un crisol de platino previamente puesto a peso constante, incinerar, enfriar en un desecador y pesar. Humedecer el residuo con agua y adicionar 6 mL de acido fluorhidrico, evaporar a sequedad, incinerar durante 5 min, enfriar en un desecador y pesar. Una perdida de mas del lO % con relaci6n al peso del residuo obtenido en la primera ignici6n indica la presencia de di6xido de silice. pH. MGA 0701. Entre 7.5 y 8.5. CAPACIDAD DE NEUTRALIZACION. MGA 0701. A 37 ± 3°C. Calibrar el potenci6metro con la SA de biftalato de potasio 0.05 M pH 6.4 y de tetraoxalato de potasio 0.05 M, usar un agitador magnetico de 40 x 10 mm centrado en el vaso, a una velocidad de agitaci6n de 300 ± 30 rpm. Preparacion de la muestra. Homogeneizar la muestra y determinar la densidad (~fGA 0251). Pasar una alicuota de la muestra homogeneizada, equivalente ala dosis minima marcada en el marbete, a un vasa de precipitados de 250 mL, agregar agua hasta un volumen de 70 mL, mezclar con un agitador magnetico durante 1 min. Procedimiento. Mantener la preparaci6n de la muestra en agitaci6n, mediante el agitador magnetico, adicionar una alicuota de 30 mL de SV de acido clorhidrico 1 N, agitar durante 15 min exactamente. Despues de la adici6n del acido y en un periodo que no exceda de 5 min adicionales, titular el exceso de acido clorhidrico con SV de hidr6xido de sodio 0.5 N hasta tener un pH estable de 3.5 durante 10 0 15 s (MGA 0701). Calcular el numero de miliequivalentes de acido consumido, considerando que cada mililitro de SV de acido clorhidrico 1 N es igual a 1 miliequivalente de acido consumido y expresar el resultado en terminos de miliequi-

LiMITES MICROBIANOS. MGA 0571. La muestra esta ausente de microorganismos pat6genos y no contiene mas de 100 UFC/mL de organismos mesofilicos aerobios y no mas de 10 UFC/mL de hongos filamentosos y levaduras. VALORACION DE HIDROXIDO DE ALUMINIO. MGA 0991. Preparacion de la muestra. Pesar en un vasa de precipitados 10 g de la muestra previamente agitada, adicionar 50 mL de agua y 10 mL de acido clorhidrico, digerir sobre un BV durante 1 h, enfriar y filtrar, recibir el filtrado en un matraz volumetrico de 200 mL, lavar el filtro con agua, recibir el lavado en el mismo matraz, llevar al aforo con agua y mezclaro Procedimiento. Pasar una alicuota de 20 mL de la preparaci6n de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 300 mL, agregar 20 mL de agua y adicionar con agitaci6n continua en el siguiente orden: una alicuota de 25 mL de SV de edetato dis6dico 0.05 M Y 20 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.8 Y calentar casi a punto de ebullici6n durante 5 min. Enfriar, adicionar 50 mL de etanol y 2 mL de SR de ditizona, mezclar. Titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M hasta cambio de color de verde violeta a rosa. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la muestra por 20 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulaci6n, tambien puede determinarse potenciometricamente usando electrodos de mercurio/mercuroso-calomel. Determinar la densidad de la muestra (MGA 0251) Y convertir los gramos de muestra a mililitros. Calcular la cantidad de Al(OH)3, en el volumen de muestra tornado, considerando que cada mililitro de SV de edetato dis6dico 0.05 M es equivalente a 3.9 mg de hidr6xido de aluminio. VALORACION DE TRISILICATO DE MAGNESIO. MGA 0991. Preparacion de la muestru. Prepararla como se indica en la Valoracionde hidroxido de aluminio. Procedimiento. Pasar una alicuota de 20 mL de la preparaci6n de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 500 mL, adicionar 180 mL de agua y 20 mL de trietanolamina, agitar. Agregar 10 mL de SA de cloruro de amonio-hidroxido de amonio pH 10.9 Y tres gotas de SI de negro de eriocromo T. Enfriar la soluci6n a una temperatura entre 3 y 4°C, por inmersi6n del matraz en un bafio de hielo, sacar el matraz del bafio de hielo y titular con soluci6n de edetato dis6dico 0.05 M hasta punto final azul. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la soluci6n de la muestra por 20 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulaci6n, tambien puede determinarse potenciometricamente empleando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Determinar la densidad de la muestra como se indica en MGA 0251 Y convertir los gramos de muestra a mililitros.

ALUMINIO, HIDROXIDO DE Y TRISILICATO DE MAGNESIO. SUSPENSION ORAL

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Ca1cular la cantidad de Mg2 Si 30 s, en el volumen de muestra tornado, considerando que cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M es equivalente a 6.521 mg de trisilicato de magnesio.

ALUMINIO, HIDRQXIDO DE Y MAGNESIO. TABLETAS Contienen no menos del 90.0 % y no mas del 120.0 % de las cantidades de Al(OH)3 y Mg 2 Si 30 S, indicadas en el marbete.

ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0511, Magnesio. Pesar y pulverizar no menos de 20 tabletas. Mezclar una pordon de la muestra equivalente ados tabletas con 10 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N, agregar 5 gotas de SI de rojo de metilo, calentar a ebullicion, agregar solucion de hidroxido de amonio 6 N hasta que el color de la solucion cambie a amarillo intenso, continuar la ebullicion durante 2 min y filtrar. El filtrado da reaccion positiva a las pruebas para magnesio. B. MGA 0511, Aluminio. Lavar el precipitado obtenido en el Ensayo de Identidad A, con solucion de cloruro de amonio al 2 % (m/v) caliente, agregar 10 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N Y filtrar. EI filtrado da reaccion positiva a las pruebas para aluminio. C. Pasar el papel filtro y contenidos en el Ensayo de identidad B a un crisol pequefio de platino previamente puesto a peso constante; incinerar, enfriar en un desecador y pesar. Humedecer el residuo con agua, agregar 6 mL de acido fluorhidrico. Evaporar a sequedad, incinerar durante 5 min, enfriar en un desecador y pesar. La muestra pierde mas de 10 % con relacion al peso del residuo de la incineracion inicial, 10 que ind~~a la presencia de Si0 2.

UNIFORMIDAD DE DOSIS. MGA 0299. Cumple los requisitos. CAPACIDAD DE NEUTRALIZACION. MGA 0991. Procedimiento. Pesar 20 tabletas, determinar su peso promedio, triturar hasta polvo fino, pesar el equivalente a 600 mg de hidroxido de aluminio, colocar el polvo en un matraz Erlenmeyer de 300 mL provisto de tapon, adicionar una alicuota de 50 mL de SV de acido sulfUrico I N, calentar a 37°C, agitar continuamente durante 1 h. Manteniendo esta temperatura, adicionar SI de bromofenol y titular el exceso de acido con SV de hidroxido de sodio 0.5 N. Ca1cular los mililitros consumidos de Ia solucion de SV de acido sulfurico 1 N en la porcion de muestra tomada y relacionar el valor obtenido con el peso promedio por tableta, ca1culado al principio del procedimiento. Cada 200 mg de hidroxido de aluminio consumen no menos de 10 mL de SV de acido sulfurico 1 N.

VALORACION DE HIDROXIDO DE ALUMINIO. MGA 0991. Preparacion de la muestra. Pesar y pulverizar no menos de 20 tabletas. A una cantidad de polvo equivalente a 1.2 g de hidroxido de aluminio, agregar 20 mL de agua, agitar y agregar lentamente 30 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N, si es necesario calentar hasta disolucion, enfriar y filtrar. Recibir el filtrado en un matraz volumetrico de 200 mL, lavar el filtro con agua y recibir ellavado en el mismo matraz, llevar al aforo con agua y mezclar. Procedimiento. Pasar una alicuota de 10 mL de la preparacion de la muestra a un matraz Erlenmeyer de 300 mL, agregar 20 mL de agua y adicionar con agitacion continua en el siguiente orden, una alicuota de 25 mL de la SV de edetato disodico, 20 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.8 y calentar casi a punto de ebullicion durante 5 min. Enfriar, adicionar 50 mL de etanol y 2 mL de SR de ditizona, mezclar. Titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M hasta cambio de color de verde violeta a rosa. Correr un blanco de reactivos y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulacion tambien puede determinarse potenciometricamente usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Calcular la cantidad de Al(OH)3, en la porcion de muestra tomada por medio de la siguiente formula: (Y - X)(3.9)(20) Donde: Y = Volumen de SV de edetato disodico. X = Volumen de solucion de sulfato de zinc 0.05 M. 3.9 Miligramos de Al(OH)3, equivalentes a 1 mL de solucion de edetato disodico 0.05 M.

VALORACION DE TRISILICATO DE MAGNESIO. MGA 0991. Preparacion de la muestra. Utilizar la solucion preparada como se indica en la Valoracion de hidroxido de aluminio. Solucion indicadora de negro de eriocromo T. Disolver 200 mg de negro de eriocromo T en una mezcla de 15 mL de trietanolamina y 5 mL de etanol, mezclar. Procedimiento. En un matraz adecuado, depositar 10 mL de la preparacion de la muestra, agregar 180 mL de agua y 20 mL de trietanolamina; agitar, agregar 10 mL de SA de cloruro de amonio-hidroxido de amonio pH 10.9 Y tres gotas de SI de negro de eriocromo T; mezclar. Enfriar la solucion entre 3 y 4 °C por inmersion del matraz en un banD de hielo. Retirar el matraz del banD de hielo y titular con SV de edetato disodico 0.05 M. Hacer una determinacion en blanco sustituyendo la solucion de la muestra por 10 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. EI punto final de la titulacion tambien puede determinarse potenciometricamente, usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M consumido equiva1e a 6.521 mg de trisilicato de magnesio.

ALUMINIO, HIDR6xIDO DE Y TRISILICATO DE MAGNESIO. TABLETAS

Preparados farmaceuticos

1523

con la SV de hidr6xido de sodio 0.1 M usando SI de roj 0 de metilo. Deben requerirse no menos de 20 mL de la soluci6n de hidroxido de sodio 0.1 M. Suspensi6n oral de hidr6xido de aluminio en un vehiculo adecuado. Contiene no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de Al(OH)3, indicada en el marbete.

VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. pH. MGA 0701. Entre 5.5 y 8.0.

ASPECTO DE LA SUSPENSION. El contenido es una suspensi6n homogenea, visco sa, libre de grumos y particulas extranas. Despues de 24 h puede presentar ligera sedimentaci6n que al agitarse resuspende. ENSAYO DE IDENTIDAD. MGA 0511, Aluminio. Pasar una alicuota de 10 mL de la muestra a un vasa de precipitados, adicionar soluci6n de acido clorhidrico 2 M hasta formar una soluci6n. La muestra da reacci6n positiva a las pruebas para aluminio. CLORUROS. No mas de 0.28 %. Pesar 10 g de la muestra en una capsula de porcelana, agregar 0.1 mL de SR de cromato de potasio y 25 mL de agua, agitar y adicionar SV de nitrato de plata 0.1 N hasta obtener un color rosa persistente. No se requieren mas de 8 mL de SV de nitrato de plata 0.1 N. SULFATOS. MGA 0861. No mas de 0.05 %. Pasar 5 g de la muestra a un vasa de precipitados, adicionar 5 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 N hasta disoluci6n completa, calentar a ebullici6n, enfriar; pasar la soluci6n a un matraz volumetrico de 250 mL, enjuagar varias veces el vaso, reunir los lavados en el mismo matraz, llevar al aforo con agua, mezclar y filtrar si es necesario. Pasar una alicuota de 20 mL de la soluci6n anterior a un tuba de Nessler y a otro tub 0 , 0.2 mL de la SV de acido sulfurico 0.02 diluir a 40 mL con agua y proceder como se indica en MGA 0861.

MGA 0111. No mas de 0.6 ppm. Pesar 8.3 g de la muestra y disolver en 20 mL de soluci6n de acido sulfurico 7 adicionar agua hasta un volumen de 35 mL y proceder como se indica en MGA 0111, usar 5 mL de la soluci6n de referencia de arsenico que contiene 1 Ilg/mL. METALES PESADOS. MGA 0561. No mas de 5 ppm. Pesar 4 g de la muestra y disolver en 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 3 N con ayuda de calentamiento, enfriar, filtrar si es necesario y diluir con agua a 25 mL, pro ceder como se indica en MGA 0561, emplear 2 mL de soluci6n de referencia de plomo que contiene 10 Ilg/mL. SALES DE AMONIO. Pesar 25 g de la muestra. Pasar a un aparato de destilaci6n para amonio, adicionar 25 mL de la soluci6n de hidr6xido de sodio 5 My 250 mL de agua, destilar aproximadamente 100 mL, recibir el destilado en 25 mL de SV de acido clorhidrico 0.1 My titular el exceso de acido

CAPACIDAD DE NEUTRALIZACION. Pesar 5 g de la muestra en un vasa de precipitados, pasar a un matraz Erlenmeyer de 300 mL provisto de tap6n, con ayuda de 100 mL de agua, calentar a 37°C y mantener esta temperatura durante toda la prueba, agregar 100 mL de la SV de acido clorhidrico 0.1 M previamente calentada a 37°C, agitar continuamente manteniendo esta temperatura; determinar el pH de la soluci6n como se indica en MGA 0701, a los 10, 15 Y 20 min. EI pH no es menor de 1.8, 2.3 y 3.0 respectivamente y en ningun momenta es mayor de 4.0. Agregar 10 mL de la SV de acido clorhidrico 0.5 M previamente calentada a 37°C, agitar continuamente durante 1 h y titular la soluci6n potenciometricamente como se indica en MGA 0991 con la SV de hidroxido de sodio 0.1 M hasta un pH de 3.5, empleando electrodos de vidrio/calomel. No se requieren mas de 50 mL de la SV de hidr6xido de sodio 0.1 M, para la neutralizaci6n. LIMITES MICROBIANOS. MGA 0571. No contiene mas de 100 UFC/mL de organismos mesofilicos aerobios y no mas de 10 UFC/mL de hongos filamentosos y levaduras. Libre de pat6genos.

Procedimiento. Pasar 25 g de la muestra a un vasa de precipitados, adicionar 15 mL de acido clorhidrico y calentar suavemente hasta disoluci6n completa, enfriar y pasar cuantitativamente a un matraz volumetrico de 500 mL, enjuagar el vasa con agua y reunir los lavados en el matraz, nevar al aforo con agua y mezclar. Pasar una alicuota de 20 mL de la soluci6n a un vasa de precipitados de 250 mL y agregar en el siguiente orden con 25 mL de la SV de edetato dis6dico 0.05 de acetato de amonio-acido acetico 4.8 y calentar la soluci6n a ebullici6n incipiente durante 5 min, ynfriar, adicionar 50 mL de etanol, 2 mL de SR de ditizona y titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M hasta cambio de color a rosa claro. Correr un blanco de reactivos sustituyendo la soluci6n de la muestra por 20 mL de agua y hacer las correcciones necesarias. El punto final de la titulaci6n tambien puedc determinarse potenciometricamente, utilizando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel como se indica en MGA 0991. Determinar la densidad de la muestra como se indica en MGA 0251 y considerar para determinar el volumen equivalente de la cantidad pesada de muestra. Calcular la cantidad en miligramos de Al(OH)3 en el volumen de muestra tornado, por medio de la siguiente f6rmula:

ALUMINIO, HIDR6xIDO DE. SUSPENSI6N ORAL

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undtwima edicion.

(25M1

-

VM z )(78.01)(25)

Donde: MJ = Molaridad de edetato disodico. M2 Molaridad de sulfato de zinc. V = Mililitros de la SV de sulfato de zinc gastados en la titulacion. 78.01 = Masa molecular en miligramos de hidroxido de aluminio equivalente a una mili mol.

ALUMINIO, HIDROXIDO DE. TABLETAS Cada tableta contiene el equivalente a no menos del 95.0 % y no mas del 110.0 % de la cantidad de hidroxido de aluminio indicada en el marbete. ENSAYO DE IDENTIDAD. MGA 0511, Aluminio. Triturar hasta polvo fino no menos de 10 tabletas, pesar una cantidad del polvo equivalente a 500 mg de hidroxido de aluminio, pasar a un va so de precipitados, agregar 10 mL de solucion de acido clorhidrico 3 N, digerir con calentamiento suave y filtrar. El filtrado da reaccion positiva a las pruebas para aluminio. UNIFORMIDAD DE DOSIS. MGA 0299. Cumple los requisitos. DESINTEGRACION. MGA 0261, Tiempo maXImo 10 min. Utilizando SR de fluido gastrico simulado como medio de prueba. VALORACION. MGA 0991. Pesar no menos de 20 tabletas, pulveriza~ finamente, pasar una cantidad del polvo, equivalente a ~ g de hidroxido de aluminio, a un matraz Erlenmeyer. Agregar 15 mL de acido clorhidrico, calentar hasta disolucion, diluir con 100 mL de agua, mezclar y filtrar, recibiendo el filtrado en un matraz volumetrico de 500 mL. Lavar con agua el filtro, reuniendo los lavados en el mismo matraz, llevar al aforo con agua y mezclar, pasar una alicuota de 20 mL a un matraz Erlenmeyer, agregar en el siguiente orden y agitando continuamente, 25 mL de SV de edetato disodico 0.05 M, 20 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.8, calentar hasta cerca de ebullicion durante 5 min. Enfriar, agregar 50 mL de etanol y 2 mL de SI de ditizona. Titular con SV de sulfato de zinc 0.05 M. Hacer una determinacion en blanco utilizando agua en lugar de la muestra y hacer cualquier correccion necesaria. El punto final de la titulacion, tambien puede determinarse potenciometricamente, utilizando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel; proceder segun se describe en MGA 0991. Cada mililitro de SV de edetato disodico 0.05 M equivale a 3.9 mg de hidroxido de aluminio.

ALUMINIO, HIDR6xIDO DE. TABLETAS

ALUMINIO, SUBACETATO DE; ACETATO DE HIDROCORTISONA; OXIDO DE ZINCY LIDOCAiNA. SUPOSITORIOS Supositorios de lidocaina con acetato de hidrocortisona, subacetato de aluminio y oxido de zinc, en una base adecuada, contiene no menos del 95.0 % y no mas del 105.0 % de lidocaina (C14H22N20); no menos del 92.5 % y no mas del 107.5 % de acetato de hidrocortisona (C23H3206); no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de oxido de zinc (ZnO), no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de subacetato de aluminio AI(OH)(CH 3C0 2)z, de las cantidades indicadas en el marbete. SUSTANCIAS DE REFERENCIA. SRef-FEUM de lidocaina y acetato de hidrocortisona, manej ar de acuerdo a las instrucciones de uso. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. Para Udocaina. MGA 0351. Triturar en pequenas porciones no menos de 10 supositorios, pesar una cantidad equivalente a 60 mg de lidocaina, pasar a un vasa de precipitados de 100 mL, agregar 25 mL de solucion de acido clorhidrico 2 M, calentar a ebullicion durante algunos minutos agitando continuamente y enfriar en un banD de hielo, filtrar y recibir el filtrado en un embudo de separacion. Agregar 15 mL de solucion de hidroxido de sodio 5 N, extraer con 25 mL de eter dietilico, lavar la fase eterea con 25 mL de agua y descartar el lavado. Evaporar el extracto etereo y secar el residuo en un desecador. Elaborar las pastillas efectuando una dispersion en bromuro de potasio con la preparacion de la muestra y con la SRef-FEUM de lidocaina tratada de la misma manera. Obtener el espectro de absorcion infrarrojo. El espectro de absorcion de la preparacion de la muestra corresponde con el obtenido con la preparacion de referencia. B. Para acetato de hidrocortisona. MGA 0361. Nota: proteger las soluciones contra la accion de la luz durante toda la prueba. EI espectro de absorcion en la region visible de la preparacion de la muestra corresponde con el obtenido en la preparacion de referencia, como se indica en el inciso de la Valoracion de acetato de hidrocortisona, usando celdas de 1 cm y utilizando el blanco preparado en el mismo inciso para ajustar el aparato.

C. MGA 0241, Cap a delgada. Soporte. Cromatoplaca de tierra de diatomeas. Fase movil. Tolueno:cloroformo (3: 1). Preparacion de la muestra. Triturar en pequenas porciones no menos de 10 supositorios, pesar una cantidad equivalente a 5 mg de acetato de hidrocortisona, pasar a un vasa de precipitados, agregar 20 mL de metanol, calentar a ebullicion y

Preparados farmaceuticos

agitar, enfriar a 0 °C durante 30 min, filtrar y evaporar a sequedad el filtrado. Pasar cuantitativamente el residuo a un matraz volumetrico de 10 mL con ayuda de una mezcla de cloroformo:metanol (9:1), llevar al aforo con la misma mezcla y agitar. Preparacion de referenda. Preparar una solucion que contenga 500 )lg/mL de la SRef de acetato de hidrocortisona en una mezcla de cloroformo:metanol (9:1). Revelador. Solucion de acido sulrurico al 10 % (v/v) en etanol. Procedimiento. Impregnar la cromatoplaca, dejando correr de un extremo a otro, con una mezcla formamida:acetona (1 :9). Sacar la cromatoplaca de la camara, dejar evaporar los disolventes y aplicar inmediatamente en carriles separados 10 )lL de la preparacion de referencia, 10 )lL de la preparacion de la muestra y 10 )lL de una mezcla de volumenes iguales de ambas preparaciones. Desarrollar el cromatograrna en la misma direccion que la impregnacion dejando correr la fase movil hasta % partes arriba de la linea de aplicacion, retirar la cromatoplaca de la camara, marcar el frente de la fase movil, dejar evaporar el disolvente, calentar a 120°C durante 15 min, rociar la cromatoplaca caliente con solucion reveladora, volver a calentar la cromatoplaca a 120°C durante 10 min, dej ar enfriar y observar baj 0 luz del dia y bajo lampara de luz UV. La mancha principal obtenida en el cromatograma con la preparacion de la muestra corresponde en tamafio, color y RF a la mancha obtenida en el cromatograma con la preparacion de referencia, la mancha obtenida en el cromatograma con la mezcla de ambas preparaciones aparece como una mancha unica y compacta.

LIMITES MICROBIANOS. MGA 0571. La muestra no contiene mas de 100 UFC/g de organismos meso"micos aerobios. LICUEFACCION. MGA 0531. No mas de 15 min. UNIFORMIDAD DE DOSIS. MGA 0299. Cumple los requisitos. Utilizar el metodo de Valoracion de acetato de hidrocortisona. VALORACION DE LIDOCAINA. MGA 0991, Valoracion en disolucion no acuosa. Pesar no menos de 20 supositorios, calcular su peso promedio, triturar en pequefias por" ciones, pesar una cantidad equivalente a 60 mg de lidocaina, pasar cuantitativamente a un vasa de precipitados de 100 mL, agregar 40 mL de cloroformo, disolver agitando el matraz y filtrar. Enjuagar el matraz y el filtro con tres porciones de cloroformo de 10 mL cada una, agregar 30 mL de acido acetico glacial y tres 0 cuatro gotas de SI de cristal violeta. Titular con SV de acido perclorico 0.1 N en acido acetico glacial hasta vire del indicador. EI punto final tambien puede determinarse potenciometricamente utilizando

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electrodos de vidrio/calomel. Calcular la cantidad de lidocaina en la porcion de muestra tomada considerando que cada mililitro de SV de acido perclorico 0.1 N es equivalente a 23.43 mg de C 14 H 22 N 2 0.

VALORACION DE ACETATO DE HIDROCORTISONA. MGA 0361. Nota: proteger las soluciones contra la accion de la luz. Preparacion de referencia. Preparar una solucion de la SRef de acetato de hidrocortisona en etanol absoluto libre de aldehidos, que contenga 44.8 )lg/mL de acetato de hidrocortisona. Preparacion de la muestra. Triturar no menos de 10 supositorios en pequenas porciones, pesar una cantidad equivalente a 9 mg de acetato de hidrocortisona, calentar sobre un banG de agua con 20 mL de etanol absoluto libre de aldehidos, hasta que el acetato de hidrocortisona este completamente disuelto. Enfriar en hielo y decantar a traves de una torunda de algodon absorbente recibiendo los extractos en un matraz volumetrico de 100 mL. Repetir la extraccion con 3 porciones adicionales de etanol absoluto libre de aldehidos, de 20 mL cada una, usando una torunda diferente para filtrar cada extraccion, llevar al aforo con etanol absoluto libre de aldehidos y mezclar. Pasar una allcuota de 25 mL de esta solucion a un matraz volumetrico de 50 mL, llevar al aforo con etanol absoluto libre de aldehidos y mezclar. Procedimiento. Pasar, por separado, a matraces volumetricos de 25 mL, provistos de tapon, alicuotas de 10 mL de la preparacion de la muestra, 10 mL de la preparacion de referencia y 10 mL de etanol absoluto libre de aldehidos que servira como blanco, agregar a cada matraz 2 mL de solucion de cloruro de 2.3.5-trifeniltetrazolio al 0.5 % (m/v) en etanol absoluto libre de aldehidos, preparada el dia de su uso; desplazar el aire del matraz con nitrogeno libre de oxigeno, inmediatamente adicionar a los matraces 2 mL de SR de hidroxido de tetrametilamonio diluido y volver a desplazar el aire con nitrogeno libre de oxigeno. Tapar los matraces, mezclar su contenido con agitacion suave y colocarlos en un banG de agua que tenga una temperatura de 30°C durante 1 h. Enfriar rapidamente y llevar al aforo con etanol absoluto libre de a1dehidos. Determinar la absorbancia en la region visible de la solucion de referenda y de la solucion de la muestra a la longitud de onda de maxima absorbancia de 485 nm aproximadamente, en celdas de 1.0 em y el blanco para ajustar el aparato. Calcular la cantidad de C23 H32 0 6 en la porcion de muestra tomada por medio de la siguiente formula: CD

(

Am ) Are!

Donde: C = Cantidad de acetato de hidrocortisona por mililitro en la solucion de referencia. D = Factor de dilucion de la muestra. Am = Absorbancia obtenida con la solucion de la muestra. A rer = Absorbancia obtenida con la solucion de referencia. ALUMINIO, SUBACETATO DE; ACETATO DE HIDROCORTISONA; 6XIDO DE ZINCY LlDOCAiNA. SUPOSITORIOS

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

VALORACION DE SUBACETATO DE ALUMINIO. MGA 0991. Solucion de benzoato de sodio-acido acetico. Preparar como se indica en la Valoracion de subacetato de aluminio de la monografia de Subacetato de aluminio, acetato de hidrocortisona, oxido de zinc y lidocaina, unguento. Procedimiento. Pesar no menos de 20 supositorios, calcular su peso promedio, triturar en pequenas porciones, pesar una cantidad equivalente a 50 mg de subacetato de aluminio pasar a un vasa de precipitados de 150 mL, agregar 5 mL de acido clorhidrico y 5 mL de agua. Calentar a ebullici6n sobre una parrilla electrica. Filtrar la soluci6n caliente, recibir el filtrado en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y enjuagar el vasa y el filtro con agua caliente. Diluir el filtrado con agua hasta 100 mL. Agregar soluci6n de hidr6xido de sodio 5M hasta formar un precipitado, posteriormente agregar gota a gota soluci6n de acido clorhidrico 2 M, hasta que se disuelva el precipitado, agregar 1.0 g de cloruro de amonio, 10 mL de soluci6n de acetato de sodio al 10 % (m/v) y 10 mL de soluci6n de benzoato de sodio all0 % (m/v). Medir el pH potenciometricamente, el cual esta comprendido entre 3.5 y 4.5, si es necesario ajustarlo agregando soluci6n de acido clorhidrico 2 M 0 soluci6n de hidr6xido de sodio 5 M. Calentar en un banD de agua durante 30 min. Filtrar la soluci6n caliente, lavar el vasa y el filtro con 3 porciones de 10 mL cada una de soluci6n caliente de benzoato de sodio-acido acetico. Colocar el filtro con el precipitado en el mismo vasa de precipitados de 150 mL, agregar 5 mL de acido clorhidrico y 5 mL de agua, calentar a punto de ebullici6n. Agregar 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 5 M y 20 mL de agua, calentar y agitar hasta que se disuelva el precipitado. Enfriar a temperatura ambiente. Agregar una alicuota de 25 mL de SV de edetato dis6dico 0.1· M, tres gotas de SI de azul de timol. Neutralizar con hidr6xido de amonio hasta que tome un color ligeramente rosado, agregar 1 mL de la soluci6n de acido clorhidrico 2 ~ y calentar a ebullici6n durante 2 min. Agregar gota a gotJ 5 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.5 con agitaci6n continua, calentar a ebullici6n nuevamente la soluci6n. Enfriar a temperatura ambiente y agregar etanol absoluto libre de aldehidos hasta aproximadamente el doble del volumen. Ajustar el pH entre 4.0 y 5.5 utilizando soluci6n de acido clorhidrico 2 M 0 hidr6xido de amonio. Agregar 2 mL de SR de ditizona y titular con SV de sulfato de zinc 0.1 N hasta cambio de color. Correr un blanco de reactivos preparado con una alicuota de 25 mL de SV de edetato dis6dico 0.1 M, 3 gotas de SI de azul de timol, 5 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.5, 60 mL de etanol absoluto libre de aldehidos y 2 mL de SR de ditizona. Hacer las correcciones necesarias. EI punto final tambien puede determinarse potenciometricamente, empleando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel segun titulaciones complejometricas. Calcular la cantidad de subacetato de aluminio en la porci6n de muestra tomada, considerando que cada mililitro de SV de edetato dis6dico 0.1 M equivale a 16.208 mg de Al(OH)(CH3C02)2. ALUMINIO, SUBACETATO DE; ACETATO DE HIDROCORTISONA; 6XIDO DE ZINC Y LlDOCAiNA. UNGOENTO

VALORACION DE OXIDO DE ZINC. MGA 0991. Solucion de benzoato de sodio-acido acetico. Preparar como se indica en la Valoracion de subacetato de aluminio de la monografia de Subacetato de aluminio, acetato de hidrocortisona, oxido de zinc y lidocaina, unguento. Procedimiento. Pesar no menos de 20 supositorios, calcular su peso promedio, triturarlos en pequenos trocitos, pesar una cantidad equivalente a 400 mg de 6xido de zinc, pasar a un vasa de precipitados de 150 mL, agregar 5 mL de acido clorhidrico y 5 mL de agua. Calentar a ebullici6n sobre una parrilla electrica. Filtrar la soluci6n caliente, recibir el filtrado en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, lavar el vasa y el filtro con agua caliente y llevar a un volumen de 100 mL con agua. Agregar soluci6n de hidr6xido de sodio 5 M hasta que se forme un precipitado, posteriormente agregar gota a gota soluci6n de acido clorhidrico 2 M hasta que se disuelva el precipitado, agregar 1.0 g de cloruro de amonio, 10 mL de soluci6n de acetato de sodio al 10 % (m/v) y 10 mL de soluci6n de benzoato de sodio al 10 % (m/v). Medir potenciometricamente el pH, el cual esta entre 3.5 y 4.5, si es necesario ajustarlo con la adici6n de soluci6n de hidr6xido de sodio 5 M 0 soluci6n de acido clorhidrico 2 M. Calentar la mezcla durante 30 min en un banD de agua. Filtrar la soluci6n caliente, enjuagar el matraz y el filtro con 3 porciones de soluci6n caliente de benzoato de sodio-acido acetico de 10 mL cada una, recibir el filtrado y los lavados en un matraz volumetrico de 500 mL, enfriar, llevar al aforo con agua y mezclar. Pasar una alicuota de 50 mL del filtrado a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, agregar 50 mL de agua y soluci6n de hidr6xido de sodio 5 M hasta obtener una reacci6n neutra 0 ligeramente alcalina al papel indicador. Agregar 20 mL de SA de cloruro de amonio-hidr6xido de amonio pH 10.7 y 10 gotas de SI de negro de eriocromo T y titular con SV de edetato dis6dico 0.1 M hasta que la soluci6n vire a color azul. El punto final tambien puede determinarse potenciometricamente, usando electrodos de mercurio/mercurosocalomel, segun titulaciones complejometricas. Calcular la cantidad de 6xido de zinc en la porci6n de muestra tomada, considerando que cada mililitro de SV de edetato dis6dico 0.1 M equivale a 8.138 mg de ZnO.

ALUMINIO, SUBACETATO DE; ACETATO DE HIDROCORTISONA; OXIDO DE ZINC Y LIDOCAiNA. UNGOENTO Ungiiento de lidocaina con acetato de hidrocortisona, subacetato de aluminio y 6xido de zinc, en una base adecuada. Contiene no menos del 94.0 % y no mas del 106.0 % de lidocaina (C14H22N20) y no menos del 90.0 % y no mas del 110.0 % de las cantidades de acetato de hidrocortisona (C23H3206), subacetato de aluminio Al(OH)(CH3C02)2 y 6xido de zinc (ZnO), indicadas en el marbete.

SUSTANCIAS DE REFERENCIA. SRef-FEUM de lidocaina, acetato de hidrocortisona y acetato de prednisolona, manejar de acuerdo a las instrucciones de uso.

Preparados farmaceuticos

ASPECTO. Masa homogenea, suave, libre de gninulos y particulas visibles.

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LIMITES MICROBIANOS. MGA 0571. La muestra no contiene mas de 100 UFC/g de organismos mesofilicos aerobios.

CONTENIDO MINIMO. MGA 0221. Cumple los requisitos. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. Para lidocaina. MGA 0351. Pesar una cantidad de muestra equivalente a 100 mg de lidocaina, pasar a un vaso de precipitados de 100 mL, agregar 25 mL de solucion de acido c1orhidrico 2 M, calentar a ebullicion durante algunos minutos agitando continuamente, y enfriar en un baiio de hielo. Filtrar y recibir el filtrado en un embudo de separacion. Agregar 15 mL de solucion de hidroxido de sodio 5 M, extraer con 25 mL de eter dietilico, lavar la fase eterea con 25 mL de agua y descartar el lavado. Evaporar el extracto etereo y secar el residuo en un desecador. Elaborar las pastiHas con la dispersion de la preparacion de la muestra y de la preparacion de la SRef-FEUM de lidocaina en bromuro de potasio. Obtener los espectros de absorcion al infrarrojo. El espectro de absorcion de la preparacion de la muestra corresponde con el de la preparacion de referencia. B. Para acetato de hidrocortisona. MGA 0241, CLAR. Proceder como se indica en la Valoraci6n, el valor de retencion relativo obtenido con la preparacion de la muestra, corresponde al obtenido con la preparacion de referencia.

C. MGA 0241, Capa delgada. Soporte. Cromatoplaca de gel de silice cromatografica con indicador de fluorescencia. Fase movil. Cloroformo:metanol:agua (180:15:1). Preparacion de referencia. Pesar una cantidad de la SRef equivalente a 5 mg de acetato de hidrocortisona, adicionar 5 mL exactamente medidos de metanol, calentar en un BV durante 5 min, con agitacion constante y dejar enfriar suavemente a temperatura ambiente. Esta solucion contiene 1 mg/mL de acetato de hidrocortisona. Preparacion de la muestra. Pesar una cantidad de la muestra equivalente a 5 mg de acetato de hidrocortisona, pasar cuantitativamente a un matraz Erlenmeyer, agregar 5 mL exactamente medidos de metanol, calentar en un BV durante 5 min con agitacion constante, dejar enfriar suave mente a temperatura ambiente y filtrar la solucion metano1ica. Procedimiento. Aplicar a la cromatoplaca, en carriles separados, 10 ~L de la preparacion de referencia y 10 ~L de la preparacion de la muestra. Desarrollar el cromatograma, dejando correr la fase movil hasta % partes arriba de la linea de . aplicacion. Retirar la cromatoplaca de la camara, marcar el frente de la fase movil, dej ar secar a temperatura ambiente, rociar la placa con solucion de acido sulfurico en metanol al 70 % (v/v) , calentar a 90°C durante 20 a 30 min, dejar enfriar y observar bajo lampara de luz UV. La mancha principal obtenida en el cromatograma con la preparacion de la muestra, corresponde en fluorescencia y RF, al de la mancha obtenida con la preparacion de referencia.

VALORACION DE LIDOCAINA. MGA 0991. Pesar una cantidad de la muestra equivalente a 100 mg de lidocaina, pasar a un vasa de precipitados, agregar 30 mL de cloroformo, con agitacion mecanica durante 10 min y filtrar. Enjuagar el vaso y el filtro con tres porciones de cloroformo de 10 mL cada una. Agregar al filtrado 30 mL de acido acetico glacial y 3 0 4 gotas de S1 de cristal violeta. Titular con SV de acido perclorico 0.1 N en acido acetico glacial hasta vire del indicador. EI punto final tambien puede determinarse potenciometricamente, utilizando electrodos de vidrio/calomel 0 vidrio/plata-cloruro de plata. Calcular la cantidad de C 14H 22N 2 0 en la muestra tomada, considerando que cada mililitro de SV de acido perclorico 0.1 N equivale a 23.43 mg de C14H22N20. V ALORACION DR ACETATO DE HIDROCORTISONA. MGA 0241, CLAR. Solucion de fosfato monobasico de potasio 0.01 M pH 3.2. Pesar 1.361 g de fosfato monobasico de potasio, pasar a un matraz volumetrico de 1 000 mL, disolver y llevar al aforo con agua, mezclar. Determinar el pH, si es necesario ajustar el pH a 3.2 con acido fosforico 0 con solucion de hidroxido de potasio 0.1 M. Fase movil. Metanol:solucion de fosfato monobasico de potasio 0.01 MpH 3.2 (60:40), filtrar y desgasificar. Patron interno. Pesar una cantidad de la SRef equivalente a 12 mg de acetato de prednisolona, pasar a un matraz volumetrico de 100 mL, disolver y llevar al aforo con metanol, mezclar. Esta solucion contiene 120 ~g/mL de acetato de predniso lona. Preparacion de referencia. Pesar una cantidad de la SRef equivalente a 12.5 mg de acetato de hidrocortisona, pasar a un matraz volumetrico de 50 mL. Disolver y llevar al aforo con metanol, mezclar. Pasar una alicuota de 3 mL de la solucion anterior, a un matraz volumetrico de 25 mL. Adicionar una alicuota de 5 mL del patron interno, llevar al aforo con metanol y mezclar. Esta solucion contiene 30 ~g/mL de acetato de hidrocortisona y 24 ~g/mL de acetato de prednisolona, respectivamente. Preparacion de la muestra. Pesar una cantidad. de la muestra equivalente a 850 ~g de acetato de hidrocortisona, pasar cuantitativamente a un tuba de centrifuga de 50 mL, provisto de tapon, adicionar una alicuota de 5 mL del patron interno y una alicuota de 20 mL de metanol, agitar mecanicamente durante 15 min, centrifugar a 1 500 0 2 000 rpm durante 10 min y utilizar elliquido sobrenadante para la prueba. Condiciones del equipo. Detector de luz UV; longitud de onda de 254 nm; columna de 30 cm x 3.4 mm, empacada con Ll con tamaiio de particulas de 3 a 10 ~m de diametro; flujo de 0.25 mL/min. Procedimiento. 1nyectar al cromatografo, por separado, volumenes iguales (20 ~L) de la preparacion de referencia y de

ALUMINIO, SUBACETATO DE; ACETATO DE HIDROCORTISONA; 6XIDO DE ZINCY LlDOCAiNA. UNGOENTO

.r. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

la preparaci6n de la muestra, obtener sus correspondientes cromatogramas y calcular el area bajo lacurva. Calcular la cantidad de en la muestra tomada, por medio de la siguiente f6rmula:

A ) CD ~ ( Aref

Donde: C Cantidad de acetato de hidrocortisona por mililitro en la preparaci6n de referencia. D Factor de diluci6n de la muestra. Area bajo lacurva obtenida en el cromatograma con la preparaci6n de la muestra. Area bajo la curva obtenida en el con la preparaci6n de referencia. DE SUBACETATO DE ALUMINIO. MGA 0991. Solucion de benzoato de sodio-acido act'~tico. Disolver 109 de benzoato de sodio en 1 000 mL de agua usando calor, agregar 10 mL de acido acetico Procedimiento. Pesar una cantidad de la muestra ~~."",~ ,~,~+~ a 55 mg de subacetato de pasar cuantitativamente a un vasa de agregar 5 mL de acido clorhidrico y 5 mL de agua, calentar a ebullici6n sobre electrica. Filtrar la soluci6n recibir el filtrado en un matraz de 250 mL, lavar el filtro con agua caliente y llevar a un volumen de 100 mL. soluci6n de hidr6xido de sodio 5M hasta la formaci6n de un postenonnlente agregar soluei6n de acido clorhidrieo 2 hasta que el se vU'>VA'"""'" agregar 1.0 g de cloruro de 10 mL de soluci6n de acetato de sodio al 10 % mL de solude sodio al 10 % 3.5 y usando soIuci6n de aeido clorhidrico de hidr6xido de sodio Calentar la mezcla durante 30 min en un banG de agua. Filtrar la 801uci6n el matraz y el filtro con tres """ '-''''",,,, de 10 mL cada una de soluci6n caliente de benzoato de 80dio-acido acetico. CoIoear el filtro con el en un matraz de 250 agregar 5 mL de aeido clorde ebullici6n en hidrico y 5 mL de agua. Calentar a una parrilla eh~ctrica, agregar 10 mL de soluci6n de acido clorhidrico 5 M Y 20 mL de agua. Calentar en un banG de agua con agitaci6n continua, hasta disolver el precipitado. Enfriar a temperatura ambiente. Agregar una alicuota de 25 mL de SV de edetato dis6dico 0.1 M Y tres gotas de S1 de azul de timol. Neutralizar con hidr6xido de amonio hasta color blanco 0 casi blanco, adicionar 1 mL de la 801uci6n de acido clorhidrico 2 M y calentar a ebullici6n durante 2 min, agregar por goteo 5 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico pH 4.5 con agitaci6n continua, volver a calentar a ebullici6n. Dejar enfriar a temperatura ambiente, diluir con etanol absoluto hasta el doble del volumen. Ajustar el pH entre 4.0 y 5.5 usando hidr6xido de amonio 0 soluci6n de acido

AMANTADINA, CLORHIDRATO DE. TABLETAS

clorhidrico 2 M. Agregar 2 mL de SR de ditizona y titular con SV de sulfato de zinc 0.1 N hasta cambio de color. Correr un blanco de reactivos preparado con una alicuota de 25 mL de SV de edetato dis6dico 0.1 M, tres gotas de S1 de azul de timol, 5 mL de SA de acetato de amonio-acido acetico 4.5, 60 mL de etanol absoluto y 2 mL de SR de ditizona. Haeer las correcciones necesarias. El punto final tambien puede determinarse potenciometricamente, empleando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Calcular la cantidad de subacetato de aluminio en la porci6n de muestra tom ada, considerando que cada mililitro de SV de edetato dis6dico 0.1 M equivale a 16.208 mg de Al(OH)(CH 3C0 2h DE DE ZINC. MGA 0991. Solucion de benzoato de sodio-acido acetico. iJ1"""I'"\':>1"Q'" como se indica en Valoracion de subacetato de aluminio. Procedimiento. Pesar una cantidad de muestra equivalente a 300 mg de 6xido de pasar a un vasa de precipitados de 150 agregar 5 mL de acido clorhidrico y 5 mL de agua. Calentar a ebulliei6n sobre parrilla electrica. Filtrar la soluci6n caliente, recibir el filtrado en un matraz de 250 lavar el vasa y el mtro con agua caliente y nevar a un volumen de 100 mL con agua. soluci6n de hidr6xido de sodio 5 M hasta que se forme un nf''l,01'p''''f''I''''Yl?~nj-p agregar a soluei6n de acido clorhidrico 2 hasta que se disuelva el agregar 10 mL de soIuei6n de acetato de 1.0 g de cloruro de Y 10 mL de soluei6n de benzoato de sodio al 10 % Medir el dio a1 10 % entre 3.5 y si es necesario cual esta tarlo con soluei6n de hidr6xido de sodio M 0 con soIuci6n acido clorhidrico 2 M. Calentar la mezcla durante 30 min en un banG de agua, filtrar la soluci6n Call1eJlLC. matraz y el filtro con 3 de 0 mL cada una luci6n caliente de benzoato de sodio-acido recibir filtrado y los lavados en un matraz volumetrico de 500 llevar al aforo con agua y mezclar. Pasar una alicuota del filtrado unmatraz de 250 agregar 50 mL de agua, adicionar soluci6n de hidr6xido de sodio alcalina al M hasta obtener reacci6n neutra 0 indicador. 20 mL de SA de cloruro de amode S1 de negro nio-hidr6xido de amonio 10.7 y 10 de eriocromo T y titular con SV de edetato dis6dico 0.1 hasta vire a color azul. El punto final tambien puede determinarse potenciometricamente usando electrodos de mercurio-mercuroso/calomel. Calcular la cantidad de 6xido de zinc en la porci6n de muestra eonsiderando que cada mililitro de SV de edetato dis6dico 0.1 M es equivalente a 8.l38 mg de ZnO.

Contienen no menos del 95.0 % y no mas del 105.0 % de la eantidad de C lOH 17N'HCl, indicada en el marbete.

Preparados farmaceuticos

SUSTANCIA DE REFERENCIA. SRef-FEUM de clorhidrato de amantadina, manejar de acuerdo a las instrucciones de uso. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MGA 0241, CG. El valor del tiempo de retencion relativo, obtenido en el cromatograma con la preparacion de la muestra, corresponde al valor del tiempo de retencion obtenido en el cromatograma con la preparacion de referencia. Proceder como se indica en la Valoracion. muestra da reaccion

Cloruros. MGA las pruebas para cloruros.

nnC'1t1Ue>

MGA 0299.

UNIFORMIDAD DE

MGA 0291. Muestra

c;ur,rLUu,feSlU,

a

los

/1

''1/'17~',H''

1.

Q 75 %. en

Patron

de referenda. una solucion de la de clorhidrato de amantadina en agua, que 110 de clorhidrato de amantadina. Procedimiento. Colocar cada tableta en el 900 mL de agua como medio de accionarlo 100 rpm durante 45 inmediatamente filtrar una porClon de esta solucion. Hacer una de alicuotas vaso. Pasar una alicuota de 5 mL de la nr'~nC'''''',(,l rptprp'nf'l'> a un tubo de de 50 y a otro una alicuota de la mezcla filtrada a la cantidad de clorhidrato de amantanrr'cpntp en el tubo de la a cada tuba de solucion de hidroxido 10 mL del patron interno. durante 60 la fase Arc.""""" Obtener los CrC)m:ltognlm:as pn~pclralClOln

de la muestra. Calcular el por~AU"'~".~' por medio de la LHF.I.-HV~H'-'

formula: 100eD

1529

MGA 0241, CG. Patron interno. Preparar una solucion de naftaleno en n-hexano, que contenga 400 ~g/mL de naftaleno. de referenda. Pesar 200 mg de la SRef-FEUM de clorhidrato de amantadina, pasar a un matraz volumetrico de 100 mL, disolver y llevar al aforo con agua, mezclar. Pasar una alicuota de 25 mL de esta solucion a un matraz Erlenmeyer de 250 mL, provisto de tapon esmerilado, agregar 25 rnL de solucion de hidroxido de sodio 2 una alicuota de 50 mL del patron interno y agitar durante 60 min con agitador magnetico, que se separen las utilizar la fase de n-hexano para la Esta de clorhidrato de amantadina y 1",-,:>"Pl''Clt,l1'''' del ,rnTAC'Tnr columna de 1.22 m x mm diametro interno emlpa~:;a(la con 10 % de 01 sobre SIA de malla 100-120. Ui",JlLU'",V
6

8-25

94

66

6 --> 34

25-40

66 --> 10 10

34 --> 90 90

40-45

~>

Nota: previo a 1a inyeccion de Ia muestra, el sistema debera equilibrarse a las condiciones del tiempo cero. Condiciones del equipo. Cromatografo de Hquidos equipado con detector UV a 215 nm, columna de 2.1 mm x 10 cm, empacada con octadecilsilil silica gel para cromatografia (5 J.lm) con tamafio de poro de 20 nm, temperatura 60°C, velocidad de flujo de 0.2 mUmin. Volumen de inyeceion: 10 ~L. Verificacion del sistema. EI cromatograma obtenido con la preparacion de referencia debera corresponder al cromatograma del certificado de la SRef de Iilgrastim. Resultados. El perfil del cromatograma obtenido can la preparacion de la muestra debera corresponder al del cromatograma obtenido con la preparacion de referencia.

E. Secuencia N-terminal. Los primeros 15 aminoa.cidos secuenciados a partir del amino terminal deberan ser: Met-ThrPro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-Ser-Phe-Leu. Hacer una degradacion de Edman en un equipo secuenciador de fase solida automatizado, operado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cargar aproximadamente 1 mmol del material a probar en el cartucho del secuenciador usando el protocolo aprobado por el fabricante. Correr al menos 15 ciclos de secuenciacion. Identificar los derivados de fenilhidantoina (PTH) de los

FILGRASTIM HUMANO RECOMBINANTE (rhu-G-CSF)

IMPUREZAS CON PESOS MOLECULARES MAYORES QUE EL DE FILGRASTIM. MGA 0241, CLAR. E1 total de picas con tiempos de retencion menores que el del pico principal debe ser no mas del 2 %. Determinar por cromatografia de exclusion molecular. Emplear el procedimiento de normalizacion. Solndon 1. Disolver 4.1 g de aeetato de sodio en 400 mL de agua, ajustar el pH a 4.0 can acido acetico y diluir a 500 mL con agua. Preparacion de la muestra. Diluir Ia preparacion que se va a analizar con la solucion 1 hasta obtener una concentracion de 0.4 mg/mL. Preparacion de la referenda. Diluir una cantidad de SRef de Filgrastim con solucion 1 para obtener una concentracion de 0.4 mg/mL. Soludon de resolucion. Mezclar una porcion de la preparacion de referencia en vortex durante 30 s aproximadamente. Fase movil. Disolver 7.9 g de bicarbonato de amonio en 1 000 mL de agua y ajustar el pH a 7.0 can SR de acido fosforico y diluir a 2 000 mL con agua. Condiciones del equipo. Cromatografo de Jiquidos equipado can detector VV a 215 nm, columna de 7.8 mm x 30 em, ernpacada con silica gel hidrotllica para cromatografia (5 !lm) de un grado apropiado para fraccionamiento de proteinas globulares en el rango de peso molecular relativo de 10 000 a 500 000, temperat1Jfa 30°C, velocidad de flujo de 0.5 mUmin, volumen de inyeccion de 20 f'L. Retencion relativa con referencia al monomero de filgrastim (tiempo de retencion: cerca de 19 min): agregados aproxjma~ damente 0.60; oligomero de filgrastim 1 aproximadamente 0.75; oligomero de filgrastim 2 aproximadamente 0.80; dimero de filgrastim aproximadamente 0.85.

Productos biotecnof6gicos

Verificacion del sistema. Con 1a soluci6n de resoluci6n. EI tiempo de retenei6n del monomero de filgrastim es de 17 a 20 min; la resoluci6n es no menor de 3 entre los picas del dimero y monomero de filgrastim. Calcular el porcentaje del contenjdo del dimero, olig6meros y agregados. IMPUREZAS CON PESOS MOLECULARES DIFERENTES AL DEL FILGRASTIM. MGA 031, Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS condiciones reducidas y no reducidas. En la preparacion de la muestra 1 las impurezas con pesos moleculares menores 0 mayores que el de filgrastim, ninguna banda debenl ser mas intensa que la banda principal en el electroferograma obtenido con la preparacion de la muestra 4 (2,0 %), Dimensiones del gel. 1 mm de espesor. Gel de resolucion. Acrilamida a1 13 %, Soluci6n amortiguadora para muestras (condiciones no reducidas). Mezclar vohlmenes iguales de agua y soluci6n amortiguadora coneentrada para muestras SDS-PAGE, Solucion amortiguadora concentrada para mucstras SDS-PAGE. Disolver 1.89 g de tris (hidroximeti1) amino metano, 5,0 g de 1auri1 sulfato de sodio y 50 mg de azul de bromofenol en agua, Afiadir 25,0 mL de glicerol y di1uir a 100 mL con agua, Ajustar el pH a 6,8 con acido clorhidrico y di1uir a 125 mL con agua, Solucion amortiguadora para muestras (condiciones reducidas). Mezc lar volumenes iguales de agua y soluci6n amortiguadora concentrada para muestras SDS-PAGE en condiciones reducidas que contiene 2-mGrcaptoetanol como agente reductor. Soludon amortiguadora concentrada para muestras SDS-PAGE en condiciones reduddas. Diso1ver 3,78 g de tris (hidroximeti1) amino metano, 10,0 g dodeeil su1fato de sodio y 100 mg de azul de bromofenol en agua, Agregar 50,0 mL de glicero1 y di1uir a 200 mL con agua, Afiadir 25,0 mL dc 2-mereaptoetanoL Ajustar e1 pH a 6,8 con acido clorhidrieo y diluir a 250,0 mL con agua, Alternativamente se puede emplear ditiotreitol como agente reductor en lugar del 2-mercaptoetanol. En este caso preparar la soluci6n amortiguadora como sigue: disolver 3.78 g de tris (hidroximeti1) amino metano, 10,0 g dodecil su1fato de sodio y 100 mg de azul de bromofeno1 en agua, Agregar 50,0 mL de glicerol y di1uir a 200 mL con agua, Ajustar e1 pH a 6,8 con aeido clorhidrico y diluir a 250,0 mL con agua, Inmediatamente antes de usar, agregar la cantidad necesaria de ditiotreitol para obtener una concentraci6n de 100 rn1v1. Preparacion de Ia muestra ]. Diluir la preparaci6n que se va a analizar con la soluci6n amortiguadora para muestras hasta obtener una concentraci6n de 100 Jlg/mL. Preparacion de la muestra 2. A 0,20 mL de 1a preparacion de 1a muestra1 agregar 0,20 mL de solucion amortiguadora para muestras. Preparacion de la mnestra 3, Diluir 0.20 mL de 1a preparacion de la muestra 2 a 1 mL con la solucion amortiguadora para muestras.

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Preparaciiin de la mnestra 4. Diluir 0.20 mL de 1a preparacion de la muestra 3 a 1 mL con la soluci6n amortiguadora para muestras. Preparacion de la mnestra 5. A 0,20 rnL de la preparacion de 1a muestra 4 agregar 0,20 mL de solucion amortiguadora para muestras. Preparacion de referenda 1. Solucion de marcadores de peso molecular en e1 rango de 14.4 a 94 kDa para calibrar ge1es de poliacri1amida-SDS, Preparacion de referenda 2. Dilulr la referencia de Filgrastim SRef con soluci6n amortiguadora para muestras hasta obtener una concentracion de 100 f!g/mL. Tratamiento de Ia muestra. Calentar a ebullici6n durante 5 min. Volumen de aplicacion. 20 f!L. Detcccion. Tind6n con plata. Verificaci6n del sistema. La preparaci6n de referencia 1 cumple los criterios de validaci6n. Se observa una banda en el electroferograma obtenido con la preparacion de muestra 5. Se observa una graduacion en la intensidad del tcfiido en los electroferogramas obtenidos con las preparaciones de muestra desde la 1 hasta 1a 5, IMPUREZAS CON CARGAS DIFERENTES A LA DEL FILGRASTIM. Enfoque isoelectrico. En cualquier impureza, ninguna banda debe ser mas intensa que la banda principal en el electroferograrna obtenido con la preparacion de referencia 2 (10 %), Preparacion de ia muestra. Diluir la preparacion que se va a analizar con agua hasta obtener una concentraci6n de 0.3 mg/mL. Preparacion de la referencia 1. Diluir la referencia de Filgrastim con agua hasta obtener una concentraci6n de 0.3 mglmL. Preparacion de la referenda 2. Diluir la referencia de Filgrastirn con agua hasta obtener una concentraci6n de 0,03 mglmL. Preparacion de la referencia 3. Usar una soluci6n de calibraci6n de punto isoelectrico en el intervale de pi de 2.5 a 6.5 preparada de acuerdo a las instmcciones del fabricante. Enfoque. Gradiente de pH: 4,5 a 8,0, Cato1ito: soluci6n de hidr6xido de sodio 1M, Ano1ito: soluci6n de icido glutiunico 0,04 M en una solueion de i\Cido fosforico a1 0,0025 % (v/v), Vo1umen de aplieaeion: 20 f!L. Deteccion: Sumergir el gel en soluci6n de fijaci6n para isoelectroenfoque en gel de poliacri1amida (soluei6n que contiene 35,0 g de acido su1fosalicilico y 100,0 g de aeido t.ricloroacetico por litro de agua). Incubar con agitacion suave a temperatura ambiente durante 30 min. Vaciar la solucion y anadir 200 mL de solucion decolorante (Consta de una mezda de 1 volumen de acido acetico glacial , 4 volumenes de metanol y 5 volumenes de agua). Incubar con agitacion durante 1 h, Drenar e1 gel, anadir solucion de co1orante Coomassie (Solueion de 1,25 giL de azul acido 83

FILGRASTIM HUMANO RECOMBINANTE (rhu-G-CSF)

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

en una mezcla consistente en 1 volumen de acido acetico glacial, 4 volltmenes de metanol y 5 volumenes de agua. Filtrar). Incubar durante 30 min. Deeolorar el gel por difusi6n pasiva can soluci6n deco10rante hasta que las bandas se observen claramente frente a un fondo claro. Veriticacion del sistema. En el eiectroferograma obtenido con la preparaci6n de referencia 3, los marcadares relevantes de punto isoelectrico, deberan estar distribuidos a 10 largo de todo e1 gel. En el electroferograma obtenido con la preparacion de referencia I, el pI de la banda principal debera estar entre 5.7 a 6.3. PROTEINAS RELACIONADAS. MGA 0241, CLAR. Para cada impureza no mas del 2 %. La suma total de proteinas relacionadas no es mayor del 3.5 %. Emplear el procedimiento de normalizaci6n de areas. Soluci6n 1. Solucion amortiguadora pH 4.0 de acetato de sodio 0.1 M, que contiene O. I mg/mL de polisorbato 80 y 50 mg/mL de sorbitol. Preparacion de Ia muestra. Diluir 1a preparaci6n que sc va a analizar con 1a soluci6n 1 hasta obtener una concentraci6n de 0.2 mg/mL. Preparacion de la referenda 1. Dilui1' la SRef de Filgrastim con soluci6n 1 hasta obtener una concentraci6n de 0.2 mglmL. Preparacion de la referencia 2. A 500 JlL de la preparaci6n de referencia 1, agregar 2 J.lL de una soluci6n de peroxido de hidr6geno de una concentraci6n de 4.5 giL, mezclar e incubar a 25°C durante 30 min, despues agregar L5 mg de L-metionina. Fase movil 1. DiJuir 1.0 mL de acido trifluoroacctico con 900 mL de agua y agregar 100 mL de aeetanitrilo. Fase movil 2. Di1uir 1.0 mL de acido trifluoroacetico con 200 mL de agua y agregar 800 mL de aeetanitrilo. Tiempo (min.)

Fase movill % (v/v)

Fase movil2 % (v/v)

0-35

34 ->27

63 ->73

35 - 50

27-> 10

73->90

50 - 60

10->34

90->66

Condiciones del equipo. Cromatografo de liquidos equipado con detector VV a 215 nm, columna de 4.6 mm x 0.25 01, empacada con butilsilil sHiea gel para cromatografia (5 flm) con un tamafio de poro de 30 nm, temperatura 60 DC, velocidad de flujo de 0.6mLlmin, volumen de inyecei6n de 50 flL. Retencion relativa con referencia a1 'filgrastim; tiempo de retenci6n: cerca de 28 min; forma oxidada 1: aproximadamen!e 0.85; forma oxidada 2: aproximadamente 0.95; formas desamidadas: aproximadamente 1.1. Verificacion del sistema. Con la preparacion de referencia 2. La resoluci6n es no menor de 1.5 entre los picos de las formas oxidadas I y 2.

FILGRASTIM HUMANO RECOMBINANTE (rhu-G-CSF)

PROTEINAS TOTALES. MGA 0241, CLAR. Entre 90 y 110 % de 10 dec1arado en el marbete. POTENCIA. No menor del 80 % y no mas del 125 % de la potencia establecida. Los limites de confianza (F ~ 0.95) estin entre el 74 y 136 % de la potencia estimada. La actividad de la preparacion a examinar se determina por comparacion de las diluciones de la preparacion de la muestra con las diluciones de la preparacion de referencia de t'lgrastim calibrada en Vnidades Internacionales (VI). Preparacion de referencia. Solucion de SRef de filgrastim a una concentraci6n de 800 UlimL. Preparar 10 diluciones seriadas de la SRcf de tHgrastim para la curva de calibraci6n. Preparacion de la muestra. Soluci6n de 1a muestra a una concentraei6n de 800 VIImL. Realizar 10 dilueiones seriadas de la muestra para la curva de calibraci6n. Solndon de sal de lelrazolio. Pesar 5.0 g de sal de tetrazolio y disalver en 1000 mL del medio de eultivo y esterilizar por filtraci6n Preparacion de ceIulas. Preparar una suspension de celulas M-NFS-60 (a ATCC no. CRL-1838) que contenga 7 x 105 celulas por mililitro. Inmediatamente antes de su usc, afiadir 2-mercaptoetano1 para obtener una concentracion 'final 0.1 mM en la suspension. Procedimicnto. Colocar 50 ilL del medio de diluci6n a cada pozo de una placa de microtitulacion de 96 pozos. Afiadir 50 ~lL mas del medio de di1uci6n a los pozos correspondientes a los blancos. Agregar 50 ~lL de cada preparaci6n (Ia muestra y referenda mas las diluciones seriales de la curva de calibraci6n), par triplicado. Despues colocar en cada pozo 50 ~,L de la suspensi6n celular preparada, cuidando de mantener las ce!u1as en suspension homogenea durante 1a adici6n. Incubar la plaea a 36.0 a 38.0"C durante 44 a 48 h en una incubadora humidificada usando 6 ± ! % de CO 2 . Finalmente, adicionar 20 J.lL de una soluci6n esteril de sal de tetrazolio a cada pozo y valver a incubar par 4 horas mas. Transcurrido e1 tiernpo, disolver el formazan y estimar la cantidad producida, usando un lector de placas a 490 nm. Calculos. Calcular fa potencia de la preparaci6n examinada, empleando un metoda estadistico apropiado, par ejemplo e1 ensayo de Hneas para1elas. AcnVIDAD ESPECIFICA. Entre 1.0 x 108 VI/mg y 8 1.6 x 10 UIImg. La actividad especifiea (AE), se caleula usando la siguiente formula:

AE = AlP Donde: A = Actividad biol6gica por unidad de volumen. P "" Concentraci6n protei ca. CONSERVACION, Entre 2 y 8 'c. No debe congelarse.

Productos biotecno/6gicos

BIOMEDICAMENTO (SOLUCION INYECTABLE) DESCRIPCION. Solucion clara incolora a ligeramente amarilla, libre de particulas extranas. F:NSAYOS DE IDENTIDAD Debenin aplicarse cada una de las siguientes pruebas, comparando con una preparaci6n de referencia. A. POTENCIA. Debe inducir la proliferacion celular. B. ENFOQUE ISOELECTRICO. EI punto isocl6ctrico se

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Contiene no menos de 95.0 % y no mas de 105.0 % de insulina humana mas la correspondiente desarnido A-21 insulina, la eual no debe ser mayor al 2.0 % en relacion al peso seeo. Por eonvencion, con el proposito de normalizar las preparadones de inslliina, se considera que 0.0347 mg de insulina humana son equivalentes a 1.0 UI de insulina. La insulina hurnana debe ser producida bajo condiciones disefiadas para minimizar el grade de contaminaci6n microbiana. Para insulina hurnana producida par tecnologia de ADN recombinante, antes de liberar el producto es necesario llevar a cabo las siguientes pruebas para cada lote del biofannaco.

encuentra en 6 ± 0.2 unidades de pH conforme al metodo que se emplea para el biofannaco.

BIOFARMACO C. ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS. MGA 0311. Tiene un peso molecular relativo de alrededor de IS.S kDa en comparacion con una preparacion de referencia conforme al metoda indicado para el biofarmaco. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No mis de 2 DE/dosis. POTENCIA. Como se indica para el Biofarmaco. PROTEINAS TOT ALES. MGA 0241, CLAR. Entre 90 y 110 % de 10 declarado en el marbete. INOCUIDAD. MPB 335. Cumple los requisitos. pH. MGA 0701. Entre 3.0 y 4.5 para el producto sin diluir. VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. CONSERVACION. Entre 2 y S "c. No debe congclarse.

INSULINA HUMANA RECOMBINANTE Esta monografia aplica para el bioffumaco denominado insulina humana recombinante, el cual es un peptido de dos cadenas cuya estructura es identica a la honnona antidiabetica producida por el pancreas humane y presenta 1a siguiente secuencia de aminoacidos: GIVEQdCTSI

I

FVNQHLCGSH

I

CSL YQLENYC

I

LVEAL YLVCG

N

ERGFFYTPKT

Nota: Las lineas representan puentes disulfuro.

M,5S07.5S [11061-6S-0]

DESCRIPCION. PaIva blanco a casi blanco de consistencia fina. SOLUBILIDAD. Soluble en icidas minerales diluidos a con descomposici6n en solueiones alcalinas diluidas. Casi insoluble en agua y alcohol. ENSAYOS DE IDENTIDAD Debenin aplicarse las siguientes dos pruebas. A. MGA 0241, CLAR. Examinar los cromatogramas obtenidos en la prueba de Contcnido de Insulina. EI tiempo de retenci6n del pico principal del cromatograma de la preparacion de la muestra es similar al tiempo de retencion obtenido para la preparacion de referencia. B. MAPEO DE PEPTIDOS. MGA 0241, CLAR. Corte selectivo de los enlaces peptidicos. Preparacion de ia muestra. Preparar una soluci6n que COlltenga 2,0 mg/mL del compuesto a ser examinado en una solucion de acido c1arhidrico 0.01 M Y transferir 500 fiL de esta saluci6n en un tuba limpio. Agregar 2.0 mL de la solucion amortiguadora de HEPES pH 7.5 Y 400 fiL de salucion que contenga 1.0 mg/mL (500 U/mL) de proteasa tipo XVII-B de Staphylococcus aureus cepa VS. Tapar cl tuba e incubar a 25 "C durante 6 h. Detener la reaccion agregando 2.9 mL de salucion amortiguadora de sulfatos pH 2.0. Preparacion de referencia. Preparar al mismo tiempo y de 1a rnisrna manera que la preparacion de 1a muestra perc usando SRef de insulina humana en lugar del compuesto a ser examinado. Solucion amortiguadora de HEPES. Disolver 2.S g de HEPES (icida N-2-hidroxietilpiperazina N-2 etanosulfoico) en 90 rnL de agua para cromatografia en un matraz volum6trico. Ajustar can hidroxida de sodio 5 M a pH 7.5, diluir con agua hasta aj ustar el volumen de 100 mL y mezc1ar. Solucion amortiguadora de sulfatos. Mezclar volumenes iguales de 250 rnL de las siguientes soluciones: sulfato de amonio 2.0 M Y acido sulfurico 0.5 My filtrar. Fase estacionaria. Octadecilsilil silica gel para cromatografia (3 fim) can un tamano de poro de S nrn.

INSULINA HUMANA RECOMBINANTE

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion

Fase movil A. Mezelar 100 mL de acetonitrilo grado cromatogritfico. 200 mL de solucion amortiguadora de sulfatos pH 2.0 (deserita en el apartado anterior) y 700 mL de agua para cromatografia, filtrar y desgasificar. Fase movn B. Mezclar 200 mL de [a soluci6n amortiguadora de sulfato. pH 2.0. 400 mL de acelonitrilo grado cromatografico y 400 mL de agua, filtrar y desgasificar. Condiciones del equipo. Cromatogratb de liquidos equipado con detector UV a 214nm y columna de 4.6mm x 10em, mantener la temperatura de la columna a 40°C, Programar el cromat6grafo de acuerdo a la tabla 1 con velocidad de f1ujo de 1 mUmin. Acondicionamiento. En las condiciones iniciales durante 15 min. Realizar un ensayo en blanco con el gradiente indieado cn la tabla I. lnyeccion. 50 ftL. Verificacion del sistema. Los cromatogramas obtenidos con Ja preparaci6n de la muestra y de referenda son simi lares cualitativamente al cromatograma de la SRef de insulina humana digerida proporcionado con la SRef. En el cromatograma obtenido con la preparaci6n de referencia, identificar los picos correspondientes a los fragmentos digeridos I, II y III: empleando el cromatograma de la SRef de insulina humana digerida, proporcionado con la SRef. Factor de simetria. No mayor de 1.5 para los picos COlTespondientes a los fragmentos II y Ill. Resoluci6n. No menor de 3.4 entre los picos correspondientes a los jj-agmentos II y [[I.

Tabla I. Gradiente para mapeo de peptidos. Tiempo

Fase movil A

(min)

(%

0-60

90

60 - 65

30

v/v)

~>

-->

30 0

Fasc movil B ('Yo v/v) 10 --> 70 70

-->

100

65 -70

0

100

70 -71

0-->90

100--> 10

71 - 86

90

10

Resultados. EI perfil del cromatograma obtenido con la preparaci6n de la muestra conesponde al cromatograma obtenido con la preparaci6n de referencia.

CONTENIDO DE INSUUNA. MGA 0241. CLAR. Preparacion de la muestra. Disolver 40.0 mg del compuesto a ser examinado en una soluci6n de acido clorhidrico 0.01 My ajustar el volumen a 10.0 rnL con el mismo solvente. Preparacion de referencia A. Disolver el contenido de un vial de SRef de insulina humana en una soluci6n de acido clorhidrico 0.01 M para obtener una concentracion de 4.0 rngiL. Preparacion de referencia B. Disolver el contenido de un vial de SRef de insulina porcina en una soluci6n de acido

INSULINA HUMANA RECOMBINANTE

clorhidrico 0.01 M para obtener una concentraci6n de 4.0 mg/L. Preparaciiin de referencia C. Diluir 1.0 mL de la preparaci6n de referencia B en 50.0 mL de una soluci6n de icido clorhidrico 0.01 M. A 1.0 mL de esta so1uci6n adieionar 1.0 mL de la preparacion de referencia A. Prep"racion de referenda D. Diluir 1.0 mL de la preparaci6n de referencia A en 10.0 mL de una soluci6n de :iciclo clorhidrico 0.01 M. Soluci6n de resolucion. Mezclar 1.0 mL de la preparaci6n de refercncia A con 1.0 mL de la preparaci6n de referencia B. Mantener las soluciones entre 2 y 8°C, usarlas dentro de las 48 h posteriores. Si se utiliza un inyector automMico, mantener la temperatura del mismo entre 2 y 8 0c. Fuse estacionaria. Octadecilsilil silica gel para cromatogratia (5 ftm). Fase m6vil. Mezclar 42 volumenes de la fase m6vil A con 58 volumenes de la fase movil B, ajustar la composici6n de 1a mezc1a 5i es necesario. Preparar y mantener las siguientes soluciones a temperatura de 20°C. Fase movil A. Disolver 28.4 g de sulfato de sodio anhidro en agua y !1evar a volumen de 1 000 mL con el mismo solvente; agregar 2.7 mL de 35

35.0 - 105.0

65-+35

35->65

105.0 - 107.5

35-.100

65-+0

107.5 - 120.0

100

0

ProdUGtos biotecno/6giGos

Condiciones del equipo. Cromat6grafo de liquidos equipado con un detector UV a 214 nm, columna de 4.6 nun x 0.10 m, cmpacada con L2 con tamano de pom de 30 nm, vclocidad de flujo de 1.0 mJ./min. Inyecci6n de 200 flL de las preparaciones de muestra 0 de refcrencia. Equilibrio. En las condiciones iniciales por 10 menos durante 12 min. Verificacion del sistema. Los cromatogramas obtenidos con la preparacion de referenda y con la preparaci6n de la muestra deberin seT cualitativamente similares en los tiempos de retenci6n. Resultados. EI perfil del cromatograma obtenido can la preparaci6n de la muestra corrcsponde al cromatograma obtcnido con la preparaci6n de referenda. E. Secuencia N-terrninal. Hacer una degradaci6n de Edman en un equipo secuenciador de fase s6lida automatizado, operada de acucrdo con las instrucciones del fabricante. Cargar aproximadamente ] mmol del material a probar en el cartucho del secuenciador usando el protocolo aprobado por el fabricante. COffer 16 ciclos de secuenciaci6n, notando, si es apropiado, la presencia de prolina en las posiciones 2, 6, 8 Y12. Identificar los derivados de fenilhidantoina (PTH) de los aminoacidos liberados en cada cicIo de secuenciaci6n por CLAR de fase reversa. EI procedimiento pucde Ilevarse a cabo usando la columna y los reactivos recomendados por cl fabricante del secuenciador para separar los aminoacidos-PTH. EI procedimiento de separacion se calibra usando: - La mezcla de aminoacidos-PTH suministrada par cl fabricante del secuenciador, can las condiciones del gradiente ajustadas para lograr la maxima resoluci6n de todos los aminoacidos. - Una mezcJa obtenida del primer cielo de secuenciaci6n en blanco de acuerdo a las recomendaciones del fhbricante del equipo. Resultados. Los primeros 16 aminoacidos secuenciados a partir del amino terminal deber56

30-35

44->0

56->100

35-45

0

100

45-50

0->64

100->36

50-60

64

36

Condiciones del equipo. Cromatagrafo de liquidos equipado con un detector UV a 214 nm, columna de 4.6 mm x 0.15 m, empacada con L26 con tamafio de poro de 30 nm, velocidad de flujo del.2 mLimin. lnyeccian de 100 ilL de preparacian de la muestra 1, preparaciones de referencia 1 y 2. Veriticaci6n del sistema. Preparacion de referencia 2. Tiempo de retencion. Molgramostim aproximadamente 22 min. Repetibilidad. Maxima desviaci6n relativa estandar de 5.0 % despues de 4 inyecciones. Resolucion: minimo dos entre los picos debidos a la albumina y el molgramostim. Limites. Cualquier impureza: para cada impureza, maximo 1.5 %. Impurezas totales eluyendo entre 5 y 30 min: maximo 4%. POTENCIA. MPB 0340.No menos de 10 x 106 U]/mg de proteina

BIOMEDICAMENTO (SOlUCION INYECTABlE) DESCRIPCION. Polvo de color blanco 0 ligeramente amarillo, y diluyente incoloro transparente, ambos libres de pmi1culas extrafias. Una vez reconstituido es una solucion incolora 0 amarillo claro, libre de particulas extranas.

Productos biotecn%gicos

ENSAYOS DE IDENTIDAD Deberfm aplicarse cada una de las siguientes pruebas, comparando con una preparaci6n de referencia:

A. Potencia. MPS 0340. B. Enfoque isoelectrico.

2617

unidades de pH y una banda menor con lm punta isoelectrico de aproximadamente 4.8 unidades de pH. B. Mapa de peptidos. MGA 0241, CLAR. EI analisis se lleva a cabo en las soluciones digeridas de la muestra y las preparaciones de referenda con tripsina a 37 °e. Las preparaciones digeridas se analizan por cromatogratla de liquidos conforme al metoda validado por el fabricante.

C. Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.MGA 0311.

C. El tiempo de retenci6n de los picas en el cromatograma con la solucion de prucba es similar al obtenido con la preparacion de referenda.

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINA. endotoxinaiviaL

MGA 0316.

Maximo

12 UI

de

HUMEDAD. MGA 0671. No mas del 4.0 % (m/v).

D. Protein as relacionadas, dimeros y sustancias relacionadas. MGA 0241, CLAR. En el cromatograma obtenido, el tiempo de retenciGn del pico principal can la solucion de prueba es similar al del pica principal en el cromatograma de la preparacion de referencia. La suma de las areas de todos los picos diferentes del pica principal no es mayor del 13.00/0. No tomar en cuenta los picos debidos al disolvente.

CONSERVAnON. Entre 2 y 8 0c.

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos.

SOMATROPINA INYECT ABLE

INOCUIDAD. MPS 0680. Cumple los requisitos. Inyectar en cada rat6n 0.5 mL de una soluci6n conteniendo 2.0 Ul/mL en SR de solucion salina.

POTENCIA. MPS 0340. Se cncuentra entre 70.0 a 125.0 % de la potencia indicada en el marbete. INOCUIDAD. MPS 0680. Cumple los requisitos.

La somatropina inyectable es una preparacion liofilizada de proteina con 191 aminmicidos. Es el principal componente de la hormona del crecimiento y es producida por la ghindula pituitaria humana. Se obtiene utilizando tecnologia de ADN recombinante. EI contenido de proteinas derivadas de las cclulas recombinantes y el ADN residual se encuentran dentro de sus Hmites establecidos por el fabricante y aprobados por la autoridad sanitaria ademas de demostrar su efecto de promocion de crecimiento en modelos ani males de prueba. Una muestra de 1.0 mg de somatropina anhidra utilizada como materia prima equivale entre 2.5 y 3.0 UI de actividad especifica. DESCRIPCION. EI liofilizado es un polvo blanco. EI producto reconstituido es una soluci6n incolora, transparente a ligeramente opalescente y libre de partkulas. EI diluyente es agua calidad inyectable y puede estar adicionada de soluciones amortiguadoras 0 estabilizantes. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. Isoformas. Determinar por isoelectroenfoque. La banda principal en el electroforetograma obtenido con la soluci6n de pmeba al 6.25 % corresponde en posici6n a la obtenida con la preparacion de referencia. Ademas, ninguna banda es mas intensa que la banda mayor caracteristica de somatropina y esta tiene un punto isoelectrico de aproximadamente 5.0

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No mas dc 5.0 UI de endotoxinas par miligramo de producto. VALORACION. MGA 0241, CLAR. EI valor determinado en la prucba quedara comprendido entre 89.0 y 110.0 % de 10 dec1arado en el marbete. Se realiza por cromatografia de exclusi6n de tamafio conforme al metoda validado por el fabricante. En el cromatograma obtenido, el pico principal eluye de acuerdo a los parametros de validaci6n del metodo, a un tiempo de retencion aproximado de 12 a ] 7 min. Calcular el contenido de somatropina de las areas del pico en los cromatogramas obtenidos con la solucion de prueba y preparaci6n de referencia.

Dimeros y sustancias relacionadas de alto peso molecu~ lar. En el cromatograma de exclusion de tamafio, realizado para Valoraci6n, con la soluci6n de plueba, la suma de las areas de todos los picos de dimero de somatropina y otras proteinas de mayor peso molecular tienen tiempos relativos de retencion de 0,9 y 0.65 respectivamente, relativos al pico principaL La resoluci6n definida por la relacion de altura en la grafica por encima de la linea basal del valle que separa los picos de mon6mero y dimero no es mayor a OA. (La suma de las areas de todos los picas con tiempo de retenci6n menor que el pico principal no es mayor que 6.0 %. No tomar en cuenta cualquicr pico debido al disolvente).

SOMATROPINA INYECTABLE

2618

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

HUMEDAD. MGA 0041. No mas de 3.0 % (mlv). A menos que otro limite se justifique con estudios de estabilidad. CONSERVACION. Entre 2 y 8 'c. No congelar.

VACUNAANTIHEPATITIS B RECOMBINANTE Es una preparacion purificada de antigeno de superficie del virus de Ia hepatitis B (HBsAg) producido por tccnica de ADN recombinante, expresando el gene que codWca para el HBsAg en levaduras 0 lineas celulares de mamifero. La vacuna puede contener el producto codificado por el gene S (226 aminoacidos. 22 kDa), 0 una combinaci6n de prodllCtos del gene S, del gene pre-S2 (280 aminoacidos, 27 kDa) y del gene pre-SI (400 aminoacidos, 42 kDa). Para su formulacion como producto final inyectable, el antlgeno puede ser adsorbido en un adyuvante mineral tal como hidroxido de aiuminio 0 fosfato de aluminio hidratado 0 lipido A monofosforilado. EI antigeno HBsAg purificado resuItant.e debe ser inmunogenico. PREPARACION DE REFERENCIA. La preparaci6n de referencia es parte de un lote representativo que muestra ser al menos tan inmunogenico en animales como un lote que en estudios clinicos en adultos jovenes y saludables produce seroconversion no menor de 95 %, correspondiente a un nivel de anticuerpos neutralizantes no menor de 10 mUIImL. La preparacion de referencia no debe contener aditivos 0 adyuvantes ausentes en la preparacion de prueba. CARACTERIZACION DEL ANTIGENO. EI fabricante lleva a cabo estudios de desarrollo para caracterizar el antlgeno y establecer Ia estructura de Ia proteina completa, y el contcnido de lipidos y carbohidrat.os. Las caracteristicas morfologicas de particulas del antigeno se establecen por microscopia electronica. La densidad promedio de flotacion de las particulas de antigeno se determina por un metodo fisicoquimico tal como centrifugacion en gradiente. Se deben caracterizar los epitopos antigenicos. La fraccion de proteina del antigeno se caracteriza en terminos de Ia estructura primaria, por ejemplo por ia determinacion de Ia composicion de aminoacidos, por secuencia parcial de aminoacidos y por mapeo de peptidos.

ANTiGENO PURIFICADO

IDENTIDAD Y CONTENIDO DE ANTIGENO. La cantidad y la identidad de HBsAg se determina por comparaci6n con una preparacion de referencia del fabricante pot un metodo inmul1oquirnico validado, tal como radio inmulloensayo (RIA), ELISA, inmunoblot (preferentemente usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra un epitopo protector) 0 difusian radial simple. La relacion antigeno/proteina debe estar dentro de los limites aprobados para este producto. El peso molecular de Ia banda mayor tevelada en el analisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (MGA 03//), bajo condiciones reductoras corresponde al valor esperado en relacion a Ia secuencia de aminoacidos establecida y las secuencias del polipeptido y su po sible glicosilaci6n. ESTERILlDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos, utilizar un volumen de 10 mL para cada medio de cultivo. PUREZA. La pureza del antigcno se dctermina por comparacion con una prepatacion de referenda usando el MGA 0241, CLAR 0 bien otros metodos tales como MGA 0311, Electroforesis en gel de poLiacrilamida-SDS, con tincion con azul acido 92 y plata. Un metodo adecuado debe ser suficientemente sensible para detectar un cont.arninante potencial a una concentracion de 1 % de proteina total. No menos de 95 % de Ia proteina total consiste de HBsAg. COMPOSICION. Se debe determinar el contenido de proteinas, lipidos, acidos nucleicos y carbohidratos, usando metodos validados, y deben estar dentro del limite aprobado para est.e product.o. ADN RESIDUAL. Si se usa una linea celular continua de mamifero para Ia produccion, no debe haber mas de 100 pg de ADN en Ia cantidad de antigeno equivalente a una dosis. AGENTES AUXILlARES EN LA PURIFICACION. Si se usa sal de cesio, de bromo, sacarosa u otros agentes durante el proceso de produccion, llevar a cabo una prueba para deteccion de sus residuos en el antigeno purificado. Su contenido debe estar dentro de los limites autorizados para este producto. PRUEBAS ADICIONALES. Se pueden requerir en cl antigeno purificado pruebas tales como: contenido de alburnina animal residual, cuando se usa suero animal para la producci6n (:'050 ngidosis), 0 pruebas para detccci6n de compuestos quimicos residuales usados durante la extracdon y purificacion. Si se utiliza adsorcion en lipido A monofosforilado (MPL) como adyuvante debe detenninarse el grado de adsorcion por un metodo adecuado y validado.

Para la preparacion de la vacuna en su forma de granel final, solamente se utilizara antigeno purificado que cumple con los siguientes requisitos:

GRANEL FINAL

PROTEINA TOTAL. MPB 0860. Entre 80 y 120 % (mlv) del limite aprobado para este producto.

Se prepara a partir de antigeno purificado y puede incluir un preservativo y un adyuvante.

VACUNA ANTIHEPATITIS B RECOMBINANTE

Productos biotecno/6gicos

Salamonte un granal final que cumple con los siguientes requisitos se pucde usaf en la preparacion de un late final.

ESTEJUUDAD. MGA 0381. Cumple los requisitas. Utilizar un volumen de 10 mL para cada media de cultivo.

POTENCIA. Se puede camprobar mediante dos metodos altemativos: A. Metodo in vivo. La prucba consiste en medir la seroconversi6n para el antigeno de superficie del virus de Ia hepatitis B

(HBsAg) en grupos de ratones inmunizados con diferentes diluciones de la vacuna de muestra y vacuna de referencia,

2619

2. El ensayo cumple can los panlmetros de linealidad y paralelismo. PRESERVATIVO. Tiomersai. MPB 0920. Cuando apliqne, detenninar la cantidad de preservativo selecclonado por el fabricante, por metoda quimico 0 fisicoquimico. La cantidad no es menor que la minima cantidad demostrada como etectiva y no mayor de 115 % de la cantidad indicada en el marbete. FORMALDEHIDO UBRE. MPB 0500.

No mas de

0.02 % (m/v).

expresando el valor obtenido como potencia relativa.

Utilizar grupos de no menos de 10 ratones de 4 semanas de edad entre 14 y 16 g de una cepa susceptible al virus de la hepatitis B, los cuaies se inoculan con un volumen de entre 0.5 y LO mL de la vacuna de muestra por via intraperitoneal dependiendo de 1:1 dosis, emplear cuando menos cuatro diluciones diferentes can illl factor de diluci6n constante que permitan caJcular el 50 % de seroconversi6n contra el HBsAg. Usar como diluyente solucion de SR de Soluci6n salina adicionada can hidr6xido de aluminio a Ia concentraci6n utilizada par et fabricante en cl producto. Inocular gntpOS similares de ratones con Ia vacuna de referencia. Simultaneamente inocular a otro gntpO de 10 ratones unicamente con el diluyente. Sangrar los ratones entre los 28 y 32 dias. Se colecta suero de cada animal par separado; la determinaci6n de anticuerpos anti-HBsAg se realiza por medio de una prueba sensible como la de radioinmunoensayo 0 la de ELISA. Los resultados obtenidos del grupo testigo negativo (ratones inoculados solo con el diluyente), se utilizan para calcular el valor de corte indicado en el metodo. La DEso se calcula por un metodo estadistico para ensayos de respuesta cuantal. La prueba es valida si: 1. La DEso esta comprendida entre la diluci6n mas baja y la mas alta probada. 2. El analisis estadistico muestra paralelismo. 3. El limite de confianza de Ia potencia relativa esta comprendido entre el 33 y 300 % de la patencia estimada. B. Metodo in vitro. El metodo utilizado sera previamente validado por el fabricante. En general consiste en preparar diluciones de la vacuna de prueba y de una vacuna de referenda (en algunos casos la vacuna a probar requiere un pretratamiento) y par el sistema de ELISA se determina el contenido de I-lBsAg. Las diluciones de la vacuna a probar y de la vacuna de refefencia deben mostrar relaci6n dosis-respuesta, a fin de lograr lffia relaci6n lineal. Para el calculo de potencia relativa se utiliza un metodo estadistico como el de lineas paralelas. La prueba es vttlida si: 1. La prueba de ELISA empleada cumple can los criterios de aceptaci6n estableddos por e1 fabricante del reactivo.

BIOMEDICAMENTO (SUSPENSION INYECT A· BLE) DESCRIPCION. Suspension homogenea de color blanco, libre de particulas extranas y gnnnos.

Nota: EI granel final sera dosificado dentm de un sistema contenedar-cierre que asegure la esterilidad del producto. Si al granel final se Ie aplican las pruebas de formoldehido residual, preservativo y actividad, pueden ser omitidos en el lote fina!' ENSAYOS DE IDENTIDAD A. La prueba de actividad 0 el perfil electrofaretico de la vacuna se pueden utilizar como pntcbas de identidad. B. El I-lBsAg puede identificarse con la tccniea de ELISA en

la prueba de antigenicidad 0 con otro metoda inmuno'" quimico previarnente validado (por ejemplo electroforesis en gel de PAGE-SDS). ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No mas de 3 UI de endotoxina par dosis. POTENCIA. Se puede comprobar mediante los dos metodos alternativos descritos para el granel final. ESTERIUDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ADYUVANTE. MPB 0120. No mas de 1.25 mg par dosis humana individual si se usa hidroxido de aluminio 0 fosfato de aluminio hidratado como adyuvante. Si se utiliza adsorci6n en lipido monofosforilado A (MPL) como adyuvante debe deterrninarse cl grado de adsorci6n por un metodo validado. PRESERV ATIVO. Tiomersa!. MPB 0920. Cuando aplique, la cantidad no es menor que la minima cantidad dcmostrada como efectiva y no mayor de 115 % de la cantidad indicada en el marbete. FORMALDEHIDO UBRE. MPB 0500.

No mas de

0.02 % (mJv).

VACUNA ANTIHEPATITIS B RECOMBINANTE

2620

Farmacopea de los Eslados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

pH. MGA 0701. Limite especificado por el fabricante.

BIOFARMACO

OSMOLARIDAD, Limites especificados por el fabricante.

ANTIGENO MONOVALENTE PURIFICADO

CONSERVACION. Entre 2 y 8 cC. Evitar la congelaci6n.

Los metodos de control de cali dad deben asegurar la segregacion de diferentes genotipos de la proteina Ll durante los pasos de fabricaci6n.

VACUNA RECOMBINANTE CONTRA EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (PROTEiNA L 1)

DESCRIPCION, Liquido transparente lescente.

Es una preparacion que contiene capsides purificadas de virus (PPV. parlieulas parecidas a virus) compuestas de la proteina L 1 recombinante de diferentes genotipos del virus del papiloma humano (VPH).

En la actualidad existen dos tipos de vacunas contra el VPH: La vacuna bivalente contiene PPV de los genotipos 16 y 18 expresados en celulas de insectos infectadas con un baculovirus recombinante y puriticadas. Las PPV son adsorbidas en hidroxido de aluminio y formuladas con el adyuvante AS04, compuesto 3-0-desacil-4'-monofosforil de lipido A (MPL) adsorbido en hidroxido de aluminio. La vacuna tetravalente contiene PPV de los genotipos 6, II, 16 Y 18. Las proteinas L1 son expresadas en levaduras de forma independiente, purificadas, ensambladas y adsorbidas en sulfato de hidroxifosfato de aluminio amarfo.

0

ligeramente opa-

IDENTIDAD. Identificar cada granel del antigeno monovalente purificado por ensayos inmunol6gicos previamente validados por el fabricante, apropiados para e1 genotipo del antigeno VPH. PUREZA, MPH 0880. Cump1e las especificaciones del fabricante. Determinar el grado de pureza de cada granel del antigeno monovalente purificado por metodos tales como electroforesis bajo condiciones reductoras y desnaturalizantes en geles de poliacrilamida-bis-acrilamida tefiidos usando colorantes como el azul de Coomassie. Utilizar una inmunodetecci6n en gel para identificar a la proteina Ll. Las proteinas no identificadas como L 1 son consideradas impurezas. E1limite de detecci6n del metodo es de al menos 1 % de impurezas con relacion a la proteina totaL CONTENIDO DE LA PROTEINA LI INTACTA, Calcular la relaci6n porcentual entre la proteina Ll intacta y los fragmentos de menor peso molecular a partir de los ensayos en geles de poliacrilamida-bis-acrilamida utilizados para determinar la pureza.

FABRICACION La produccion de la vaClma se basa en el sistema de lote sernillalbanco de celulas. La producdon de las vacunas contra VPH se realiza usando procesos que resultan en productos comparables en cali dad con la vacuna de probada eficacia clinica y seguridad en el humano. La pertinencia y seguridad de los sistemas de expresion son aprobadas por la Secretaria a traves del registro sanitario del producto. PREPARACION DE REFERENCIA, Un 10te de vacuna que muestre ser efectivo en ensayos clinicos 0 un lote representativo designado como vacuna de referenda. SISTEMA DE EXPRESION. Los bancos celulares y vectores de expresion maestros y de trabajo, empleados para la produccion de la vacuna deberan contar con informacion en relaci6n a su origen, caracterizaci6n biologica y molecular, identificacion y pureza.

PROTEiNA TOTAL. MPH 0860. Determinar el contenido total de proteina en cada granel del antigeno mono valente purificado. CONTENIDO DEL ANTIGENO. Cumple las especificadones del fabricante. Determinar la proporcion entre el contenido de antigeno y de proteina mediante ensayos inmunologicos previamente validados por el fabricante comparando con la preparacion de referencia. Puede omitirse si se realiza en el antigeno monovalente adsorbido. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ESTRUCTURA Y TAMANO DE LAS PPV. Deterrninar el tamano y la estmctura de las PPV por al menos dos de los siguientes metodos validados por el fabricante: A. Microscopia electronica de transmisi6n. B. Dispersion din'mica de luz. C. CLAR (MGA 0241).

VACUNA RECOMBINANTE CONTRA EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (PROTEiNA L 1)

Productos biotecnol6gicos

ADN RESIDUAL. No mas de 10 ng en 1a can!idad de antigena que constituye una dosis. De acuerdo al metoda propuesto y validado por e1 fabricante.

2621

CONTENIDO DE ANTIGENO. Cumple las especificaciones del fabricante. Determinar Ia proporci6n entre el contenido de antigeno y de proteina mediante ensayos inmuno16gicos previamente validados por el fabricante comparaedo con Ia preparaci6n de referenda.

PROTEINAS DEL HOSPEDERO. Cumple las especificaClones del fabricante. De acuerdo al metoda propuesto y validado par el fabrican!e.

ADYUV ANTE AS04

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos.

Nota: cuando el MPL es adsorbido antes de adicionarlo a Ia vacuna, el AS04 debe cumplir los siguientes requisitos:

IMPUREZAS DERIV ADAS DEL PROCESO. Cumple las especificaciones del fabricante. Determinar el contenido de agentes potencial mente peligrosos utilizados durante el proceso de fabricaci6n, de acuerdo con metodos establecidos par el fabricante.

GRADO DE ADSORCION DEL MPL. Cumple las especificaciones del tabricante. Determinar el contenido de MPL no adsorbido con un metoda validado por el fabricante, tal como cromalografia de gases. pH. MGA 0701. Cumple las espccificaciones del fabricante.

PRUEBA DE EUMINACION DE BACULOVIRUS INFECCIOSOS. Cumple las especificaciones del fabricante. Cuanda se utilicen baculovirus recombinantes, demostrar su eliminacion 0 inactivaci6n utilizando alguno de los siguientes metodos validados por el fabricante: A. Titulacion por ensayo en placa 0 diluci6n hasta punto final.

B. Reacci6n en cadena de polimerasa.

ESTERIUDAD. MGA 0381. Cumplc los requisitos.

Se obtiene a partir de Ia combinaci6n aseptica de los antigenos monovalentes adsorbidos, los que deben cumplir con las especificaciones listadas. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos.

ANTiGENO MONOVALENTE ADSORBIDO Consiste en el antigeno monovalente puriticado adsorbido en un vehiculo mineral, como una sal de aluminio, y/o formulado con MPL. S6lo deben utilizarse preparaciones del antigeno monovalente adsorbido que cumplan las especificaciones del antigeno monovalente purificado. IDENTIDAD. Identificar cada granel del antigcno monovalente adsorbido con ensayos inmunol6gicos previamente validados por el [abricante, apropiados para cl genotipo de cada antigeno de VPH. ESTERILIDAD. MGA 038J.Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. Utilizar un metoda validado por el fabricante. CONCENTRACION DEL VEHICULO MINERAL Cuando aplique. Cumple las especificaciones del fabricante. Utilizar un metodo validado por el fabricante.

PRESERV ATIVO. Si se adiciona, el contenido eslii cntre el 85 y 1 15 % de 10 deelarado por el fabricante. Cuantificar par un metoda validado por el fabricante.

BIOMEDICAMENTO Las muestras de cada lote de vacuna final curnplen con los siguientes requisitos: DESCRIPCION. Uquido blanco opalescente que al dejar reposar puede presentar un dep6sito blanco y sobrenadante incoloro. Al agitar es un liquido libre de particulas extrafias. IDENTlDAD. Cada uno de los antigenos presentes en el medicamento biotecnol6gico son identificados en cada lote por metodos previamente validados pOl' el fabricante. La prucba de potencia puede ser utilizada como prucba de identidad. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. pH. MGA 0701. Entre 5.7 Y 7.0.

GRADO DE ADSORCION. Cumple las especilicaciones del fabricante. Utilizar un metodo validado por el fabricante.

PRESERVATIVO. Si se adiciona, el contenido esta entre el 85 y 115 % de 10 declarado en el marbete. Determinar par un

pH. MGA 070J. Cumple las especiiicaciones del fabricante.

metoda validado por el fabricante.

VACUNA RECOMBINANTE CONTRA EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (PROTEiNA L 1)

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. No mas de 5 UJ de endotoxinas por dosis individual bumana. Si el adyuvante imp ide la determinacion en el medicamento biotecnologico, realizar la prueba en el antigeno concentrado purificado. ALUMINIO. MGA 0086. No mas de 0.6 mg por dosis.

vacuna en una solucion de cloruro de sodio que contiene el adyuvante de aluminio utilizado en la produccion de la vacuna. Inocular cada raton con 0.5 mL. Tomar una muestra del suero antes y despucs de la inmunizad6n (en el lapso de 21 a 28 dias). Analizar los sueros individuales por un metodo inmunoquimico para la determinaci6n de anti cuerpos neutralizantes especificos contra cada genotipo de VPH.

o determinar por un metodo validado por el fabricante.

ADYUV ANTES. Entre 80 y 120 % del contenido dec1arado por el fabricante. Determinar mediante metodos validados por el fabricante. PROTEINA TOTAL. MPB 0860. Cumple las especificaclones del fabricante. GRADO DE ADSORCION. Determinar para cada antigeno y para e1 MPL cuando sea utilizado. Cumple con las cspecificaciones del fabricante. Cuantificar por un metodo validado por el fabricante. POTENCIA. Cumple las especificacioncs del [abricante. Utilizar un metoda apropiado in vivo 0 in vitro. Los resultados de la prueba in vitro correlacionan con una prueba in vivo. Si se utiliza una prueba de potencia in vivo, la prueba puede ser aplicada al biofannaco. Comparar can 1a preparacion de referencia. Prueba in vivo. Inocular al menos tres diluciones de 1a vacuna a evaluar y de la preparacion de la vacuna de referencia. Utilizar para cada dilucion un gmpo de ratones hembras de una cepa determinada, de 6 a 8 scmanas de edad. Diluir la

La prucba es valida sl: -La DEso de 1a vacuna evaluada y la de la referenda estan entre ia menor y la mayor dosis administrada a los animales. -El amilisis estadistico no muestra desviacion significativa de la linealidad 0 el paralelismo. -Los limites de confianza (P ~ 0.95) estan dentm de los limites aprobados para el producto en particular. Prueba in vitro. Para cada genotipo, la potcncia cumple las especificaciones del fabricante. Utilizar un ensayo inmunol6gico para cada genotipo de antigeno, comparando la vacuna evaluada con la de referenda. Los ensayos utilizan anticuerpos monoclonales para epitopos en la proteina Ll que inducen protecci6n. Analizar vadas diluciones de la vacuna eva1uada y de la de referencia y utilizar un modelo apropiado para analizar los datos. VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. INOCUIDAD. MPB 0680. Cumple los requisitos. CONSERVACION. Entre 2 y 8 'C. Evitar la congelaci6n.

VACUNA RECOMBINANTE CONTRA EL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO (PROTEiNA L 1)

HEMODERIVADOS

INTRODUCCION .................................................................. REOUISITOS DE LA MATERIA PRIMA PARA ELABORAR HEMODERIVADOS ................................................... CARACTERisTICAS DEL ETIOUETADO DE LA MATERIA PRIMA PARA LA ELABORACION DE LOS HEMODERIVADOS .................. MONOGRAFiAS .......................................................................

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Hemoderivados

INTRODUCCION Los hemoderivados son productos obtenidos de la sangre humana, los cuaies son utilizados con fines terapeuticos y son separados por tecnicas industriales de fraccionamiento del plasma. Estos han cobrado hoy en dia una gran importancia, por su respuesta eficaz en tratamientos de enfermedades que requieren de estos productos, sin dejar de tener en cuenta que al tratarse de productos derivados del plasma humano, no se pucde descartar totalmente la posibilidad de transmisi6n de enferrnedades infecciosas, por 10 que es importante vigilar estrictamente los lineamientos para la obtenci6n de la materia prima, definidos en la normatividad vigentc. Una vez que se cuenta con la materia prima de cali dad se pueden obtener diferentes hemoderivados como la albumina humana, los fa.ctores de Ia coagulaci6n, basicamente el factor VII! liotilizado, el factor IX, la inmunoglobulina humana normal (para aplicaci6n intramuscular, subcutanea y endovenosa) y las inmunoglobulinas especificas como la antirrabica 0 antitetanica, Existen otros productos que en los ultimos afios han tenido gran trascendencia como son los Selladores de fibrina y las Solueiones de proteinas plasmaticas. Para poder obtencr todos estos productos es necesario que todos los bancos de sangre, que proporcionan la materia prima, cumplan con 10 estipulado en la norma oficial mexicana NOM-253-SSAI-20l2, Para fa disposicion de sangre humana y sus componentes con Jines terapeuticos vigente, utilizando bolsas de cxtracci6n multiples que contengan las soluciones anticoagulanles y conservadoras necesarias las cuaies cumplinin con 10 estipulado en este capitulo de la Fannacopca mexicana. Con el prop6sito de que los productores naciona1es y extranjeros de hemoderivados tengan la misma oportunidad de participar en la comercializaci6n y de que el mayor beneficio sea para el paciente al que se Ie administre el producto, en este capitulo se ha buscado la manera de armonizar con otras farmacopeas. Finalmente en e1 capitulo tambien se cncuentra inc1uido el factor VIn recombinante que atm cuando ya no corresponde a un producto derivado del plasma hurnano y cuya obtenci6n es diferente, queda incluido ya que se estabiliza con albumina humana, Los metodos analfticos seran validados para su aplicacion.

REQUISITOS DE LA MATERIA PRIMA PARA ELABORAR HEMODERIVADOS CUll1ple con los requisitos que se establecen en la norma oticial mexicana NOM-253-SSAI-20I2, Para fa disposicion de sangre humana y sus componentes con Jines terapeuticos vigente. Cuando se administran productos preparados a partir de sangre 0 plasma humano no se puede descartar totalmente 1a posibilidad de transmisi6n de enfermedades infecciosas.

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Todos los procesos invo1ucrados en la fabricaci6n de hemoderivados se rnanejan con procedimientos de buenas practicas de fabricaci6n, para estab1ecer un sistema de garantia de calidad, desde Ia selecci6n del donante para la extracci6n de sangre hasta el productotinal. Comprobar en forma documentada Ia identidad de los donantes que cumplen con 10 sefialado a continuaci6n. A. Selecci6n rigurosa, mediante evaluaci6n clinica de donantes de sangre y evaluaci6n de 1aboratorio de la sangre para los agcntes infecciosos conocidos; se llevara a cabo emp1cando mctodos aprobados por 1a autoridad sanitaria. La sangre se analiza en fonna individual, emp1eando metodologia sensible y especifica, los resultados obtenidos deben ser negativos para: antigeno de superficie del virus B de la hepatitis, anticuerpos contra los virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 y 2, virus C de la hepatitis, Trypanosoma cruzi y Treponema pallidum. En caso de donantes de sangre residentcs 0 procedentes de las zonas consideradas de riesgo 0 con actividades de riesgo para ser portadores de enfennedades tales como brucelosis, pa1udismo, 0 con antecedentes clinicos de haberlas padecido, la sangre debera ademas dar resultados ncgativos a las pruebas de laboratorio establecidas para cada caso. Cuando Ia materia prima sea de donantes de otros paises, debe cumplir can Ia normatividad del lugar de origen y Ia normatividad nacional. Si existen enfermedades endcmicas, como par ejernplo virus de leucemia humana de celulas T tipo I y II (HTLV-l Y II), cumplira can las pruebas que determine la Autoridad cornpetente del pais de procedencia. B. Aplicaci6n a los donantes del proceso de autoexclusi6n, referido en la norma olicial mexicana NOM-253-SSAI-2012, Para la disposicion de sangre humana y sus componentes con fines terapeuticos. La exclusion de 1a utilizaci6n de placentas como materia prima de producci6n en e1 proceso de fabricacion. REQUISITOS DE VALIDACION VIROLOGICA, En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluiran cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n de patogenos. b) Uno 0 mas procesos validados de inactivaci6n y uno 0 mas procesos validados de eliminaci6n de pat6genos. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envo1tura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar e1 proceso de purificacion, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion 0 interferencia en la prueba de titulaci6n de anticuerpos.

INTRODUCCION

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Se puede realizar una inmunizacion deliberada de donantes para la obtencion de inmunoglobuhnas con actividades especificas, bajo supervision medica apropiada y siguiendo las recomendaciones emitidas por la Organizacion Mundial de la Salud (OMS). PLASMA. El plasma para fraccionamiento, es la fraccion liquida de la sangre humana, que resuIta de la separacion de los componentes celulares de la sangre. Esta separacion se lleva a cabo en presencia de anticoagulante y sepanindolo por procedimiento de aferesis 0 pOl" centrifugacion difcrencial. El plasma obtenido a partir de sangre total 0 aferesis, destinado a produccion de concentrados de factores de la coagulacion u otros componentes labiles, sera separado de los componentes celulares de la sangre y se congela a una temperatura de 30°C bajo cero 0 menor en las primeras 6 h 0 hasta las primeras 18 h, si la sangre total estuvo en refrigeracion entre 1 y 6°C, previo a la congelacion del plasma. Para obtencion de factores no labiles el plasma se separa de los componentes celuJares y congelarse a temperatura de 20°C bajo cero 0 menor, antes de las siguientes 72 h de su recolecci6n. DESCRIPCION. Antes de la congelaci6n es un liquido transparente 0 ligeramente turbio, color amarillo palido sin datos visibles de hemolisis. MEZCLAS DE I'LASMA PARA FRACCIONAMIENTO A. PRUEBAS SEROLOGICAS. Deteccion de antigeno de superficie del virus B de la hepatitis, anticuerpos contra la hepatitis C y anti cuerpos contra el VIH I Y 2, Trypanosoma cruzi y anticuerpos contra Treponema pallidum, utilizando metodologia sensible y especifica. Dando resultados negativos en cada caso. B. PRUEBA DE DETECCION DE ACIDOS NUCLEICOS. En su proceso de produccion, la determinacion puede realizarse mediante reacci6n en cadena de 1a polimerasa (PCR) u otro metodo de sensibilidad y espeeificidad igual 0 mayor, validados. No mas de J 04 UI de ADN viral/mL de Parvovirus B-19 y dcben dar resultados negativos para hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana tipo 1.

PROTEiNAS TOTALES. MPB 0840 0 MPB 0860. Cumple los requisitos U otro metoda validado por el fabricante. CONSERVACION. Conservar el plasma congelado, dependiendo de los hemoderivados que se quieran obtener; a las temperaturas mencionadas en la descripci6n de Plasma, que se sefiala a1 principio de esta monografia. ETIQUETADO. La eliqueta permite la identificaci6n de procedencia y el rastreo del plasma, desde el producto linal hasta la fuente individual.

CARACTERisTICAS DEL ETIQUETADO DE LA MATERIA PRIMA PARA LA ELABORACION DE HEMODERiVADOS Permite la identificacion de procedencia y el rastreo del plasma desde el producto final hasta la fuente individual. Indicara: 1. Condiciones de conservacion. 2. Pecha de caducidad. 3. La lcyenda: la transmisi6n de agentes infecciosos no es tota/mente descartada cuando son administrados productos preparados a partir de fa sangre 0 plasma humano. 4. Pais de procedencia del plasma y sus dcrivados, cuanda sean mas de uno se referiran en et instructivo. 5. Lo establecido en la NOM-072-SSAI-2012, Etiquetado de medicamentos y de remedios herbolarios.

ANTITROMBINA III EI concentrado de Antitrombina III es una fraccion de glicoprotein a obtenida a partir del plasma humano que inactiva a la trornbina en presencia de un exceso de hepar ina. Se obtiene de una mezda de plasma humane de varias donantes de sangre que cumple los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. La preparacion reconstituida en el volumen de disolvente indicado en la etiqueta 0 en el instructivo contiene no menos de 25 UIImL. REQUISITOS DE VALIDA CION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluiran cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cllalquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 !ogaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar eJ proceso de purificacion, demostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nive1 que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en la prueba de titulaci6n de anticuerpos. Durante e1 proceso de purificacion y concentracion se puede anadir un estabilizador. La actividad espedfica durante dicho proceso no sera inferior a 3 UI de antitrombina III por miligramo de proteina total sin considcrar la albumina que pudiera estar presentc. E1 concentrado se filtra para eliminar

CARACTERisTICAS DEL ETIQUETADO DE LA MATERIA PRIMA PARA LA ELABORACI6N DE HEMODERIVADOS

Hemoderivados

cualquier posible contaminaci6n bacteriana, se envasa en recipicntcs definitivos esteriles y se sella al vado 0 en atmosfera de gas inerte, sin conservador alltimicrobiano. Demostrar que e1 proceso de fabricaci6n pemlite obtener de

forma rcpetitiva en lotes consecutivos, un producto que pucde unirse a Ia heparina en un porcentaje de 60 % 0 mayor, mediante un metoda validado por el productOf, el cual pucde requcrir electroforesis en gel de agarosa.

DESCRIPCION. El liofilizado puede presentar una apariencia pulverulenta 0 de un solido poroso friable de color blanco. Una vez reconstituido, Ia soluci6n es transparente 0 ligeramente opalescente.

SOLUBILIDAD. Rcconstituir una muestra del producto can el volumen de disolvente indicado por el fabricante y agitar suavemente durante un maximo de 10 min. La preparacion se disuelve por completo, dando una solucion incolora 0 ligeramente opalescente. ENSA YOS DE lDENTIDAD A MPB 0600. Reaccion positiva a antisueros especificos contra proteinas plasmaticas humanas y reaccion negativa a antisueros especificos para proteinas plasmaticas de otras especies. B. La prueba de Potencia es utilizada como prueba de identidad.

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pH. MGA 0701. Entre 6.0 y 7.5, Determinar en el producto reconstituido. HUMEDAD. MGA 0041. No mas de 3.0 %, PROTEiNAS. MPB 0840 0 MPB 0860. Cumple los requisitos, HEPARlNA. MPB 0580, La preparaci6n no contienc mas de 0.1 UI de heparina par Unidad Internacional de antitrombina III. Es necesario validar la prueba de Heparina para cada preparacion en estudio, para tener en cuenta la interferencia originada por la antitrombina III. CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y aceptados por la autoridad sanitaria. CONSERVACION. Entre 2 y 8 "C, ETIQUETADO. Adema, de 10 establecido en Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo, indicara: 1. Cantidad de antitrombina 1Il expresada en Unidades Internacionales. 2. Cantidad total de proteina en la solucion final en gramos por mililitro. 3. Lo establecido en Ia norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos.

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. PIROGENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyeetar a cada conejo un volumen que contenga 50 VI de antitrombina ITI por kilogramo de peso, calculado conforme a 10 indicado en la etiqueta. OSMOLARlDAD. MGA 0621. No menos de 240 mOsmlL. POTENCIA. Determinar par comparacion de su capacidad para inactivar la trombina en presencia de un exceso de heparina con la obtenida para una preparaci6n de referencia de concentrado de antitrombina III humana, calibrada en Unidades Internacionales. En la prueba se mezclan cantidades variables de la preparacion problema con una cantidad fija de trombina y se determina la actividad de la trombina residual mediante un sustrato cromogenico adecuado. La Unidad Intelllacional corresponde a la actividad de una cantidad dada del Patron Internacional de concentrado de antitrombina lII. Verificar la validez de la prueba y caleular la actividad de la preparacion por los metodos estadisticos, empleando el model0 de lineas paralelas. La potencia estimada no es menor que 80 % ni mayor que 120 % de la potencia establecida en la etiqueta. El intervalo de contlanza (IC ~ 0.95) no es menor que 90 % y no es mayor que 110 % de la potencia estimada.

COMPLEJO DE PROTROMBINA HUMANA El complejo protrombina humana es una fraccion proteica del plasma que contiene a1 factor IX de la coat,rulaci6n sanguinea junto con cantidades variables de Factores 11, VII Y X; la presencia y cantidades de estos factores adicionales depende del metoda de fraccionamiento. Se obtiene del plasma humano que cumple con 1a monografia de Plasma humano parafraccionamiento. REQUISITOS DE VALlDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hcmoderivados incluiran cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos de inactivaci6n validados. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el pro~ ceso, sera como minima del orden de 10 logaritmos, Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante e1 proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de puriiicaci6n, demostrando que 1a concentracion residual de dichas sustancias

COMPLEJO DE PROTROMBtNA HUMANA

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion que interfiera en la prueba de titulacion de anti cuerpos.

FABRICACION Un metodo de preparacion esta designado para reducir al maximo la activacion de cualquier factor (minimizar el potencial de trombogenicidad). La actividad especifica es no menor a 0.6 UI de factor IX por miligramo de proteina total, antes de la adicion de cualquier proteina estabilizadora. La [raccion del complejo de protrombina se disuelve en una cantidad adecuada de diluyente. De acuerdo al proceso de produccion, adicionar: heparina, antitrombina y otras sustancias auxiliares, tales como estabilizadores. No adicionar agentes antimicrobianos como conservadores. La solucion se hace pasar a traves de III filtro para bacterias, es distribuido asepticamente en viales finales y congelado inmediatamente. Enseguida se liofiliza y los viales son cerrados al vacio 0 bajo un gas inerte. DESCRIPCION. EI liofilizado puede presentar una apariencia pulverulenta 0 de un solido friable, muy higroscopico. Una vez reconstituido Ia soluci6n puede ser ligeramente amarilla U opalescente. IDENTIDAD. Cumple con las especificaciones de ensayo de actividad para cl factor IX de coagulaci6n y aquellas que aplique para factores II. VII y X. SOLUBILIDAD. A un vial de Ia preparacion a examinar adicionar e1 volumen de liquido diluyente como 10 indica Ia etiqueta a la temperatura recomendada. La preparacion se disuelve completamente con una agitacion suave durante 10 min, resultando una solucion clara. pH. MGA 0701. Entre 6.5 y 7.5. OSMOLARIDAD. MGA 0621. No menos de 240 mOsm/L. PROTEINA TOTAL. MPB 0840. Si es necesario, diluir un volumen exactamente medido de Ia preparacion reconstituida con una SR de soluci6n salina, para obtener una solucion que contenga aproximadamente 15 mg de proteina en 2 mL. A 2.0 mL de soIuci6n en un tubo dc fondo redondo para ccntrifuga adicionar 2 mL de SR de molibdato de sodio al 7.5 %. y 2 mL de una mezcla de I volumen de SR de acido suIfi\rico libre de nitr6geno, y 30 volumenes de agua R. Mezclar, centrifugar por 5 min, decantar el liquido sobrenadante y dejar el tubo invertido escurriendo sabre papel mtra. Determinar el nitr6geno en el residuo por el metodo de digestion con acido sulfurico y calcular la cantidad de proteina multiplicando el resultado por 6.25. Tambien puede aplicarse el MPB 0860.

COMPLEJO DE PROTROMBINA HUMANA

FACTORES DE COAGULACION ACTIVADOS. Realizar un tiempo de protrombina con diluciones de 1 a lOy de I a 100. EI resultado no es valido si el tiempo de coagulaci6n para el tubo control es de 200 a 300 s. Si es necesario, diluir 1a preparacion a examinar que contenga 20 UI de factor IX par mililitro. Para cada una de las diluciones, el tiempo de coagulacion es no menor alSO s. HEPARINA. MPB 0580. Si durante la preparaci6n ha sido adicionada heparina, determinar la cantidad presente por el ensayo de heparina en concentrados de Factores de coagulacion. La preparacion a seI examinada contiene no Imls de la cantidad de heparina establecida en la etiqueta y en ning{m caso es mayor a 0.5 VI de heparina por Unidad Internacional de factor IX. TROMBINA. Si la preparacion a examinar contiene heparina, determinar la cantidad presente como 10 describe el ensayo para heparina y neu1Talizar con la adicion de SR sulfato de protamina (10 IJ.g de sulfato de protamina neutraliza I UI de heparina). En cada uno de dos tubos, mezclar voIumenes iguales de la preparacion reconstituida y SR de fibrinogeno 3 giL. Mantener uno de los tubos a 37°C durante 6 h y Ia otra a temperatura ambiente por 24 h. En 1m tercer tubo) mezclar un vohunen, partiendo de SR trombina humana 5 UI, hasta obtener llila concentraci6n de 1 UIImL y colocar el tuba en un baiio de agua a 37°C. No debe haber coagulacion en los tubos que contienen Ia preparacion a examinar. La coahru1aci6n ocurre dentro de 30 s en c! tuba que contiene trombina. HUMEDAD. Determinar mediante un metodo adecuado, tal como la semimicro determinaci6n de agua MGA 0041 0 perdida por secado MGA 0671. El contenido de agua esta dentro de los limites aprobados por 1a autoridad competent.e. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS IlACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La prcparaci6n contiene menos de 0.05 UE por unidad internacional de factor IX. Esta pmeba puede ser reemplazada por Pirogenos. PIROGENOS. MGA 071 f. Cumple los requisitos. Tnocular por kilogramo de masa de conejo un volumen de la PREPARACION rcconstituida equivalente a no menos de 30 UI de Factor IX. Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. ACTIVIDAD ~'ACTOR IX. MPB 0380. Llevar a cabo el ensayo de factor IX de la coagulacion humana. La potencia estimada es no menor al 80 % y no mayor al 125 % de la potencia establecida. El intervalo de confianza (P ~ 0.95) de Ia potencia estimada es del 80 al125 'Yo.

Hemoderivados

FACTOR U. MPB 0360. Llevar a cabo el ensayo para factor II de la coagulaci6n humana. La potencia estirnada es no menor a1 80 % y no mayor al 125 % de la potencia establecida. EI intervalo de conlianza (I' = 0.95) de la potencia estimada es del 90 al 111 %. FACTOR vn. MPB 0400. Si la etiqueta establece que la preparacion contiene factor VII, l1evar a cabo el ensayo de factor VII de la coagulaeion. La potencia estimada es no menor al 80 % y no mayor a 125 % de la potencia estableeida. El interval0 de confianza (I' = 0.95) de la potencia estimada es del 80 al125 %. FACTOR X. MPB 0440. Llevar a cabo ensayo de factor X de la coagulacion. La potencia estimada es no menor al 80 % y no mayor al 125 % de la potencia establecida. El interval0 de confianza (I' = 0.95) de la potencia estimada es del 90 al 111 %. CONSERVACION. Entre 2 y 8 °C protegido de la luz. En los casos que el fabricante demuestre la estabilidad del producto ante la autoridad sanitaria a una temperatura no mayor de 30°C, con estudios correspondientes, podra conservarse a esta temperatura. ETIQUETADO. Adem:'" de 10 ya establecido en los requisitos de materia prima para hemoderivados indicara: 1. 2.

3. 4. 5. 6.

7.

8. 9.

Unidades Internacionales de factor IX y cuando aplique, de los factores II, VII y X. Contenido de proteina C y/o proteina S en el liofilizado en easo de que aplique. Proteinas tatales. Nombre y cantidad de cualquier sustancia afiadida, incluyendo a la heparina, cuando aplique. Tiempo de estabilidad del producto reconstituido. La leyenda: "el riesgo de transmision de agentes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se aplican hemoderivados". En los casos en que el almacenamiento se encuentre entre 9 y 30°C, indicar en fonna especifica cuales seran sus cuidados. Senalar protegido de la luz. Lo establecido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos,

FACTOR VIII DE LA COAGULACION SANGUiNEA HUMANA UOFIUZADO (CON o SIN FACTOR DE VON WILLEBRAND) El factor VIII de la coagulaeion (VlII:C) sanguinea humana liofilizado se prepara por fraccionamiento del plasma procedente de mas de diez donantes de sangre que cumple con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderi-

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vados, que se sefialan al principio de este capitulo. Se dispone de una amplia gama de preparaciones can diferente actividad y grado de pureza. La pureza del producto se detennina por la actividad especifica; cantidad de proteina deseada (factor de la coagulaeion) por miligramo de proteina total y la cantidad de factor de von Willebrand, en Unidades Internacionales (UI), en caso de que 10 contenga. La aetividad especifiea no sera inferior a 1.0 UI de factor VIII:C por miligramo de proteinas totales, antes de agregar cualquier proteina estabilizadora. La potencia de la preparaci6n reconstituida, como senala la etiqueta no sera menor a 20 UI de factor VIlI:C por mililitro. REQUISITOS DE V ALlDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluiran cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificaci6n, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en la prueba de titulaci6n de anti cuerpos,

Validacion de productos en que se declara que tienen actividad de factor de von Willebrand. En los productos que se aptican al tratarniento de la enfermedad de von Willebrand, se demuestTa que el proceso de fabricaci6n da un producto con composicion constante que incluye actividad de factor de von Willebrand. Esta composici6n se puede comprobar de diferentes maneras, Por ejemplo, el nLunero y cantidad relativa de diferentes multimeros se puede determinar por electroforcsis en gel de agarosa al l.0 % con dodecil sulfato de sodio, con 0 sin amllisis de Western blot, y usando una mezcla de plasma humane normal como referencia; la observaci6n del estimdar de referencia multimerico se puede llevar a cabo utilizando una tecnica inmunoenzimatica, la evaluaci6n cuantitativa se puede llevar a cabo por analisis densitometrico 0 por otros metodos apropiados validados por el fabricante. Actividad de factor de von Willebrand. Para productos que se aplican en el tratamiento de 1a enfermedad de von Willebrand. La actividad de este factor se determina por un metodo adecuado, utilizando una preparaci6n de referencia del mismo tipo que Ia preparacion que se esta examinando, calibrada contra el Estandar Internacional para factor de von Willebrand en plasma. Los metodos adecuados incluyen la determinaci6n de actividad del cofactor ristocetina y

FACTOR VIII DE LA COAGULACI6N SANGUiNEA HUMANA LlOFILIZADO (CON SIN FACTOR DE VON WILLEBRAND)

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

determinacion de al dad de union al cohlgeno. EI siguiente metoda para dcterminar la actividad de cofactor de ristocetina se da como ejemplo de un metoda adecuado. Adividad de cofactor de ristocetina. l-Iacer diluciones de 1:20, 1:80, 1:120 y 1:160, de la preparaci6n que se esta examinando y de la preparacion de referencia como indique la etiqueta, usando como diluyente SR de soluci6n salina y una soluciim de albiuuina Immana (50 giL). Mezclar 20 flL de cada dilucion con 20 pL del reactivo de von Willebrand conteniendo plaquetas humanas estabilizadas y ristocetina A. Mezclar en una placa de vidrio moviendola suavement.e en circulos durante j min. DejaI' reposar durante otro minut.o y leer el result.ado contra un fondo oscuro de iluminaci6n lateral. La ultima dilucion que muestra aglutinaci6n claramente visible indica el titulo de cofactor ristocetina en la muest.ra. Multiplicar la ultima diluci6n positiva pOl' el factor que indica la etiqueta del reactivo, montar siempre un control positivo y uno negativo. Usar diluyente como control negativo. Factor de von Wiliebrand. La potencia estimada es no menor de 60 % y no mayor de 140 % de la potencia declarada. DESCRIPCION. EI liotilizado es de aspecto pulverulento 0 de un solido poroso, friable, de color blanco 0 ligeramente amarillo. Una vez reconstituido la solucion es incolora 0 ligeramente amarilla, transparente 0 ligeramente opalescente. SOLUBILJDAD. Reconstituir el producto con agua inyectabIe, segun 10 indicado en la etiqueta a una temperatura entre 20 y 25°C Y agitar suavemente, evitando la formacion de espuma. El producto se disuelve por complet.o antes de to min. Cuando se mantiene el producto entre 20 y 25°C, no prescnta senales de coagulacion hasta 3 h despues.

ENSAYOS DE IDENTIDAD A. AIPB 0600. Da reacci6n positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas humanas y reaccion negativa a los antisueros cspccificos para proteinas animales. B. Las determinaciones de factor VI!!: C y de aetividad de factor de von Willebrand en los casos en que dicha actividad existc, son utilizadas como prueba de identidad. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. PIROG ENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyectar un volumen equivalente a 50 UJ/kg de peso del conejo, 0 ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cuando este validado el metodo de cndotoxinas bacterianas. La preparaci6n a examinar contiene maximo 0.03 UI de endotoxinas por UI de factor VllI:c.

POTENCIA. MPB 0420. La potencia estimada es del 80 al 120°;;) de la actividad dcclarada. El intcrvalo de confianza (IC ~ 0.95) no excede los limites del 80 al 120 % de la actividad medida. HEMAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B. MPB 0560. Diluir con SR de solucion salina para obtener una concentraeiim de 3.0 UIImL de factor Vl1I:c. EI producto eumple si no ll1uestra aglutinacion en una diluci6n (1 :64). HUMEDAD. MGA 0041. No mas de13.0 %. PROTEINAS TOTALES. MPB 0840 0 MPB 0860. Determinar la cantidad de proteinas conlcnidas en el envase. Obtener una concentracion aproximada de 15 mg de proteina en 2.0 mL en un tuba para centrifuga, introdudr 2.0 mL de esta solucion, anadir 2.0 mL de SR de molibdato de sodio al 7.5 % y 2.0 mL de SR Acido sulf6rieo, exento de nitrogeno, al 30 %. Agitar, centrifugar durante 5 min, decantar el sobrenadante y dejar escurrir el tuba sobre papel filtro. Determinar el contenido de nitrogeno presente en el precipitado y caleular la cantidad de proteinas multiplicando por 6.25. Para algunos productos con una proteina estabilizadora, como la albumina, este met.odo no es aplicable. Se puede utilizar otro metodo validado por el fabricante para determinacion del producto de interes. FHlRINOGENO. MPB 0840 0 MPB 0860. Diluir I: 10 Ia preparaci6n reconstituida con SR de solucion salina, a un volumen de la preparacion que cont.enga l5 mg de fibrin6geno, anadir suficiente SR de trombina humana 5 UI para coagular 1a proteina y dejar reposar durante 2 h. La cant.idad de SR de Trombina humana 5 UI que se requiere es igual a 10 veCGS la cantidad necesaria para coagular en 15 s a 37°C, 1,0 mL de Ia so1uci6n de fibrin6geno humano al 0.1 % en SR de soluci6n salina a un pH entre 7.2 y 7.3. Recoger el coagulo y lavar con SR de soluci6n salina. Calcular la cantidad de nitrogeno protcico (fibrinogeno) y ll1ultiplicar el resultado por 6.25. El tlbrinogeno corresponde maximo a1 80 % de las proteinas t.otalcs en Ia preparacion. OSJVlOLALIDAD. 240 mOsmollkg.

MGA 0621.

No

menos

de

pH. MGA 0701. Entre 6.5 y 7.5. Determinar en el producto reconstituido. CADUCIDAD. De aeuerdo a estudios de estabilidad validados por cl fabricantc y aceptados por la autoridad sanitaria. In vitro validado de cndotoxinas bacterianas. CONSERVACTON. Entre 2 y 8 °C protegido de la luz. En los casos que el fabricant.e demuestre 1a estabilidad del producto ante Ia autoridad sanitaria a una temperatura no mayor de 30°C, con estudios correspondientes, podra conservarse a esta temperatura.

FACTOR VIII DE LA COAGULACION SANGUiNEA HUMANA LlOFILIZADO (CON o SIN FACTOR DE VON WILLEBRAND)

Hemoderivados

ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principia de estc capitulo, indicar: I. Pais de procedencia del plasma. 2. Cantidad de factor VITI:C expresada en Unidades Internacionales. 3. Unidades Intemacionales de factor VIIl coagulante por miligramo de prate ina. 4. Cantidad de factor de von Willebrand expresada en Unidades lntemacionales par mi!i!itro del producto reconstituido. 5, Concentraci6n de proteinas totales en la soluci6n final en gramos por mililitro. 6. Ticmpo de estabilidad del producto una vez reconstituida. 7. Nombre y concentracion de cualquicr sustancia afiadida. 8. Grado de pureza del producto a factor VllI. 9. En los casas en que el almacenamiento se encuentre entre 9 y 30°C, indicar en forma especifica cuaies scrim sus cuidados. 10. Sefialar protegido de la luz. 11. La establecido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos,

FACTOR VIII DE LA COAGULACION SANGUiNEA HUMANA RECOMB IN ANTE (ADNr) El factor VIn de la coagulacion humana recombinante (ADNr) es una preparacion liofilizada de glicoproteinas que tiene la misma actividad como el factor VIn en plasma humano. Actua como cofactor de Ia activacion de factor X en la presencia de factor IXa, fosfoHpidos e iones caIdo, EI factor VIII de la coagulacion humana recombinante (ADNr) circula en plasma principalmente como dos cadenas glicosiladas proteicas unidas pOI iones meta1icos divalentes: la pesada, de masa molecular relativa de 200 000; Y la !igera, de masa molecular relativa de 80 000. El factor VIII de Ia coagulacion humana recombinante (ADNr). se prepara como factor VIII de estmctura completa (octocog a1fa) 0 bien como lU1a estructura acortada de dos cadenas (masa molecular relativa de 90000 Y 80000) en la cual e1 dominio B ha sido eliminado de la cadena pesada (moroctocog alta). En Ia estructura campleta, el factor VIn de la coagulacion human a recombinante (ADNr) contiene 25 sitios potenciales de N-glicosilacion, 19 en el dominio B de la cadena pesada, 3 en la parte remanente de Ia cadena pesada (rnasa molecular relativa de 90000) Y 3 en la cadena !igera (masa molecular relativa 80 000). En la estructura corta de dos cadenas, el dominio B ha sido eliminado de Ia cadena pesada (moroctocog alfa) y posee una masa molecular relativa de 90 000 a 80 000.

2631

Los diferentes product.os son caracterizados por su tamafio molecular y modificaciones post-traduccion de la informacion y/o algunas otras modificaciones. El producto final Hene una actividad especifica de factor VllI de 5 UlImg a 20 UI/mg de proteina.

FABRICACION El tactor VIll rccombinante (ADNr) purifieado, puede contener albumina humana u otros agentes estabilizantes, asi como sustancias auxiliares para ajust.e de pH y osmolaridad adecuados. La albumina adicionada cumple can los Requisitos de Ia materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan a principio del capitulo de Hemoderivados, La actividad espccifica cs no menor de 2 000 Ul de factor VIII: C par miligramo de proteina total antes de la adici6n de cualquier proteina estabilizante, y varia dependiendo de 1a pureza y el tipo de modificaci6n de estructura molecular de factor VIII. La caUdad de Ia preparacion a granel esta controlada usando como referenda uno 0 mas preparaciones de referencia del fabricante.

PREPARACIONES DE CANTE

REFER~~NCiA

DEL FABRI-

Durante la etapa del desarrollo del producto sc establecen las preparaciones de referenda, para Ia verlficaci6n de uniformidad de calidad de los lotes, durante la produccion para el control a granel purificado y granel final. Las preparaciones de referenda de los jabricantes se derivan de lotes representativos de factor VIll recombinante (ADNr) de grane1 puritlcado que son cornpletamente caracterizados por pmebas incluyendo las que se describen mas adelante y cuya actividad procoagulante y otras propicdades funciona1es relevantes han sido determinadas y comparadas, siempre que sea posible, con un Estandar Internacional de factor VTTI concentrado, Las preparaciones de referencia son caracterizadas adecuadamente y son almacenadas en alicuotas bajo condiciones que aseguren su estabilidad.

PRODUCTO A GRANEL PURIFICADO (ADNr) E1 granel purificado cumple can una combinaci6n apropiada de prucbas que caracterizan la integridad del factor VIII (ADNr). Si esta presente alguna sustancia afiadida durante la purificaci6n del producto a granel, que pudiera interfedr con una prueba, Ia pmeba se lleva a cabo antes de la adici6n de dicha sustancia. Cuando aplique, las pruebas para Ia caracterizaci6n pueden alternativarnente ser realizadas hasta el producto final.

FACTOR VIII DE LA COAGULACI6N SANGUiNEA HUMANA RECOMBINANTE (ADNr)

2632

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Actividad biologica espccifica 0 relaci6n de actividad de factor VIII a factor vln A (antigenico). L1evar a cabo Ia prueba de actividad mediante MPB 0420. Cuantificaci6n del factor VIII coagulante. El contenido de proteina, 0 cuando esta presente un estabilizador, el contenido de antigeno factor VIII se determina por un metodo adecuado y se calcula la actividad bio16gica espedfica 0 la relacibn entre la actividad de factor VIII (MPB 0420) Y factor VIII antigenico. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. Composicion proteica. Se determina par una selecci6n de tecnicas de caracterizaci6n que pueden incluir mapeo peptidico, Western blot, CLAR, electroforesis en gel. electroforesis capiiar, espectrometria de masas y otras tecnicas seleccionadas por el fabricante para monitorear la integridad y pureza. La composici6n proteica es comparable a la de la preparaci6n de referencia establecida por el fabricante. B. Distribuci6n de tamafio molecular. Usando cromatografia de exclusion, la distribuci6n de tamafio molecular es comparable a la de la preparaci6n de referenda establecida por el fabricante. C. Mapa peptidico. No hay diferencia significativa entre Ia proteina de prueba y la preparaci6n de referenda establecida par el fabricante. Relacion de carbohidratoshlcido sialico. La uniformidad lote a lote se determina mediante e1 contenido de monosacaridos y el grado de sializacion 0 determinacion de oligosacaridos es monitoreado y corresponde a las preparaciones de referencia del fabrieante.

PRODUCTO FINAL Cumple con los requisitos sefialados en Producto a granel purificado (ADNr) y los que se scnalan a continuacion. Reconstituir la preparaci6n como se sefiala en Ja etiqueta 0 instructivo, inmediatamente antes de llevar a cabo las pmebas, excepto las de solubilidad y humedad cuando apliquen. Aditivos Determinar por un metodo validado por el fabricante el contenido de sustandas inc1uidas en la formulaci6n del producto. Estos contienen entre el 80 al 120 % de 10 declarado en la etiqueta, cuando aplique. DESCRIPCION. EI Iiofilizado se puede presentar como una masa friable 0 polvo blanco 0 ligeramente amarillo. Una

vez reconstituido se farma una soluci6n es incolora 0 ligeramente amarilla transparente 0 ligeramente opalescente. SOLUBILIDAD. Adicionar Ientamente al producto Ia cantidad de agua inyectable indicada en Ia etiqueta entre 20 y 25°C. Mezclar par rotacion evitando la farmaci6n de espuma. EI producto se disuelve por completo antes de 5 min. ENSAYOS DE lDENTlDAD A. La distribuci6n de las bandas de peptidos caracteristicas corresponden con las de la preparaci6n de referenda del fabricante (SDS-PAGE 0 Western Blot). A. La prueba de actividad tambien puede ser utilizada como prueba de identidad.

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Menos de 3 UI en el volumen que contiene 100 UI de actividad de factor VIII. ACTIVIDAD. MPB 0420. La potencia estimada es del 80 al 125 % de Ia aetividad declarada. EI intervalo de confianza (IC ~ 0.95) no excede los limites del 80 al 120 %. de la actividad medida. HUMEDAD. MGA 0041. No mas de 3.0 %. OSMOLALIDAD. 240 mOsmollkg.

MGA

0621.

No

menos

de

pH. MGA 0701. Entre 6.5 y 7.5. CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y aceptados por la autoridad sanitaria. CONSERVACION. De acuerdo a 10 establecido en Ia etiqueta del producto y protegidos de la Iuz. ETIQUETADO: 1. Cantidad de factor VIIT expresada en Unidades Internacionales. 2. Concentraci6n de proteinas totales en la solucion final en gramos par mililitro. 3. Estabilizador utilizado. 4. La preparaci6n una vez reconstituida se aplica inmediatamente. 5. No usarse S1 no se reconstituye completamente. 6. E! contenido se usa s610 una vez. 7. Nombre y cantidad de sustancias afiadidas. 8. Tipo de diluyente y volumen usado para Ia reconstituci6n. 9. Lo establccido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos.

FACTOR VIII DE LA COAGULACI6N SANGUiNEA HUMANA RECOMBINANTE (ADNr)

Hemoderivados

FACTOR IX DE LA COAGULACION SANGUiNEA HUMANA 1I0FIlIZADO

2633

EI factor IX de Ia coagulaci6n es una fraccion proteica plasmatica que contiene ademas de este, otros faetores del complejo protrombinico (1I, VB Y Xl. Se prepara a partir de plasma que cumpla con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo.

La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriorrnente dichas sustancias y validar el proceso de purificacion, dernostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara Ia preparaci6n o interferencia en Ia prueba de titulacion de anti cuerpos.

FABRICACION

DESCRIPCION. El liofilizado es un polvo blanco 0 amarillo claro. Una vez reconstituido la solucion es incolora o ligeramente amarilla.

EI metoda de preparacion esta disefiado para mantener Ia integridad funcional del factor IX, para reducir a1 minima Ia activaci6n de cualquier factor de coagulacion y evitar Ia generacion de trombos. La actividad especifica es no menor de 50 UI de factor IX por miligramo de proteina total, antes de la adici6n de cualquier proteina estabilizadora. EI factor IX se disuelve en un liquido adecuado que puede contener heparina, antitrombina y otras sustandas auxiliares tales como un estabilizador. No se afiaden conservadores antimicrobianos. La solucion se pasa a traves de un tittro con tamafio de poro de 0.22 ~m; se envasa asepticamente en recipientes finales y se congela de inmediato, procediendo en seguida a Ia liofilizacion; se sella al vacio 0 con gas inerte. Consistencia del metodo de fabricacion. Se evalua por metodos analiticos aplicados durante el desarrollo del proceso que incluyen: Analisis de factor IX, detenninacion de factores de coagulacion activados, determinacion de actividades de factores II, VII y X que no exceden en total de 5 % de la actividad de factor IX. Producto tinal. Es un concentrado deshidratado, estable, esteril, derivado de mezcla de plasma de varios donantes. Se obtiene por purificacion mediante procesos diversos como Ia precipitaci6n, cromatografia por afinidad 0 cromatografia por inmunoafinidad (mediante anticuerpos monoclonales de origen murino), metodos que separan eficazmente el factor IX de los otros factores (II, VII Y X) que forman el complejo de Ia Protrombina limitando asi el poder trombogEmico potenciaL REQUISITOS DE V ALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluiran cua1quiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos de inactivacion validados. b) Uno 0 mas procesos de inactivacion y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, asi como bacterianos y parasitarios.

SOLUBIUDAD. Adieionar lentamente al produeto la cantidad de agua inyectable indicada en Ia etiqueta entre 20 y 25°C. Mezclar suavemente pOl' rotacion evitando Ia formaci6n de espuma. El producto se disuelve por completo en 10 min, formando una solucion incolora 0 ligeramente amarilla. Cuando se- mantiene entre 20 y 25°C, no presenta sefiales de eoagulaci6n hasta 3 h despues. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Da reaccion positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas humanas y reacci6n negativa a los antisueros especificos para proteinas plasmaticas de canejo, bovino y equino.

B. La prueba de Patencia es utilizada como prueba de identidad. ESTERILlDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cuando este validado el metodo de endotoxinas bacterianas. La preparaci6n a examinar contiene maximo 0,03 Ul de endotoxina por U nidad Interuacional de factor IX. Esta prueba puede ser reemplazada por Pirogenos PIROGENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyectar un volumen no menor de 50 Ul de factor IX por kilogramo de peso de conejo. Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. POTENCIA. MPB 0380. La potencia estimada es de 80 a 125 % de la poteneia establecida. El intervalo de confianza (IC ~ 0.95) de la potencia estimada es de 80 a 125 %. La potencia de Ia preparaci6n reconstituida, como se sefiala en la etiqueta, es mayor de 20 UI de faetor IX por mililitro. HEMAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B. MPB 0560. Disolver Ia muestra en agua inyectable. Diluir con SR de solucion salina para obtener una concentraci6n de 3 UI/mL de factor IX. El producto cumple si no muestra ag1utinacion en una dilucion 1:64.

FACTOR IX DE LA COAGULACION SANGuiNEA HUMANA LlOFILIZADO

2634

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

HUMEDAD. MGA 0041. No mas de 3.0 % No mas de 2.0 %.

0

MGA 0671.

4. 5.

PROTEINAS TOTALES. MPB 08400 MPB 0860. Determinar la cantidad de proteinas contenidas en el envase. Obtener una concentraci6n aproximada de 15 mg de proteina en 2.0 mL en un tuba para centrifuga, introducir 2.0 mL de esta solucion, anadir 2.0 mL de SR de molibdato de sodio al 7.5 % Y 2.0 mL de SR de acido sulffuico exento de nitrogeno, al 30 %. Agitar, centrifugar durante 5 min, decantar el sobrcnadante y dejar escurrir el tubo sobre papel filtro. Detenninar el contenido de nitrogeno presente en el precipitado y caleular la cantidad de proteinas multiplicando por 6.25. Para algunos productos con una proteina estabilizadora, como la albumina, este metoda no es aplicable. Se puede utilizar otro metodo validado por el fabricante para la detenninacion del producto de interes. OSMOLALIDAD. 240 mOsmol/kg.

MGA 0621.

No

menos

de

pH. MGA 0701. Entre 6.S y 7.5. Determinar en el producto reconstituido. HEPARINA. MPB 0580. Si se ha aiiadido heparina durante la preparaci6n, detenninar la cantidad mediante la valoraci6n de heparina en los concentrados de factores de coagulacion. La preparaci6n a examinar no contiene mas de la cantidad de heparina indicada en la etiqueta y en ningun caso mas de 0.5 UI de heparina por Unidad Internacional de factor IX. FACTORES DE COAGULACION ACTIVADOS. Si es necesario, diluir la preparaci6n a un contenido de 20 UI de factor IX por mililitro. Para cada una de las diluciones el tiempo de coagulacion no es menor de 150 s. CADUCIDAD. De aeuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabrieante y aceptados por la autoridad sanitaria. CONSERVACION. Entre 2 y 8 °C protegido de la luz. En los casos que el fabricante demuestre la estabilidad del producto ante la Autoridad Regulatoria a una temperatura no mayor de 30°C, con estudios correspondientes, podni conservarse a esta temperatura. ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se senalan al principio de este capitulo, indicar: I. Pais de procedencia del plasma. 2. Cantidad de factor IX expresada en Unidades Internacionales. 3. Concentracion de proteinas totales en la solucion final en miligramos por mililitro.

FIBRINOGENO HUMANO UOFIUZADO

6.

7.

8. 9.

Nombre y cantidad de sustancias adicionadas, inc1uyendo heparina si se utiliza. Nombre y volumen del Hquido usado para la reconstitucion. La leyenda: "el riesgo de transmision de agontes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se aplican hemoderivados". En los casos en que el almacenamiento se encuentre entre 9 y 30°C, indicar en forma especifica cualcs seran sus cuidados. Senalar protegido de la luz. Lo establecido en la norma oficial mexicana vigcnte para etiquetado de medicamentos.

FIBRINOGENO HUMANO UOFIUZADO El fibrinogeno humano contiene los constituycntes solubles del plasma humane y es transformado a fibrina cuando se Ie agrega trombina. Se obtiene par el fraccionamiento del plasma humano. EI producto final puede contener substancias auxiliares como sales, amortiguadores y estabilizadores. Se obtiene de una mezcla de plasma humano de varios donantes de sangre que cumpJe con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. Cuando se disuelve en el volumen indicado en la etiqueta, la solucion contiene no menos de 10 giL de fibrin6geno.

FABRICACION REQUISITOS DE V ALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos de inactivaci6n validados. b) Uno 0 mas procesos de inacti vaci6n y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, as! como bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y vaHdar el proccso de purificacion, demostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion que interfiera en la prueba de titulacion de anticuerpos. El metoda de preparacion permite obtener fibrinogeno con una actividad especifica, (contenido de fibrin6geno respecto al total del contenida de proteina) no menor a 80 %.

Hemoderivados

PRODUCTO TERMINADO DESCRIPCION. El liofilizado es un polvo blanco a amarillo claro 0 un solido friable. Una vez reconstituido la solucion es blanca opalescente. SOLUBILIDAD. Agregar al producto, el volumen de disolvente especiticado en la etiqueta. La preparaci6n se disuelve dentro de los 30 min entre 20 y 25 'C. formando una solucion casi incolora 0 ligeramente opalesccnte. ENSAYOS DE IDENTIDAD

2635

fibrin6geno, aplica antes de agregar el estabilizador. Tambien puede obtenerse Albumina, con Fibrin6geno durante el fraccionamiento; por 10 que se determina por un metodo inmunoquimico y la cantidad de Albumina detenninada, se resta del contenido de proteinas totales para obtencr la actividad cspecifica. B. Mczclar 0.2 mr.. . de la preparaci6n rcconstituida, con 2.0 mL de una solucion amortiguadora (pH entre 6.6 y 6.8) que contenga suticiente trombina (aproximadamente 3 VI/mL) y calcio (0.05 mollL). Mantener a 37 'C durante 20 min, separar cl precipitado por centrifugaci6n (3 500 rpm, durante 20 min). lavar completamente can SR de soluci6n salina. Determinar el contenido de nitrogeno por digestion can acido sulfurico (MPB 0840) Y ca1cular el contenido de fibrin6geno (proteina coagulable) multiplicando el resultado por 6.0. El contenido no es menor de 70 % y no mas de 130 % de Ia cantidad de fibrinogcno indicado en la etiqueta.

A. MPB 0600. Reconstituir el producto como 10 indique la ctiqueta, inmediatamente antes de su liSO. Se recomienda se reaticen las prucbas utilizando antisueros especificos a las proteinas del plasma de cada especie de animales domesticos, comimmente usados en la preparacion de productos biol6gicos originarios del pais de procedencia. E1 producto da reaccion positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas hurnanas y reaccion negativa a los antisueros especificos para proteinas plasrnaticas de otras especies.

ESTABILIDAD DE LA SOLUCION. Mantener la solucion a una temperatura entre 20 y 25 'c. Ninguua formacion de gel se presenta dentro de los 60 min, de rcconstituido c1 producto.

B. MPB 0480. La prueba de Fibrinogeno es utilizada como prueba de identidad.

CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y accptados por 1a autoridad sanitaria.

ESTERILIDAD. MeA 0381. cump1e los requisitos.

CONSERVACION. Entre 2 y 8 °C protegido de la luz.

Una

vez

reconstituido,

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MeA 0316. Cumple los requisitos. La preparaci6n contiene menos de 0.03 UE/mg de fibrinogeno. Esta prueba puede ser reemplazada por Pirogenos. PIROGENOS. MeA 0711. Cumple los requisitos. lnyectar por ki1ogramo de peso de conejo, un volumen de la preparacion reconstituida equivalente a no menos de 30 mg de iibrinogeno, calculado de la cantidad especificada en la etiqueta. Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. OSMOLAIUDAD. MeA 0621. La osmolaridad del producto reconstituido es no menos de 240 mOsm/L. pH. MeA 0701. Entre 6.5 y 7.5, del producto reconstituido.

ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de estc capitulo, indicara: I . Cantidad de fibrin6geno en el recipiente. 2. Cuando sea aplicable, la eantidad de proteina utilizada como estabilizador. 3. Lo establccido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos. 4. La leyenda: "el ricsgo de transmisi6n de agentes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se aptican hemoderivados". 5. Lo establecido en Ia norma oficial mexicana vigente para etiquctado de medicamentos. 6. Pais de procedelleia del plasma.

INMUNOGLOBUUNA HUMANA NORMAL

HUMEDAD. MeA 0041. No mas de 3.0 %. FIBRINOGENO. MPB 0480. El contenido no es menor de 70 'Yo y no mayor de 130 % de la cantidad de fibrinogeno indicada en la etiqueta.

La inmunoglobulina humana normal contiene principalmente inmunoglobulinas humanas tipo G (IgG). Este producto se fabrica para aplicacion intram'-lscular 0 subcutanea.

PROTEINAS TOTALES. MPB 0840 0 MPB 0860. A. Si se agrega a1 producto, Albumina humana como estabilizador, el requisito para la actividad especifica del

REQUISITOS DE V ALIDA CION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluira cua1quiera de las siguientes dos opciones:

INMUNOGLOBULINA HUMANA NORMAL

2636

Farmacopea de los Eslados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

a) b)

Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, asi como bacterianos y parasitarias. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, seni como minima del orden de 10 logaritmos. EI metoda de preparaci6n incluye la eliminaci6n de residuos de sustancias que se hayan emplcado para inactivaci6n 0 eliminaci6n de virus, para evitar residuos que pudieran estar presentes en el producto final y que pudieran caUSal' efectos adversos en pacientes tratados con estas preparaciones, 0 interferencia en la prucba de titulaci6n de anti cuerpos. TITULACION DE ANTICUERPOS. La soluci6n de inmunoglobulina a una concentracion de 160 giL contiene anticuerpos protectores contra un virus y una bacteria patogenos para humanos, titulados por un metoda cuantitativo en el cual se requieren preparaciones estandar de referencia. La prueba demuestra correlacion del titulo de anticuerpos con la respuesta protectora en human os. EI fabricante selecdona los agentes patogenos usados para la pmeba y eJ metodo dc titulaci6n apoyado por el estandar de referenda; ambos seran aceptados por la autoridad nacional de control. El metodo de titulacion podra ser sustituido por otro en que se haya demostrado satisfactoriamente con estudios de investigacion cientifica, y en comparacion con el estandar de referenda, Ulla correlacion con la proteccion y cumpla con 10 que se sefiala anteriormente en este parrafo. Se obtiene un incremento de 10 veces 0 mas en el titulo de dichos anticuerpos en el producto terminado, en comparacion con el que se obtuvo previamente en la mezcla de plasmas utilizados como materia prima para el fraccionamiento.

FABRICAcrON Se prepara a partir de plasma humano de donantes que cumplan con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan a1 principio de este capitulo. La preparacion puede contener soluciones estabalizadoras como: cloruro de sodio, glicina u otros.

PRODUCTO TERMINADO DESCRIPCION. EI producto liquido es transparente 0 ligeramente opalescente; incoloro 0 ligeramente amarillo. El liofilizado es un polvo 0 un s6lido poroso friable, de color blanco 0 amarillo patido.

antisueros especificos para proteinas plasmaticas de conejo, bovino yequino. B. MGA 0311. Inmunoelectroforesis. Usando un antisuero

contra suero humano normal, comparar un suero humano normal y la muestra, ambos diluidos a una concentracion de proteinas de 10 giL. El componente principal de la muestra corresponde a la fraccion de IgG del suero normal. La solucion de la muestra puede presentar pequefias cantidades de otras proteinas plasmaticas. SOLUBILIDAD. En el producto liofilizado, adicionar el volumen de disolvente indicado en 1a etiqueta. Mezc1ar suave mente por rotacion, evitando la formacion de espuma. EI producto se disuelve por completo en un tiempo maximo de 20 min, a una temperatura entre 20 y 25°C. ESTERILIDAD. MGA 0381. CumpJe los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La preparacion contiene no mas de 5.0 UI de endotoxina por mililitro. Esta prueba puede ser reemplazada por Pir6genos. PIROGENOS. MGA 071J. Cumple los requisitos. Inyectar j.O mLlkg de peso del conejo. Esta prueba pucde ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. AGREGADOS MOLECULARES. MPB 0100. La suma de monomeros y dimeros representa no menos del 85 % del area total del cromatograma y los polimeros y agregados representan no mas del 10 % del area total del cromatograma. En el cromatograma de 1a muestra obtenido por cromatografia de Hquidos de alta resoluci6n (CLAR), el pico principal corresponde a los monomeros de IgG y un pico correspondiente a los dimeros con un tiempo de retencion relativo con respecto a los monomeros de aproximadamente 0.85. Identificar los picos obtenidos en los cromatogramas de la muestra; cualquier pico que presente en un tiempo de retencion menor al de los dimeros corresponde a los poHmeros y agregados. HUMEDAD. MGA 0041. No mas del 3.0 % en el producto liofilizado. PROTEINAS TOTALES. MPB 0840 0 MPB 0860. EI contenido de proteinas no es menor de 10 % (m/v), ni mayor de J 8 % (rn/v) y queda comprendido entre el 90 y 11 0 % de 10 declarado en la etiqueta. Considerar en los calculos la eliminacion del nitr6geno no proteico contenido en algun estabilizador.

ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Da reaccion positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas humanas y reaccion negativa a los

INMUNOGLOBULINA HUMANA NORMAL

PUREZA ELECTROFORETICA. MPB 0880. No menos del 90 % de la cantidad de las proteinas son inmunoglobulinas.

Hemoderivados

PRESERVATIVOS. MPB 0920. No mas de 0.02 % (m/v), si el producto 10 contiene. pH. MGA 0701. Entre 5.0 y 7.2. Preparar una diluci6n del producto con SR de soluci6n salina para abtencr una concentraci6n a1 1.0 % de proteina. VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos, para la presentaci6n liquida. ANTI CUERPOS CONTRA EL ANT/GENO m: SUPERFICIE DEL VIRUS B DE LA HEPATITIS. No menos de 0.5 UIIg de inmunoglobulina. ANTICUERCUERPOS CONTRA EL VIRUS A DE LA HEPATITIS. No menos de 100 UIImL. Realizar esta prueba, s610 cuando se utilice para la profilaxis de hepatitis A. CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validadas por el fabrical1te y aceptados por la autoridad sanitaria. CONSERVACION. Entre 2 y 8°C. ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principia de este capitulo, indican): 1. Pais de procedencia del plasma. 2. Cantidad total de proteina. 3. Volumen. 4. Via de administraci6n. 5. Volumen y tipo de diluyente utilizado para la reconstitucion del producto liofilizado. 6. La leyenda: "el riesgo de transmisi6n de agentes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se aplican hemoderivados". 7. Contenido minima de anticuerpos expresado en Unidades Internacionales. 8. Que la preparaci6n se uti lice para la profilaxis de infecci6n par el virus A de la hepatitis, cuando aplique. 9. Lo establecido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos. 10. Temperatura en grados centigrados en que se conservan y en su caso recomendaciones para su almacenamiento.

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REQUIsnos DE VALlDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluiTtm cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones apEca a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, asi como bactenanos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. El metodo de preparaci6n incluye la eliminaci6n de residuos de sustancias que se hayan empleado para inactivaci6n 0 eliminacion de virus, para evitar residuos que pudieran estar presentes en el producto final y que pudieran causar efectos adversos en pacientes tratados con estas preparaciones, 0 interferencia en la prueba de titulaci6n de anti cuerpos. ACTIVlDAD COAGULANTE. El metoda de preparaci6n tambien incluye pasos que eliminan agentes productores de trombosis. Se requiere identificar factores de coagulacion, sus zim6genos y pasos del proceso que causan su activacion. Se tomara en cuenta a otros agcntes que favorecen la acdon coagulante del plasma. TlTULACION HE ANTICUERPOS. La soluci6n de inmanoglobulina a una concentraci6n de 50 gIL, contendra anticuerpos protectores contra un virus y una bacteria patogenos para humanos, titulados por un metoda cuantitativo en el cual se requieren preparaciones estandar de referencia. La prueba demuestra correlaci6n del titulo de anticuerpos con la respuesta protectora en humanos. El fabricante selecciona los agentes patogenos usados para la prueba y el metodo de tituladon apoyado por el estandar de referenda; ambos accptados por la autoridad nacional de control. El metodo de titulaci6n podni ser sustituido por otro en que se haya demostrado satisfactoriamente con estudios de investigaci6n cienHfica, y en comparaci6n con el estandar de referenda, una correlaci6n con la protecci6n y cumpla con 10 que se sefiala anteriormente en este parrafo. Sc obtiene un incremento de tres veces 0 mas en el titulo de dichos anticuerpos en el producto terminado, en comparaci6n con el que se obtuvo previamente en la mezc1a de plasmas utilizados como materia prima para el fraccionamiento. FABRICACION

INMUNOGLOBULINA HUMANA NORMAL ENDOVENOSA (IGHNE) La inmunoglobulina humana normal endovenosa contiene inmunoglobulinas humanas no modificadas, principalmente tipo G (IgG).

Se prepara a partir de plasma humano de donantcs que cumplan con los Requisitos de fa materia prima para efaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. El metodo de preparaci6n incluye la eliminaci6n de agentes procoagulantes. La preparacion puede contener soluciones estabilizadoras como la albumina humana.

INMUNOGLOBULINA HUMANA NORMAL ENDOVENOSA (IGHNE)

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

PRODUCTO TERMINADO DESCRIPCION. EI producto Iiquido es transparente 0 ligeramente opalescente, incoloro 0 ligeramente amarillo. El liofilizado es un polvo 0 un solido poroso friable, de color blanco 0 amarillo pulido. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Da reaccion positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas humanas y reaccion negativa a los antisueros especificos para proteinas plasmaticas de conejo, bovino yequino. B. MGA 0311, lnmunoelectroforesis. Usando un antisuero contra suero humano normal, comparar un suero humane normal y la muestra, ambos diluidos a una concentracion de proteinas al 1.0 %. El componente principal de la muestra corresponde a Ia fraccion de IgG del suero normal. La solucion de 1a muestra puede presentar pequefias cantidades de otras protein as plasmaticas. Cuando el producto contiene solucion de alburnina humana como estabilizadar, esta se observa como componente mayor de 1a preparaci6n, por 10 que dicha prueba se aplica antes de la adicion de Ia alburnina como estabilizador.

corresponde a los monomeros de IgG y un pico correspondiente a los dimeros con un tiempo de retencion relativo con respecto a los monomeros es de aproximadamente 0.85. Identificar los picos obtenidos en los cromatogramas de la muestra; cualquier pico que presente un tiempo de retencion menor al de los dimeros corresponde a los polimeros y agregados. La pmeba aplica antes de Ia adicion de Ia aIbLlmina como estabilizador. HEMAGLUTININAS ANTI-A Y ANTI-B. MPB 0560. Si e1 producto contiene mas de 30 giL de inmunoglobulinas, diluir la muestra hasta esta concentracion, antes de preparar las diluciones en las cuales se realiza Ia pmeba. El producto cumple si no muestra aglutinacion en una diluci6n (l :64). HUMEDAD. MGA 0041. No mas del 3.0 %. MGA 0671. No mas del 2.0 %. OSMOLALIDAD. 240 mOsmollkg.

MGA 0621.

No

menos

de

PROTEINAS TOTALES. MPB 0840 a MPB 0860. EI contenido de proteinas no es menor del 3 % y queda comprendido entre el 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta. Considerar en los calculos Ia eliminaci6n del nitrogeno no proteico contenido en algun estabilizador.

SOLUBILIDAD. En el producto Iiofilizado, adicionar el volumen de disolvente indicado en la etiqueta. MezcIar suavemente por rotaci6n evitando Ia formaci6n de espuma. El producto se disuelve por completo en un tiempo maximo de 30 min, a una temperatura entre 20 y 25°C.

ACTIVIDAD ANTICOMPLEMENTARIA (AAC) DE INMUNOGLOBULINA. MPB 0640. EI consumo de complemento no es mayor de 50 % (I CHso/mg de inmunoglobulina).

ESTERILIDAD. MGA 0381. Una vez reconstituido cumple los requisitos.

FUN CION Fe DE LA INMUNOGLOBULINA. MPB 0520. Cumple los requisitos.

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La preparacion contiene no mas de 0.5 UI de endotoxina por mililitro. En preparaciones que contengan menos del 5.0 % de proteinas y no mas de 1.0 UI de endotoxinas pOl' mililitro en preparaciones que contengan mas del 5.0 % y hasta 10 % de proteinas. Esta prueba puede ser reemplazada por Pir6genos.

ACTIVADOR DE PREKALIKREINA (APK). MPB 0820. No mas de 35 UIImL, calculado contra una preparaci6n de referencia que contiene 30 giL de inmuuoglobulina.

PIROG ENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyectar un volumen equivalente a 0.5 g de inmunoglobulina par kilogramo de peso corporal de conejo en no mas de 10 mL. Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas AGREGADOS MOLECULARES. MPB 0100. La suma de monomeros y dimeros representa no menos del 90 % del area total del cromatograma y los polimeros y agregados representan no mas del 3 % del area total del cromatograma. En el cromatograma de la muestra obtenido por cromatografia de liquidos de alta resoluci6n (CLAR), el pica principal

INMUNOGLOBULINA HUMANA NORMAL ENDOVENOSA (IGHNE)

pH. MGA 0701. Entre 4.0 y 7.4. Preparar una diluci6n del producto con SR de soluci6n salina para obtener una concentracion al 1.0 % de proteina. VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos, para la presentacion liquida. ANTIGENO DE SUPERFICIE DEL VIRUS B DE LA HEPATITIS. No menos de 0.5 UUdosis de inmunoglobulina. ANTI CUERPOS ANTI D. Cumple con el requisito de anti cuerpos anti D para la inmunoglobulina humana. INMUNOGLOBULlNA A. Que puede ser determinada por un metoda inmunoquimico validado por el fabricante. No excede el maximo declarado en Ia etiqueta.

Hemoderivados

ENDOTOXINAS BACTERlANAS. MGA 316. PlUeba validada por el productor. EI producto contiene menos de 0.5 UT de endotoxina POf mililitro para soluciones con un contenido de proteina de 50 giL Y menos de 1.0 UUmL, para soluciones con contenido de proteina mayores de 50 giL pem no mayores de 100 giL. Esta prueba puede ser reemplazada por Pir6genos. PIROGENOS. MGA 0711. Inyectar a cada conejo inyectar un volumen equivalente a 0.5 g de inmunoglobulina pero no mas de lO mL por kg de peso. Estu prucba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. CADUCIDAD. De aeuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y aceptados por Ia autoridad sanitaria. CONSERVACION. En el caso del producto Hquido, mantener en recipientes de vidrio, protegido de Ia luz y a Ia temperatura indicada en Ia etiqueta. Mantener el producto liofilizado en recipientes de vidrio incoloros, con vado 0 con un gas inerte, protegido de Ia luz y a una temperatura no mayor de 25°C. ETiQUETADO. Ademas de 10 estableeido en Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo, indicara: I. Pais de procedencia del plasma. 2. Cantidad total de proteina. 3. Volumen. 4. Via de administracion. 5. Volumen y tipo del diluyente utilizado para Ia reconstitucion del producto liofilizado. 6. La leyenda: "el riesgo de transmision de agentes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se apJican hemoderivados". 7. Contenido minImo de anticuerpos expresado en Unidades Internacionales. 8. Lo establecido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos. 9. Temperatura en grados centigrados en que se conserva y en su caso recomendaciones para su almacenamiento.

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que estan participando activamente en programas de inmunizacion especifica. Cumple con 10 especificado en la monografia de Inmunoglobulina humana normal. REQUISITOS DE VALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluira cualguiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. b) Uno 0 mas procesos de inactivacion y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualguiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envolhlra, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificacion, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a lID nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion o interferencia en la prueba de titulacion de anticuerpos. ETIQUETADO. Cumple con 10 indicado en Inmunoglobu!ina humana normal, con la siguiente adicion: 1. Potencia de inmunoglobulina humana especifica. 2. Contenido minima de anticuerpos expresado en Unidades Internacionales.

INMUNOGLOBUUNA HUMANA ANTI-I) La inmunoglobulina Anti-D que es una preparacion liquida 0 liofilizada que contiene inmunoglobulinas, principalmente inmunoglobulina G, que contiene anticuerpos especificos contra el antigeno D de los eritrocitos. El plasma cumple con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se seiialan al principio de este capitulo.

FABRICACION

INMUNOGLOBUUNAS HUMANAS ESPECiFICAS Es una preparacion de inmunoglobulina humana que se realiza a partir de plasma humano que cumpla con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. Los donantes de sangre se seleccionan por pruebas inmunologicas, determinando los titulos de los anticuerpos de interes. Comprobar que tiene inmunidad adquirida humoral par exposicion natural al antigeno en cuesti6n (0 de inten§s) 0

Se puede obtener del plasma de donantes con un titulo suficiente previamente adguirido de anticuerpos anti-D. Para asegurar el abasto de inmunoglobulina anti-D se puede obtener de donantes inmunizados con eritrocitos D-positivos que son compatibles en sus otros grupos sanguineos, para evitar la formacion de anticuerpos indeseables. Donantes de eritrocitos. Cumplen con los requerimientos prescritos en la monografia Plasma Humano para Fraccionamiento. Inmunizacion. La inmunizacion de donantes de plasma se lleva a cabo bajo supervisi6n medica. Las recomendaciones,

INMUNOGLOBULINAS HUMANAS ESPECiFICAS

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

incluyenda pruebas de Iaborataria se han formulado por Ia Organizaci6n Mundial de Ia Salud. Mezcla de plasma. A fin de limitar Ia biocarga de DNA del parvovirus B 19 en el plasma mezc1ado obtenido de varios donantes, sera validado usando tecnicas de amplificaci6n de acidos nuc1eicos, utilizandolO.O UI de virus B19 como control positivo DNA de parvovirus B. La prueba es invalida si el control positivo no es reactivo 0 si el resultado obtenido con el control interno indica Ia presencia de inhibidores. Si se afiade Inmunoglobulina Humana Normal 0 Solucion de Albumina Humana a la preparaci6n la mezc1a de donaciones de plasma de la que se obtuvieron cumplen con el requerimiento sefialado de parvovirus B 19. REQUISITOS DE V ALlDACION VIROLOGICA. En Sil proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para elirninar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y vaHdar el proceso de purificacion, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion 0 interferencia en la prueba de titulacion de anticuerpos.

PRODUCTO TERMINADO La Inmunoglobulina humana Anti-D cumple con los requisitos establecidos en la monografia de Inmunoglobulina humana normal, excepto para el contenido minimo de proteinas totales, con las adiciones siguientes: IDENTIDAD. La prueba de Palencia es utilizada como prueba de identidad.

ETiQUETADO. Ademas de 10 establecido en Ia monografia Inmunoglobulina humana normal, indicara el numero de Unidades Internacionales por envase.

INMUNOGLOBUUNA HUMANA CONTRA EL VIRUS A DE LA HEPATITIS Se prepara a partir de plasma humano que cumpla con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivadas, que se sefialan al principio de este capitulo. Contiene anticuerpos especificos contra el virus A de la hepatitis. REQUlSITOS DE VALlDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. b) Uno 0 mas procesos de inactivacion y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y vahdar el proceso de purificacion, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n o interferencia en la prueba de titulaci6n de anti cuerpos. La fnmunoglobulina humana contra el virus A de fa hepatitis, cumple con los requisitos establecidos en Ia monografia de Inmunoglobulina humana normal, excepto para el n6mero minimo de donantes y el contenido minima de proteinas totales con las adiciones siguientes: POTENCIA. Se determina par Ia comparaci6n del titulo de anticuerpos contra antigenos del virus A de la hepatitis, con una preparaci6n estandar 0 de referencia calibrada en Unidades lnternacionales, utilizando una prueba de inrnunoensayo validada por el fabricante y aprobada por la autoridad sanitaria. La potencia establecida es igual 0 mayor a 600 UIImL, rnientras que Ia potencia estimada no es menor que la potencia establecida. La potencia estimada en el intervalo de confiallza (IC ~ 0.95), no es menor del 80 % ni mayor del ] 25 %.

POTENCIA. MPB 0620. Cumple los requisilos. Metoda A. De I 500 01, equivalente a 300 ).lg en 1.5 mL 0 en 2.0 mL, segun presentacion. La potencia estimada es no menor del 90 % de Ia polen cia especificada en Ia etiqueta. EI intervalo de eonfianza (IC ~ 0.95) de Ia potencia estimada no es menor del 80 % ni mayor del 120 %. Puede utilizarse un metoda altemativo para determinacion de potencia si se obtlene una correlacion satisfactoria con los resultados del Metoda A.

PROTEiNAS. MPB 0840 0 MPB 0860. EI contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta.

PROTEiNAS. MPB 0840 0 MPB 0860. EI contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta.

ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Ia monogratia de Inmunoglobulina humana normal indicani el numero de Unidades Intemacionales por envase.

IDENTIDAD. La prueba de Patencia es utilizada como una prueba de actividad contra el virus A de Ia hepatitis.

INMUNOGLOBULINA HUMANA CONTRA EL VIRUS A DE LA HEPATITIS

Hemoderivados

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INMUNOGLOBULINA HUMANA CONTRA El VIRUS B DE LA HEPATITIS

INMUNOGLOBUUNA HUMANA ANTIRRAslCA

Se prepara a partir de plasma humane que cumpla con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan a1 principio de estc capitulo. La preparacion COl1tiene anti cuerpos especificos contra el vims B de la hepatitis.

La inmunoglobulina antirra.bica es una preparaci6n liquid a 0 liofilizada que contiene inmunoglobulinas, principalmente inrnunoglobulina G, que se aplica por via intramuscular y se prepara a partir de plasma de donantes inmunizados contra la rabia. EI plasma cumple con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. Cumple con los requisitos de la lnmunoglobulina humana normal.

REQUISITOS DE V ALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los hemoderivados incluiri cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 10garitmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posterionnente dichas sustancias y validar el proceso de purificaci6n, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se apl1cani la preparaci6n o interferencia en la prueba de titulaci6n de anticuerpos. La inmunoglobulina humana contra el virus B de hepatitis, cumple con los requisitos establecidos en la monografia de Inmunoglobulina humana normal excepto para el numero minimo de donantes y el contenido minima de proteinas totales, con las adiciones siguientes: IDENTIDAD. La prucba de Paten cia es utilizada como una prueba de identidad conlra el vims B de Ia hepatitis. POTENCIA. Se determina par Ia comparacion del titulo de anticuerpos contra antigenos de Ia hepatitis B, con una preparaci6n estandar 0 de referencia calibrada en Unidades Internacionales, utilizando una pnleba de inmunoensayo aprobada por Ia autoridad sanitaria y validada por el fabricante. La potencia establecida es igual 0 mayor a 100 UIImL. La potencia estimada no es menor que la potencia establecida. La potencia estimada en el intervalo de confianza (Ie ~ 0.95), no es menor del 80 % ni mayor del 125 %. PROTETNAS. MPB 0840 0 MPB 0860 EI contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta. ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Ia monografia de Inmunoglobulina humana normal, indicar el n6mero de Unidades Intemacionales por envase.

REQUISlTOS DE V ALlDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de el1minaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificaci6n, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en la prucba de titulaci6n de anti cuerpos.

PRODUCTO TERMINADO La lnmunoglobulina humana antirrabica cumple con todos los rcquisitos establecidos en la monografia de Inmunoglobulina humana normal, excepto para el contenido minimo de proteinas totales, con las adiciones siguientes:

ENSAYOS DE IDENTlDAD A. MPB 0600. Reacciona especificamente con antigenos del virus de la rabia. B. La prueba de Palencia es utilizada como prueba de identidad. Neutraliza el virus de la rabia, haci6ndolo inocuo para animales 0 c61ulas susceptibles.

POTENCIA. MPB 0660. La patencia establecida es igual 0 mayor alSO UI/mL y no superior al doble de Ia misma. EI intervalo de contianza (Ie ~ 0.95) queda comprendido entre el 80 y 120 %.

INMUNOGLOBULINA HUMANA CONTRA EL VIRUS B DE LA HEPATITIS

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

PROTEINAS. MPB 0840 0 MPB 0860. EI contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta. ETIQUETADO. Adem's de 10 establecido en la monografia de Inmunoglobulina humana normal, indicara el nLImero de Unidades Internacionales por envase.

INMUNOGLOBUUNA HUMANA ANTIRRUBEOLA La inmunoglobulina antirrubeola es una preparacion Hquida o liofilizada que contiene inmunoglobulinas, principalmente inmunoglobulina G, que se aplica por via. intramuscular y se prepara a partir de plasma de donantes inmunizados contra Ia rubeola. EI plasma cumple con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan a1 principio de este capitulo. REQUISITOS DE VALIDA CION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. b) Uno 0 mas procesos de inactivacion y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante cl proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplcan sllstancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificacion, demostrando que la conceniracion residua! de dichas sllstancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en !a prueba de titulacion de anticuerpos.

I'RODUCTO TERMINADO La inrnunoglobulina humana antirrubeola, cumple con todos los requisitos establecidos en Ia monografia de Inmunogfobulina humana normal excepto para el contenido minimo de proteinas totales con las adiciones siguientes:

POTENCIA. Se determina por la comparaci6n del titulo de anticuerpos contra antigenos del virus de la rubeola, con una preparacion estandar 0 de referencia calibrada en Unidades Internacionales, por una prueba de inhibicion de la hemaglutinacion validada. La potencia establecida es igual 0 mayor de 4 500 VI/mL. E! intervalo de confianza (IC ~ 0.95) queda comprendido entre el 50 y el 200 %. PROTEINAS. MPB 0840 0 MPB 0860. E! contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en Ia etiqueta. ETIQUETADO. Adem's de 10 establecido en la monografla de fnmunoglobulina humana normal, indicara el numero de Unidades lnternacionales por envase.

INMUNOGLOBUUNA HUMANA ANTISARAMPION Es una preparaci6n liquida 0 liofilizada que se obtiene a partir del plasma humano de donantes seleccionados que tienen anti cuerpos especificos contra el virus de sarampi6n y que cumple con los Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. REQUISITOS DE VALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos viraIes con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disrninuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificaci6n, demostrando que Ia concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en Ia prueba de titulaci6n de anticuerpos.

ENSAYOS DE IDENTIDAD

I'RODUCTO TERMINADO

A. MPB 0600. Reacciona especificamente con antigenos del virus de la rubeo lao

La inmunoglobulina humana antisarampi6n, cumple con todos los requisitos establecidos en la monografia de fnmunogfobulina humana normal, excepto para el numero minimo de donantes y el contenido minimo de proteinas totales con las siguientes adiciones:

B. La prueba de Palencia es utilizada como prueba de identidad.

INMUNOGLOBULINA HUMANA ANTIRRUBEOLA

Hemoderivados

ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Reacciona especificamente con antigenos del virus de Sarampion. B. La prueba de Palencia es uti1izada como prueba de identidad. POTENCIA. Se determina par 1a comparacion del titulo de anti cuerpos contra antigenos del virus de Sarampion, con una preparaci6n de referencia calibrada en Unidades Internacionales. La potencia estimada es igua1 0 mayor a 50 UI/mL de anti cuerpos neutralizantes para el virus del sarampi6n. La potencia es determinada por la neutralizaci6n de un virus de reto en un cultivo de celulas susceptibles a Ia infecci6n por el virus del sarampion evaluando simultaneamente a la muestra contra una preparacion estandar de referencia de suero antivirus del sarampi6n calibrada en Unidades Intenmcionales, Preparar diluciones al doble de la muestra y del estandar de referencia. A las diluciones anteriores agregar un volumen igual de una suspension de virus del sarampion que contenga 1 000 DlCC 50 /mL e incubar en ausencia de 1uz a 37°C durante 2 h. Colocar 0.2 mL de la mezcla anterior en al menos seis pozos en una microplaca que contenga las celulas e incubar durante al menos lO dias, Verificar los cultivos para comprobar la actividad viral y comparar la dilucion que dene la menor eantidad de inmunoglobulina, la eual neutraliza al vinls y comparar con la correspondiente dilueion de la preparaci6n de referencia,

PROTEINAS. MPB 0840 0 MPB 0860. E1 contenido de proteinas se eneuentra entre 90 y 110 % de 10 declarado en la etiqueta, ETIQVETADO. Ademas de 10 estab1ecido en 1a monogratIa de Inmunoglobulina humana normal, indicani el numero de Unidades Intemacionales pOl' envase,

INMUNOGlOBULINA HUMANA ANTIVARICElA Es una preparacion Hquida 0 liofilizada que se obtiene a partir del plasma humane de donantes seleccionados que tienen anticuerpos especificos contra el Herpes virus varicellae 0 virus herpes humane tipo 3 y que cumple con los Requisitos de La materia prima para eLabarar hemoderivadas, que se seiialan al principio de este capitulo. REQUISlTOS DE VALIDA CION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion.

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b)

Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios, La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minima del orden de 10 10garitmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posterionnente dichas sustancias y validar e1 proceso de purificaci6n, demostrando que la concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nive1 que no represente un riesgo para los pacientes a los que se apticani 1a preparaci6n 0 interferencia en la prueba de titulaci6n de anticuerpos. PRODVCTO TERMINADO La inmunoglobulina humana antivaricela, cumple con los requisitos establecidos en la monografia de Inmunoglobulina humana normal, excepto para el contenido minimo de proteinas totales, con las siguientes adiciones: ENSAYOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Reacciona especificamente con antigenos del virus de varicela zoster.

B. La prueba de Patencia es utilizada como prueba de identidad. POTENCIA. Se determina por un metoda de inmunoensayo, que permita Ia comparacion del titulo de anti cuerpos contra antigenos del virus varicela zoster con una preparaci6n de referencia calibrada en Unidades lnternacionales, utilizando una prueba de inmunoensayo aprobada por la autoridad sanitaria y validada por e1 fabricante. La potencia establecida es igua1 0 mayor a 100 VI/mL. E1 interva10 de confianza (IC ~ 0.95) queda comprendido entre e1 80 y e1 125 %. PROTEiNAS. MPB 0840 0 MPB 0860. El contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 1 J 0 % de 10 declarado en 1a etiqueta. ETlQUETADO. Ademas de 10 estab1ecido en la monografia de Inmunoglabulina human a normaL, indicara el numero de Unidades Internacionales por envase.

INMUNOGlOBUlINA HUMANA ANTITETANICA DESCRIPCION. La inmunoglobulina Antitetanica es una preparaci6n Hquida 0 liofilizada que contiene inmunoglobu1inas, principalmente inmunoglobulina G, que se aplica

INMUNOGLOBULINA HUMANA ANTIVARICELA

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undfJCima edicion.

por via intramuscular y se prepara a partir de plasma de donantes inmunizados contra el tetanos. EI plasma cumple con los Requisitos de fa materia prima para efaborar hemoderivados que se sefialan en la introduccion de este capitulo. La preparaci6n contiene las inmunoglobulinas humanas, antitoxinas especificas que tienen el poder de neutralizar la toxina formada por Clostridium telani. REQUISITOS DE VALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. CuaJquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar 01 proceso de purificacion, demostrando que la concentTaci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nive] que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n 0 interferencia en la prueba de titulacion de anticuerpos. PRODUCTO TERMINADO La inmunoglobulina hurnana antitetanica, cumple con los requisitos establecidos en Ia monografia de fnmunoglobulina humana normal, excepto para el contenido minima de proteinas totales, con las adiciones siguientes: ENSA YOS DE IDENTIDAD A. MPB 0600. Reacciona especificamente con antigenos de Clostridium tetani. B. La prueba de POlencia es utilizada como prueba de identidad. POTENCIA. MPB 0180. La potencia establecida es igual 0 mayor a 100 DI de antitoxina tetanica por mililitro. EI intervaiv de contianza (Ie ~ 0.95) queda comprendido entre el 80 y 125 %. PROTEINAS. MPB 0840 0 MPB 0860. EI contenido de proteinas se encuentra entre 90 y 110 % de 10 dedarado en la etiqueta. ETlQUETADO. Ademas de 10 establecido en la monografia de Inmunoglobulina humana normal, indicara el numero de Dnidades Internacionales por envase.

PLASMA CON CONTENIDO PARCIAL DE PROTEiNAS Y PROCOAGULANTES EI plasma con contenido parcial de proteinas y procoagulantes se obtiene de plasma fresco congelado que no ha sido conservado a la temperatura sefialada en la norma oficial mexicana NOM-253-SSAI-2012, Para la disposicion de sangre humana y ,sus componentes con fines terapeuticos vigente, 0 bien que no se ha congelado antes de seis u ocho horas (de acuerdo al anticoagulante) despues de su obtenci6n en cuyo caso se pierden los tactores Iabiles; 0 del plasma fresco congeJado del cual se ha separado el crioprecipitado en cuyo caso ademas de la marcada reducci6n de los factores labiles V y VIII de Ia coagulaci6n y de la concentracion de fibrin6geno, el contenido de inmunoglobulinas, albumina y demas factores de la coagulacion son los mismos que los contenidos en el plasma fresco congelado. Es obtenido de donantes clinicamente sanos que cnmplan con los requisitos en norma oficial mexicana NOM-2S3SSAl-2012, Para la disposicion de sangre humana y sus componenles can fines terapeuticos, tal como se indica en los Requisitos de La materia prima que se sefialan al principio de este capitulo. Nota: cumple con las especificaciones sefialadas en la monografia de Plasma fresco congelado.

ETIQUETADO Cada unidad de plasma cumple con 10 establecido norma oficial mexicana NOM-253-SSAI-2012, Para la disposicion de sangre humana y sus componentes con Jines terapeuticos vigente.

PLASMA FRESCO CONGELADO El plasma fresco congelado se obtiene por centrifugaci6n, por sedimentacion de unidades de sangre total 0 por procedimientos de aferesis, obtenida de donantes clinicamente sanos que cumplan con los requisitos que se establecen en Ia norma oficial mexicana NOM-253-SSA 1-2012, Para la disposicion de sangre humana y sus componentes con fines terapeuticos. Tal como se indica en Requisitos de la materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principia de este capitulo. Este producto s610 es utilizado como materia prima, no como producto terminado. El plasma fresco tlene proteinas (albumina e inmunoglo¥ bulina) y todos los procoagulantes, considerar como tal al que se separa de los eritrocitos dentro de las primcras seis horas de extraido y se coogela a una temperatura de 30°C bajo cero 0 menor en un lapso menor a una hora. Nota: 8i se e1aboran mezclas de plasma, debe ser del mismo tipo sangnineo ABO.

PLASMA CON CONTENIDO PARCIAL DE PROTEiNAS Y PROCOAGULANTES

Hemoderivados

Informacion que debe contener la etiqueta de cada unidad de plasma: 1. Nombre, domicilio y telMono del Banco de sangre 2. Numero tinieD de identificacion de la Unidad. 3. Fecha de extracci6n y caducidad indicando el dia el mes y 01 ano. 4. Grupo sanguineo ABO. 5. Contenido de la Unidad y volumen aproximado. 6. Temperatura en gradas centigrados en que se conserva, en su caso, recornendaciones para su almacenamiento. 7. Nombre del anticoagulante. 8. Resultado de pruebas de deteccion de agentes infecciosos lTansmisibles pOI transfusion. DESCRIPCION. Al descongelar el plasma presenta un color amarillo claro opalescente.

PLASMA HUMANO TRATADO POR INAC· TIVACION VIRAL El plasma humano, mczclado, lotificado y tratado par inactivacion viral, es un producto congclado 0 liofilizado, esteril y no-pirogenico. Despues de descongelar 0 reconstiluir el producto, se obtiene una saludon lista para transfundirse, siguiendo las especiticaciones de la norma oficial mexicana NOM-253SSAl-2012, Para fa disposicion de sangre humana y sus componentes confines terapeuticos, en su numeral ]4 (transfusion de unidades y reacciones adversas a la transfusion). El plasma utilizado se obtiene por centrifugacion 0 par procedimientos de aferesis, obtenida de donadores clinicamente sanos, que cumplan con los requisitos que se establecen en Ia NOM-253-SSAl-20l2, tal como se indica en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo. Las unidades de plasma que vayan a utilizarse para la elaboracion del producto, seran congeladas a una temperatura menor de 30°C bajo cero 0 menos, dentro de las primeras 6 h despues de la separacion de las celulas. Cada lote de proceso se prepara con una mezcla de unidades de plasma pertenecientes al mismo grupo sanguineo ABO. REQUISITOS DE V ALIDACION VIROLOCICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: c) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. d) Uno 0 mas procesos de inactivacion y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minima del orden de 10 logaritmos.

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Si se emplean sustancias para eliminar a inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y vaHdar el proceso de purificacion, demostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion 0 interferencia en la prueba de titulacion de anticuerpos.

PRODUCTO TERMINADO EI metodo de preparacion sera disefiado para minimizar la activacion de cualquier factor de coagulacion (para disminuir la posibilidad de trombogenieidad) e ineluir uno 0 varios procesos validados para la inactivacion de agentes infeccios05 conocidos; si durante la producci6n son utilizadas substancias para la inactivacion viral, sertm validarse los procesos de purificacion utilizados, para demostrar que la concentracion de dichas substancias en cl producto tinal ha sido reducido a niveles que no representen un riesgo para los pacientes a los que se les va a administrar. La solucion se filtra a traves de una membrana para eliminar bacterias, llenada en forma esteril en el recipiente final y sc congela inmediatamente; puede ser liofilizada posteriormente. DESCRIPCION. EI produeto despues de descongelarse, es un liquido claro 0 ligeramente opalescente, libre de particulas solidas a gelatinosas. El producto liofilizado es un polvo o solido quebradizo, de color blanco 0 amarillo claro. ENSAYOS DE IDENTIDAD A. ELECTROFORESIS. MGA 0311. Muestra las mismas bandas al compararlo con e1 plasma humane normaL B. Cumple con la pmeba para hemoaglutininas anti-A y anti-B.

SOLUBILIDAD DEL PRODUCTO LlOFILIZADO. Agregar al produeto el volumen de disolvente especificado en Ia etiqueta. La preparacion se disuelve durante los siguientes 30 min entre 20 y 25°C. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La preparacion contiene menos de 0.1 UIE/mL. Esta pmeba puede ser reemplazada par Pir6genos. PIROCENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyee!ar 3 mLlkg de peso de conejo. Esta prueba puede ser reemplazada par Endotoxinas bacterianas. HUMEDAD DEL PRODUCTO MGA 0041. No mas de 3.0 %.

LIOFILlZADO.

PLASMA HUMANO TRATADO POR INACTIVACI6N VIRAL

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Farmacopea de los Estados Unidos Mex/canos, undecima ed/ci6n.

OSMOLAUDAD. MGA 0621. El producto reconstituido 0 descongelado tiene no menos de 240 mOsmikg. PROTEINA TOTAL. MPS 0840 45 giL.

0

MPS 0860. Minimo

pH. MGA 0701. Entre 6.5 y 7.6.

Es un concentrado en fase Jiquida estable, esteril derivado de mezclas de plasmas de varios donantes de sangre. No se agregan conservadores al plasma usado. La ausencia de Pir6genos forma parte de los controles y la verificacion de uniformidad de cali dad de los 10tes, durante la producci6n para el control a granel purificado y granel final.

CITRATO. MGA 0811. No mas de 25 mmoliL. CALClO. MGA 0811. No mas de 5.0 mmoliL. POTASIO. MGA 0811. No mas de 5.0 mmoliL.

somo. MGA

0811. No mas de 2.0 x 102mmoliL.

FACTOR VIII. MPS 0420. Realizar la prueba para factor VIn de coagulacion, utilizando un plasma de referencia. La potencia estimada es de no menos de 0.5 UlimL. FACTOR V. La potencia estimada es no menos de 0.5 UIImL. FACTOR XI. La potencia estimada es no menos de 0.5 UI/mL. CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y aceptados por la Secretaria de Salud. CONSERVACION. El producto liquido congelado se mantiene a una temperatura de 30°C bajo cero 0 menos y el producto liofilizado entre 2 y 8°C. ETlQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo, indicani: 1. El grupo sanguineo ABO. 2. EI metoda usado para inactivaci6n viral.

SEllADORES DE FIBRINA Constituido esencialmente por dos elementos: componente j, concentrado de fibrin6geno, fracci6n proteica con fibrin6geno humane y el componente 2, preparaci6n con trombina humana. Este ultimo convierte al prirnero a fibrina despues de su reconstituci6n en presencia de iones de calcio. Contiene un antifibrinolitico como el acido tranexamico 0 acido epsilon aminocaproico u otro. Puede contener factor XIII de la coagulacion humana como estabilizador de la fibrina y albumina hmnana. No se requiere conservador. Una vez reconstituido el producto como 10 establece la etiqueta, el componente 1 contiene no menos de 40 giL de proteina coagulable; la actividad de la trombina varia dentro de un rango de 4 a 1 000 UI/mL. Se prepara a partir de plasma humano que cumpla con los Requisitos de fa materia prima para efaborar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo.

SELLADORES DE FIBRINA

FABRICACION REQUlSITOS DE V AUDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminacion validados. Cualq uiera de estas dos opciones aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emp1ean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificacion, demostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion 0 interferencia en la prueba de titulacion de anti cuerpos. Los componentes 0 mezclas de los mismos son pasados a traves de un filtro de retencion de bacterias y distribuidos asepticamente en contenedores esteriles. Los contenedores de los constituyentes liofilizados son envasados en condiciones de vacio 0 con atmosfera libre de oxigeno, puede utilizarse nitrogeno u otro gas inetie antes de cerrar el contenedor. En cualquiera de los casos, los contenedores son cerrados para excIuir microorganismos. Si en la formulacion del componente 1 esta incluido el factor XIII de la coagulacion humana en una concentracion igual 0 mayor de 10 UI/mL, se !leva a cabo el ensayo para factor XIII (MPS 0460). DESCRIPCION. Los componentes liofilizados son polvos 0 solidos higroscopicos de color blanco 0 ligeramente amarillo. Los constituyentes liquidos son incoloros 0 ligeramente amarillos. Para los componentes liofilizados, reconstituir inmediatamente antes de llevar a cabo los analisis, cxcepto para la prueba de solubilidad y humedad.

COMPONENTE 1. Concentrado de Fibrinogeno SOLUBILIDAD. Reconstituir elliolilizado con el volumen de diluyente indicado y a la temperatura que especifique la eliqueta del producto. EI concentrado se disuelve dentro de un periodo de 20 min formando una solucion incolora 0 ligeramente amarilla, transparente 0 ligeramente opalescente.

Hemoderivados

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ENSAYOS DE IDENTlDAD

I.DENTIDAD. La pmeba de Trombino es utilizada como prueba de identidad.

A. La prueba de Fibrin6geno es utilizada como prueba de identidad,

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos.

B. Cumple con los requisitos del ensayo de factor Xlll de la coagulaci6n humana cuando aplique (MPB 0460).

ESTERILlDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. POTENCIA FIBRINOCENO (Proteina coagulable). Utilice el metoda A 0 B. La protcina coagulable en miligramos estara entre 70 y 130 % de la cantidad indicada en la etiqueta. A. Proteina coagulable. MPB 0840. Mezclar 0.2 mL de la preparaci6n reconstituida con 2 mL de una soluci6n amortiguadora de pH entre 6.6 y 7.4 con suficiente SR de trombina humana 5 VI, hasta obtener aproximadamente 3 UlImL y calcio (0.05 mollL). Mantener a 37 'C durante 20 min, separar el precipitado por ccntrifugaci6n a 5 000 g por 20 min, lavar con SR de saludon salina y determinar las proteinas mediante el metodo KjeldahL Caleular c1 contenido proteico multiplicando el resultado par 6. B. Ensayo de coagulaci6n. Diluir la preparacion reconstituida con SR de saludon salina para obtener una concentraci6n de fibrinogeno entre 0.1 y 1.0 g/mL. Tomar 0.2 mL de la diluci6n, mantener a 37°C dLU-ante 60 s y aiiadir Ia cantidad suficiente de trombina humana grade reactivo, hasta obtener aproximadamente 20.0 UIImL, con un contenido de a1 menos 1.0 mmol/L de calcio. Determinar el tiempo de coagulaci6n mediante un metodo manual 0 automatizado. Repetir el procedimiento con a1 menos tres diluciones diferentes en el rango mencionado anteriormente con un estindar de fibrinogeno primario 0 secundario (plasma humano). El plasma humane esttmdar se calibra contra una mezcla de plasma fresco (> 100 donantes).

POTENCIA TROMBINA. La potencia estimada es no menDs del 80 % Y no mas del 125 % de la establecida en la ctiqueta. Diluir la preparaci6n a examinar con SR de soluci6n salina y albumina bovina 10 giL para obtener una concentraci6n de 4 a 10 UIImL de trombina. A 0.] mL de la dilueion agregar 0.9 mL de solucion de fibrinogeno, ealentado a 30 °c y comenzar a medir el tiempo de coagulacion inmediatamente. Repetir el proccdimiento con al menos tres diluciones y comparar con un estandar de trombina calibrado en Unidades Internacionales. Realizar una curva de calibraci6n en papel semilogaritmico utilizando los tiempos de coagulacion para las diluciones de Ia referencia y el contenido de unidades de trombina. La potencia estimada no es menor que la potencia establecida para cl producto. EI intervalo de confianza (IC ~ 0.95) de la potencia estimada no es menor que 80 % y no es mayor que 125 %. HUMEDAD. MGA. 0041. No mas de 3.0 % (m/v). MGA 0671. No mas de 2.0 % (m/v). pH. MGA 0701. Entre 5.0 y 8.0. CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados par el fabricante y aeeptados por la autoridad sanitaria, CONSERV ACION Segun indicaciones senaladas en la etiqueta. Almacenar en contenedores que protejan de Ia luz.

ESTABILlDAD. No hay formacion de gel despues de 120 min de su reconstituci6n.

ETIQUETADO. Ademas de 10 estableeido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se seiialan al principia de este capitulo, indicar:

HUMEDAD. MGA. 0041. No mas de 3.0 % (m/v). MGA 0671. No mas de 2.0 % (m/v).

2.

pH. MGA 0701. Entre 6.5 y 8.0.

1.

3.

COMPONENTE 2. Preparaeion de Trombina

4.

SOLUBILlDAD. Reconstituir el liofilizado con el volumen de diluyente indicado y a Ia temperatura que especifique el marbete del producto, El concentrado se disuelve dentro de un periodo de 5 min formando una solucion incolora, transparente 0 ligeramente opalescente.

5. 6. 7.

Pais de procedencia del plasma. Cantidad de fibrinogeno en miligramos de proteina coagulable par vial y trombina expresados en Unidades Internacionales. Cantidad de antifibrinolitico expresado e~ rniligramos por mililitro. Cantidad de cloruro de calcio expresado en micromol por litro. Contenido de factor XIII si es mayor a 10 UlimL. Nombre y volumen del diluyente para reconstituir los componentes, cuando aplique. Lo establecido en Ia norma oficial mexicana vigente para etiquctado de medicamentos.

SELLADORES DE FIBRINA

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Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

SOlUCION DE AlSUMINA HUMANA Se prepara a partir de plasma humano que cumpla con los Requisitos de fa materia prima para elaborar hemaderivadas, que se sefialan al principio de este capitulo. La obtenci6n de Ia Albumina se realiza bajo condiciones controladas, particularmente de pH, fuerza ionica y temperatura, a fin de que Ia pureza electroforctica de albumina en el producto final no sea menor del 95 % de Ia cantidad total de proteina. La soluci6n de albumina humana cs preparada como una solud6n concentrada conteniendo entre 20 y 25 % de proteinas totales, 0 como una soluci6n isot6nica que contenga de 3.5 y 5.0 % de proteinas totales. Puede agregarse un estabilizador contra los cfectos del calor, como el caprilato de sodio (octanato de sodio) 0 N- acetiltript6fano 0 una combinaci6n de ambos, no agregar conservadores antimicrobianos en ninguna etapa del proceso. La soluci6n es pasada a traves de un filtro capaz de retener bacterias y posteriormente se distribuye ascpticamente en contenedores esteriles que son tapados para prevenir la contaminaci6n. La so1uci6n en su envase final es calentada a 60 DC ± 1 DC Y mantenida a esta temperatura durante no menos de 10 h. Posterionnente los envases son incubados a una temperatura entre 30 y 32 DC durante no menos de 14 dias a una temperatura entre 20 y 25°C durante no menos de 4 scmanas, el examen visual de estos contenedores no presenta evidencias de contaminaci6n microbiana. REQUISlTOS DE VALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de produccion, todos los hemoderivados incluira cua1quiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivacion. b) Uno 0 mas proccsos de inactivacion y uno 0 mas proccsos de eliminadon validados. CuaJquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos viralcs con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminucion acumulada de particulas virales, durante el proceso, sera como minimo del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de produccion, es preciso eliminar posterionnente dichas sustancias y vaHdar el proceso de purificaci6n, demostrando que la concentracion residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparaci6n o que illterfiera en la prucba de titulaci6n de antieuerpos. DESCRIPCION. Es una soluci6n dara, ligeramente viscosa, amarillo claro, ambar 0 verde. IDENTIDAD. MGA 0311. InmunoelectroforesL,. La banda que se presenta en la soluci6n de la muestra, correspondcni a la banda de la soluci6n de referencia. ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos.

SOLUCION DE ALSUMINA HUMANA

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. Para soluciones con un contenido de proteinas menor de 5,0 %, no mas de 0.5 UE/mL; para soluciones con un contenido de proteinas mayor de 5.0 % pero no mayor de 20 %, no mas de 1.3 UE/mL; y para soluciones con un conteuido de proteinas hasta 25 %, no mas de 1.7 UE/mL. Esta prueba puede ser reemplazada por Pirogenos. PIROGENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. En 01 caso de una solucion entre 20 y 25 % de proteina, inyectar al conejo 5.0 mUkg de peso de Ia preparacion a examinar y para una soluci6n que contiene entre 3.5 y 5.0 % de proteina, inyectar 10 mUkg de peso. Esta prueba puede ser reemplazada pOl' Endotoxinas bacterianas. pH. MGA 0701. Entre 6.7 y 7.3. Diluir Ia preparacion a examinar con SR de solucion salina, hasta una concentraci6n de 1.0 % de proteinas.

VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. PUREZA EU~CTROFORtTlCA. MPB 0880. No menos del 95 % de la cantidad de las proteinas presentes, sera albumina. SODIO. MGA 0331. No mas de 160 mmollL, con limites de variacion entre 95 y 105 % del valor indicado en Ia ctiqueta, determinado por espectrofotometria de cmisi6n atomica can las siguientes modificadones: Obtener concentraciones finales de 10 ~lg/mL de sodio, tanto en Ia preparacion de referenda, como en la preparadon de ia muestra y determinar el porccntaje de transmitanda de ambas soluciones a 589 nm. Calcular Ia concentracion milimolar de sodio en la muestra por medio de la formula siguiente: 16C(T/S) Donde: C = Concentracion de Ia soluci6n de referenda. T = Porcentajc de transmitancia obtenido con Ia soludon de Ja muestra. S = Porcentaje de transmitancia obtenido can la soluci6n de referencia. POTASIO. MGA 0331. No mas de 0.050 mM/g de proteina. Empleando el metodo de espectrofotometria de emisi6n atomica can las siguientes modificaciones: Preparar concentraciones finales de 10 ~lg/mL de potasio, tanto en el estandar de referencia, como en 1a muestra y determinar el porcentaje de transmitancia de ambas soluciones a 766.5 nm. Calcular la concentracion milimolar de potasio en la muestra, por medio de Ia formula siguientc:

Hemoderivados

0.2 C (T/ S) Donde: C = Concentraci6n de la soluci6n de referencia. T = Porcentaje de transmitancia obtenido con la soiudon de la rnuestra. S = Porcentaje de transmitancia obtenido con la soluci6n de referenda. GRUPO HEME. MGA 0361. La absorbancia de una soluci6n diluida al l.0 % (rn/v) de proteina con SR de soluci6n salina, en llna celda de 1.0 em de paso de luz, a 403 nm, no mayor de 0.15. PROTEiNAS. MPB 0840 a MPB 0860. Cumple los requisitos. Los limites de variaci6n esUi.n entre 95 y 105 % de la cantidad indicada en la etiqueta. AGREGADOS MOLECULARES. MPB 0100. La suma de monorneros y dimcros representa no menDs del 95 % del area total del cromatograma y los polimeros y agrcgados representan no mas del 5 % del area total del cromatograma. ACTIV ADOR DE PREKALIKREINA (APK). MPB 0820. Maximo 35 UlimL. ALUMINIO. MGA 0086. No exeede de 200

~g!L.

ESTABILIDAD. Despues de calentar a 57 °C durante 50 h no habra precipitaci6n. CADUCIDAD. Hasta 36 meses, de acuerdo a estudios de estabilidad a diferentes temperaturas, validados par el fabricantc y aceptados por ia autoridad sanitaria. ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para efahorar hemoderivados, que se sefialan al principio de este capitulo, indicar: t. Pais de procedencia del plasma. 2. Volumen. 3. La leycnda: "e! riesgo de transmisi6n de agentes infecciosos no puede ser totalmcnte excluido, cuando se aplican hemoderivados". 4. Contenido de sodio expresado en miJimoles por litro. S. Concentraci6n de proteinas totales en la soluci6n final en gramos por mililitro. 6. Nombre y concentraci6n de cualquier sustancia anadida (par ejemplo, los estabilizadares etc.). 7. Lo establecido en la norma o:t1cial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos.

2649

SOlUCI6N DE PROTEiNAS PlASMATICAS Se prepara a partir de plasma humano que cumpla con los Requisitos de fa materia prima para elahorar hemoderivados, que se sefialan a1 principio de este capitulo. REQUlsrros DE VALIDACION VIROLOGICA. En su proceso de producci6n, todos los bemoderivados inc1uinln cualquiera de las siguientes dos opciones: a) Dos 0 mas procesos validados de inactivaci6n. b) Uno 0 mas procesos de inactivaci6n y uno 0 mas procesos de eliminaci6n validados. Cualquiera de estas dos opciones, aplica a agentes infecciosos virales con y sin envoltura, bacterianos y parasitarios. La disminuci6n acumulada de particulas viralcs, durante el proceso, sera como minima del orden de 10 logaritmos. Si se emplean sustancias para eliminar 0 inactivar virus durante el proceso de producci6n, es preciso eliminar posteriormente dichas sustancias y validar el proceso de purificaci6n, dernostrando que Ia concentraci6n residual de dichas sustancias se reduce a un nivel que no represente un riesgo para los pacientes a los que se aplicara la preparacion o que interfiera en Ia prueba de titulaci6n de anticuerpos. La solucion de proteinas plasmaticas es una solucion acuosa isot6nica de proteinas plasmaticas, que contiene albumina y globulinas estabilizadas en forma tal que rnantienen su solubilidad despues de recibir un calentamiento a una temperatura de 60°C durante 10 h. La separaci6n de proteinas se 1leva a cabo mediante condiciones controladas de pH, fuerza ionica y temperatura, en tal forma que el producto final contenga no menos del 8S % de albumina. La soluci6n de proteina plasmatica es una soluci6n isot6nica conteniendo de 4 as g de proteinas totales (p/v). Como estabilizador se utiliza caprilato de sodio. No se agregan conservadores antimicrobianos. La solucion se esteriliza pOT filtracion y se distribuye en su envase final. Los cuales son sometidos a 60°C durante 10 h. Los envases se incuban entre 30 y 32°C durante 14 dias y entre 20 y 2S °C durante al menos 4 semanas para examinarse visualmente y detectar alguna po sible contaminaci6n microbiana. DESCRIPCION. Liquido claro 0 ligoramente amarillo claro. Puede presentar un ligero scdimento que desaparece mediante agitacion. ENSA YO DE IDENTIDAD. MPB 0600. Da rcacci6n positiva a antisueros especificos para proteinas plasmaticas humanas y reacci6n negativa a los antisueros especificos para proteinas plasm{tticas de conejo, bovino yequino.

SOLUCION DE PROTEiNAS PLASMATICAS

2650

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion,

ESTERILIDAD. MGA 0381. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La preparaci6n contiene menos de 0.0] UIE/mL. Esta prueba puede ser reemplazada par Pir6genos. PIROGENOS. MGA 0711. Cumple los requisitos. Inyectar 3 mLlkg de peso de conejo. Esta prueba puede ser reemplazada par Endotoxinas bacterianas. pH. MGA 0701. Entre 6.7 y 7.3. Preparar una diluci6n del producto con SR de soluci6n salina para obtener una concentraci6n al 1.0 % de proteina. VARIACION DE VOLUMEN. MGA 0981. Cumple los requisitos. PUREZA ELECTROFORETICA. MPB 0880, Al menos el 85 % de las proteinas presentes son albumina y 15 % de globulinas. SODIO. MGA OSIl. No mas de 160 nmo!. Can las siguientes condiciones: obtener concentraciones finales de 10 mg/mL de sodio, tanto la preparaci6n de referencia como Ia preparaci6n de la muestra y determinar el porcentaje de transmitancia de ambas soluciones a la longitud de onda de 589 nm. Caleular Ia concentraci6n milimo1ar de sodio en la muestra por medio de Ia siguiente f6rmula: ]6C(T/S)

Donde: C = Concentracion de la solucion de referencia. T = Porcentaje de transmitancia obtenido con la solucion de Ia muestra. S = Porcentaje de transmitancia obtenido con Ia solucion de referencia. POTASIO. MGA 0811. No mas de 2 nmo!. Con las siguientes modificaciones: obtener concentraciones finales de 10 J.lg/mL de potasio tanto de la preparacion estandar de referencia, como de la preparacion de la muestra y determinar el porcentaje de transmitancia de ambas soluciones a Ia longitud de onda de 766.5 nm. Caleular la concentraci6n milimolar de potasio en la muestra, por medio de la formula siguiente: 0.2 C(T/S)

Donde: C = Concentraci6n de 1a soluci6n de referencia. T = Porcentaje de transmitancia obtenido con Ia soluci6n de Ia muestra.

S

=

Porcentaje de transmitancia obtenido con Ia soluci6n de referencia.

GRUPO HEME. MGA 0361. La absorbancia de una soluci6n diluida al 1.0 % (m/v) de proteina can SR de so1uci6n salina en una celda de 1.0 cm de paso de luz, a una longitud de onda de 403 nm, no excede de 0.25. Usar agua destilada como referencia. FOSFATASA ALCALINA. No mas de 0.1 Unidad Internacional por gramo de proteinas. Por un metodo validado por el fabricante. AGREGADOS MOLECULARES. MPB 0100. No menos de 10 % del total del nitrogeno presente en las fracciones combinadas esta asociado con proteina no retenida, PROTEINAS TOTALES. MPS 0840 a MPB 0860. Entre 4 y 5 % de proteinas totales de las cuales 85 % es albumina y 15 % otras proteinas (globulinas). ETIQUETADO. Ademas de 10 establecido en Requisitos de fa materia prima para elaborar hemoderivados, que se seiialan al principio de este capitulo, indicar: 1. Pais de procedencia del plasma. 2. Volumen. 3. La leyenda: Hel riesgo de transmisi6n de agentes infecciosos no puede ser totalmente excluido, cuando se aplican hemoderivados". 4. Contenido de sodio expresado en milimoles por Htro. 5. Concentraci6n de proteinas totales en Ia soluci6n final en gramos por mililitro. 6. Nombre y concentraci6n de cualquier sustancia aiiadida (por ejemplo, los estabilizadores etc.). 7. Lo establecido en la norma oficial mexicana vigente para etiquetado de medicamentos.

SOlUCIONES ANTICOAGUlANTES Y CONSERVADORASPARASANGRE Las soluciones anticoagulantes y conservadoras que se usan comunmente para el almacenamiento de sangre total 0 concentrado eritrocitario, contienen por 10 menos glucosa y una soluci6n reguladora de citratos a pH de 5.0 a 5.6. El contenido de citrato de sodio, glucosa 0 glucosa anhidra es no menos del 95 % y no mas del 105 % de la f6rmula descrita a continuacion. El contenido de acido citrico 0 acido citrico anhidro es no menos del 90 % y no mas del 110 % de la formula descrita a continuaci6n.

SOLUCIONES ANTICOAGULANTES Y CONSERVADORAS PARA SANGRE

Hemoder;vados

SOlUCION ACIDO, CITRATO Y DEXTROSA (ACD)

2651

SOlUCION CITRATO FOSFATO DEXTROSA (CPD)

SOLUCION ACD

SOLUCION CPD Formula

A

Citrato de sodio 22.0 g Acido citrico monohidratado 8.0 g 7.3 g o Acido citrico anhidro Glucosa 24.5 g 22.3 g o Glucosa anhidra Af:,'1la inyectable 1000.0 mL suficiente para Para cada 100 mL de sangre recolectada'se requieren 15.00 mL DESCRIPcrON. Liquido claro, incoloro amarillo.

Citrato tris6dico dihidratado

26.30 g

Acido citrico monohidratado

3,27 g

o Acido citrico anhidro

2.99 g

4.8 g

Glucosa

25,5 g

4.4 g

o Glucosa anhidra

B

13.2 g

23,2 9

14.7 g 13.4 g 1000.0 mL 25.0 mL 0

ligeramente

ESTERILTDAD. MGA 0381. Cump1e los requisitos.

Fosfato rnonobasico de sodio dihidratado Agua inyectable suficiente para Para cada 100 mL de sangre recolectada se requieren

CITRATO. MPB 0200. Cumple los requisitos.

SODIO. MGA 811. Cump1e los requisitos,

FOSFATO. MPB 0200, Cumple los requisitos,

AZUCARES REDUCTORES. MGA 0131. Cump1e los requisitos.

SO mo. MGA 811. Cumple los requisitos,

PIROCENOS. MGA 0711, Cump1e los requisitos, Inyeetar 10 mL de solucion diluida, can SR de solucion salina libre de pir6genos) que contenga aproximadamente 5 giL de eitrato de sodio, por kilogramo de peso del conejo, Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. pH. MGA 0701, Entre 4.5 y 5.0 CADUCIDAD. De acuerdo a estudios dc estabilidad validados por el fabricante y aceptados por Ia autoridad sanitaria. ETIQUETADO.Indicar': 1. Composici6n y volurnen de la soluci6n. 2. La vigencia de Ia sangre colectada es de 21 dias. 3. Condiciones de conservaci6n. Proteger de la luz. 4. Maxima y minima cantidad de sangre que se colecta en el recipiente pIastico desechable que contiene el anticoagulante. Lo establecido en Ia norma oficial rnexicana vigente para etiquetado de medicamentos

1000.0 mL 14.0 mL

OTROS REQUISITOS. Cumple los requisitos de Descripcion y Esterilidad) establecidos para Ia So lucian de itcido, citrato y dextra,a (ACD).

CITRATO. MPB 0220. Cumple los requisitos.

,ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cump1e los requisitos. La preparaci6n contiene menos de 5.56 UE/mL. Esta prueba puede ser reemplazada por Pirogenos.

2.51 g

AZUCARES REDUCTORES. MGA 0131. Cumple los requisitos. ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MGA 0316. Cumple los requisitos. La preparacion eontiene menos de 5.56 UE/mL. Esta prueba puede ser reemplazada por Pirogenos. PIROCENOS. MGA 0711, Cumple los requisitos. Inyectar 10 mL de solucion diluida, can SR de solucian salina libre de pir6genos, que contenga aproximadamente 5 giL de citrato de sodio, por kilogramo de peso del conejo, Esta prueba puede ser reemplazada por Endotoxinas bacterianas. pH. MGA 071)J. Entre 5,0 y 6,0 CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad validados por el fabricante y aceptados por Ia autoridad sanitaria. CONSERVACION. Proteger de la Iuz. ETIQUETADO. La establecido en Soluci6n addo. citrata y dextrasa (ACD).

SOLUCION ACIDO. CITRATO Y DEXTROSA (ACD)

2652

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

SOLUCION CITRATO FOSFATO DEXTROSA ADENINA (CPDA-1)

AZUCARES REDUCTORES. MeA 0131. Cumple los requisitos.

SOLucrON CPDA-l Citrato tris6dico dihidratado Acido citrico monohidratado Glucosa monohidratada Fosfato monobasico de sodio dihidratado

Adenina Agua inyectable suficiente para Para cada 100 mL de sangre rccolectada se requieren

ENDOTOXINAS BACTERIANAS. MeA 0316. Cumple 26.30 g 3.27 g 31.75 g

los requisitos. La preparacion contiene menos de 5.56 UE/mL Esta prueba puede ser reemplazada par Pirogenos.

2.51 g

PIROGENOS. MeA 0711. Curnple los requisitos. Inyectar 10 rnL de soluci6n diluida, con SR de soluci6n

0.275 g 1 000.0 mL 14.0 mL

OTROS REQUISITOS. Curnple los requisitos de Descripcion, Pirogenos y Esterilidad, establecidos para la Solucion de acido, citrato y dextrosa (A CD).

salina libre de pirogenos, que contenga aproximadamente 5 giL de citrato de sodio, por kilograrno de peso del conejo. Esta prueba puede ser reemplazada par Endotoxinas bacterianas.

pH. MeA 0701. Entre 5.0 y 6.0 CADUCIDAD. De acuerdo a estudios de estabilidad valida-

CITRA TO. MPB 0200. Cumple los requisitos.

dos par el fabricantc y aceptados par 1a autoridad sanitaria.

FOSFATO. MPB 0200. Curnplc los requisitos.

CONSERVACION. Proteger de la luz.

SODIO. MeA 811. Cumple los requisitos.

ETIQUETADO. La establecido en Soluci6n 6cido, citrato y dextrosa (AeD), excepto la vigencia que indicara: J. La vigencia de la sangre colectada es de 35 dias.

ADENINA. MPB 0060. Cumple los requisitos.

SOLUCION CITRATO FOSFATO DEXTROSAADENINA (CPDA·1)

ESTAD!STICA PARA ENSAYOS BIOl6GICOS

I. INTRODUCCION

2655

2. DEFINICIONES ......................................................................

2655

3. ASIGNACION AL AlAR .........................................................

2656

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL .......................................

2656

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL ........................................

2700

6. ESTIMACION DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS EN LA VACUNA BCG ..........................................

2723

7. COMBINACION DE POTENCIAS ESTIMADAS EN ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL .......................................

2727

TABLAS ESTADisTICAS ...............................................................

2729

Esladistica para ensayos bio/6gicos

2655

1. INTRODUCCI6N

2. DEFINICIONES

Los metodos bio16gicos se ernplean para cnsayar ciertas sustancias euya potencia no debe ser determinada por medias quirnicos 0 fisicos. El principio por aplicar, siempre que sea posible, sera el de cornparacion con una preparacion de referencia, con el fin de establecer cuanto de la muestra probada produce e1 mismo efecto bio16gico que una cantidad dada de la preparaei6n patron (la unidad). Es una eondiei6n esencial de tales metodos de ensayo biol6gico que las pnwbas con la preparacion de referencia y con la muestra euya potencia esta siendo detenninada, sean llevadas a efecto al mismo tiempo y en todos los atros aspectos, bajo condiciones estrictamente comparables.

Un ensayo biologico (0 bioensayo) es un procedimiento para estimar Ia naturaleza, constitucion 0 potencia de un material (0 de un proceso), por medio de la reaccion que sigue a su apticacion en la materia viva.

Cualquier estimaci6n de la potencia derivada de un ensayo biol6gico, esta sujeta a error aleatorio debido a la variabilidad de las respuestas, por 10 tanto de ser posible, se debera caleular el error de los resultados para cada ensayo. Con este proposito, se describen metodos para el disefio de las pruebas y para el ea!culo de los errores de las estimaciones de Ia potencia. Estos metodos dan cuenta de los errores aleatorios inherentes al ensayo, pero suponen que los errores sistematicos, e.g. errores al pesar 0 al diluir, no representan una fuente importante de variaci6n en Ia estimaci6n de Ia potencia. Pueden emplearse metodos alternativos de disefio 0 de calculo, siempre y cuando no sean menos confiables que los descritos. No es posible establecer con certeza limites precisos para Ia potencia estimada de una preparacion, con base en Ia evidencia de un ensayo biologico, a menos que se asigne un significado convencional a la palabra certeza. Para muchos propositos una confianza de 95 %, es en la practica, equivalente a certidumbre, y por 10 tanto, este nive1 de confianza ha sido usado en los calculos que aqui se dan. Las propias estimaciones del error estan sujetas a error apreciable, a menos que se basen en un numero muy grande de observaciones. Los calculos pueden nevar, por 10 tanto, a conclusiones falsas a menos que se tomen precauciones para evitar este hecho, como puede ser el caleulo de los limites de confianza. Los limites de confianza para Ia potencia, proporcionan una indicacion de ia precision con Ia que tal potencia se ha ca!culado en la prueba.

Nota: al final del capitulo se presenta la secci6n de tab las estadisti.cas identificadas y referenciadas con numeros anibigos.

Los ensayos biol6gicos se dividen en ensayos cual1tativos y ensayos cuantitativos. Los ensayos cualitativos, con los que se pretende, por ejemplo, identificar una sustancia por medio de una reaccion caracteristica producida en una especie particular de entidad biologica, raramente presentan dificultad en su analisis estadistico. Por su parte, los ensayos cuantitativos, son semejantes a los metodos de medicion fisica 0 de analisis quimico cuantitativo, en que conducen a una determinacion numerica de alguna propiedad del material (0 proceso) por ser ensayado. Cuando se dispone de un metodo quimico y uno biologico para el mismo proposito, no siempre la mejor precision del primero 10 haec preferible. Al ser el bioensayb especifieo y sensible, presenta las siguientes ventajas: 1)

EI principio activo no tiene que ser conocido.

2)

El material a ensayar no tiene que ser puro.

3)

Permite cuantificar cantidades principio activo.

muy pequefias del

EI prop6sito de un ensayo biologico cuantitativo, es determinar la concentraci6n de una sustancia S, en una preparacion P, midiendo la aetividad de P, en un sistema bio16gieo B. En un bioensayo es posible establecer dos puntos. 1)

S, es la sustancia sometida a ensayo; P, generaimente es una mezc1a de S y de otras sustancias que la acompafian, ya sea en forma natural 0 debido a un proceso de manufactura. Adicionalmente, P puede contener sustancias anadidas deliberadamente para llevarla a una forma y dilucion apropiadas para el bioensayo.

2)

La aplicacion de S a B origina un cambio en alguna caracteristica mensurable de S, donde Ia magnitud del eambio depende del eontenido de S en P.

Es muy importante que la respuesta sea definida sin ambigiiedad, y debe estar tan intimamente relacionada con el usa terap6utico del farmaco como sea posible. OcasionaImente, cuando Ia respuesta conduzca a un bioensayo con poca confiabilidad, es preferible utilizar una respuesta que, aunque no este tan relacionada con el uso terapeutico, permita una mayor conflabilidad.

1. INTRODUCCION

Lbbb

J-armacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

La caracterfstica distintiva de los ensayos biol6gicos cuanritarivos, es que la aplicacion de estimulos identicos a la materia viva, da Lugar a respuestas no necesariamente iguales. En un ensayo con un numero razonable de unidades de pmeba, no es posible describir sin enor 1a relacion dosisrespuesta, y consecuentemente, tampoco es posible evaluar sin enor 1a potencia del material a ser ensayado. Debido a la variabilidad inherente a las respuestas biologicas, es necesario recurrir a los metodos estadisticos para obtener 1a mejor estimaci6n de la potencia de un material, asi como la precisi6n de la estimaci6n. Entre los bioensayos cuantitativos pueden distinguirse ensayos directos y ensayos indirectos: EI ensayo directo consiste en definir previamente un efecto, y administrar a una unidad de prucba (unidad de ensayo) cantidades acumuladas del material, hasta encontrar la dosis a la cual sc presenta tal efecto. En la actualidad este tipo de ensayo es practicamente de interes academico, por 10 que su analisis estadistico no se describira. Debido a los problemas practicos que presenta el ensayo directo, como alternativa el analista puede usar los ensayos indirectos, en los que dosis predeterminadas se administran a un numero predeterminado de unidades de prueba, evaluando la respuesta. La respuesta biologica puede ser de dos tipos: I) Gradual. que es de canicter continuo y 2) Cuantal, todo 0 nada, que es de caracter nominal. Estos dos tipos de respuestas biologicas condicionan dos formas de relaciones dosis-respuesta, con tratamientos estadisticos diferentes, que se veran mas adelante. Para eliminar el error sistematico en la determinacion de la potencia de una preparacion, se hace necesario el usa de sustancias de referencia 0 patrones, con respecto a los cuales esta se esttma en forma relativa. Una preparacion patron contiene S a una concentracion conocida y constante. Esta preparaci6n se debe conservar bajo condiciones que preserven tanto como sea posible su actividad. EI uso de un patron usualmente conduce a la definicion de la unidad patron, como la actividad de una cierta cantidad del patron. La potencia del patr6n se expresa en unidades de peso 0 volumen 0 en unidades arbitrarias. Cualquier preparacion de pmeba M puede entonces ser ensayada contra el patron P, por ensayo simultaneo. Si P contiene 1 000 unidades par gramo y sucede que M contiene 100 unidades

3. ASIGNACI6N AL AZAR

por gramo, una dosis 10 veces x gramos de M, daria 1a misma respuesta que x gramos de P. La potencia, 0 mejor atm, potencia relativa de M, en terminos de P, se dice entonces que es de 1110, 0 equivalentemente, M tiene una potencia de 100 unidades por gramo.

3. ASIGNACION Al AZAR La asignacion de las unidades de pmeba (animales, tubos, etc.) a diferentes condiciones de ensayo debe efectuarse por algun proceso estrictamente aleatorio. Cualquier otra eleccion de condiciones de ensayo, que no se permiten deIiberadamente en e1 disefio experimental, debe tambien efectuarse al azar. Son ejemplos, 1a asignacion de Jas jaulas a las posiciones en un laboratorio y e1 orden en que se administran los tratamientos (combinacion dosis-preparacion). En particular, un grupo de animales que reciben 1a misma dosis de cua1quier preparacion no deben tratarse juntos (a1 mismo tiempo 0 en la misma posicion) a menos que haya fuerte evidencia de que la fuente de variacion (por ejemplo: entre tiempos 0 entre posiciones) es despreciable. EI analista debe protegerse contra la seleccion no aleatoria inconsciente de unidades de prueba para formar los gmpos, utilizando algun recurso como una tabla de numeros aleatorios (consultar un texto de estadistica).

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL 4.1 MODELOS ESTADiSTICOS Algunos de los bioensayos incluidos en esta Farmacopea, han sido concebidos como "ensayos de dilucion," 10 que significa que la preparacion muestra por ensayar, contiene el mismo componente activo que la preparacion patron, pero en una razon diferente de componentes activos 0 inertes. En tal caso, la preparaci6n muestra puede, en teoria, derivarse a partir de la preparacion patron por dilucion con componentes inertes (dilucion en este sentido incluye tambien el concentrar el principio activo en la muestra, al remover componentes inertes). Para verificar si un ensayo particUlar puede considerarse como un ensayo de dilucion, es necesario examinar los efectos de diluir las preparaciones, sobre la relacion dosisrespuesta debida al componente activo. Cuando el efecto de diluir las preparaciones sobre las relaciones dosis-respuesta en un ensayo, se desvia marcadamente del efecto de diluir el componente activo, este modelo no es valida para este ensayo en particular. Para modelar e1 efecto de dilucion en el modelo teorico, es litil transformar la relacion dosis-efecto a una relacion lineal. Para aplicar el modclo de lineas paralelas que se describe posteriormente es indispensable e1 cumplimiento de los siguientes requisitos:

Estadistica para ensayos biol6gicos

2657

Que los diferentes tratamlcntos se asignen al azar a las unidades de prueba. Que las respuestas a cada tratamiento se distribuyan nonnalmente. Que la desviaci6n estandar de la respuesta a cada tratamiento sea independientc de la media aritmetica de la respuesta.

paral01a a si misma. Para verificar si un ensayo cump1e con este modelo, debe satisfacer los siguientes requisitos:

Sc satisface la primera condici6n hacienda usa de 10 rccomendado en la secci6n 3.0. Cuanda se sospecha de desviaciones de la distribucion normal, debe disefiarse un ensayo con un llllmero de unidadcs de prucba suficientes, para poder emplear la prueba de Shapiro-Wilk, que se describe en la secci6n 4.7. Si se sospccha que la condici6n 3 no se cumple, se sugiere que se emplee la prucba de Hartley que requiere de al menos euatro unidades de prucba por tratamiento (consu1tar la secci6n 4.8). Cuando la condici6n 2 6 3, 0 ambas, no se cump1en, se sugiere el empleo de una transformaci6n de la respuesta para satisfacerlas. J

121 cumplimiento de los requisitos 1 y 2 se verifican a1 haeer e1 analisis de los datos. El requisito 1 s610 puede verificarse en ensayos en que se hayan utilizado al menos tres diluciones (dosis) de cada preparaci6n. La elecci6n de un ensayo con s610 dos diluciones de cada preparaci6n, debe apoyarse en estudios previos, que demuestren linealidad de la relaci6n log dosis-respuesta.

1) 2) 3)

E1 tipo de transformaci6n que se ha de aplicar a un bioensayo determinado, debe decidirse s610 al establecer el procedi-miento, y no cambiar esta transformaci6n, a menos que se demuestre que 01 no cumplimiento de los requisitos no es incidental, sino producto de un cambio sistematico en las condiciones. En este caso, el procedimiento preliminar debe ser reproducido, antes de que se adopte una nueva trans-formaci6n para los ensayos de rutina. 4.2 MODELO DE LiNEAS PARALELAS Este modelo se basa en una relaci6n Iineal entre la respuesta (y) y ellogaritmo de la dosis (x): y"'" a +bx

Dande: = Respuesta esperada. x ~ log dosis. a y b = Coeficientes de regresi6n.

1)

2)

Cuando se ha establecido la validez del ensayo, se estima Ia potencia relativa de laCs) muestra(s) con respecto a la del patr6n, pudiendosc expresar e1 resultado como una razon de potencias, 0 transfom13rse a las unidades apropiadas. Puedcn estimarse, ademas, limites de confianza de la potencia, a partir de cada conjunto de datos del onsayo. 4,3 mSENO DEL ENSA YO Con el fin de aplicar los analisis estadisticos que se describen posteriormente, es necesario imponer las siguientes restricciones al disefio del ensayo: 1)

2) 3)

y

Si la preparaci6n se diluye, cada valor de x en la rclaci6n, disminuye una cantidad igual al logaritmo del factor de diluci6n. Por ejemplo, si la preparaci6n se diluyera 1:2, Ia relaci6n se convertiria en: y

= a +b (x-Iog2)= (a-blog2 )+bx = a ' + bx

Ioda respuesta disminuye en una cantidad constante b log 2, es decir, la linea de regresi6n se despJaza hacia abajo,

Que la relaci6n entre el logaritmo (log a IOglO) de la dosis y 1a respuesta pueda ser representada par una linea recta, en el intervalo de dosis ensayadas. Para cualquicr muestra en e1 ensayo, la linea recta debe ser paralela a la del patron.

4)

Sc debe usar el mismo numero de dosis para cada preparaci6n en el ensayo. Se dan formulas para ensayos ados y tres dosis. La raz6n de dosis adyacentes debe ser constante (factor de diluei6n constante). Debe haber un ntnnero igual de unidades de prueba para cada tratamiento. Si llegara a perderse alguna respucsta, esta podria reemplazarse par un valor estimado pOl' los metodos que se describen en la secci6n 4.11. La asignaci6n de las unidades de prueba a los distintos tratamientos debe hacerse de acuerdo al diseno aplicado como se indica a continuaci6n.

4,3,] mSENO COMPLETAMENTE AL AZAR Si la totalidad de las unidades de prueba (animales, tubas, etc.) parecen ser razonablemente homogeneas, en cuanto a caracteristicas que, se suponga 0 sepa, pueden afectar la rospuesta, la asignaci6n de las unidades a los diferentes tratamientos debe hacerse completamente al azaL

En los cnsayos de respuesta cuantal, las condiciones 2 y 3 se aseguran mediante las transformaciones implicitas en cada procedimiento descrito.

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2658

Farmacapea de los Estados Unidas Mexicanas, undecima edici6n.

4,3.2 DISENOS QUE CONSIDERAN LA VARIABILlDAD INTRINSECA DE LAS UNlDADES DE PRUEBA 0 DE LAS CONDICIONES DE ENSAYO

patron y una preparaci6n muestra, ensayadas a dOB dosis (ensayo cruzado de dos dosts), 0 a tres dasis (ensayo cruzado de Ires dosis).

Cuando se sospecha que las respuestas de subgrupos de unidades de prucba difieren debido a caracteristicas propias de estas (peso, edad, lote de media de cultivo. etc.), 0 bien de las condiciones del ensayo (posicion de los tubos en la estufa de incubaci6n, hora del ensayo, etc.), pucde incrementarse la precisi6n de la estimaci6n de la potencia, introduciendo una 0 mas restricciones en la asignacion de las unidades a los tratamientos.

EI ensayo se realiza en dos etapas separadas por un intervale de tiempo apropiado. Las unidades se distribuyen aleatoriamente en gropos con un mismo numero de unidades de prueba, cuatro grupos S1 se ensayan dos dosis 0 seis grupos si se ensayan tres dosis de cada preparacion, y cada grupo recibe uno de los cuatro 0 seis tratamientos en la primera ocasi6n. En 1a segunda ocasion, las unidades que recibieron una preparacion (patron 0 muestra), reciben la otra preparacion, y las unidades que recibieron dosis bajas en la primera ocasi6n, reciben dosis altas en la segunda 0 viceversa. Para el caso de tres dosis, en los gnlpos que reciben las dosts intermedias, los tratamientos se cruzan s610 con respecto a la preparacion (patron 0 muestra).

4.3.2.1 DISENO EN BLOQUES AL AZAR En este disefio, es posible agrupar a Jas unidades de prueba con base en una fuente de variacion identificable (bloque), tal como la diferencia en sensibilidad entre camadas, 0 la variaci6n entre cajas de Petri en un ensayo rnicrobiologico de difusion en agar. El disefio requiere que cada tratamiento se aplique una vez por bloque (camada 0 caja de Petri). Gtros disefios admiten la posibilidad de aplicar dos 0 mas veces un tratamiento dentro de cada bloque. Estos disefios no se consideran en esta Farmacopea.

El procedimiento estadistico que pennite evaluar si un bioensayo satisface las condiciones del modelo de Uneas paralelas, es el amllisis de varianza. Con base en este analisis se determina:

4.3.2.2 DISENO EN CUADRADO LATINO

1)

Este disefio es apropiado cuando la respuesta es afectada por dos fuentes de variacion, que se puedan controlar durante el ensayo; por ejemplo: t x t posiciones, resultantes de t reng10nes y t columnas en un recipiente rectangular para un ensayo de antibioticos. Este disefio es util cuando el numero de condiciones de ensayo y/o caracteristicas propias de las unidades de prueba, son iguales al numero de tratamientos. Los tratamientos son asignados a las llilidades de prueba con base en un formato conocido con el nombre de cuadrado latina. La parte de la variacion de la respuesta debida a las t caracteristicas y/o t condiciones del ensayo es separada del error.

4.4 ANALISIS DE V ARIANZA

2)

Este procedimiento es aplicable a ensayos de dos y tres dosis, con un patron y una 0 dos muestras, en cualquiera de los disefios descritos anteriormente (disefios completamente al azar, disefios en bloques al azar, etc.), con la restriccion de que estos sean balanceados. Cuando se tenga el caso de valores perdidos, consultar la seccion 4.1]. PROCEDIMIENTO Codificar los tratamientos segUn la tabla I. dependiendo de si se trata de un ensayo ados dosis 0 a tres dosis, y deJ numero de preparaciones (un patron, una muestra 0 un patron, dos muestras). 2) Seleccionar el formato de registro de datos para el disefio y numero de tratamientos empleados, segun la tabla II. y efectuar los citlculos indieados (suma total, suma total de cuadrados y suma de los cuadrados de los totales). 3) Construir 1a matriz de totales de tratamientos y contrastes para el ensayo empleado, scgun la tabla III, y efeetuar los calculos indicados (totales y contrastes). 4) Construir la tabla de analisis de varianza para el disefio y nitmcro de tratamientos empleados (tabla IV), y 1)

En este capitulo se describen f6rmulas y un ejemplo de un cuadrado latino sin repcticion; se sugiere consultar a un estadistico cuando se requiera efectuar repeticiones del cuadrado latino. 4.3.2.3 DISENO CRUZADO Este disefio incrementa la precision, eliminando los efectos de las diferencias entre las unidades de prucba y balanceando los efcctos de la preparacion y las dosis. Uno de los casos mas simples consiste en aplicar s610 dos tratamientos a cada unidad de prueba, en dos ocasiones distintas para el mismo ensayo. S610 se consideraran los casos para una preparacion

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

Si la relacion entre la variable respuesta 0 llila trans forrnacion de esta y el logaritmo de la dosis, es de tipo lineal (en un bioensayo de tres dosis). Si existen dcsviaciones del paralelismo entre el patron y laCs) muestra(s), (ensayos ados y tres dosis).

Estadistica para ensayos biol6gicos

efectuar los caleulos indicados (grados de libertad, suma de cuadrados, cuadrados medios y raz6n de cuadrados medios F ), calc

5)

Determinar el valor critico de ]a raz6n de cuadrados (tabla 1) para cada fuente de variaci6n, medias F wi

exceptuando la del error, tomando en cuenta tanto los grados de libertad de la fuente de variaci6n respectiva (numerador) como los grados de libertad del error

2659

(denominador), y obtener la decision con base en Ia siguiente regIa. REGLA DE DECISION

Para establecer la regIa de decision sabre las fuentes de variacion respectivas para un cnsayo ados dasis 0 para un ensaya a tres dosis, referirse a la parte correspondicnte de la tabla V,

Tabla 1, Codificacion de tratamiento 1 patron, 1 muestra, 2 dosis

I patron~ 1 muestra~ 3 dosis

= patr6n a dosis baja P2 = patron a dosis alta m 1= muestra a dosis baja m 2 := muestra a dosis alta

PI

=

P2

=

patron a dosis baja patron a dosis intermedia P3 ~ patron a dosis alta m 1 = muestra a dosis baja m 2 = muestra a dosis intermedia m3 = patron a dosis alta

PI

1 patron, 2 muestras, 2 dosis

1 patron, 2 muestras, 3 dosis

PI = patron a dosis baja

PI

=

patron a dosis alta m] = mucstra uno a dosis baja m2= muestra uno a dasis alta Z1 = muestra dos a dosis baja Z2 = muestra dos a dosis alta

P2

=

P2

patron a dosis baja patron a dosis intermedia P3 = patron a dosis alta m 1 = muestra uno a dosis baja m2= muestra uno a dosis intermedia m3 = muestra uno a dosis alta ZI = muestra dos a dosis baja Z2 = muestra dos a dosis intermedia Z3 = muestra dos a dosis alta

=

TABLAS DE FORMATOS DE REGISTRO DE DATOS Tabla 11 A, Disefio completamente al azar ENSAYO A DOS DOSIS 1 patron, 1 muestra

Tratamientos____ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _-=::cc m,

___ . 1'r______~_ - - - - Totales:

PI

P2

Suma total:

NIl

+"'+Y n

Suma total de cuadrados: Suma de los cuadrados de los totales:

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2660

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undec;ma edic;6n.

Tabla

Disciio completamente al azar ENSAYO A DOS DOSIS

[J B.

1 patron, 2 muestras ----,-" ----,

- - - - -------, - - - - - "

Tratamientos

-----,,-----~,,--

"----"----~,

----------------

p,

y, -,

-----"----,------ ----------,----------.-,,---

Totales:

P,

------------,,-

---,,-----""-

M;

Z2

Suma total: _

Suma total de cuadrados:

2

2

2

-Y 1 +Y 2 +···+Y n =P,2 +p22 + ... +zi

Suma de los cuadrados de los totales:

Tabla fl C. Diseno en bloqucs al azar ENSA YO A DOS DOSIS 1 patron, 1 muestra

Tratamientos

Bloquc r;

r,

-----------

Totales

y,

. _r_L ______ , __ J...!::..

Totales

---""--------""----,--------

Pi y/

P;

----,,---..:..,,"----,,------.:,,___ ,____ y.1L,, ___ __,, __ ~_,,~ ____ _ P2 M/ M2

2:>

Suma total: Suma total de cuadrados: Suma de los cuadrados de los totales:

2

2

2

=Y, +Y 2 + ... +y, =p I2 +p2 +M2l+M2 2 ' 2 L.R2 =R,2 +Ri + ... +R,'

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

Estadistica para ensayos bi%gicos

2661

Tabla II D. Discno en bloques al azar ENSAYO A DOS DOSIS 1 patr6n, 2 muestras

Bloque

Tratarnientos -------------

1'1 r1 r2

YJ Y2

r,

,,:y!:~,,

Totales

P1

----

,,---"'--,-

Totales

----------

m1

1'2

Z,

ZJ

m2

RJ R2

P2

M,

M/

Suma total:

R,

y" Z2

Z/

-------

2>

LY=Y, +Y2 +"'+Y n

Suma total de cuadrados:

~

2

Lr

2

L.,Y

Suma de los cuadrados de los totales:

,,2

2

2

=Y, +Y 2 +···+Y"

=p,2 +P 22 + ... +Zf

LR2 =R,2 +Rf + ... +R,2

Tabla If E. Diseiio en cuadrado latina ENSAYO A DOS DOSIS 1 patron, 1 muestra

Bloques r, r2

rJ _'::4____ _

Totales

C2

p,(y,) m2(Y2) P2(Y3) .. I1l1.(YAL

C,

CJ

mbs) P'(Y6) m2(Y7)

P2(Y9) m,(YlO) P'(Yll) .. p.z(Y!l.... ... m2(Y',). C2

Totales:

Totales

C4

CJ

m,(Y13) h(V,,) m'(Y15) p,(Y,,)

R, R2 R3 R4

C4

:2>

MI =Y 4 +Ys +YIO +Y15

M

2

=Y 2 + Y 7 + Y 12 + Y 13

PI =YI +Y6 +Yll +Y 16

P2

=

Y 3 + Y 8 + Y 9 + Y 14

Suma total:

LY=Y, +Y2 +"'+Y'6

Suma total de cuadrados:

Ly2

Suma dc los cuadrados de los totales:

2

=y j +yi +"'+Y(6 2 )R =R21 +R22 +R23 +R24 k..J 2 "C =C J2 +C 22 +C 32 +C 42 L. "T' =M2 +M2 +p 2 +p 2

.L...

1212

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2662

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecfma edici6n.

Tabla II F. Disefio en cuadrado latino ENSAYO A DOS DOSIS 1 patron, 2 muestras

Bloques .,-. - - - - - - -

B10ques

--------

Totales

C4

C,

Co

z'(Y!3)

P,(YJ9)

rn,(y,,)

z,(y,,)

R,

P,(Ys)

rn'(Y'4)

Zl(Y,O)

P2(Y")

m'(Y3')

R2

m2(yj)

Z2(YO)

P,(Y15)

m'(Y2')

Z'(Y'7)

P'(Y33)

R3

r4

h(Y4)

m2(Y1O)

Z'(Y'6)

PI(Y22)

nJ'(Y28)

Z'(Y34)

R4

r,

z,(y,)

P'(Yll)

m2(Y17)

Z2(Y23)

P'(Y'9)

m,(YJ5)

R,

ro

m,(Y6)

z,(y,,)

P2(YIS)

nJ2(Y'4)

z,(YJo)

P,(Y30)

c,

C2

C3

r,

p,(y,)

m,(Y7)

r,

z,(y,)

r3

-------

Totales

C,

C,

C3

Totales:

C,

C4

Co

= Y I + Y 8 + Y 15 + Y 22 + Y 29 + Y 36

P,

P, =Y4 +Yl' +Y'8 +Y'9 +Y'6 +Y33

+ Y 7 + Y 14 + Y 21 + Y 28 + Y 3' M, = Y 3 + Y 10 + Y 17 + Y '4 + Y 25 + Y 3' 2 I = Y 5 + Y 12 + Y 13 + Y 20 + Y 27 + Y 34 22 = Y 2 + Y 9 + Y '6 + Y 23 + Y 30 + Y 31

M

I

=Y6

Suma total:

LY=Y,

Suma total de cuadrados:

"'22,2

+Y2

+···+Y 36 2

L.,Y =Y, +Y, +···+Y 36 'VR' =R'1 +R22 +···+R 62 L... 'VC' =C 2 +C' +···+C'

Suma de los cuadrados de los totales:

L...

I

2

6

LT' =P,' +p,2 +M,' +M~ +21' +2~ Tabla II G. Disefio completamente al azar ENSAYO A TRES DOSIS 1 patron, 1 muestra

Tratamientos -----~~.-,-,.

PJ

P2

P3

m}

y, y,

Totales:

y, -~Cc-" ___ ".,_,_,_, __ ~~_______ Yn _-'-P.J..,_ _ _..:P-,2_ _ _..:P-,3.....;_=.:.M:;;J...'_ _.....;M;:.;..'_ _-CM=3__

Sumatotal: Suma total de cuadrados: Suma de los cuadrados de los totales:

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

Ro ------------,,~"'.

LY=Y, +Y, +···+Y" 2'

,

=Y j +Y 2 +"·+Yn

LY

Estadistica para ensayos bio/6gicos

2663

Tabla II H. Disano eompletamente .1 azar ENSAYO A TRES DOSIS t patron, 2 rnuestras

Tratamientos Z3

YI

Y2

PI

Totales:

P2

P3

MI

M2

MJ

I>=y,

Suma total:

ZI

Z3

Z2

+ Y2 + ... +

y"

2 1... - +Y2 =Y,2 +Y2·

Suma total de cuadrados:

Ly2

Suma de los cuadrados de los totales:

L1'2 =p,2 +P22 + ... +Z~

n

Tabla II I. Diseno en bloques al azar ENSAYO A TRES DOS IS 1 patron, 1 muestra

Tratamientos

Bloque Pl

P2

Totales

PJ

mJ

Y1 Y2

rl r2

__ ,m!I__

_J1L.~

Totales

P,

Suma total:

LY=Y, +Y2 +···+Y"

SU111a total de cuadrados:

"'\:"'

Suma de los cuadrados de los totales:

LT2 =p,2 +Pi. + ... +Mi

L.,Y

2

2

2

2

=Y 1 +Y 2 + ... +y"

LR2 =R,2 +Rg + ... +R; Tabla II J. Diseno en bloques al azar ENSAYO A TRES DOS IS 1 patron, 2 muestras

Bloque

Tratamientos Pl

Totales

P3

Y1

Y2

. _r,______ ,_l1: Totales P,

Z2

Suma total: Suma total de cuadrados: Suma de los cuadrados de los totales:

",,222

2

L.,Y =Y, +Y 2 +···+Y" 2:T2 =p ,2 +P 2' + ... +Z~

2:R2 =R,2 +Rg + ... +R;

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2664

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Tabla II K. Disefio en cuadrado latino ENSAYO A TRES DOSIS 1 patr6n, 1 muestra

B10ques B10ques

c,

c,

-------~-~-

p,CYd m3CY') P,(y3) m2CY4) P2CY5) /1110'6)

m,cy,) p,CYs) m3CYO) P3CYlO) m2(Yll) P2(Yl2)

Totales

C,

C2

r, r2 r3 r4

r,

Totales:

Totales CJ

C,

C4

Co

m'CY'9) p,CY,o) m,cy,,) P'CY22) m3CY") ~m'CY'8)_ ~. P3(1'~4L~ C3 C4

R, m3CY3') P3CY'5) R, m'(Y'6) P3CY3') R3 m2CY33) P'CY27) m,CYn) R4 P'CY34) R5 m'CY35) P'CY29) m3CY30) ._~.~P1(,mL __ JI§ __ ~~

P, = Y, + Y

22

p'CYl3) m'CY'4) P,cy,,) m3CY'6) P'CY17)

8

+y

'5

C5

+Y

Co

+ Y '9 + Y 36

P 2 =Ys +Y12 +Y 13 +Y20 +Y27 +Y34 P 3 = Y 3 + Y 10 + Y M

1 =

Y

6

17

+ Y 24 + Y 25 + Y 32

+ Y, + Y 14 + Y 2' + Y 28 + Y 35

M2 =Y 4 +Y11 +Y18 +Y'9 +Y26 +Y33 SUlla total:

M3 =Y2 +Yo +Y 16 +Y23 +Y30 +Y3' LY=Y, +Y2 +···+Y36 2

2

2

Suma total de cuadrados:

",2

Suma de los cuadrados de los totales:

LR2 =R 12 +Ri + ... +R~

L..Y

=Y 1 +Y 2 +···+Y 36

2 =C' +C 2 +···+C 2 "'C L.i 1 2 6 2 "'T2 =p1 +p' +p' +M21 +M'2 +M23 L.i 2 3

4~

ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

I>

Estadistiea para ensayos bio/6gieos

2665

Tabla If 1. Diseno en cuadrado latino ENSAYO A TRES DOSIS 1 patr6n, 2 muestras

Bloques

Bloques

~

..

~---

-,,~,~

Totales

C,

C2

C]

C4

C,

CG

C7

Cg

Co

r,

p{Yl)

m,(YlO)

Zl(Y,9)

p,(y,s)

m'(YJ7)

Z2(Y40)

P3(YSS)

m3(Y64)

Z3(Y73)

R,

r2

Z3(Y2)

P,(Y,,)

m,(Y20)

Zl(Y'9)

P,(Y38)

m'(Y47)

Z'(Y'6)

P3(Y6')

m3(Y74)

R,

r3

m3(Y3)

Z3(Y,')

P,(Y,,)

mJ0'30)

Zl(Y39)

P,(Y4S)

m,(Y'7)

z,lv,,)

P3(Y75)

R3

r4

P3(Y4)

m3(Ynl

Z3(Y22)

P1()']1)

m,(Y40)

Zl(Y49)

P,(Y'8)

m2(Y67)

Z2(Y76)

R4

r,

z,(y,)

P3(Y,4)

m3(Y23)

Z3(Y32)

P1(Y41)

m,(Y,O)

Zl(Y'9)

P'(Y68)

m2(Yn)

R,

r6

m,(Yo)

Z,(y,,)

P3(Y'4)

m3(Y33)

23(Y42)

P,(Y,,)

m,(Y60)

z,lv69)

P,(Y78)

R6

r7

P2(Y7)

m,(Y16)

Z2(Y")

P3(Y34)

m3(Y43)

Z3(Y52)

P1(Y61)

m,(Y70)

Zl(Y79)

R7

r,

21(Y8)

P2(Y17)

m20'26)

Z2(Y35)

P3(Y44)

m3(Y'3)

Z3(Y62)

P1(Y71)

m,(ygO)

Rs

m,(Y,)

Zl(Y18)

P,(Y27)

m'(Y36)

Z'(Y4')

P3(Y54)

m3(Y63)

Z3(Y72)

P1(YS1)

R9

r9 , ______

'm~"

Totales

_ _ _ _ _' ' ' _ .. _ _ _ _ _ , , _

C,

~

..

~~---~,,-,---~~--

---,------,~-,,-----,,--

C,

Totales:

C,

C3

Cs

C7

C9

PI

=YI

P2

= Y 7 + Y 17 + Y 27 + y '8 + Y 38 + Y 48 + Y 58 + Y 68 + Y 78

P3

=Y 4

M

1

M

2

M

3

+YII

+Y21 +Y31 +Y 41 +Y51

~--~,,---

+Y61

I>

+Y 71 +Y81

Y 44 + Y 54 + Y 55 + Y 65 + Y 75 = Y 9 + Y 10 + Y 20 + Y 30 + Y 40 + Y 50 + Y 60 + Y 70 + Y 80 = Y 6 + Y 16 + Y 26 + Y 36 + Y 37 + Y 47 + Y 57 + Y 67 + Y 77 = Y 3 + Y 13 + Y 23 + Y 33 + Y 43 + Y 53 + Y 63 + Y 64 + Y 74 +

Y 14

+

Y 24

+

Y 34

+

ZI =Ys +Y 18 +Y19 +Y29 +Y39 +Y49 +Y59 +Y69 +Y79

Z 2 = Y 5 + Y 15 + Y 25 + Y 35 + Y 45 + Y 46 + Y 56 + Y 66 + Y 76 Z 3 = Y, + Y 12 + Y 22 Suma total: Suma total de cuadrados: Surna de los cuadrados de los totales:

+

Y 32 + Y 42 + Y 52 + Y 62 + Y 72 + Y 73

I>=YI +Y2 +"'+Y81 "",222

2

L.,Y =Y , +Y 2 +"'+Y81 2 '" L.t R' =R' 1 +R' 2 + .. ·+R 9 "'C' =C 2 +C' + .. ·+c' L..

1

2

9

"'T2 =p2 +p' +p2 +M21 +M22 +M23 +Z,1 +Z,2 +Z23 L.t 1 2 3

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

I,

I

2666

Farmacopea de los Estados Unidos Mex;canos, undecima edici6n.

Tabla III A. Matriz de totales de tratamientos y contrastes ENSAYO A DOS DOSIS 1 patr6n, 1 muestra 1 patr6n, 2 muestras

Patron p

Muestra m

Muestra z

Totales de dosis baja

~

M/

Zj

Totales de dosis alta

P,

M,

Z2

Totales

P=~+P,

M=M j +M2

Z =Zj +Z2

Contraste lineal

Lp =p,-~

Lm =M2 -Mj

L,=Z,-Zj

Tabla III B. Matriz de totales de tratamientos y contrastes ENSAYO A TRES DOSIS 1 patr6n, 1muestra

1 patron, 2 muestras Patron p

Muestra m

Muestra z

Totales de dosis baja

P,

Mj

Zj

Totales de dosis intermedia

P,

Z2

Totales de dosis alta

P,

M2 MJ

P=~+P,+P,

M=M j +M2 +MJ

Z =Zj +Z2 +Z3

Lp =P,-P,

Lm =M3- M j

L, =Z3 -Zj

Cp = P, -2P' +P,

Cm =Mj -2M,+M3

C, = Zj-2Z2 +Z3

Totales Contraste Lineal Contraste cuadnitico

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

ZJ

Estadistiea para ensayos bi%gieos

2667

Tabla IV A. Analisis de varianza ENSAYO A DOS DOSIS 1 patron, 1 muestra

Fuente de

Grados de

variaci6n

libertad

p2 +M2

Preparaciones

SC p

Regresi6n lineal

medios

CM,=SC,

4r

L2 +L2 m p SCn

2r

CM, CMe

-SCr

SC , (I)

Error

Fca1c

(L> )2

2r n (Lp+Lm)2

SC,

No paralelismo

Cuadrados

Suma de cuadrados

CM,

(1) Los

gradas de libcrtad del error (gle) Y la suma de cuadrados del error(SCe) dependen del tipo de disefio empleado: disefio completarnente al azar (DCA), disefio en bloques al azar (DBA) 0 disefio en cuadrado latina (DeL).

Disefto

gle

SCe

DCA

4(r-l)

SCe =

DBA

3(r-l)

SC,

=

2/2 2>2 ---r 2:;T 2 2:;R 2 (2:;y)2

2:>2 - - -r - - - -4- +

n

I/2 I.R2 I.C (I.y)2 2>2 - - -4 - - - -4- - - -4- + 8 2

DCL

6

SCe =

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2668

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n

Tabla IV B. Anahsis de varianza ENSAYO A DOS DOSIS 1 patron, 2 muestras Fuente de variaci6n Preparaciones

Grados de libertad

se

2

No paralelismo

sen

2

=-----2r

(L

p

n

+Lm +L,

6r L2 +L2 +L2 p m " 2r

)2

Sec

SC (1)

ElTor

(1)

p2 +M' +Z,

p

sec

Regresion lineal

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

e

Los grados de libertad del error (gle) Y la suma de cuadrados del error (See) dependen del tipo de disefio empleado: disefio completamente al azar (DCA), disefio en bloques al azar (DBA) 0 disefio en cuadrado latino (DCL).

Diseno

gl,

DCA

6(r-l)

SC~

L;T' See =L:>2 ---r

DBA

DCL

5(r-1)

20

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

See =2>2 sec =L;y'

LT'

LR2 (LY)'

--------+ 6

r

n

L;T2 L;R2 L;e 2 (L;y)'

----------+ 6

6

6

18

Estadistica para ensayas bia/ogicas

2669

Tabla IV C. Amllisis de varianza ENSAYO A TRES DOSIS 1 patr6n, 1 rnuestra Fuente de variacion

Grados de Iibertad

SC p =

Preparaciones

SC"

No paralelismo

(:~:> )2

3r

n

2r (C p +C m

SCn

Diferencia en la regresion cuadnitica

SCd, 1(1)

gn

SCn

CM p =SC p

)2

CM" =SC

4r L2 +L2 m p

SC,

Regresion Cuadratica

Error

p2 +M2

(L p +Lm

Regresi6n lineal

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

"

"

)2

n

CM, =SC n CM

SCn

(1 )

d,

CM,

CM, eMn

CM =SC

SC"

I2r C p2 +C m2 6r

CM"

=SC dn

CM, CM, CM

n

CM d, CM,

SCn gl,

(1) Los grados de libertad del error (gfe) Y 1a surna de cuadrados del error (SCe) dependen del tipo de disefio empleado: diseiio pletamente al azar (DCA), disefio en bloques al azar (DBA) 0 disefio en cuadrado latino (DeL).

Disefio

gle

DCA

6(r-l)

DBA

5(r-l)

DCL

20

COill-

SCn SC,

:L/2 =:L>2 --r

L;T 2 L;R 2 (L;y)2 SC, = :L>2 - - - - - - - - + r 6 n L;T2 L;R 2 L;c 2 (L;y)2 SC,=L;y2 - - - - - - - - - - - - + 6

6

6

18

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2670

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Tabla IV D. Analisis de varianza ENSAYO A TRES DOSIS 1 patron, 2 muestras

Fuente de variaci6n

Grados de tibertad

p' +M2 +Z, Preparaciones

SC p

2

No paralelisrno

SC, 2

SCn

Regresi6n cuadnitica Diferencia en la regresion cuadratica

2

6r +L' L'p m +L2, 2r

(C p +C m +C p 18r C'p +C' +C' m'

SCd,

I (1) ge

Error (I)

SC ,

SCe

CI> )2

6r

CMp

n

3r

(L p + L m +L,

Regresion lineal

Cuadrado. medios

Suma de cuadrados

)'

SC p 2

CM, =SC,

CMn

SC,

)'

CM d,

(1 )

CMe

CM,

SCn

CM , CM n

2

CM ,

CM, =SC ,

SC,

Fcalc

CM, CM ,

SCd,

CM d,

2 SCe

CM ,

gl,

Los grados de libertad del error (gle) Y la suma de cuadrados del error (See) dependen del tipo de diseiio empleado: diseiio completamente al azar (DCA), diseiio en bloques al azar (DBA) 0 diseiio en cuadrado latino (DCL).

Disefio

g/,

DCA

9(r-l)

DBA

8(r-l)

DCL

56

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

SCe LT2 SCe = L>2 ---r LT' LR2 LR' (Ly)2 SC, = LY' - - -r - - - -9- - - -9- + n LT' LR2 LC' (LY)' SC,=LY' - - -9 - - - -9- - - -9- + 40.5

Estadistiea para ensayos bio/6gleos

2671

Tabla VA. RegIa de decision ENSAYO A DOS DOSIS I patron, I muestra 1 patron, 2 muestras

.Fuente de variaci6n

RegIa de decision

Regresi6n lineal

Ellogaritmo de la dosis tiene efeeto lineal sabre la respuesta. Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto lineal sabre la respuesta. Las rectas log dosis-respuesta no son paralelas.

No paralelismo

- -

Las rectas log dosis-respuesta son paralelas.

Tabla V B. RegIa de decision ENSAYO A TRES DOSIS 1 patr6n, 1 muestra ] patron, 2 muestras

Fuente de variacion Regresi6n lineal

RegIa de decision Si F eale

~ Flab

Ellogaritmo de In dosis tiene cfecto lineal sobre la respuesta.

Si Feale < Ftab

Ellogaritmo de III dosis no tiene cfecto lineal sabre In respuesta.

Si

Las rectas log dosis-respuesta no son paralelas.

---

No paralclisrno

Regresi6n cuadnitica

Peale ;;:: F tab

Si [ G

tab

estadistico, Si G < G calc

lab

, el valor YJ debe ser ehminado del anahsis En un diseiio en cuadrado latino, el valor perdido se calcula utilizando el siguiente procedimiento:

, el valor YJ no debe ser ehminado del

anaJisis estadistico.

I)

Si se sospecha que se ticne mas de un valor aberrante, el procedirniento debe efectuarse cuantas veces sea necesario, modificando el numero de repeticiones r en cada ocasi6n.

2)

Identilicar tanto el blogue de la columna, como el bloque del renglon, asi como el tratarniento, asociados con el valor perdido. Caleular el total de dicho blogue columna C', el total de dicho blogue rengIon

R', el total de dicho tratarniento T', asi como el total de todos los val ores

4.11 VALORES PERDIDOS En un bioensayo, se pucde llegar a perder el valor de Ia respuesta de una 0 mas unidades de prucha, por ejemplo por muerte de un animal, contaminaci6n de un tuba, mala difusi6n del antibi6tico en una caja de Petri, etc. El analisis estadistico para estos casos resulta mas compiicado, sin embargo, este puede ser efectuado por los procedimientos anteriormente descritos, al sustituir Ia informacion perdida por un valor calculado con base en los resultados obtenidos. De esta rnanera, Ia perdida de informacion unicamente modilica los grados de libertad del error, perdi6ndose un grade de libertad par cada valor perdido. Se describe aqui el procedimiento para el calculo de val ores perdidos en disefios completamente al azar, en bloques al azar y en cuadrado latino. Para el caso del disefio cruzado, debe consultarse a un estadistico, ya que el procedimiento depende del tratamiento en que se haya perdido Ia informacion.

2">' 3)

I) 2)

Identificar tanto el bloque como el tratamiento asociados a Ia perdida de informacion. Caleular el total de dicho bloque R' Y de dicho tratamiento T', asi como el total de todos los valores

Ly'·

(k --l)(k - 2)

4.11.41)080 MAs VAI~ORES PERDIDOS Si se tienen 2 0 mas datos perdidos (y!, y!! ,y' 1\ ,y!!!! ,.. ) y el numero de estos no es mayor al 5 % del total de unidades de prueba en un diseiio en bloques al azar 0 en un disefio en cuadrado latino, efectuar el siguiente procedimiento.

2)

El valor perdido en un disefio en bloques al azar, se calcula mediante el siguiente procedimiento:

con la siguiente ecuaci6n:

Donde: k = Numero de tratamientos.

En un disefio completamente al azar, el valor perdido en un tratamiento, se sustituye por Ia media de los valores de dicho tratamiento. 4.11.2 DISENO EN BLOQUES AL AZAR

y'

, k(R'+C'+T')-2I>' y=

I)

4.11.1 DISENO COMPLETAMENTE AL AZAR

Calcular el valor perdido

Mediante una inspeccion, suponer val ores para y", y '" , y"'! , ... , excepto para y', y calcular una aproximacion para y' con base en Ia ecuacion descrita anteriormente, segun sea el caso. Con e1 valor calculado para y' y los supuestos para y!tt, y"" , ... , calcular e1 valor para y", y asi sucesivamente hasta completar el cielo.

E1 ciclo se empieza de nuevo al utilizar los valores calcula~ dos para y I f , Y I t ! , Y t!!! , ••• , y recalcular el valor para y El procedimiento se da par terminado cuando los val ores del mismo dato perdido no difieran significativamente de los val ores calculados en el ciclo anterior. t •

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2676

Farmacopea de los Estados Unidos Mex/canos, undec/ma edici6n.

4.12 DISENO INCOMPLETO DESBALANCEADO 5+1 EN BLOQUES PARA ENSAYO DE DIFUSION EN AGAR

Grupo 3 P ® ® ® ® ®@ @® ® ®@@ @@® ®@® P, 4

La mayoria de los ensayos para determinar Ia potencia de antibioticos por valoracion microbiologica descritos en esta Farmacopea, se basan en Ia construccion de una curva de calibracion a cinco dosis, y la interpolacion de un punto correspondiente a Ia muestra.

Caia 7

Este procedimiento es conocido comunmente como 5+ 1, Y consiste en un disefio incompleto desbalanceado en bloques. Sus caracteristicas, sl unicamente se ensaya una muestra, son las siguientes:

® ®'@ ®®® ®®® ®®® ®@® ®@® 5

en escala logaritmica y un nive1 de dosis de Ia muestra, equivalente en forma estimada a Ia dosis intermedia del patron (m 3 ),

Caja 10

Caja 1

Caja 2

® ® ® ®o@ @'@ @"@ ®@® ®@® ®@® Caia 5

4, ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

®6)®

(6)® m J

Caja 14

Caja 15

Deben considerarse dos aspectos importantes en el disefio: 1)

EI uso de una sola dosis de Ia muestra, debe apoyarse en estudios que demuestren el paralelismo de las curvas log dosis-respuesta. El amilisis de varianza permite detectar desviaciones del efecto lineal del log de la dosis sobre la respuesta,

Si estas condiciones no se cumplen, la validez del estimado de la potencia de Ia muestra es dudosa, debido a que son sllpuestos del modele de Hneas paralelas. PROCEDIMIENTO 1) Codificar SllS tratamientos con base en Ia simbologia siguiente.

Grupo 2

Caja 4

® 6J'6J

Caia 13

2)

Caja 3

Caja 12

c§ ® 6J In)

En Ia siguiente figura se ilustran estas caracteristicas:

® ® @J® @J@ @® ® ®@® ®@® ®@®

Caja 11

Grupo 5

d) d 2 'I ds d4 log- = log- = log- =10g-) ( d4 d] d2 d,

Grupo I

Caia 9

Grupo 4

I) Se tienen un total de seis tratamientos, cinco niveles de dosis del patron (p"P"PlIP) Yp,) igualrnente espaciados

2) Se utilizan un total de 15 caias de Petri divididas en 5 grupos de tres cajas cada uno. 3) A cada caja del grupo se Ie asigna por triplicado la dosis intermedia del patron y otra dosis del patr6n 0 Ia muestra, repitiendose la misma asignacion para las otras dos cajas del grupo, 4) Las repeticiones de los dos tratamientos en cada caja, se distribuyen de forma alternada.

Caia 8

Caja 6

PI ~ Patron a dosis 1

Patron a dosis 2 Patron a dosis 3 Patron a dosis 4 Patr6n a dosis 5 = Muestra a dosis 3

P2 = P3 = P4 = Ps = m3

Estadistica para ensayos biologicos

2677

2) Registrar los datos en e1 siguiente formato y efectuar los c(ilculos indicados. Caja de Petri ~T_ra_tam_ie_n_to~_ (Bloque) PI P3 f),I,)

Yl,1,2

------,~--

--- f),),]

Y

dj,l =Y1,1,1

Yl,l,l -

---"",,~

Y], I,J

d I, J

Diferencia

-Y 3 ,)

---,~,~,--

d 1,2 =Y

f l ,l,2

Caj. de Petri __T_ra_t_am_ie_n_to (Bloque) P2 P3

Diferencia

" =Y",

2 -

J

5

Y J, 1

-Y 3,1

YZ,5,2 YZ,),1

YI ,5,3

d 2 ,6 =Y 2

5,3

-Y 3.5

Y3, 1,1 +Y3, 1,2 + Y3, 1,3 3, I

3

3

Tratamiento

Caj. de Petri (Bloque)

Diferencia PI

P3

Caja de Petri _Tratallliento (Bloque) P2 P3

Diferencia

6

2

d 2 ,9 =Y2 ,6,J -Y3,'

YU,1

3

3

=aja de Petr Tratamiento (Bloque) P3 P4

Caia de PetrI__Tr_a_ta_mien_to_ -,,~ Diferencia (Bloque) PI P3 d 1 , 7 =Y j , 3 , J

--~

Diferencia

~,-,---

-Y3,3

7

3

d4

,3

=y 4,7,3

-Y3,7

Y3,7,1 +Y3,7,2 +Y3,7,3

3

3

Caja de Petri _Jratamiento__ (Bloque) P2 P3

Diferencia

Cai_ de Petri_Tratamiento P4 P3 (Bloque)

Diferencia

f 4,U

Y2,4, ! ---'-~---"--"---

f 3, S, 2

8

d 4 , 5 =Y4 , 8 , 2 -Y3,g

"---,---,--,,,,"'-,---""""----~,

d 2 , Z =Y z, 4 , 2 -f l ,4

4

Y

f 4,8, J

f 3,8, J

3

3,4

3

4, ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2678

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Caja de PetrI, Tratamiento (Bloque) P4 P3

Caj. de Petri Tratamiento

Diferencia

Diferencia

(B1oque)

d 3,1 =Y3,13,c1_-Y3,13 _ __

d 4 ,7 =Y4,9,1 -Y3,9 9

13

Y 3 ,13,1 +Y 3 ,13,2 +Y 3 ,13,3

3

Caia de Petri (B1oque)

Tratalllie~ P5

P3

YS.]U,I

YJ,iO,1

"""",_

10

3

..- _ . _ .

YS,IO,2

Y1 ,1G,2

YS. 1U

Y],IU

Diferencia

Caia de Petri, (Bloque)

14

Tratamiento

Diferencia

ffl3

P3

YJ ,14,1

Y3 ,14,1

d 3,4

Y}, 14.2

Yl , 14, 2

d 3,

=Y3,14, I

- Y 3,14

=yJ, 14,2

J, 14 .•.- , - -..--

.........

yJ,14,J

d J, 6

Y},IU

=y

-

-Y

...... _--

3, i4,3

- Y 3,14

Y3,lO,1 +Y3,lO,2 +Y3,IO,3

3

3

Caia de Petri_1'ratamiento (B1oque)

P5

Diferencia

P3

11

d S ,4 ::::Y5 ,11,1

-Y3,11

d 5 ,5 ::::YS ,1I,2

-Y3,11

d S ,6

Yl,ll,l

Caj a de Petri _-,T=-:r"a:::l=am=ie=n:ct"o,-(B1oque) P3 m3 Y},IS,I

Y3 ,IS,i

15

::::YS ,ll,3 -Y::l.ll

Y

=Y3, IS, - Y 3, IS j

Y},IS,2

YJ ,15,2

d 3,8

=Y3,15,2

YLl5 ,3

YU

d 3, 9

=Y3,15,3 - Y 3, 15

5,3

- Y 3,15

3, IS

3

3) Registrar las diferencias y efectuar los c'Jeulos indieados

Caja de Petri ...__T_r_a_t_a.~~-1iento Ps

d 3,7

........ _ . - . - - - -

3

(B1oque)

Diferencia

Diferencia

P3

(suma total, suma total de cuadrados, suma de cuadrados de los totales y eontraste lineal del patr6n),

dS, 7

=YS , 12, 1 -Y3,12

Diferencias 12

YS.!2.2

=YS, 12,

YJ ,12,2

- Y 3,12

____ 1'1 d1,l

P2 d 2 ,l

p,

I''i

,,,_1';,

d3 ,l

d 4,l

dS,l

d2 ,2

d3,2

d 4 ,2

dS ,2

------~-----------------

d 12

d2 ,9 Y 3 ,12,1

+Y3,J2,2

3

4, ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

+Y3,12,3

d j ,9

- - -...

~,~"""

d 4 ,9

d S ,9

Estadistica para ensayos bio/6gicos

Suma total:

Totales

P1

=d1,1

"L- d =d

+d 1 ,2 +",+d 1 ,9

P5

4)

=d 5 ,1 +d,

2

+",+d s

+d 1 ,2 + ... +d S ,9

Suma de los cuadrados de los totales: """'T2 :::::.p 2 +p 2 +M 2 ...Lp 2 +p 2

=d 3 ,1 +d 3 ,2 +",+d 3 ,9

P 4 =d 4 ,1 +d 4 ,2 +",+d 4

1 ,1

Suma total de los cuadrados: 2 2 L:d =drl +d I ,2 + ... +dr9

P 2 =d 2 ,1 +d 2 ,2 +",+d 2 ,9 M3

2679

L.J

12'3'45

,9

Contraste lineal del patron: Lp =-2P j -P z +P4 +2Ps

9

Construir la tabla de ana1isis de varianza y efectuar los calculos indicados (surna de cuadrados, cuadrados medios y Feale).

Tabla V!. Analisis de varianza F'uente de variacion

Grados de libertad

Tratamientos

Suma de cuadrados

LT2

5

----

SC,

(Ld

Cuadrados medios

)2

SC,

CM,

46 (P 1 +P 2 +P4 +PS

=--

5

9

Preparaciones

SCI' =

Regresion lineal

SCt

)2

M2

(Id )2

9

46

+

36

3

CMp =SC p

L2

Error

CM

p

Regresi6n no lineal

CM, =SC t

90

SC I =SC, -SC p -SC

3

SC, eMil

t

LT 2 SCt = Ld 2 ---9

40

Fea/e

eM e

CM

t

CM

3 SC e

" CM,

40

Obtener la decision con base en la siguiente tabla:

Tabla VI!, Regia de decision Regia de decision

Fuente de variacion

Si F ca1c

Regresi6n lineal

~

4.09

EI logaritmo de la dosis tiene efecto lineal sobre la respuesta.

---

... -

Si Fca/c < 4.09 ...

--~

..

-

.•.-

Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto lineal sobre la respuesta .

- -

2.84

Si Fudc

;::::

Si

< 2.84

..

_-_._-

~---

Ellogaritmo de la dosis tiene efecto no lineal sobre la respuesta.

Regresi6n no lineal Fcalc

Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto no lineal sobre la respuesta.

4, ENSAYQS DE RESPUESTA GRADUAL

2680

Fannacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Para efectuar eI ca!culo de Ia paten cia y sus limites de confianza, es necesario asegurar que Ia relaci6n log dosisrespuesta es de tipo lineal, 10 cual queda demostrado si por Ia regIa de decision, el Iogaritmo de Ia dosis tiene efecto lineal sobre la respuesta y el logaritmo de Ia dosis no tiene un efecto no lineal sobre la misma. Si esta condici6n no se cumple, es muy probable que las dosis del patron utilizadas en el ensayo sean incorrectas, por 10 tanto, se sugi~re disefiar el ensayo con base en dosis mayores 0 menores, segUn sea el caso. 5)

4.13 EJEMPLOS 4.13.1 ENSAYO DE VITAMINA Eu (DISENO COMPLETAMENTE AL AZAR; 1 PATRON, I MUESTRA, A 3 DOSIS) La preparacion patron se ensayo a 0.8, 1.2 Y 1.8 ng/tubo. Se prepararon dosis equivalentes de la preparaci6n muestra. Formato de registros de datos Metametro de la respuesta (y) Tratamientos

Calcular el valor de Ia pendiente b con la siguiente ecuaci6n:

L b = __--'P-c--,-

IOgl :: J

90 6)

m,

Calcular eI Iogaritmo de la potencia relativa de Ia muestra con Ia siguiente ecuaci6n:

M

M=_3

9b La potencia relativa de la muestra es:

1.06 1.07 0.99 0.86 1.06 1.02

1.17 1.14 1.14 1.l3 1.l3 l.l5

0.91 0.93 0.98 0.96 0.89 1.01

1.09 1.04 0.97 1.06 1.04 1.02

l.l5 l.l5 l.l4 l.l6 l.l0 l.l5

P2~6.06

P3~6.86

M,=5.68

M2~6.22

M3~6.85

0.96 0.91 0.92 0.76 1.03 0.93 P,~5.5J

Suma total: Si se desea expresar Ia potencia en unidades, multiplicar la potencia relativa de la muestra, por la potencia asignada a la muestra.

LY = 0.96+0.91 + ... +1.15 = 37.18 Suma total de cuadrados: ~

7)

Calcular los limites del intervalo de contianza para el Iogaritmo de Ia potencia relativa, con base en Ia siguiente tabla: Tabla VIII

Sig>O.I

s:

2

2

2

2

=0.96 +0.91 + ... +1.l5 =38.7622

Suma de los cuadrados de los totales: ~

2

2

2

2

L.,T =5.51 +6.06 + ... +6.85 =232.0166

Limites de confianza

g

Si g

L.,Y

2.02

M±--

eM e

b(l-g)

()(1 1 M2 l-g -+-+9

2.02

0.1

M±-

j

eM e (

b

1

36

Idd

M2)

-+-+-9 36 rdd

4.13.1.1. PROCEDIMIENTOS PARA IDENTIFICAR VALORES AEERRANTES 0 ERRA TICOS

4.13.1.1.1 PROCEDIMIENTO DEL INTERVALO MAXIMO

Donde: 4.08CM, g=

b

2

Tratamiento Orden

P1

P,

Pl

m,

m,

m3

y,

0.76

0.86

l.l3

0.89

0.97

UO

Y2 Y3 Y4 Ys

0.91

0.99

1.13

0.91

1.02

1.14

0.92

1.02

1.14

0.93

1.04

1.15

0.93

1.06

1.14

0.96

1.04

1.15

0.96

1.06

1.15

0.98

1.06

1.15

y,

1.03

1.07

1.17

1.01

1.09

1.16

"dd

Ldd~9l[10g(~~)r +[lO{~:)r +[lOg(~!Jr +[lOg(:~Jrl Los limites de la potencia relativa de la muestra, se obtienen al detenninar el antilogaritmo tanto del limite superior como del inferior. Si se desea expresar los limites del intervalo en unidades, multiplicarlos por la potencia asignada a la muestra.

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

--~------------~-------

Estadistiea para ensayos bi%gleos

Tratamiento

Y6

Yl

PI

1.03

0.76

0.27

P2

1.07

0.86

0.21

PJ

1.17

1.13

0.04

m1 m2 mJ

1.01

0.89

0.12

1.09

0.97

0.12

1.16

1.10

0.06 0.82

G

Total

I

= 0.27 en P

max

R

0.91-0.76 1.03-0.76

calc

G

tab

2681

0.556

= 0.644

REGLA DE DECISION Ya que 0.556 < 0.664, el valor 0.76 no debe ser ehminado del anahsis estadistico. Matriz de tatales de tratamientos y contrastes

1

= 0.27 = 0.329 calc 0.82

patron P

muestra m

5.51

5.68

6.06

6.22

6.86

6.85

P = 18.43

m = 18.75

Tot.les de dosis baj. -,-~,,~-""-,,-

R

tab

= 0.300

Totales de dosis intermedia .. - - - - - - - - , -

Totales de do,is alta REGLA DE DECISION

-,~""~-"""""""'-

Totales Ya que 0.329 > 0,300, el tratamiento PI' tiene potencialmente al menos un valor aberrantc

0

Contraste lineal

ernltico.

4,13,1.1,2 PROCEDIMIENTO DE LA DISTANCIA MINIMA

Tratamiento

Valores

Y2

YJ

Y4

= 6.86-5.51 = 1.35

P L

m

Y,

Y6

C PI

0.76

0.91

0.92

0.93

= 6.85-5.68 = 1.17

Contraste cuadratico

.~-.

Yl

L

0.96

1.03

P

C

m

= 5.51- 2(6.06)+ 6.86 = 0.25 =5.68-2(6.22)+6.85=0.09

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2682

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Tabla IX Anltlisis de varianza Fuente de variacion

Grados de libertad

Preparaciones

Suma de cuadrados

SC p

Regresi6n lineal

SC n

Regresion cuadratica

SC e

37.18 2 --=0.0028 36

(3)(6) ( 1.35 + 1.17

SC r

No paralelismo

)2

0.2646

( 4 )( 6) 1.35

2

+ 1.17

Fcalc

F tab

85.35

4.17

0.45

4.17

0.52

4.17

0.13

4.17

= 0.0028

CM p

eM r = 0.2646

2 0.2646

(2)(6)

= 0.0014

(0.25 + 0.09 )2 0.0016

= 0.0014

CMn

CMc

= 0.0016

(12)(6) 0.25 2 + 0.09 2

Diferencia en la regresion cuadratica

Error (DCA)

18.43 2 +18.75 2

Cuadrados medios

SC de

SC e = 15271.27-

30

0.0016 = 0.0004 CM

( 6)( 6)

232.0166

= 0.0928

6

dc

CM e

= 0.0004

= 0.0031

Tabla X Regia de decisi6n Fuente de variaci6n

RegIa de decision

Regresi6n

Ya que F eale > Flab. el logaritmo de la dosis tiene un efceto lineal sabre el metametro de la respuesta.

No paralelismo

Ya que Fcale < Flab, las rectas log dosis metametro de la respuesta son paralelas.

Regresion cuadnitica

Ya que Fcale < F tab , ellogaritmo de la dosis no tiene efecto cuadnltico sobre el metametro de Ia respuesta.

Diferencias en Ia regresion cuadnitica

Ya que

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

Fcalc


= 17.6+ 17.8 +... + 22.9 = 736.3 Suma total de cuadrados:

= 1.0712

,,2

2

2

1.0514

0.2646 - (0.0031)(2.042 2 )

Suma de los cuadrados de los totales:

Los limites del intervalo de confianza son: 1.0514 (0.0299) ±

2

Loy =17.6 +17.8 + ... +22.9 =15271.27

0.2646

'"' ,2 2 2 2 Loy =105.7 +123.5 + ... +139.4 =91621.39

,\,2

2 (1.0514 -1)[ 1.0514(0.0299') + 8(0.1761 )]

2

2

2

L.,R =122.4 +123.9 + ... +121.5 =90360.83

3 4.13.2.1 PRUEBA DE HOMOCEDASTICIDAD DE HARTLEY

0.0314 ± 0.0656 - 0.0342 a 0.0970 Al obtener el antilogaritmo: 10". 0.0342 a 10-0.097

Varianza de cada tratamiento:

0.9247 a 1.250)

,,2

2

2

2

L.,y =17.6 +17.8 + ... +17.4 =1862.21

4.13.1.2 VALOR PERDIDO

y,

Suponiendo que en P: se perdi6 el valor = 0,76 calculado con base en el resta de la informacion del tratamiento es:

(Iy)' ~ (17.6+ 17.8+ ... + 17.4)2 ~ 11172.49 s .

6(186221) -11172.49

P'

4.13.2 ENSAYO DE UN ANTiBIOnCO POR DIFUSION EN AGAR (DISENO EN BLOQUES AL AZAR (1 PATRON. 1 MUESTRA, A 3 DOSIS) La preparaci6n patr6n se ensay6 a 0.5; 1.0 y 2.0 U/mL. Se

preparan dosis equivalentes de la preparaci6n muestra, con base en una potencia asignada de 1500 UlrnL.

(6)( 5)

0.026

Efectuando el mismo procedirniento:

s

2 P,

S2 P,

s'm,

=0.022 =0.016 = 0.054

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2.684

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

S2

= 0.032

S2

= 0.059

m,

Matriz de totales de tratamientos y contrastes Patron p

m,

Totales de dosis baja Totales de dosis intermedia Totales de dosis alta Totales

Razon de varianzas:

F mle

= 0.059 = 3.69 0.016

105.7 123.5 141.6 p = 370.8

Muestra m 104.3 121.8 139.4 m = 365.5

Contrastes lineales

Lp= 141.6 105.7= 35.9 Lm= 139.4 - 104.3= 35.1

F"h = 18.7

Contrastes cuadraticos

REGLA DE DECISION

Cp = 105.7 - 2 (123.5) + 141.6 = 0.3 Cm = 104.3 - 2 (121.8) + 139.4 = 0.1

Ya que 3.69 < 18.7; los tratamientos son homocedasticos.

Tabla XI. Analisis de varianza

Fuente de variaci6n

Grados de libertad

Preparaciones

SC

Regresi6n

370.8 2 + 365.5 2

736.3 2

(3)(6)

36

p

(35.9+35.1

SC

r

)2

(4)(6)

No paralelisrno

sen :; ;:

Regresi6n cuadratica

sCc

Diferencia en la regresi6n cuadratica

SC

Error (DBA)

35.9 2 +35.1 2 (2)(6)

(12)(6)

de

SC e

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

=

0.3

2

+0.1

Ftnb

CM r = 210.042

210.042

19094.7

4.24

CMn = 0.026

2.36

4.24

= 0.002

0.002

CMe

0.18

4.24

0.002 = 0.000

CM de = 0.000

0.00

4.24

2

(6)( 6)

= 15271.27-

Feale

CM p =0.780

0.780

210.042 = 0.026

(0.3 + 0.1) 2

25

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

91621.83 6

90360.83 6

2

736.3 36

= 0.280

CM e =0.011

Estadistiea para ensayas bia/6gieas

2685

Tabla XII. RegIa de decision Fuente de varia cion

RegIa de decision El1ogaritmo de la dosis tiene efecto sabre el diametro del halo de inhibicion.

Regresion

Si Fcalc < Ftab

No paralelismo

Las rectas log dosis-diametro del halo de inhibici6n son paralelas. Ellogaritmo de Ia dosis no tiene cfceto cuadratico sobre el diametro

Regresion cuadnitica

del halo de inhibicion.

Diferencias en Ia regresion cuadratica

Las curvas log dosis-diametro del halo de inhibici6n son semejantes.

V ALIDEZ DEL ENSAYO Con base en las reglas de decisi6n, se concluye que el ensayo es valido para Ia estimaci6n de Ia potoncia y sus Hmites

0..918 a 0.948 Los limitcs de confianza de 1a potencia de la muestra son:

de confianza.

1377.0 a 1422.6 U/mL

ESTIMACl(lN DE LA POTENCIA Y LiMITES DE CONFIANZA. -

Yp

I -log

b_

M

m

Ym _

370.8 (3)(6)

~---20.600

(~}

365.5 _ 20.306 (3)(6)

4.13.3 ENSAYO DE ESTREPTOMICINA (DISENO EN BLOQUES AL AZAR; 1 PATR{)N, I MUESTRA A 2 DOSIS) La preparacion patron se ensayo a 80 y 20 UIImL; se prepa-

1 log (0 5) -log 2 = 0.3010

35.9 + 35.1 (4)(6)(0.3010)

raron dosis nominal mente equivalentes de la preparaci6n

muestra, a partir de una potencia asignada de 80. UI/mg.

9.827 FORMATO DE REGISTRO DE DATOS Diametro de la zona de inhibici6n en milimetros ( y )

(20.306- 20.600) _ -0.030 9.827

Caja de Petri Hloque

c-

210..042

Totales

P2

ffll

m,

15.3

19.8

15.7

20.1

70.9

2

15.9

20.7

16.5

20.9

74.0.

3

16.6

20.4

16.4

20.9

74.3

4

16.3

21.0

16.7

20.8

74.8

5

16.4

20.2

16.8

20.6

74.0.

6

15.8

20..3

16.5

19.9

72.5

Tota1es

96.3

122.4 98.6

123.2

440.5

1.00.0.2

210.0.42-0..011 (2.0.60.

2 )

Los Hmites del intervalo de confianza son: (1.0.0.0.2) [(1.0.0.02)( -0..0.3 0/ + 8 (0..30. 10) 2 ] 1.000.2(-0.0.30)±

--,,~~.--,----

PI

La potencia en llllidades por mililitro de Ia muestra os:

1500Rm = 1399.5 U/mL

Tratamiento

3

-o..030±0.007 -0.o.37±0.023

Suma total:

2:>

= 15.3 + 15.9 + .. + 19.9 - 440..5

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2686

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Matriz de totales de tratamientos y contrastes

Suma total de cuadrados "",222

L,y

+15.9 + ... +19.9

~15.3

2

Patronp

~8196.29

Totales de dosis baja Totales de dosis alta Totales

Suma de los cuadrados de los totales:

LJ

2

~96.3

2

2

2

+122.4 +98.6 + ... +123.2

2

96.3 122.4 P ~ 218.7

Muestra m 98.6 123.2 m ~ 221.8

Contrastes lineales 122.4 - 96.3~ 26.1

~49155.65D

Lp~ ",,2

L,R

~7D.9

2

2

+74.0. + ... +72.5

2

~3235o.590.

Lm ~ 123.2 -

98.6~

24.6

Tabla XIII. Analisis de varianza

Fuente de variaci6n

Grados de libertad

Preparaciones

SC

Regresi6n lineal

SC

p

~

+221.8

~

(4)(6)

SC e

2

440..5

2

+ 24.6

8196.29

No paralelismo

~

CM r ~ 10.7.10.4

49155.650.

32350..590.

6

4

CMn

440..5 24

1.35

4.54

2 ~

1.0.45

CMe

~O.O70

Ya que F ca1c > Flab> ellogaritmo de la dosis tiene efeeto lineal sobre el diametro del halo de inhibici6n. Ya que

Fcafc

< Flab, las rectas log dosis-diarnetro del halo de inhibici6n son paraielas.

I

~ log (8D)~ log 4 ~ 0..60.20.6 \. 20.

b~

Estimaci6n de Ia potencia y limites de confianza: 2187

~O.O94

RegIa de decision

Con base en las reglas de decisi6n, se conc1uye que el ensayo es valida para Ia estimaci6n de la potencia y sus limites de confianza.

~--~18.225Q

(2)(6)

4.54

~Q.4QQ

CM p

0..40.

107.104 ~ 0..0.94

VALIDEZ DEL ENSAYO

YP

1 537.99

2

10.7.10.4

Fuente de variaci6n Regresi6n lineal

F tab

2

(2)(6)

~

Fcalc

24

(26.1 + 24.6)2

SCn

15

2

(2)(6)

~

r

218.7

26.1

No paralelismo

ElTor (DBA)

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

y

~ 221.8 ~ 18.4833

m

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

(2)(6)

26.1+246 (2)( 6)(0..60.20.6)

7.0.1757

18.4833-18.2250. 7.0.1757

R

m

~ J 0.°03661 ~ 1.0.8845

0..0.3681

Estadistica para ensayos bio/6gicos

Par 10 tanto la potencia es (80) (1.08846) ~ 87.07 UI/mg. C~

107.104 107.104-0.070(2.1312')

Totales: 1', ~13+13+ ... +10~68 1'2 =19+19+ ... +17=103 1'3 ~23+20+ ... +22~132 M, =10+13+ ... +11=66 M2 ~18+17+ ... +17=98 M, =23+22+ ... +21=130

1.0030

Los limites del intervalo de confianza son: 1.0030( 0.03681)±J (1.0030-1)[ 1.0030( 0.03681)

2

2687

+0.60206]

0.0368 ± 0.033 0.0380 a 0.0698

Suma total:

Al obtener el antilogaritmo.

'2:> = 13+23+ ... + 10=597

1.0087 a 1.1745 En unidades por rniligramo.

Suma total de cuadrados:

80.70 a 93.96 UIImg

"",2

L.,y

~13

2

2

2

+23 + ... +10 =10645

4.13.3.1 VALOR PERDIDO Suma de los cuadrados de los totales: Suponiendo que en p" de la caja de Petri 2, se perdi6 el valor y ~ 20.7, el valor calculado con base en los totales del bloque (caja Petri 2) y el tratamiento (P2) es:

",,22

L.,R

2

=98 +100 + ... +101

",2

2

2

2

~59419

2

L.,C =106 +104 + ... +98 =59501

",,2

L.,T

~68

2

2

+103 + ... +130

2

~63517

, . (6)(53.6)+4(101.7)-419.8 20.45 Y,

(6-1)(4-1)

4.13.4 ENSAYO DE TUBERCULINA (DISENO EN CUADRADO LATINO; 1 PATRON, .I MUESTRA, A 3DOSIS)

La preparaci6n patron se ensayo a 1.00; 0.20 Y 0.04 ~g. Se inyectaron dosis equivalentes de la preparacion muestra.

Matriz de totalcs de tratamientos y contrastes

Patron p

Muestra m

Total.s de dosis baja

68

66

Totales de dosis intermedia

103

98

Totales de dosis alta

132

130

p= 303

m= 294

Diametro de reacci6n (mm)

Bloques (S1110s de lnyeccion)

Bloques (Cobayo) ----,,~-

----,~,------------

Totales

Totales

c,

c,

"3

q

Cs

C6

rl

13

13

15

15

21

21

98

r2

23

13

12

15

15

22

100

rJ

23

22

12

10

18

17

102

r4

18

20

21

11

10

17

97

r5

19

17

22

21

9

11

99

r6

10

19

16

24

22

10

101

Cp

=68--2(103)+132~-6

98

96

95

98

597

Cm

=66-2(98)+130~0

Totales

106 104

Contrastes lineales Lp

~132-68=64

Lm

~130-66=64

Contrastes cuadraticos

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2688

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Tabla XIV Analisis de varianza

Fuente de variaci6n

Grados de libertad

303 2 + 294

Preparaciones

2

SC r ~

(64+64)2

(4)( 6) 2

64 +64

No paralelismo

Regresion cuadnitica

SC

Diferencia en Ia regresion cuadratica

SC

~ (-6+0)

~

2

2

20

SC

~

de

e

~

CM

682.6667

~2

p

=682.666 347.12

r

4.351

2

682.6667 ~ 0

0

(12)(6)

c

CM

36

(2)(6)

Error (DeL)

597'

--~2

(3)(6)

Regresi6n lineal

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

(-6) + 0

.5

o

4.351

0.25

4.351

0.51

4.351

2

CM

~1

(6)(6) 2 63517 59419 59501 587 10 645 - - - - - - - - - + - 6 6 6 18

~

39.33297

de

eM e

~

=1

1.9666

Tabla XV Regia de decision Fuente de variaci6n

Regia de decision

Regresion lineal

Ya que Fcalc > Flab, el logaritmo de la dosis tiene efecto lineal sobre el diametro de reacci6n.

No paralelismo

Ya que

Fcalc

< Ftahlas rectas log dosi.s-diametro de reacci6n son paralelas.

Regresion cuadratica Ya que

Fcafe

< Flab, ellogaritmo de Ia dosis no tiene efecto cuadratico sobre el diametro de reaccion.

Diferencia en Ia regresion cuadratica

Ya que Feale < Flab, las curvas log dosis-diametro de reaccion son semejantes.

VALIDEZ DEL ENSAYO

Con base en las reglas de decision, se concluye que el ensayo es valido para la estimacion de la potencia y sus timites de confianza.

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

ESTIMACION DE LA POTENCIA Y LIMITES CONFIANZA. -

303 (3)(6)

Yp~--=16.8333

-

y",

294

~--

(3)(6)

= 16.3333

m:

Estadistiea para ensayos bio/agieos

I

= log~ = log 0.2

b

=

0.2 = 10g5 = 0.699 0.04

4 ..:..+.:: 624 _ _.::62

Y15 =

Rm

6(88 + 87 + 55) - (2)(585.15)

(16.3333-16.8333) 7.6299

11.15

Fin del primer cicIo.

·7.6299

(4)(6)(0.699)

Mm

6(90+ 86+ 56) -(2)(584.5) (5)(4)

2689

Y 35 =

(5)(4)

Y 15 =

6(90+ 86+ 56) - (2)(584.49) (5)(4)

-0.0655

10.49

11.15

= 1O Ho655) = 0.8599 Fin del segundo ciclo y del procedimiento; por 10 tanto:

c=

682.6667 2 [682.6667-1.9666(2.086 )]

l.0127

(1.0127-1)[1.0127(-0.0655 2 )+8(0.6990 2

)]

3

-0.06633±0.1288 =0.1951 a 0.06247

10-o· J951 a 0.6381 a

10

Y35=

La preparaei6n patr6n se administr6 a 1 y 2 U/mL. Se prepararon dosis equivalentes de la muestra, con base en una potencia asignada de 40 U/mL; 32 conejos se distribuyeron en cuatro grupos de ocho cada uno y se les administr6 0.5 mL de la preparacion, con base en el diseiio cruzado mostrado en la siguiente tabla:

0.06247

Orden de administraci6n de los Grupo de conejos

1.1547

_ _---'"tr"atamientos Dia - - - - - --=-'-'-.... ---

1

Los limites para la potencia expresados en porcentaje son:

4. 13.4.1 V ALORES PERDIDOS

2

Suponiendo que en el bloque de la columna C3 y el bloque del rengion r3, se perdi6 el valor Y15 = 12, y ademas que en el bloque de la columna C6 y el bloque del reng16n r, se perdi6 el valor y" = 12, Y finalmente suponiendo que el porcentaje de valores perdidos no es mayor del 5 % del total de datos, el ca1culo de los valores perdidos es como sigue:

3

Yl5 =

11; usando este valor:

6(88+87+55)-(2)(585) ~ 10.5 ; (5)( 4)

usando este valor:

2

m2

63.81 a 115.47 %

El valor supuesto para

10.49

4.13.5 ENSAYO DE INSULINA POR INYECCION SUBCUTANEA EN CONEJOS (DISENO CRUZADO: 1 PATRON, 1 MUESTRA A 2 DOSIS)

Los limites del intervalo de confianza son:

1.0 1278( -0.0655) ±

y

Y15= 11.15

m,

P2

4

Donde:

dosis baja. Muestra de dosis baja.

PI = Patron a

ml =

pz = Patron a dosis alta. mz = Muestra de dosis alta.

Despues de administrar la preparacion, se Ie determina a cada conejo el contenido de glucosa en sangre (mg/IOO mL)

a la hora y dos horas y media; en el siguiente formato de registro de datos se indica la suma del contenido de glucosa de las dos determinaciones.

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2690

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Tabla XVI. Formato de registro de datos Grupo de conejos 3

2 Dia

Dia

4 Dia

Dia

2 Conejo

Conejo

Preparacion

Preparacion

2

Conejo

2

Conejo

Preparaci6n

Preparaci6n

P, 112

104

2

126

9

65

72

-----

---------

112

10

116

160

- - - - - -------------------

3

62

58

11

17

105

91

25

118

144

83

67

26

119

149

27

42

51

- - -

18

--------------------.

73

72

19

125

67

-------._-----------------

4

86

5

52

- - - -

63

12

47

93

20

56

45

28

64

107

53

13

88

113

21

92

84

29

93

----------------~

6

113

110

-----------

7

14

71

22

101

56

30

73

65

23

66

55

31

39

87

15

50

_----_......

68

101

16

55

100

4.13.5.1 PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICAR VALORES ABERRANTES 0 ERRA TICOS

24

91

68

Tratamiento

Procedimiento del intervalo maximo:

126 113 116 160 125 91 119 149

3 4

IiI,

5

Tratamiento

6

Orden

1

2

3

4

5

6

7

8

52

53

47

65

56

45

31

51

32

31

7 8

52 53 47 65 56 45 31 51

Total 62

58

50

71

66

55

39

71

86

63

55

72

83

56

42

87

I

101

68

63

72

91

67

64

107

R

110

91

65

93

92

67

73

117

112

104

73

100

101

68

93

128

YJ

116

112

88

113

105

84

118

144

Ys

126

113

116

160

125

91

119

149

Intervalo

74

60

69

95

69

46

88

98

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

= calc

71

Ys - Yl

Ys

2

Y5

_----..

- - -

..

8

..

------

91

116

63

117 -128

- - - - - - - - -

74 60 69 95

69 46 88 98 599

= 98 en 8

~~=0.164 599

REGLA DE DECISION Ya que 0.164 < 0.218. ning(m tratamiento tiene valores aberrantes 0 erraticos.

Estadistica para ensayos biol6gicos

2691

4.13.5.2 PRUEBA DE NORMALIDAD DE SHAPIRO WILK Tabla XVII

Gru!'o de conejos 1

Orden

Preparacion

(I)

(ai)

Di. I

Yl Y2 Y3 Y4

-0.605

PI 52

-0.316 -0.174

4

Dia 2 m2

Di.l

53

62

58

50

71

66

86

63

55

72

83

-0.056

101

68

63

72

91

y,

0.056

110

91

65

93

Y6 Y7 Y8

0.174

112

104

73

0.316

116

112

0.605

126 709.70

Varianza (S2)

Di.l

P2

Dia 2 mI

mI

P2

Dia I m,

47

65

56

45

31

PI 51

55

39

71

56

42

87

67

64

107

92

67

73

117

100

101

68

93

128

88

113

105

84

118

144

113

116

160

125

91

119

149

627.93

525.13

1 012.50

479.55

230.55

1214.27

1 215.Q7

2

3

4

5

6

7

8

Tratamiento

Grados de libertad de cada tratamiento: r -1 = 7

V = In

De la tabia 3 con base en el valor de r: a=0.419

q = -2.70

m

=

r\ 0.88377-0.419J 1-0.88377

Di.2

=

1.38597

H = -2.70+[(1.33)( 1.38597)] = -0.85666

1.33

Para el tratamiento 1:

Para el tratamiento 4:

[( -0.605)(52) + (-0.316)( 62) + .. + (0.605)(126)] ,

v=~----------------------------~ (7)( 709.70)

En este caso 0.89988 a(3)=a(4)

-0.174-0.056 2

v H

In (0.89988 - 0.419 1 - 0.899 88

[( -0.605)(65)+( -0.316)(71)+ .. +(0.605)(160)]' v=

V -In

[( -0.605)( 53) + ( --0.316)( 58) + .. + (0.605)(113) ] , (7)( 627.93)

0.86850

H

0.83209-0.419J = 0.90028 [ 1-0.832 09

= -2.70+[( 1.33 )( 0.90028)] = -1.50263

.. +(0.605)(125)] , v= [( -0.605)(56)+( -0.316)(66)+ (7)(479.55)

0.97662

= -2.70+ (1.33)(1.22915) = -1.06523 V=ln

Para eI tratamiento 3:

~

0.83209

Para el tratamiento 5:

1- 0.8685

v

(7)(101250)

= -2.70+ (1.33)(1.56928) = -0.61286

v = In(0.86850-0.419) = 1.22915 H

0.115

) = 1.56928

Para el tratamiento 2: v=

Dia 2

[(-0.605)(47)+(-0.316)(50)+ .. +(0.605)(116)]' (7)(525.13)

0.88377

0.97662-0.419) (

1-0.97662

=3.17176

H = -2.70+ (1.33)( 3.17176) = 1.51844

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2692

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Para el tratamiento 6: ~ 0.056+ 0.056 a(4)~a(5)~----

2 X calc

o

2

(3)(8)(7)2 -

[(-0.605)(45)+(-0.316)(55)+ .. +(0.605)(91)]' 11

=

-- 0.94643

(7)(230.55)

V~ln

(3)(8)(7)+9

r709.70+627.93+ ... +1215.07]

(8)ln

l

8

( 6.56484+6.44243+ .. + 7.10256»)~ 6.45

X;ab =14.07

0.94643~ 0.4191 (

(3)(8)(7)2 { (3)(8)(7)+9

)~2.28711

I ~ 0.94643

REGLA DE DECISION ~ ~2.70+ [( 1.33)( 2.28711)] ~

H

0.34186

Para el tratamiento 7: [( -0.605)(31)+( ~0.316)(39)+ .. +(0.605)(119) ],

0.90884

v~

(7)(1205.71) V~ln

H

Ya que 6.45 < 14.07, los tratamientos son homocedasticos. I) Calcul0 de los totales: Dia 1: P11 ~ 112+126+ ... +101 ~ 765 P 21 ~ 65+116+ ... +55

0.90884-0.419) ~1.68150 ( 1~ 0.90884

~ ~2.70+[(1.33 )(1.6815)] ~

M11 ~ 105+83+ ... +91 M21

-D.46360

I(-0.605)(51) + (-0.316)(71) + .. + (0.605)(149) J

2

(7)(1215.07)

V ~ In

H

( 0.95343~0.419J

l

~

1~0.95343

~ ~2.70+[(1.33 )(2.44017)] ~

calc

J8

1

2

709.70 6.56484

627.93 6.44243

3 525.13 6.26365

5

6 230.55 5.44047

7 1214.27 7.10190

479.55 6.17285

k~8 r-l~8-1~7

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

~ ~

719

~

579

854 533

M12~

72+160+ ... +100

~

746

M22~

104+112+... +68

~

662

~ 112+104~216

B12~140

B2~ 126+112~238

B13~201

B24 ~ 159

B3~

120

B'4 ~ 134

B25~

B4~149

BJ5~115

B26~268

B, ~ 105

Bl6~155

B27~93

B6~223

B17~

B28~

B7~207

B18 ~ 150

B29~21O

B8~

169

Bl9~

B30~201

B9~

137

B2o~101

B,

0.74

4.13.5.3 PRUEBA DE HOMOCEDASTICIDAD DE BARTLETT

Tratamiento Varianza (,1) Ini

~

118+119+... +31

91+67+ ... +68

557

TOTAL DE CADA BLOQUE (conejo)

0.54543

REGLA DE DECISION Ya que 0.74 < 1.96; la suma de los eontenidos de glueosa en sangre a la hora y a las dos horas y media, se distribuye normalmente.

Tratamiento Varianza (s 2) In s2

P22~

0.95343

2.44017

( ~0.61286) + ( ~ 1.06523) + ... +0.54543 t

~

Dia 2: P 12 ~ 144+149+...+71

Para el tratamiento 8: v~

~

196 192

BlO~276

B2l

B11 ~ 145

B22~157

~

176

B23~121

B3l

~

262

171

126

B32~31+71 ~

10:

4 1 012.50 6.92018

8 1 215.07 7.10256

SUIDa total: L>~112+126+ ... +71~5415

Suma total de cuadrados:

L>2

~1122

+126 2 + ... +712 =511583

Suma de los cuadrados de los bloques: I.E

2

=

B I2 + B 22 + ... + B 322 =216 2 +238 2 +. .+102 2 ~995 909

Esladisliea para ensayos bl%gleos

Dias:

Matriz de totales de tratamientos y contrastes

Total

Muestra

Patron

Di.l Totales de _dosisiJaja Totales de dosis alta

Pll~ 765 Mll~ 719 ___ ~~_ ~~~_~~~_ P21~

M21~

557

p. 1= P l1 + P21

Total

~

~2

32 64 2620 2 +2795 2 5415'

620 ~

M.l~MlI+M21 ~

I 322

I 298

32 64 458638.28- 458159.77 ~ 478.52

No paralelismo: L

=

SC

Patron P12~

~dosis baj~_

M12~

854

Totales de dosis alta

P22~

p. 2=

Total

M22~

533

D2~

P. 2+ M.2 ~2 795

662

I 387

III

8859.52 32 ~ 10313.03- 8 859.52 ~ 1453.52 ~

1

Interacci6n Dias ! No paralelismo:

M. 2= M 12 + M22 ~ 1408

P12+ P22

~

SC

746

---,--,--

~---~~

2

SCr 2 (-529)2 +(-224)2

Total

Muestra

+L

2

P

1

Dia 2 Totales de

(:~:> )2

D,' +Di

Dl~P·l+M.l

579

2693

SC

lL

=

P2

-I.

-I.

PI

+I. III

d"

2

m1

]2

64

[-321- ( -208) - ( -84) +( -140) ]2

Patron Total de preparaci6n

P~P,,+P'2 ~

Total

Moe.tra M~M.,+M.2

2 709

~

64

l) ~- D,+ D2 446,27

~P+M

2 706

~

5 415 Bloques (conejos)

LB2 (Ly)2

Contraste lineal:

Di. Dia I Dia2

Total

SC b ~-2--":=6~4-'-

Lp2 = ~

Total

Muestra

Patron L p , = PZ1-P ll

Lml

:=

M21-Mll

- - 40 Lml =M2r M 12

P22-P 12 -321

Ld j =Lp! +Lmj ~-348

Ld 2

~-84

Lp=Lpj+Lp2

LIIl

~-405

= Lmi +. Lm2

L= Ld j

~-224

~-529

= Lp2 -+ Lm2

=

~

5415 2 64

995909 2

497 954.50-458159.77 ~ 39 794.73

Interacci6n Dias I Preparaci6n: SC

(1'" -P., -M., +M.,)' -'--'----''---__'------''-'64 (1322-1387-1298+1408)2

~ F rab · 2) Las rectas log dosis-respuesta de las dos preparaciones son paralelas, ya que Fn < Flab3) El efecto de las preparaciones sabre la respuesta, es Independiente del dia, ya que F dp < Flab. 4) La pendiente de la relacion log dosis-respuesta para cada preparacion, es independiente del dia, ya que Fdn < Ftab . 5) La relacion log dosis-respuesta para las dos preparaciones, es independiente del dia, ya que Fdr < Flab. Ya que se cumplen las condiciones del modelo de Hneas paralelas (deseritas en 1 y 2), ademas de que las fuentes de variacion preparacion, no paralelismo y regresion son independientes del dia, el c:ileulo de la potencia y su intervalo de confianza es valida. Si cualquiera de los valores de F dp ' Fdm F dn son mayores a Ftab' se debe tener cuidado en la interpretacion de los resultados, y S1 es posible, el ensayo debe repetirse.

ESTIMACH)N DE LA POTENCIA LiMlTES DE CONFIANZA Yp

Ym

p

2709

2r M

2(16) 2706

2r

2(16)

Y DE

LOS

~-~--=84.65625

~-~--=84.56250

2 rl

= 0.OOJ28± 0.07937 10---0·07809

a 10 0.08065

Los limites expresados en potencia relativa son:

0.83543 a 1.20406 Los limites expresados en U/mL son: 33.42 a 48.16 U/mL

4.13.6 ENSAYO DE CORTICOTROPINA POR INYECCl(lN SUBCUTANEA EN RATAS. PRUEBA DE PARALELISMO DE DUNNETT EN UN DISENO COMPLETAMENTE AL AZAR (ENSAYO A 2 nOSIS, I PATRON,2 MUESTRAS) La preparacion patron se administro a 0.25 y 1 U/lOO g de peso corporal; las muestras se administraron a dosis equivalentes a las del patron. Se utilizaron 10 ratas par cada combinacion preparacion-dosis. La variable de respuesta file miligramos de :icido ascorbico por 100 g de glandula adrenal. Los resultados son los siguientes:

PI

pz

300

289

310

230

250

236

221

290

210

268

213

330

267

360

280

273

283

1 =--_...2.-_.:....0 _. -78.16912

290

236

341

240

269

[-529+(-224)

364

250

321

261 241

307

25[

2 (16)( 0.30 103)

328

231

370

290

270

294

390

229

303

223

317

223

360

269

334

254

3[2

250

342

233

295

2[6

320

216

306

259

315

235

265

265

84.56250- 84.65625

M

(!'06951-[) [ !.06951( 0.00 120 2 ) + 0.30 103 2 ]

3[0

I=IOgl :: ~lOg( ~ J~030103 b~-'--'--"":

~!.0695 [( 0.00 (20)±

Tratamiento

Donde: r = Numero de conejos par combinacion dosis-preparacion:

\Lp+Lm!

t = Valor de t de Student con los grados de libertad del error dentro de bloques.

b

-78.16912

0.00120

Rm =10°. 00 [2 =1.00277

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2696

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima ed/cion.

Suma total:

Matriz de totales de tratarnientos y contrastes

Suma total de cuadrados:

L:y'

~3002 +310' + ... +265' =4826447

Suma de los cuadrados de los totales:

L:T2

Muestra m

Patron p

:L>=300+310+ ... +265= 16805

Totale, de dosis baja

P1

Totales de dosis alta

P2 ~ 2 484 P~

Tota!es

=3320' +2484' + ... +2500' =47851061

~

3 320

5 804

z

~

2 822

M2~2440

Z2~

2500

M~

Z~

5322

M1

~3

Muestra

239

5679

Z1

Contrastes lineales

Lp = 2 484 - 3 320 ~ - 836 Lm = 2 440 - 3 239 ~ - 799 L, = 2 500 - 2 822 ~ - 322

Tabla XIX Analisis de varianza

Fuente de variaci6n

Grados de libertad

Preparaciones

2

Regresion lineal

Cuadrados medios

Suma de cuadrados 5804 ' + 5 679' + 5 322 ' SC p

sC r

16805 '

(2)(10) [-836+ (-799 )+ (""

60

322)]2

(6)(10) (_836)' +(-799)' +(_322)2

No paralelismo

2

Sen

Error (DCA)

54

See =4826447

(2)(10) 47851061

Feale

Ftab

eM r = 63 830.82

83.38

4.08

eM n ",,4109.12

5.37

3.23

eM p =3128.32

6256.63

63830.82

63830.82 = 8 218.23

eM" = 765.57

41340.90

10

Para la muestra z:

REGLA DE DECISION Ya que 83.38 > 4.08, ellogaritmo de la dosis tiene efecto lineal sobre la respuesta. Ya que 5.37 > 3.23, las rectas log dosis-repuesta no son pa-

-836-( -322)

t""" t lab

raielas.

= 2JI0(765.57)

-2.94

= 2.27

VALlDEZ DEL ENSAYO REGLA DE DECISION Ya que las rectas log-dosis respuesta no son paralelas, no se

debe efectuar el ca1culo de potencia de las muestras. Para determinar cuales rectas no son paralelas, se aplica la prueba t de Dunnett.

Ya que 0.21 < 2.27; la relaci6n log dosis-respuesta del patron y de la muestra m son paralelas. Ya que 2.94 > 2.27; la rclaci6n log dosis-respuesta del patron y de la rnuestra z no son paralelas.

Para la muestra m: -836-( -799) t mcaic

2 J!O( 765.57)

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

-0.21

Por 10 tanto, el analisis estadistico debe repetirse, eliminando la rnuestra z de este y ajustandose a las indicaciones dadas para ensayos a 2 dosis, 1 patron y 1 muestra.

Estadfstica para ensayos bio/6gicos

4.13.7 ENSAYO DE VANCOMICINA (DISENO INCOMPLETO DESBALANCEADO EN BLOQUES; 1 PATRON A 5 DOSIS Y 1 MUESTRA A UNA DOSIS) Se prepararon 5 diluciones del patron de vancomicina, a par-

tir de una solucion que contiene 10 UIImL. dande lugar a: d , ~ 3.20 d2 ~ 4.00 d 3 ~ 5.00 d4 ~ 6.25 d s ~ 7.81

UllmL UIImL UJ/mL UIImL UIImL

Grupo 5 Caja de Petri 14

13

2697

15

m3

P3

m3

P3

m3

P3

15,3 15,8 15,7

15,7 15,8 15,7

15,8 15,8 15,5

15,9 15,7 15,7

15,2 15,1 15, I

15.5 15,8 15.3

I

Se obtuvieron los siguientes prornedios y diferencias:

Caja de Petri

Diferenci~lh--p;2

Una muestra de vancomicina cuyo marbete indica que con-

tiene 812 000 UI de vancomicina por gramo, se preparo para obtener una dosis estimada de 5 U1/mL (m3)' Se utilizo como organismo de prueba Bacillus subtilis

ATCC 6633, informimdesc e1 diarnetro del halo de inhibi-

P, 14,6 14,1 13.8

P3 16,1 15,6 15,8

-1.233 -1.733 -2,033

I

14,5 14,1 14,4

16,0 15,9 16,2

Diferencia

-1.533 -1.933 -1.633

cion en milimetros.

Grupo 1 Caja de Petri

_p;--l_p~--p;~-;;;--rp-1_1._;;;_ 14,6 14,1 13.8

16,1 15,6 15,8

14.5 14,1 I 14,4 I

I

16,0, 14,0 15,9 I 14,2 16,2 l 14,1

14,7 15,1 14,8

15,8 15,6 15.5

I I

14,7 14,9 ,15,2

15,7 15,5 i 15,6, 'I

14,8 15,0 14.3

7

P3

16,6 16,8 16,3

15,6 15,8 16,0

15,7 15,4 15.3

P4

P3

16,6 16,5 16.2

15,8 15,6 15,7

16,9 16,5 16,8

16,1 15,7 15,8

p,

P3

Ps

P3

17,3 17,0 17,0

15,6 15,6 15,5

17.3 17.4 17,2

15,6 15,7 15.5

3

15,833 16,033

Caja de Petri 3

. -.....

-~

4

Diferencia i P2

P3

Diferencia

14,7

15,8

-0,933

-1.533

15,1

15,6

-0,533

-1.633

14,8

15,5

-0,833

PI

P2

14,0

15,7

-1.733

14,2

15,7

14,1

15,8

-

i

15,7+15,7+15.8

Y 3,3

15,733

3

15,8 + 15,6 + 15,5

15,633

3

9

P4

___ ~__ I __ -.l1 __

Y 3,2

Y 3,4 =

P3

Grupe 4 Caja de Petri

-

3 16.0+15,9+16.2

-

Grupe 3 Caja de Petri 8

P4

16.1+15,6+15,8

15,7 15,7 15,8

Grupo 2 Caja de Petri

P2

-

Y J.1

+___1L_ _ I

ps

P3

17.3 17,3 16,7

15,9 15,8 15,8

Caja de Petri 5

6

..- - -

'-""~--"--

P2

P3

Diferencia

14,7

15,7

14,9

15,5

15,2

15,6

P3

Diferencia

-0,900

P2 14,8

15,7

-0,667

-0,700

15,0

15.4

-0,467

-00400

14,3

15,3

-1.167

-

15,7+15,5+15,6

-

3 15,7 + 15.4 + I 5.3

Y 3,5 Y 3,6

15,600 15,467

3

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2698

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Caja de Petri

Caja de Petri 8

7

15

P4

PJ

Diferencia

P4

PJ

Diferencia

mJ

P3

Diferencia

16.6

15.6

0.800

16.6

15.8

0.900

15.2

15.5

-0.333

16.8

15.8

1.000

16.5

15.6

0.800

15.1

15.8

-0.433

16.3

16.0

0.500

16.2

15.7

0.500

15.1

15.3

-0.433

15.6 + 15.8 + 16.0

YJ

7

3 15.8+J5.6+15.7

-

Yl

8

-

YJ

J 5.800

~

15.700

~

3

=

15.5 + 15.8 + 15.3 3

15.533

Diferencias -1.233

p, -0.933

mJ -0.433

0.800

P5 1.733

-1.733

-0.533

0.067

1.000

1.433

-2.033

-0.833

-0.033

0.500

1.433

PI

Caja de Petri 10

9

)5

P4

P4

PJ

Diferencia

p,

PJ

Diferencia

16.9

16.1

1.003

17.3

15.6

1.733

-1.533

-0.900

0.033

0.900

1.700

16.5

15.7

0.633

17.0

15.6

1.433

-1.933

-0.700

0.033

0.800

1.800

16.8

15.8

0.933

17.0

15.5

1.433

-1.633

-00400

-0.267

0.500

1.600

-1.733

-0.667

-0.333

1.033

1.467

-1.533

-00467

-0.433

0.633

1.467

-1.633

-l.l67

-00433

0.933

0.867

16.1+15.7+15.8

Yl

9

Yl

)0

15.867

~

3 15.6 + 15.6 + 15.5 :=

~

15.567

3 Tota1es:

Caja de Petri

PI ~ (-1.233) + (-1.733) + ... + (-1.633) ~ -14.997

12

11

P 2 ~ (-0.933) + (-0.533) + ... + (-l.167) ~ -6.600

p,

PJ

Diferencia

p,

P3

Diferencia

17.3

15.6

1.700

17.3

15.9

1.467

MJ ~ (-0.433) + 0.067 + ... + (-0.433) ~ -1.799

17.4

15.7

1.800

17.3

15.8

1.467

P4~

17.2

15.5

1.600

16.7

15.8

0.867

P 5 ~ 1.733 + 1.433 + ... + 0.867

-

J5.6+15.7+15.5

Y},11

3

-

Yl

12

=

15.9+15.8+J5.8 3

15.600 15.833

m3

PJ

Diferencia

m3

PJ

Diferencia

15.3

15.7

- 0.433

15.8

15.9

0.033

15.8

15.8

0.067

15.8

15.7

0.033

15.7

15.7

-0.033

15.5

15.7

-0.267

15.7+15.8+15.7 1}

-

Y

;;;;:

3 15.9+15.7+15.7

3,14

3

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

~

7.099 13.500

Suma total:

L:d ~ (-1.233 )+( -1.733)+ ... +0.867 ~ -2.797 L:d'

14

13

YJ

~

Suma total de cuadrados:

Caja de Petri

-

0.800 + 1.000 + ... + 0.933

~(-1.233)' +(-1.733)' + ... +(0.867)2 ~58.300

Suma de los cuadrados de los totales:

L:T2 ~(-14.997)' +(-6.6)' + ... +(-1.799)' +(7.099)2 + (13.500)' ~ 504.352

15.733

Contraste lineal del patron:

15.767

Lp ~ -2 (-14.997) - (-6.600) + 7.099 + 2(13.5)

~

70.693

Esladfstica para ensayos biofogicos

2699

Tabla XX. Analisis de varianza Fuente de variaci6n

Grados de libertad

Tratamientos

5

SC,

SC p

504.352

(-2.797)2

9

46

(-1799 )2

36 (- 2.797)'

9

46

+

SC r =

Regresion no lineal

3

Error

40

55.869

CM,

~

11.17

CMp

~

0.217

Fcalc

Flub

991.57

4.09

0.73

2.84

( -14.997 - 6.600+ 7.099+ 13.500 )2

Preparaciones

Regresion lineal

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

70.693 2

0.217

CM,- 55.528

55.528

90

SC" = 55.869-0.217 -55.528- 0.124

SC, =58.300

504.352

2.261

9

REGLA DE DECISION

Para los limites de confianza:

Ya que 991.57 > 4.09, cllogaritmo de la dosis tiene un efecto lineal sobre el diametro del halo de inhibicion.

L:dd '"

91lIr [7.81]1'J +rllOg [6.2"1' -,- j J +lr [4'0]1' 5.0 10g

-,-

10\

J

3,21 log \ ::>.0

1,1)

r:-J'j

'" 0,845

Ya que 0.73 < 2.84, ellogaritrno de la dosis no tiene efecto no lineal sobre eI diitmelro del halo de inhibicion. Calculo de la potencia y sus limites de confianza. b

=

M -

70.693 90Iog(5/4)

= 8.05

-1.799

0.025

-9(8.105)

R=10-0 .025 =0.945

4.08( 0.056) g=

8.105 2 (0.845)

0.004

Los valores de los logaritmos de los limites son: -0.025±[ 2.02] 8.105

0.056[~+~+ (-0.025)2 9

36

"J

0.845

- 0.025 ± 0.022

10-0 .047 a 10-0 .003 La potencia de vancomicina en UI/g es: 812000 (0.945)

~

767 340 UI/g

Los Iirnites de la polencia relativa son: 0.897 a 0.993 y expresados en UI/g: 728 364 a 806316 UI/g.

4. ENSAYOS DE RESPUESTA GRADUAL

2700

Farmacapea de los Estadas Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL En ciertos bioensayos, el analista a menudo esta interesado en medir la potencia de una preparaci6n que no genera una respuesta graduada en un sistema individuaL Mas bien, la respuesta es absoluta para la unidad de prueba, es decir, esta responde 0 no a la dosis empleada dependiendo de su susceptibilidad 0 tolerancia. Este tipo de respuesta de todo 0 nada es conocida como una respuesta cuantaL La tolerancia se define en funci6n de la dosis de una preparadon farmaco16gicarnente activa, que es justamente insuficiente para provocar que la unidad de prueba involucrada muestre la respuesta establecida. Asi, si una dosis d causa que el 65 % de las unidades de prueba no respondan, 65 % de elias tienen tolerancias hasta d.

si la respuesta es muerte; DP50) si la respuesta es la proporcion de animales protegidos por un agente inmu-nizante, etc. Los metodos mas apropiados para estimar el punta final al 50 %, son aquellos basados en una soluci6n de maxima vcrosimilitud 0 el de minimos cuadrados (metodos formales). No obstante, se han propuesto rnctodos alternativos; el usa de los metodos alternativDs, se debe a que los mctodos formales se consideraban dernasiado laboriosos para su uso rutinario sin instrumentos de caIculo apropiados. Actualmente, al disponer de tales instrumentos, los metodos aproximados se lisan cada vez menas, aunque su empleo no se ha ahandonado del todD en nuestro media, por 10 que se describiran dos de e11os, 5.1 ANALISIS PROBIT

Debido a Ia variaci6n en la tolerancia de las diferentes unidades de prucba, usualrnente es posible seleccionar una dosis de la preparacion que dara una respuesta en una cierta proporcion del grupo de las unidades de pmeba. Si a grupos de unidades de pmeba comparables se les administran dosis mayores 0 men ores de Ia preparacion, la propordon de unidades de prueba que dan una respuesta variara de acuerdo a Ia dosis administrada. As!, empleando un intervalo apropiado de dosis, se hace posible establecer una relacion entre dosis y respuesta. La curva de la relacion del porcentaje de respuesta con la dosis, es una curva sigmoide asimetrica, tal que el extremo inferior de la curva es mas corto que el extremo superior derecho. Al transformar las dosis a sus logaritmos, la distribucion se aproxima a la fonna de una distribucion normal acumulada, que por definicion es simetrica. La relacion logaritmo dosis-respuesta se puede linealizar, haciendo una transformacion de la respuesta. A la respuesta transfonnada se Ie llama en general memmetro. Las transformaciones que se describiran son: Probit, Logit y la transformacion angular 2 arcsen Utilizando regresion lineal con

JP.

estos metametros, es posible determinar las dosis que producen cualquicr porcentaje de respuesta (K por ciento), y a la dosis que 10 produce, se Ie conoce como dosis efectiva K 0 DEK. Asi, las dosis que producen 30, 50, u 80 % de respuesta son conocidas como las DE)o, DE50 0 DEgo . El punto final mas comunmente empleado, es el que se estima que tenga un efecto para el 50 % de las unidades de prueba, ya que este valor es el que se obtiene con la mejor precision. A la DE50 algunas veces se Ie dan nombres diferentes, dependiendo del tipo de respuesta: DL50 0 dosis Ictal a1 50 %,

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

El anaIisis probit, es uno de los procedimientos mas utilizados para la estimacion del punto final alSO % de una preparacion y su intervalo de confianza y en su caso, Ia potencia relativa de una 0 mas muestras. A continuacion se describen los procedimientos para obtener el punto final alSO % y su intervalo de confianza, as! como la potencia relativa de una sola muestra; si se desea aplicar el analisis a mas de una muestra, se sugiere consultar a un estadistico. El metodo consiste en obtener la linea log dosis-probit de mejor ajuste, utilizando un procedimiento iterativo de regresion ponderada, basado en el principio de maxima verosimilitud. El probit es un metametro de la proporcion de reactores (p), que se define como Ia abscisa que corresponde a una probabilidad p en una distribucion normal con media 5 y varianza ]. Generalmente se requieren cuando mas dos iteraciones en el analisis, siempre y cuando se tengan suficientes proporciones de reactores distintas de 0 y 1. Para que la estimacion, del punto final alSO % y su intervalo de confianza, se considere valida es necesario establecer linealidad. En caso de ser necesaria la estimacion de una potencia relativa y su intervalo de confianza, se requiere, ademas de efectuar una prueba de linealidad combinada, establecer el paralelismo de las relaciones log dosis-probits para el patron y la muestra. 5.1.1 ESTIMACION DEL PUNTO FINAL AL 50 PORClENTO DE UNA PREPARACION PROCEDIMlENTO 1)

Tabular la siguiente informacion: el valor de la dosis (d,), ellogaritmo de la dosis (x,), el n(m1ero de unidades

Estadistica para ensayos bio/6gicos

2)

de prueba por dosis (n,) y el numero de reactores para cada dosis (rD. Caleular para cada dosis 1a proporci6n de reactores (p i ~ r, / n, ) y detenninar su probit correspondiente (y, ) en 1a tabla 8. Tabular 1a informacion.

3)

el producto del probit-10garitmo de la dosis (y i 4)

(LY)'

)

Y

Xi)'

1a suma de los 10-

garitmos de las dosis (IX), 1a suma de los cuadrados del logaritmo de las dosis tt Xl) Y la suma del producto de 5)

los probits-Iogaritmos de las dosis (LXY). Caleular los estimadores inicia1es de 1a ordenada al origcn (a 0 ) y de 1a pendiente (b 0 ) can las siguientes

ecuaciones:

L> (L>

1

Pi

Pi

f(z,)

12) Tabular e1 factor de ponderaci6n (Wi) Y el probit de trabajo (v i

Obtener el cuadrado de110garitmo de 1a dosis (x ,2 Tabular los resultados. Caleu1ar la suma de los probits

v. =Y j +

2701

13) Calcular

).

los

siguientes

productos:

njwj • njwjxi'

n i Wi Xi 2 , n i Wi V i ' n i Wi V; 2 , n i Wi V i Xi Y tabular los resultados. 14) Caleular las sumas de los productos indicados en el inciso 2 anterior 2:niwi' L':njwix i , Ln i w i x i , 2

Lniwiv j , Ln i w j v i , Lniwjvjxi 15) Caleular el segundo estimador de 1a ordenada al origen ( a I ) Y e1 segundo estimador de la pendiente (b 1 l,

con:

L;x (L;xy ) k(L;x2 )_(L;X)2 k (L;xy )- L> lL> ) b 0 ~ -'k(r-L;-x2"""')_-;-( L;-x;-:-) 2 2 )-

Lnj'W j

"nwv L...

Donde: k = N umero de dosis en el bioensayo.

I

j

,

Para cada dosis

Para cada dosis

6)

16) Obtener una nueva predicci6n del probit asociado a cada logaritmo de la dosis (y '. ) l con la siguiente ecuaci6n:

Obtener 1a predicci6n del probit asociado a1 10garitmo de la dosis (y i ), con la siguiente ecuaci6n:

1

7)

Transformar 1a predicci6n de cada probit

(y i

)

a su va-

lor asociado en la distribuci6n normal esttmdar (z i

estimados

con la siguiente ecuaci6n: Z;

8)

=Yi-5

Determinar en 1a tabla 9 e1 valor de la probabilidad acumulada (p, ) can base en e1 valor de Zi

9)

.

Determinar en la tabla 9 el valor de la ordenada f (z, l can base en e1 valor de Zi'

10) Calcular e1 factor de ponderacion (w, ) aplicando la siguiente ecuaci6n:

w,

Iy

1 -

Y~

I

Si el valor absoluto de cualquier diferencia es mayor que 0.1; es necesario volver a aplicar el procedirniento a partir del paso 6, sustituyendo ao por a l Y bo par b, en los pasos 15 y 16 a l par a, y b, por b2 , y asi sucesivamente basta que ninguna diferencia sea mayor que 0.1 en el paso 17; en este caso se indica que los estirnadores (b y a) s~ han estabilizado (be, ael. Cuando esto ocurre se procede a efeetuar 1a prueba de linealidad. 5.1,2 PRUEBA DE LINEALlDAD

[fez,

l]'

p, (I-p,)

11) Ca1cu1ar e1 probit de trabajo (v, leon 1a siguiente ecuaci6n:

17) Obtener e1 valor absoluto de 1a difereneia de los probits

),

Si en el ensayo de la preparacion se tienen al menos tres dosis, es necesario investigar el efecto no lineal de Xi sobre Yi' ya que dicho efecto haee invalida 1a estimacion del punto

final alSO %.

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2702

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

PROCEDIMJENTO 1)

Calcular el valor Ji cuadrada (X~alc) con la siguiente ecuaci6n:

M +-g-(M -x I-g

~ X• 1cak,

In iwi iv2

I

\2

b , (I-g)

Donde: -

(i\WjXj)( Iniwiv j ) (

)+ __ 1.9_6_

Lnjwix i

x

LnjW;

In! wi

I\ In.w.v. J I I /

(

Ini wi

,2

I\ In 1.wx I I j)

EI antilogaritmo de los limites, representa los limites del intervalo de confianza para la DEso. 2)

3)

Determinar el valor erilieo de Ji cuadrada (X :"b ) en la tabla 1, fijado por k - 2 grados de libertad, donde k es el numero de dasis ensayadas de la preparacion. Comparar el valor de (X;"/c)eon su valor crflico ( X;ab regia:

),

5.1.4 CALCULO DE LA POTENCIA RELATIVA Y SUS LIMITES DE CONFIANZA I)

y obtener la decision con base en la siguiente

Una vez obtenidos los estimadores estabilizados (ae Y be) para cada preparaci6n por el procedirniento descrito anteriormente, calcular tanto para el patron como para la muestra:

REGLA DE DECISION Lniw i

Si X ;alc ;::: Xt~b' la relaci6n log dosis-probit no es lineaL

Si X;alc < Xt~h' la relaci6n log dosis-probit es lineaL

LXVp ==LnjwiV;Xj

(2:;n i w i xi )(2:;n i w i vi

)

Lniw i

Si la relaci6n log dosis-probit no es lineal, se sugiere consultar a un estadistico; si la relaci6n es lineal, se dice que el ensayo es valido para el caleulo del punto final alSO % Y su intervalo de confianza, can base en el siguiente procedimiento.

LVVp =Ln;w;v;2

5.1.3 ESTIMACION DEL PUNTO FINAL AL 50 % Y SUS LIMITES DE CONFIANZA

(2:;n i w i xi )2

"xv = "n.w.v_x L...mL....'ll'

PROCEDIMIENTO

LVV

m

=Ln;wiv} Lniw i

Caleular el logaritmo del punto final alSO % (M) con la siguiente ecuaci6n: 2)

Y el punto final alSO % (DEso), se obtiene: DEso =10

)'

Lniw i LXX m =LnjWjx}

I)

(2:;n i w i vi

Caleular la pendiente eomlin a ambas rectas (bel:

Lxv + LXV Lxx + Lxx p

m

p

m

M

5.1.5 PRUEBA DE LINEALIDAD COMBINADA Los limites del intervalo de confianza para ellogaritmo de la DEso son:

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

Si en el ensayo se tienen al menos tres dosis par preparaci6n, es necesario investigar el efecto no lineal de Xi sobre Yb ya

Estadistica para ensayos biol6gicos

que dicho efecto haee invalida la estimaci6n de la potencia relativa. EI procedimiento es el siguiente: PROCEDIMIENTO 1)

Caleu1ar e1 valor de Ji cuadrada (X;,,/c):

2

(""

)

ItxvJ

x,,/c~\LVvp+Lvvm-l LXxp 2)

(LXV J 1 Lxx J m 2

+

Determinar en 1a tabla 1 e1 valor crHieo de Ji cuadrada (X ;"b ) ,fijado por k-4 grados de libertad, donde k es 1a

2703

8i las rectas noson paralelas, la estimacion de lapotencia es invaJida; 5i las rectas son paralelas, se procede a calcular la potencia relativa y sus limites de confianza.

5.1.7 CALCULO DE LA POTENCIA Y SUS LiMITES DE CONFIANZA PROCEDIMIENTO 1) Calcu1ar las medias ponderadas para los 10garitmos de las dosis, tanto del patron (x p ) como de la muestra (xm):

surna del numero de dosis de las preparaciones, patr6n y muestra. 3)

Comparar el valor de (X;",,)eon su valor critieo ( X ~b

2)

y abtencr la decisi6n con base a la siguiente

),

Calcu1ar las medias ponderadas para los probits de trabajo. tanto para el patron (v p ), como para la rnuestra (vm ):

regIa:

v

REGLA DE DECISION S·

2

I %eale

;?:

X t~b ' la relaci6n log dosis-probit no es lineal.

S·1 X calc 2 < X t~b ' la relaci6n log dosis-probit es lineal.

3)

p

~n_w.v L...J , , I

~n,w.v L...J , I I

"nw L. , ,

"n.w L. , ,

Caleu1ar e1 10garitmo de 1a potencia re1ativa (M), utilizando la siguiente ecuaci6n: v -v

8i la relacion log dosis-probit no es lineal, el ensayo no es valido para estimar la patencia de la muestra, por 10 que se sugicre consultar a tll1 estadistico; si la relaci6n es lineal, se requiere determinar si las rectas son paralelas, para 10 cual se emplea el siguiente procedimiento:

IIIb

M

,

P+xp"-X m

La potencia relativa (R) se obtiene con la siguiente ecuaci6n: R~IOM

5.1.6 PRUEBA DE PARALELISMO

Si se desea expresar la potencia en unidades, multiplicar la potencia relativa por la potencia en unidades del patron, 0 la potencia asignada a la muestra.

PROCEDIMIENTO

4)

1)

Calcu1ar el valor de Ji cuadrada (X ;",,,) can 1a siguiente

Caleu1ar los limites de eonfianza para e11ogaritmo de la potencia con la siguiente ecuacion:

ecuacion: 2

X eale

+"

xv xv )2 tXVp)2 + (LXV m)2 (" \Lp~m LXxp LXXIII

x p -Xm

Donde: 2)

Obtener 1a decision can base en 1a siguiente regIa:

REGLA DE DECISION Si XZalc ;:;:; 3.84, las rectas no son paralelas. 8i XZal c < 3.84, las rectas son paralelas.

3.84

g~ bc (fxx P + "xx ) L.... III 2

Los limites del intervale de confianza se determinan al obtener el antilogaritmo de cada uno de elIos. Si se desea expresar estos limites en unidades, se rnultiplican por la potencia en unidades del patron, 0 por la potencia asignada a la rnuestra.

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

.......................-----------------

2704

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

5.1.8 EJEMPLO 5.1.8.1 CALCULO DE LA POTENCIA Y SUS LI.MITES DE CONFIANZA DE LA VACUNA PERTUSSIS

x,

n,

r,

p,

y,

0.04

-1.3979

31

26

0.84

5.99

1.9542

-8.3737

0.008

-2.0969

32

9

0.28

4.42

4.3970

-9.2683

0.0016

-2.7959

33

4

0.12

3.82

7.8169

-10.6803

L: = -6.2907 (14.23) (14.1682)- (- 6.2907) (- 28.3223)

b0

y,

= 1.5523 x, + 7.9973

(3) (14.1682)- (- 6.2907)2

=

(3)(- 28.3223)-( - 6.2907)(14.23) (3)(14.1682) -(-6.2907)2

=Yi-5

Z,

Pi

fez i )

L: =

XiYi

14.1682

L: = -28.3223

7.9983

= 1.5523

w_,

=

f(Zi )2

Pi (I-Pi)

Vi

=Y i +

Pi -Pi f(z!)

5.8283

0.8283

0.7967

0.2827

0.4934

5.9815

4.7433

-0.2567

0.3974

0.3857

0.6212

4.4389

3.6583

-1.3417

0.0901

0.1626

0.3225

3.8422

2

2

niwivix i

91.4894

547.2441

-127.8931

87.4051

88.2382

391.6807

-185.0267

-29.7554

83.1930

40.8906

157.1099

-114.3261

L: = -92.8198

L: = 200.4872

L: = 220.6182

L: = 1 096.0347

L: = -427.2459

niwi

njWjXj

niwjxi

15.2954

-21.3814

29.8891

19.8784

-41.6830

10.6425

L: = 45.8163

-427.2459- ([(220.6182)( -92.8198) ]/45.8163} j

x,

L:= 14.23

ao

b

2

d,

200.4872- {( -92.8198)

2/45.8163}

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

1.5839

niwiv j

njWiVj

a j

220.6182 1.5839(-92.8198)=8.0241 45.8163 45.8163

Estadistica para ensayos bio/6gicos

2705

Segunda prediccion del probit. --------------------~--~-

Y. ~1.5839x I

IY i - y;1

+8.0241 '

5.8100

0.0183 0.0405 0.0626

4.7028 3.5957 Ya que 'Pi -

1':1

< 0.1 para todas las dosis, el valor de la pendiente (b) y la ordenada al origen (a) para esta preparacion, se

han estabilizado en los valores de 1.5839 y 8.0241, respectivamente.

PRUEBA DE LINEALIDAD

X2 ,"Ie

~ 1096.0347 (220.6182) [

2]

[ - 427.2459

45.8163

(-92.8198)(220.6182)] 2 45.8163 (_ 92.8198)'

2.48

200.4 8 72 - -,---,c.:::.::..:.cc.::L 45.8163

Ya que 2.48 < 3.48; la relacion log dosis·probit es lineal.

ESTIMACION DEL PUNTO FINAL AL 50 % M =

DE 50

5-8.0241 3 = -1.909 1.5839 :::; 10-1.9093 :::;

0.0 123rnL

CALCULO DEL INTERVALO DE CONFIANZA

x - 92.8198 = -2.0259 45.8163

(Xi -

x)' 6.0325

0.3944 0.0050

0.0994

0.5929

6.3099

L = 12.4418 g=

3.8416 ~0.1231 (1.5839)2 (12.4418)

El intervalo de confianza es:

-1.9093+ 0.1231[_1.9093_ (-2.0259)]+ 1.96 0.8769 (1.5839)(0.8769)

0.8769 + [-1.9093-(-2.0259)]2 45.8163 12.4418

10 C"'1.8932±O.2020) 0.0080 a 0.0204mL 65 a 165%

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2706

Farmacapea de los Estados Unidos Mex/canas, undecima edicion.

MUESTRA 2

di

Xi

ni

ri

Pi

Yi

0.04

-1.3979

33

30

0.91

6.34

1.9542

-8.8629

0.008

-2.0969

33

15

0.45

4.87

4.3970

-10.2120

0.0016

-2.7959

33

4

0.12

3.82

7.8169

-10.6803

L: = 15.03

L: = 14.6182

L: = -29.7552

L: = -6.2907 b = 3(-29.7552)-(-6.2907)(15.03)

Xi

YiX i

1.8027

(3)(14.1682)-(-6.2907)'

o

ao = (15.03) (14.1682)-(-6.2907)(-29.7552) 8.7891 (3)(14.1682)-(- 6.2907f

y;

f(zi )2

Pi -Pi

Zi=Yi- 5

Pi

fCz i )

6.2700

1.2700

0.8980

O. J 781

0.3463

6.3374

5.0100

0.0100

0.5040

0.3989

0.6365

4.8746

3.7500

-1.2500

0.1056

0.1826

0.3530

3.8289

= 1.8027 x, +8.7900

niwix i

2

W,

Vi

p;(l-Pi)

niwjvi

niwiv j

2

=Yi + f(zi)

niwivix i

11.4279

-15.9751

22.3315

72.4232

458.9746

-101.2404

21.0045

-44.0443

92.3566

102.3885

499.1032

-214.6985

11.6490

-32.5694

91.0609

44.6029

170.7799

-124.7051

L: = 44.0814

L: = -92.5888

L: = 205.7490

L: =219.4146

L: = 1 128.8577

L: = -440.6440

(2194146)( - 92.5888) - 440.6440- "--....,..,-':'c:-:-:---'b = _ _ _ _ _~~4~4.~0~81~47---1

1.7930

205.7490- (- 92.5888)' 44.0814 a = 219.4146 1.7930(-92.5888)=8.7435 1 44.0814 44.0814

J; =1.7930x; +8.7435

Ya que

6.2371

0.0329

4.9838

0.0262

3.7305

0.0195

IY i - Y; I < 0.1 para todas las dosis, el valor de la penctiente (b) y la ordenada al origen (a) se han estabilizado en los

valores de 1.7930 Y 8.7435, respectivarnente.

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

Estadistica para ensayas bia/6gicas

2707

CALCULO DE LA POTENCIA RELATIVA Y LIMITES DE CONFIANZA

"'xx L.. LXv

~200.4872- (-92.8198)2 P

45.8163

=-427.2459 (--92.8198)(220.6182)

p

P

19.7072

m

'" xv

458163

L.,

~ 1 096.0347- (220.6182)2

L vv

Lxx

12.4424

(- 92.5888)' 44.0814

~ -440.6440

(-92.5888)(219.4146)

~1128.8577- (219.4146)2

20.2156

36.7244

44.0814

m

b,

11.2750

44.0814

m

LVv

33.698

45.8163

= 205.7490

19.7072+ 20.2156 1.6832 12.4424+ 11.2750

PRUEBA DE LlNEALIDAD COMBINADA X

2 1 me

2 2 19.7072 20.2156 + 12.4424 11.2750

= (33.6968+ 36.7244)-

=

2.96

Ya que 2.96 < 5.99, la relaci6n log dosis-probit es lineal.

PRUEBA DE PARALELlSMO 19.7072' 12.4424

2

2 20.2156 11.2750

2

'-'-'-'-'-'-- + ---'-----'-

X ca1c

[

2

19.7072 + 20.2156 12.4424 11.2750

I

j = 0.26

Ya que 0.26 < 3.84; las rectas son paralelas

CALCULO DE POTENCIA RELA TIVA Y SUS LIMITES DE CONFIANZA x- p

vp

-92.8198 =-2.0259

x

45.8163

~ -92.5888

-2.1004

44.0814

m

-

220.6182 4.8153 45.8163

V

m

219.4146 4.9775 44.0814

M = 4.9775- 4.8153 + (_ 2.0259)- (_ 2.1 004) 1.6832 M =0.1709 R=100

1709

=1.4821

Calcul0 de los limites de confianza: g

=

3.84 1.6832' (12.4424+11.2750)

0.0571

2

1 1 J '-[0"-.1;..70.:..9......;·(_-_2._o2_59-,),,-]+....:...(-_2_.10_0_4-,,) -1.96 (1-0.0571) [- + - - +0.1709-(-.2.0259 l + (-2.1004 l] 1.6832 45.816 44.0814 12.4424+11.2750 [ - 2.0259 - (- 2.1004 l + + ==.:....---======----------1 - 0.0571 }- 0,0571 l,,-J

1OO.1767± 0.2542 10-0.0775

0.8366

a

10°.4309

a 2.6971

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAl.

2708

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

5.2 TRANSFORMACION ANGULAR El procedimiento aqui descrito permite detenninar la potencia de sueros y vacunas, usanda la relaci6n entre ellogaritmo de la dosis y una transformaci6n angular de la variable de respuesta. En este procedimiento se campara el punta final alSO % de una preparacion patron, y una 0 dos preparaciones muestra a tres 0 cuatro dosis, bajo las mismas condiciones de prueba, utilizando el analisis de varianza y el de regresi6n. El primer aniiJisis permite determinar si existen diferencias significativas entre los resultados de la proporci6n de reactores a distintas dosis; si existe una relaci6n lineal entre el logaritmo de las dosis y la transformaci6n angular de Ia proporci6n de reactores, y si las lineas de regresi6n de las preparaciones son paralelas; es decir, se establece la validez del ensayo. El segundo anitlisis permite calcular la potencia relativa de las rnuestras, asi como su intervale de confianza. Las restricciones para el uso de este procedimiento son: que el numero de unidades de prueba (ratones, ratas, cobayos, etc,) por dosis y preparaci6n sean iguales; que las dosis utilizadas esten en progresi6n geometrica, y que las dosis de las preparaciones de la muestra y del patr6n sean equivalentes tanto en numero (3 6 4), como en concentraci6n. Si se desea mas de cuatro dosis, se sugiere consultar a un estadistico.

5.2.1 PROCEDIMIENTO I)

2)

c:i1culos indicados [sumas de cuadrados, cuadrados medios y la raz6n de cuadrados medios (F)]. 5)

Obtener la decision para eada fnente de variacion (preparaciones, dosis, regresi6n lineal, regresi6n cuadratica o regresi6n no lineal en su caso e interacci6n preparacion*dosis). Can base en la regIa de decision respectiva (yease tabla XXIX para ensayos a tres dosis y tabla XXX para ensayos a cuatro dosis). Tabla XXI. Formato de registro de datos de la proporci6n de reactores (Pij) ENSA YO A TRES DOSIS 1 patr6n, 1 rnuestra

Preparacion Patr6np

Pl p

Muestra m

Plm

1 patron, 2 rnuestras Preparacion Pl p

Tabular el resultado de la proporeion de reactores (P'i)' segun los forrnatos de registro para el ensayo empleado (ensayos a tres dosis vease tabla XXI, y a cuatro dosis Yease tabla XXII).

Muestram

PIm

Transformar la proporci6n de reactores (Pi]) al metame-

Tabla XXII. Formato de registro de datos de la proporci6n de reactores (Pii)

p" '1

0::::

0::::

r;;-

2 arcsen liP)} (en radianes). Si para una dosis,

0::::

2arcsen

If

Si para una dosis

ENSAYO A CUATRO DOSIS 1 patron, 1 fiuestra

II, donde n es el nurnero de V4n

unidades de prueba por dosis en el ensayo. Pij "" 1,

Logaritmo de la dosis ( Xl

X2

XJ

X4

Patronp

Pl p

P2p

P3p

P4p

Muestra m

Plm

P2m

P3m

P4m

y. =3.1416-2arcsenJ I y 4n

Registrar la transforrnaci6n, segun los formatos para el ensayo empleado (ensayos a tres dosis Yease tabla XXlII y a euatro dosis Yease tabla XXIV). y cfeetuar los calculos indieados (totales, suma total y suma total de euadrados). Construir una tabla de an:ilisis de varianza, para el ensayo empleado (a tres dosis Yease tab las XXV y XXVI y a euatro dosis vease tablas XXVII y XXVIII). Efectuar los

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

)

Preparation

la transformaci6n se obtiene

con la siguiente ecuacion:

P3p

Muestra z

0, 1a transformaci6n se obtiene con la siguiente

ecuaci6n y,.

4)

P3m

Patr6np

tro y,ij

3)

x,

1 patron, 2 muestras Logaritmo de la dosis (Xi) Preparacion Xl

X2

X3

X4

Patronp

PIp

P2p

P3p

P4p

Muestra m

Plm

P2m

P3m

P4p

Muestra z

Pl,

P2,

P3,

P4z

Estadistiea para ensayos bi%gieos

Tabla XXIll. Formato de Rcgistro y Colculos para la Transformaci6n Y ij

Tabla XXIV. Formato de Registro y Colculos para la

M

= 2 arcsen

Transfonnaci6n Y Ii = 2 arcsen

ENSAYO A TRES DOSIS 1 patron, Imuestra Logaritmo de la dosis (

Patronp Muestra m

Totales

)

Totales X2

Yip

h

p

Y3p

Rp

Ylm Cl

Y2m

Y3m

Rm

C3

I>

Suma total: "'y L-t

Preparaci6n

X3

C2

Patronp

Muestra m

Totales

-

Logaritmo de la dosis ( x, ) ~

Xl

X2

X3

X4

YIp

Y2p

Y3p

Y4p

Ylm

YZm

Y3m

Y4m

Cl

C2

C3

C4

= Y Ip

"'y=y +"+y 4p +y 1m +"'+y 4m L.; Jp

+'''+y 3p +Y 1m +"'+Y 3m

Suma de los cuadrados:

""2 L.,Y = Yip +".+ Y3p + Yl m +".+ Y3m

2: Y

Suma de los cuadrados de los totales:

Suma de los cuadrados de los totales:

Par renglon

Par renglon

Porcolumna

Por columna

2

2

2

2

2

2

Muestra m

Y2p

Muestraz

YJm

h,

Yl z

Totales

Y3p

Y2m

Yim

C2

Cj

Rp Rm

YJ,

R,

CJ

L:y

Suma total:

'" R2 =R2 +R2

L.J

p

m

)

Preparacion Patron p Muestra m

Muestra z

Totales

TOTA LES

Xl

X2

X3

X4

Yip

Y2p

Y3p

Y4p

Rp

Ylm

Y2m

Y3m

Y4m

Rm

Yi,

Y2,

Y3,

Y4,

R,

C2

C3

C4

I>

Cl

Suma total:

LY=Y jp

+··+Y 3p + Y lm +"+Y3m + Ylz

Suma de los cuadrados: 2

2.

Logaritmo de la dosis (

Logaritmo de la dosis (

Yip

2

1 patron, 2 muestras

Preparacion --"'------------'- Totales X2 X3 Xl

Patronp

2

=y Ip +"'+y 4p +y 1m +"'+Y 4m

1 patron, 2 muestras

Y

Totales

Suma de total:

Suma de los cuadrados:

I

M

ENSAYO A CD ATRO DOSIS 1 patron, 1 muestra

Preparacion Xl

2709

2

2

2

2

I

Suma de los cuadrados de los totales:

Por columna

p

IC' =C

2 1

In

Y

2

2

2

2

2

=y lp +"'+y 4 P +y 1m +"'+y 42

Suma de los cuadrados de los totales:

'" R2 =R2 +Rz +R2 ~

"'y=y +"+Y 4p +Y 1m +"+Y 4m +y'Iz +"+Y 42 L....J lp

Suma de los cuadrados:

=y lp +"'+Y 3p +Y 1m +"'+Y 32

Por reng16n

+"+Y3z

Por reng16n

Z

+C: +C:

Por columna

5. ENSAYQS DE RESPUESTA CUANTAL

2710

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Tabla XXv. AmUisis de Varianza ENSAYO A TRES DOSIS 1 patron, 1 muestra

Fuente de variacion

Grados de libertad

L:;R

SC p

Preparaciones

Dosis

2

Regresion lineal

2

Error

n

CMp =SCp

(L:;y)

3

2

CM d

9

(C 4 -C l

pd

SCd

CM d CM

2

CM

)2

CM

=SC r

6 (C 3 -2C 2 +C l

CM

,

CM

)2

CM, =SC, CM

18 LC 2 (Ly)2

SC

Fcafc

2

9

L:;C 2

SCd

SC ,

Interaccion preparacion*dosis

(L:;y)

2

3

SC, =

Regresion cuadratica

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

LR2 =Ly2 - - - - - - + - 3 3 9

SC pd CM pd = - 2 1 CM, n

CM

pd

CM,

Tabla XXVI. Analisis de Varianza ENSAYO A TRES DOSIS 1 patron, 2 muestras

Fuente de variaci6n

Grados de libertad

L:;R

(L:;y)

2

Preparaciones

2

SC p = - - 3

Dosis

2

SC

Regresion lineal

d

L:;C 2 3

4

Error

n

SC

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2

CM d

9 ) 2

CM

SCd 2

=SC ,

6 (C 3 -2C 2 +C!

) 2

CM , =SC ,

18 =

pd

(L:;y)

F eale

SC p CM p = - 2

9

(C 4 - C l

SC,

Interacci6n preparacion*dosis

2

=---

SC ,

Regresion no cuadratica

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

2 LR2 Lc 2 (Ly)2 LY - - - - - - + - 3 3 9

SC pd CM pd CM

4

n

CM d CM CM CM CM

,,/

CM CM

pd

CM ,

Estadistica para ensayos bio/6gicos

2711

Tabla XXVII. Anitlisis de varianza ENSAYO A CUATRO DOSlS ] patron, I muestra

Fuente de variacion

Grados de libertad

L,R 2

Preparaciones

Dosis

3

Regresion lineal

SC p

~--

SCd

~

SC,

Regresi6n no lineal

2

Interacci6n preparacion*dosis

3

Error

n

Cuadrados medios

Sum. de cuadrados

4

L,C

2

(L,y)

~SC

eMp

8 (L,y) 2

2

~

2

SCd

CM

3

CM

--

CMd

8

p d

CM

(3C 4 +C 3 -C 2 -3C 1 )2

~SC

CM,

40

,

sen!

eM nl

~--

2 SC pd

CM pd

CM

"

CM "' CM, CM

pd

~--

3

CM ,

CM,

n

Tabla XXVIII. Analisis de varianza ENSAYO A CUATRO DOSIS 1 patron, 2 muestras ~Fuente de variacion

Preparaciones Dosis

Grados de !iliertad 2

3

Regresi6n lineal Regresion no lineal

Suma de cuadrados L,R 2 SC p

SC,~

(L,y) 2 (L,y)

2

SC 2

p 2

SCd

CMd

3

CM ,

~-

CM

~---

d

12

(3C 4 +C 3 -C 2 -3C 1 )2

CM ,

60

~SC,

6

Error

n

SCpd

L,1/ 2

L,c 2

(L,y)2

4

3

12

~L,y2 ~~~-----+

CM

pd

CM ,

CM , eM-ill

2

CM ,

SC

CM pd

6

CM ,

"'

Interacci6n preparacion*dosis

CM ,

sc

eM =-'-"

2

Peale

~--p

CM

12

4

L,C 2 SCd

Cuadrados medios

~~

n

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2712

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Tabla XXIX - Reg!as de decision ENSAYOS A TRES DOSIS 1 patron, 1 muestra Fuente de variaci6n Si ~'alc :2:: 3,00 Dosis Si Fmk < 3 .00

Regresion lineal Si Fmk < 3.84 Si F::atc ~ 3.84 Regresion euadratiea Si Fea ", < 3.84

RegIa de decision Ellogaritmo de la dosis tiene efeeto sobre Ia transformacion angular de Ia proporeion de reaetores, Ellogaritmo de la dosis no tiene efeeto sobre la transformaeion angular de Ia proporcion de reactores. Ellogaritmo de Ia dosis tiene efeeto lineal sobre la transformacion angular de la proporei6n de reaetores, Ellogaritmo de 1a dosis no tiene efeeto lineal sobre la transformaeion angular de la proporcion de reaetores. Ellogaritmo de Ia dosis tiene efeeto euadratieo sabre la transformacion angular de la proporcion de reaetores. Ellogaritmo de la dosis no tiene efeeto euadnitieo sobre la transformaeion angular de la proporeion de reaetores,

Si

Feale

~ 3.00

Se presenta interaecion preparacion*log dosis.

Si

Feale

< 3,00

No se presenta interaecion preparaeion*log dosis.

Interaecion preparaeion*dosis

1 patron, 2 muestras

Fuente de variaci6n Dosis Si F",,,

< 3.00

Si F wte ?:

3.84

Regresion lineal Si Feate

< 3.84

Si Feat, ?: 3.84 Regresion euadratiea Si Feat,

< 3.84

Si F,,,t, ?: lnteraecion preparaeion*dosis

Si Fe,,"

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2.37

< 2.37

Regia de decision Ellogaritmo de la dosis tiene efeeto sobre la transformaeion angular de la proporcion de reactores, Ellogaritmo de la dosis no tiene efeeto sobre la transformacion angular de 1a proporeion de reaetores, Ellogaritmo de Ia dosis tiene efeeto lineal sobrc la transformacion angular de la proporcion de reaetores, Ellogaritmo de la dosis no tiene cfeeto lineal sabre la transfonnacion angular de Ia proporeion de reactores, Ellogaritmo de 1a dosis tiene cfeeto cuadnitieo sobre 1a transformacion angular de la proporeion de reactores. Ellogaritmo de Ia dosis no tiene efeeto euadnitico sabre Ia transformaeion angular de la proporeion de reaetores. Se presenta interaeeion preparaeion*log dosis. No se presenta interaeei6n preparacion*log dosis.

Estadistiea para ensayas bia/ogieos

2713

Tabla XXx. Reglas de decision ENSAYOS A CUATRO DOSIS 1 patron, 1 muestra

Fuente de variacion

Si F~a" < 3.00

RegIa de decision Ellogaritmo de Ia dasis tiene cfecto sabre Ia transformaci6n angular de Ia proporci6n de rcactores. Ellogaritmo de Ia dosis no tiene cfecto sobre Ia transformaci6n angular de Ia proporci6n de reactores. Ellogaritmo de Ia dasis tiene cfecto lineal sobre Ia transformaci6n angular de Ia proporci6n de reactores. Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto lincal sobre la transformacion angular de Ia proporci6n de reactores. Ellogaritmo de Ia dosis tiene cfecto no lineal sobre Ia transformacion angular de Ia proporci6n de rcactores. Ellogaritmo de Ia desis no tiene cfecto no lineal sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores.

Si Fcalc ~

Se presenta interaccion preparacion*log dosis.

Dosis

Si F~ah < 2.60 Regresion lineal

Si F eate < 3.84 Si F eate 2: 3.00 Regresion no lineal

Interaccion preparacion*dosis Si

FeaZe

2.60

< 2.60

No se presenta interaccion preparacion*log dosis.

1 patron, 2 rnuestras

Fuente de variaci6n

Si Feate 2: 2.60 Dosis

Si Feat, < 2.60 Regresion lineal

Si Feat, < 3.84 Regresion no lineal

Si Fealc < 3.00 Si lnteraccion preparacion*dosis

Fcale ~

2.10

Si Fm/c < 2.10

Regia de decision Ellogaritmo de la dosis tiene efecto sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Ellogaritmo de la dosis tiene efecto lineal sobre la transfonnacion angular de la proporcion de reactores. Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto lineal sabre la transfonnacion angular de la proporcion de reactores. Ellogaritmo de la dosis tiene efecto no lineal sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Ellogaritmo de la dosis no tiene efecto no lineal sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Se presenta interaccion preparacion*log dosis. No se presenta interaccion preparacion*log dosis.

Que ellogaritmo de la dosis tenga efecto lineal sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Que no se presente interaccion preparaci6n*log dosis, es decir, que las lincas de regresion de las preparaciones sean paralelas.

5.2.2 V ALIDEZ DEL ENSA YO

3)

Para efectuar tanto el calculo de la potencia relativa como el de Sll intervalo de con'fianza es necesario asegurar que el ensayo satisface las sigllientes condiciones:

4)

Para un ensayo a tres dosis:

Para un ensayo a cuatro dosis:

I) 2)

Que el 10garitmo de la dosis tenga efecto sobre la transformaci6n angular de la proporci6n de reactores. Que el logaritmo de la dosis no tenga efecto cuadnitico sobre la transformacion angular de la proporci6n de reactores.

1) 2)

Que el logaritmo de la dosis tenga efccto sobre la transforrnaci6n angular de la proporcion de reactores. Que el logaritmo de la dosis no tenga efecto no lineal sobre la transformaci6n angular de la proporci6n de reactores.

5. ENSAYQS DE RESPUESTA CUANTAL

........................------------..

2714

3)

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Que ellogaritmo de la dosis tenga efecto lineal sobre Ia transformaci6n angular de la proporci6n de reactores. Que no se presente interacci6n preparaci6n*log dosis, es decir, que las lineas de regresi6n de las preparaciones sean paralelas.

4)

2

LX

2

2

2

=X I +x 2 +x 3

Tabla XXXII

Cuando por las reglas de decisi6n una 0 mas condiciones no se cumplan en el ensayo, se dice que este no es valida para el caleulo dc la potencia de la(s) muestra(s), por 10 que se sugiere consultar a un estadistico.

Caleulo de Ia penctiente comun (b), y de Ia ordenada al origen (a) para ensayos a cuatro dosis

1 patron, 1 muestra

Si el ensayo cumple con los requisitos, este es valida para el caleulo de la potencia relativa de la(s) muestra(s), procedimiento que se describe a continuaci6n.

b ~ _4.::L:...-X_C_-L.:::...-X.::L:...-C_ 2[4Lx 2 -(LX)'

5.2.3 CALCULO DE LA POTENCIA RELATIVA Y SU INTERVALO DE CONFIANZA

1

b~

Calcular la pendiente comun (b), as! como la ordenada al origen (a) para cada preparaci6n segun el disefio empleado (vease tabla XXXI, si es un ensayo a tres dosis 0 tabla XXXII, si es un ensayo a cuatro dosis).

3[4Lx2 -(LX)'

p

4

Rm -bLx am

ap

4

a rn a

1

~

3

am

Rrn -bLx 4

R" -b(Lx)

3LXC-LXLC

b

3[3Lx' -(LX)'

Rp -b LX ap

4

1 patron, 2 muestras

3LXC-LXLC 2[3Lx' -(LX)'

Rp -bI>

Donde:

Caleulo de Ia pendiente comun (b), y de Ia ordenada al origen (a) para ensayos a tres dosis

b

1

4

Tabla XXXI

1 patron, 1 muestra

4LXC- LXLC

-=--=-=--

Rp -b LX a

PROCEDIMIENTO I)

1 patron, 2 muestras

Rp -b LX ap

Rm -b LX 3 -----------

1

3

Rm -bLX am a

Donde:

LC~C, +C 2 +C 3 2:x=Xj +X2 +X3

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

3

R"-b:L> ~

3

2)

Caleular el logaritmo de la potencia rclativa de Ia(s) muestra(s) (Mm' Mz), asi como su intervalo de confianza para el disefio empleado. Vease tabla XXXIII, si es un ensayo a tres dosis 0 tabla XXXIV, si es un ensayo a cuatro dosis,

La potencia de laCs) muestra(s) (IOM m , 10M") puede ser expresada en porcentaje de 1a del patr6n, 0 en terminos de unidades, al multiplicar la potencia de este por la potencia relativa; el mismo concepto se aplica a los limites del intervalo de confianza de la(s) muestra(s).

Estadistiea para ensayos bi%gieos

2715

Tabla XXXIII. Calculo dellogaritmo de la potencia relativa (M) y su intervalo de confianza ENSAYO A TRES DOSIS Diseiio

lntervalo de confianza

Logaritrno de Ia potencia relativa

I patron 1 rnuestra

Mm

=

Mm

1 patron 2 muestras

M,

a m -a p

M

b a m -a p

10

b a , -a p

10

b

10

M

±1.96_1_ ~

0 1

±1.96-

~

0

1 M ±1.96__

"

0

Tabla XXXIV. Calculo dellogaritmo de 1a potencia relativa (M) y su intervalo de confianza ENSA YO A CUATRO DOSIS Logaritmo de Ia potencia relativa

Disefio

I patron 1 muestra

M m

Mm

I patron 2 muestras

M,

=

a

Intervalo de confianza

-a m

1

±i,96-

M p

a m -a p

M

10

b

Para dctcnninar Ia potencia del componente pertussis de la vacuna DPT, se utilizo un ensayo a cuatro dosis (0.96, 0.24, 0.06 y 0.015 mLl, empleando 12 ratones por tratamiento y siendo 1a potencia del patron de 8 Ul/mL. Los resultados fueron los siguientes:

1_ ±1.96 _ _

W M±L9~

a , -a p

5.2.4.1 CALCULO DE LA POTENCIA Y SUS LIMITES DE CONFIANZA DEL COMPONENTE PERTUSSIS DE LA V ACUNA DPT

m

10

b

5.2.4 EJEMPLO

J4nb2

m

10

b

"

J4nb 2

Preparacion -~ ._____~!l~~!!,!!!!O de Ia dosis__ Totales -0.018 -0.620 -1.222 -1.824 5.375 Patr6np 2.300 1.738 1.047 0.290 2.094 5.988 Muestra m 2.557 1.047 0.290 Totales (9 4.875 2.094 3.832 11.363 0.580 Suma total: 2.:>=2.300+2.557+ ,,+0.290=11.363 Suma de los cuadrados: 2

2

2.:>' = 2.300 + 2.557' + .. +0.290 = 21.594

Patronp Muestra m

0.833 0.917

0.583 0.750

0.250 0.250

Transformaci6n y"I) = 2 arcsen ,jPij ~ en radianes.

0.000 0.000

Suma de los cuadrados de los totales: """

L,R 2 =5.375 2 +5.988 2 =64.747

Le' =4.857

2

2

2

+3.832 +2.094' +0.580 =42.996

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2716

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Tabla XXXV Anitlisis de varianza

Fuente de variacion

Grados de Iibertad

Preparaciones

SC p

4

8 11.363 2

se nl = 5.358- 5.306= 0.052

3

SC

d

r~ab

CM d =1.786

21.52

2.60

5.306 CM = 5.306 ,

63.93

3.84

CM nl =0.026

0.31

3.00

eM pd =0.016

0.19

2.60

CM p =0.047

l'

40

2

p

Feak

=0.047

5.358 2 8 [3 (0.580) + 2.094- 3.832- 3 ( 4.857)

SC,

Error

11.363 2

SCd = - - - -

Regresion lineal Regresion no lineal Interaccion preparacion*dosis

64.747

---42.996

3

Dosis

Cuadrados medios

Suma de cuadrados

64.747 42.996 11.363' =21.594------+---=0.049 428

eM e = 0.083

12

REGLA DE DECISION

a

Ya que 21.52 > 2.60, ellogaritmo de la dosis tiene etecto sobre la transformacion angular de la proporci6n de reactores. Ya que 63.93 > 3.84, ellogaritmo de la dosis tiene efecto lineal sobre la transformacion angular de la proporcion de reactores. Ya que 0.31 < 3.00, ellogaritmo de la dosis no liene cfeeto no lineal sobre la transformaci6n angular de la proporcion de reactores. Ya que 0.19 < 2.60, no se presenta efecto de interacci6n preparacion *log dosis.

p

a

5.375-(1.210)(-3.684) 4

= 5.988- (1.21 0)( -3.684) = 2.611

4

m

Potencia relativa de la muestra: M

=

2.611-2.458

10°. 126 = 1.338

La potencia de la muestra en unidades es: 8(1.338)=10.70 UI/mL

EI intervalo con 95 % de confianza para la potencia relativa de la muestra es: L96

CALCULO DE LA POTENCIA Y DEL INTERVALO DE CONFIANZA

LC = 4.857+ 3.832+ 2.094+ 0.580= 11.363 Ix = ( -0.0 18) + (-0.620) + ( -1.222) + (-1.824) = -3.684 ",2

L.,x

IxC

2

2

2

2

= (-0.0 18) + (-0.620) + (-1.222) + (-1.824) = 5.205 = 4.857 ( -0.0 18) + 3.832 ( -0.620) + 2.094 ( -1.222 ) + + 0.580 ( -1.824 )= -6.080

b

4(-6.080) -( -3.684)(11.363) 2[4(5.205)-(-3.684)']

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

1.210

0.126

1.210

m

VALIDEZ DEL ENSAYO Con base en las reglas de decision, se dice que el ensayo es valido para el calculo de la potencia relativa y el intervalo de confianza.

2.458

10 [

O.126e

J4(ll)(l.2l0j'

1 =

1O(oll6±0.,34)

Intervalo: 0.780 a 2.291

Expresado en unidades: 6.24 a 18.33 UI/mL

5.3 TRANSFORMACION LOGiSTICA DE WILSON Y WORCESTER E1 procedimiento aqui descrito permite detenninar la potencia relativa de una muestra con respecto a una preparacion patron en funcion de sus puntos finales, alSO % (DE,o); asi como el intervalo de confianza de la (DEso) para cada preparaci6n.

Estadistica para ensayos bio/6gicos

factor de correecion para el punto final a1 50 %para 1a preparadon patron (dp ), su desviacion estandar (Sd,),

EI procedimiento esencialmente es una interpolacion lineal en Ia curva de mejor ajuste log dosis-respuesta, utilizando la transformaci6n logistica de Wilson y Worcester de Ia propordon de reactores, y el tinieD requisito de validez que se investiga es el paralelisrno. Para aplicar este procedimiento se sugicre que por ensayos previos se haya demostrado que las dosis emp1eadas presentan un efeeto lineal sabre e1 metametro de 1a respuesta, por un metodo formal. El disefio del ensayo debe reUllir las siguientes caracteristicas: 1) 2)

Que se emp1een Ires dosis por eada preparaeion, igua1mente espaciadas en progresi6n geometrica. Que el numero de unidades de prueba (multip1os de 160 de 10) sean equiva1entes para todas las dosis de ambas preparaciones, 0 no difieran en mas de 2 de Sil valor nominal.

el factor de correcci6n para la pendiente de esta prep aracion (ep ), asi como su desviaci6n estandar (se p ). La

tabla 11 se puede utilizar cuando e1 numero de unidades de prueba por dosis es 10 0 un multip10 de 10, • De manera semejante, determinar en la tabla apropiada el factor de correccion para e1 punto final a1 50 % para Ia preparaci6n muestra (dm), su desviacion estandar (Sd ) y el factor de correccion para Ia pendiente de esta m

preparacion (em), asi como la desviacion estandar (se m

).

5.3.2 PRUEBA DE PARALELISMO 1)

5.3.1 PROCEDIMlENTO 1)

2717

Ca1cu1ar 1a pendiente para 1a preparacion patron (hp ) Y para Ia preparacion muestra (b m), emp1eando las siguientes ecuaciones:

Tabular los resultados de 1a proporcion de reactores con base en el siguiente formato:

e

~-p

b p

bm

J

=

J

Donde:

Preparacion Patronp

2) Logaritm-,,-~ela

dosis ( x; )

Caleu1ar e1 error estandar de Ia diferencia de las pendientes:

- - -

Preparacion

(Sec S

Xs

b

Caleular e1 valor de t de Student:

b -b

t

Donde: r = Numero de reactores. n= Numero de unidades de prucba por combinaci6n de dosis preparacion. 2)

Calcu1ar Ia ordenada a1 origen (a) y 1a pendiente (b) tanto para el patron como para la muestra, por media de las siguientes f6rmulas: ap

~3-2(P

Ip

+P2p +P3P );

b P =P3p -Plp

Si bp 0 bm son menores que 0.3, no se puedcn ernplear las tab las, por 10 que se requiere, 0 bien utilizar un metoda formal de caleulo 0 repetir el ensayo.

3)

Determinar los factores de correcci6n y Sil desviaci6n estandar, • Con base en el valor absoluto de Q p y el valor de bp , determinar en 1a tabla 10 (n - 160 sus mu1tiplos), el

)1.4142

2J,J;;

Muestra m 3)

+Se",

=_p __ m

calc

S b

Obtener la decision con base en la siguiente regIa. REGLA DE DECISION Si Si

It,,,,,1 Ilc,kl

2: 1,96 el ensayo no satisface 1a prueba de para1elismo,

< 1.96 c1 ensayo satisface 1a prueba de para1elismo,

Si el ensayo satisface la pnleba de paralelismo, se dice que la estimaci6n de la potencia relativa es valida; en caso contrario, se sugiere repetir el ensayo.

5.3.3 CALCULO DEL PUNTO FINAL AL 50 %, LIMITES DE CONFIANZA Y POTENCIA RELA TTV A. 1)

Ca1eular e1 p"mto final a1 50 % para Ia preparacion patron (DE5(Ip) y para 1a preparacion muestra (DEsom), eon base en las siguientes restricciones:

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

2718

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edic;6n.

DE50p = 1 rf 2 + dpf

e p =1.l5±1.23

e In =0.97±1.07

= 1 OX2 -dpf

DE SOp

= lOx 5 +d mf

DE

Prueba de paralelismo.

50m

x5 d DE 50m = 10 - ",f

P

Calcular el intervalo de confianza para la DEsop Y el intervalo de confianza para la DE som :

2)

10[

log DE 50p±

od

1.15 = 1.645 0.6990

=

b

bm

=

0.97 =1.388 0.6990

Error est!lildar de la diferencia de las pendientes

f]

(1.23 + 1.07) 1.4 I 42 - - - - ' - - - = 0.582 2 (4)( 0.6990)

~

..tn

t de Student t calc --

1.645-1.388

0.442

0.582

EI resultado de los limites puede ser expresado en porcentaje respecto de la DEso, tanto para la preparacion patron como para la preparacion rnuestra.

Como 0.442 < 1.96, el ensayo satisface la prueba de paralelismo.

3)

Calculo de las DEso

Calcular la potencia relativa de la preparacion rnuestra con respecto a la preparacion patron:

Yaqueap>O

= 10 l-2.3979+0.13 (0.6990) J = 10-2.3070

DESOp

DE 50 p

DESOm

=0.0049mL Ya que am = 0

EI resultado puede expresarse en unidades, al rnultiplicar la potencia relativa por el contenido en unidades del patron

DEsOm

10 [-2.204lt-0(0.6990)J

=

=10-2.2041

=0.0062mL 5.3.4 EJEMPLO. PRUEBA DE POTENCIA DE LA

VACUNA PERTUSSIS, UTILIZANDO 16 RATONES POR TRATAMIENTO Logaritrno de la dosis ( Xi ) -1.6990 -2.3979 -2.0969

Preparacion Patron p (8UP/rnL)

0.9375

0.3125

Calculo de timites de confianza Patron:

[ -2.307Qt

(0.68)( 0.6990)

10

J

4

Por 10 tanto los limites de confianza para el patron son:

0.1250

0.0038 mL a 0.0065 mL Como porcentaje de la media:

Preparacion

100 (0.0038 mL)(--)=78 % 0.0049

Logaritrno de la dosis ( X I )

-

____

-1.5052

-2.2041

-2.903 I

0.8750

0.5000

0.1250

Muestra m

(0.0065 [-2.2041±

Muestra: a p = 3 - 2(0.9375+ 0.3 I 25+0.1250) = 0.25

b p =0.9375-0.1250=0.8125 a b

m m

=3-2(0.8750+0.5000+0.1250)=0

10

mL)(~)~133

(0.75X 0.6990)

%

l

4

a

10-2 .3352

10-2.0730

Por 10 tanto los limites de contianza para 1a rnuestra son: 0.0046

= 0.8750-0.1250=0.75

0.0049

a

0.0085 rnL

Como porcentaje de la media:

De acuerdo con la tabla 10: d p =0.13±0.68

d m =0.00±0.75

5. ENSAYOS DE RESPUESTA CUANTAL

(0.0046 mL)( ~) ~ 74 % 0.0062

Estadistica para ensayos bio/6gicos

100 (0.0085 mL)(--) ~ 137 % 0.0062

Ca!culo de la potencia relativa: 0.0049 0.0062

4)

= 6.32 UP/mL

5.4 METODO DE REED-MUENCH Aunque hay razones para preferiT el metoda de caieulo de Spearman-Karber, el metoda de Reed-Muench aim se usa en algunas ocasiones, por tal motivG, se describe a continuaci6n, LJ. Reed y H. Muench hicieron una sugercncia ingeniosa para la estimacion rapida de una DEso. EI fundamento del metoda consiste en utilizar, a las dOB diluciones criticas entre las que se encuentra el punta final al 50 %, grupos mas grandes de unidades de prueba que 10 que en realidad se incluyeron a esas diluciones. Asi, se supone que una unidad de prucba que responde a una dasis inferior a una dosis dada, debe responder a esta dosis. Igualrnente, se considera que una unidad de prucba que no respondi6 a una dasis dada, no respondera a dosis menores.

5.4.1 PROCEDIMIENTO La interpo1acion entre los logaritmos de las dosis contiguas donde se halla comprendido el 50 % de reactores, se efeetua can la siguiente formula: M=x pa 2.5eo) 0 con crecimiento confluente, se consideran no contables. El procedimiento de amilisis aqui descrito se inicia con una prueba de bondad de ajuste para cada dilucion, describiendose posterionnente el procedimiento para detenninar Ia validez del efecto de dilucion y el procedimiento para el caleulo de UFC. Ademas sc describe la prueba de homogeneidad de la diluci6n inicial.

Nota: es conveniente mcncionar que todos los recipientes de una misma diluci6n se deben ajustar a una distribucion uni~ forme, pero las preparaciones de diferentes diluciones se ajustan a lUla distribucion de Poisson. Es declr, intradiluci6n debe haber uniformidad y entre diluciones hay un comportamiento de Poisson.

Sustituyendo en (7): - 3.75± 1.96,fiJI5

- 3.75±O.76 a 10- 2 .99

10- 4 .51

6. ESTIMACION DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS EN LA VACUNABCG 6.1INTRODUCCION EI caleulo de unidades formadoras de colonias (UFC) es la prueba basica en el control de calidad de la vacuna BCG. En esta se inocula un volumen definido de cada una de tres diluciones al doble de una suspension de vacuna, bien en 5, 5 Y 10 0, par duplicado en 3, 3 y 6 recipientes que contenga un media de cultivo solido apropiado. Al elegir los niveles de diluci6n para una cuenta viable, es necesario definir primero un nurncro optimo de colonias por recipiente (co), que no sea muy pequeno, pero 10 suficiente para asegurar colonias discretas y facilmente contables. Se pretende abtener este numcro en el nivel intermedio de diluci6n, con el fin de que para variaciones moderadas, al menos en uno de los tres niveles se obtenga siempre un numero apropiado de colonias. En el caleulo de UFC se les da una mayor ponderacion a las colonias para el nivel de diluci6n que en promedio de un numero menor 0 igual al 6ptimo de colonias, se da una menor ponderaci6n al nivel de diluci6n que de en promedio hasta dos veces el 6ptimo (:::;; a 2eo) y una minima 0 nula ponderaci6n a niveles de diluc16n que en promedio, den mas del doble del optimo. Cuando el numero de UFC en un recipiente sea mayor de 2.5 veces el 6ptimo, el resultado se registra como: exceden ellimite.

6.2 PRUEBA DE BONDAD DE AJUSTE UNIFORME PARA CADA UNA DE LAS DILUCIONES El numero de colonias por recipiente para una diluci6n en particular esta sujeto al error de muestreo; en consecuencia, las cuentas variaran de recipiente a recipiente debido a este error y pueden variar aun mas debido a errores ajenos a este. La distribuci6n empirica que describe Ia variaci6n entre las cuentas, debe concordar razonablemente con las predicciones que pueden obtenerse a partir de una distribuci6n te6rica, denominada Distribuci6n Uniforme. La medida de esta concordancia pennite determinar con razonable certeza sl las variaciones en las cuentas obtenidas son producto del error de muestreo 0 manifiestan un error adicional que puede invalidar Ia prueba. Para determinar la concordancia de Ia distribuci6n uniforme con los resultados obtenidos, se hace uso de una prueba estadistica conocida como Bondad de Ajuste, que debe satisfacer una suposici6n a priori de asignaci6n al azar de las diluciones a los recipientes. El procedimiento se aplica s610 a aquellas diluciones cuyos recipientes sean contables. 6.2,1 PROCEDIMIENTO I)

Determinar el numero de recipientes contablcs par dilucion (r).

2)

Calcular la suma de las colonias en todos los recipientes:

riv, J

l 3)

,~,

Obtener el cuadrado de cada cuenta (y:) y caleular la

l( t; ,

Se cuentan y registran las UFC en cada recipiente, de acuerdo con las siguientes consideraciones: los recipientcs con cuentas dentro del limite (::; 2.5m), que excedan ellimite (> 2.5(0) Y

suma de los cuadrados de las euentas

y ;

6. ESTIMACI6N DE UNIDADES FORMADORAS DE COLON lAS EN LA VACUNA BCG

2724

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

Recipiente

Cuadrados de cada cuenta de colonias

Numero de colonias / recipiente (y;)

2

(Y, )

y,

y,2

2

y,

Y2

3

Y3

YJ

4

Y4

y~

r

y,.

y, y,

x calc-X/ab' 2 > 2

la variaci6n de las cuentas en la dilucion,

muestra otro componente de error ademas del error de muestreo. En este ultimo caso, se sugiere repetir la prueba e investigar, si es posible, la causa del error.

2

Cuando se han ensayado varias vacunas, 0 se han llevado a cabo repeticiones de una misma vacuna bajo las mismas condiciones, es posible surnar los valores de li-cuadrada obtenidos de las diluciones individuales. Los grados de libertad deben tambien sumarse. El valor de Ji cuadrada asi obtenido, proporciona una base mas confiable para efectuar la prueba de bondad de ajuste.

2

2

,

:i:

I>, =n

2

2

Yi

6.2.2 EJEMPLO

1=1

i-I

4)

Si

Las cuentas obtenidas en una diluci6n de vacuna BeG fueron las siguientes:

Caleular el valor de Ji-cuadrada (x calt:: 2 ).

17,15,20,ct*, 16, 16,18 ct*

= Recipiente contaminado Ly=17+15+ ... +18=102 ~

",-,Y

2

2 %calc

Dado que las frecuencias esperadas Ei

SOn

todas iguales y

2

2

+15 + ... +18

2

=1750

=6(1750)_102=0.94 102

2

X 1ab = 11.07

es la media de las frecllencias observadas en los recipientes.

:2:>,

=17

REGLA DE DECISION Ya que 0.94 < 11.07, la variaci6n de las cuentas en la dilucion se debe u.nicamente al error de muestreo.

1",1

y=-r

X ~alC

Los siguientes val ores de X 2

calc

se obtuvieron para una setie

de tres diluciones de una vacuna: ( , X ~alc

:;;:;:

r

-2:),

r-l

Xcalc

Xlab

5

4

12,47

9,49

1=1

5)

Determinar el valor critico de Ji-cuadrada de la tabla 1, x , , considerando los grados de libertad (m'llnero de re-

'"'

6)

cipientes menos 1, r-l). Comparar el valor caleulado de Ji-cuadrada

5

4

3.14

9,49

10

9

7.05

16.92

Total

17

22.66

27.59

Como se observa, el primer valor de Xv calc 2 indica que la va-

con el

riacien de las cuentas muestran otro componente de error, ademas del error de muestreo, ya que X 2 > X2

valor critico y obtencr una decision segUn la siguiente regia:

(12.47> 9.49); sin embargo, ya que la suma de los valores

X;a

Ie

REGLA DE DECISION Si

2

2

r

:dalc < X~b' la variaci6n de las cuentas en la diluci6n se

debe imicamente al error de muestreo.

calc

tab

de X;alc es menor que el valor critico correspondiente a la suma de los grados de libertad (22.66 < 27.59), se concluye con esta base mas confiable que las variaciones de las cuentas para las tres diludones se debe unicamente al error de muestreo.

6. ESTIMACI6N DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS EN LA VACUNA BCG

Estadistica para ensayos bio/6gicos

6.3 PRUEBA DEL EFECTO DE LA DILUCION

5)

De aqui en adelante los niveles de diluci6n para la vacuna se designanill como dlo d 2 Y d 3, siendo esta ultima Ia mas diluida. Ya que en esta prucba se utiliza uu factor de dilucion 1:2, y si se tiene que d, es 1 : 20 000. entonces d2 es 1 : 40 000 Y d3 es 1 : 80 000. Asimismo. si las diluciones son efectuadas correctamente, el cfccto de la diluci6n sabre las medias de las cuentas de las UFC de cada dilucion, que se designan como PI' Y2' Y3' podria plantearse de Ia siguiente manera:

Y2 debe ser el doble de Y3'

Cy 2 ~ 2Y3) y .P, debe ser

lasumade Y2 mas el doble de

Y3'

G'~Y2+2YJ),conla

variacion propia del muestreo. La duplicidad de .Y3 se debe a que en el procedimiento, se asigna a la tercera diluci6n el dohle de recipientes con respecto a las dos primeras diluciones. EI procedimiento aqui dcscrito pennite determinar si el efecto de la dilucion en las medias de las cuentas de las UFC es el esperado; en caso contrario, se sugicre repetir la prucba e investigar, si es posible, Ia causa del error. El siguiente procedimiento se aplica cuando todas los recipientes son contables y se satisface la prueba de bondad de ajuste de la diluci6n iniciaL

Ca1cular los valores de t de Student (t l calc, t2 calc), como la razon de la diferencia (D) entre el eITor estandar (SD), respectivo: D, D2 t ~-t"!calc ~-S' 2calc S~ ~ D1

6)

Obtener la decision de acuerdo a la siguien!e regia:

I I 2 I I 2 el efecto de la dilucion es el esperado. Si II'm" I;, 2 I I;, 2 el efecto de la dilucion no es Si

I

No.

C~>,

' LY2' LY

3

)

entre el numero de recipientes de

la diluci6n respectiva, (rr, r2, rJ ).

1

2mle

1


0).

En caso de que Feal

I>2 LX'

=0.0100' +0.1000' + .. +1.0000' = 1.26010 LXY = 0.01 OOx 0.0 1 00+ 0.1 OOOx 0.1 000+ ... + LOOOOx 1.0000= 1.26005 Calcular la pendiente "m" con la formula 15.

Esta estimaci6n corresponde al caiculo de Ia incertidumbre tipoB.

9.3 Estimaci6n de Ia incertidumbre SC3asociada a la

Sustituyendo vaJores La pendiente m es 4 x 1.26005 - 1.61000 x 1.60990 4 x 1.260 10 - (1.61000)

repetibilidad.

2

= 0.99998 g/ g

Uso de Ia desviacion estandar asociada a Ia repetibilidad obtenida de Ia informacion tecnica proporcionada por el fabricante de la balanza

Calcular la ordenada al origen "b" de acuerdo a la fonnula 16.

La incertidumbre cstandar asoeiada a la repetibilidad (5,,), se obtiene de Ia informaci6n proporcionada por el fabricante como desviaci6n estandar.

= - 0.00002 g

s c3

= S = 0 00015 g

1.60990- 0.99998x 1.61 000 b =---------4

Calcular la desviaci6n estandar de regresion de acuerdo a Ia formula 14:

ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

2814

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

1.26000- 0.99998x 1.26005- ( -0.0(002) x 1.60990

(8), debido a que estas magnitudes tienen las mismas unidades (g):

4-2 Sc ~o.

= JS2

cf

+S2

(:2

+S2

c3

+S2

c4

(22)

000061 g

Al sustituir los valores se obtiene:

Por 10 tanto:

Sc

J0.000007 2 + 0.000029 2 + 0.000 152 + 0.0000612

S '4 ~ O. 000061 g Esta estimaci6n se basa en la incertidumbre tipo A.

~0.000164g

9.5 Estimacion de la incertidumbre SC s asociada a la reproducibilidad No se cuenta con la informacion necesaria. La incertidumbre estandar asociada a este componente es un cstirnador dificil de obtener, ya que representa la variaci6n entre los resultados de una misma masa por un mismo 0 diferente analista, en diferentes dias. Un estudio R&R (reproducibilidad y repetibilidad del instrumento) podria proporcionar 1a informaci6n. En estc caso no se cuenta con la informaci6n de esta fuente de incertidurnbre, por 10 que se puede considerar que SC s = 0 g y no se debe considerar en el calculo de la incertidumbre combinada. 9.6 Combinacion de la incertidumbre componentes secundarios relacionados con sustancia de referenda Para combinar la incertidumbre de los secundarios relacionados a la masa de la referencia, se utiliza la f6rmula 22 derivada

(u,) de los la masa de la

componentes sustancia de de la f6rmula

Por 10 tanto este es el estimador asociado a Lie· 10. ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE (Ud) CORRESPONDIENTE AL VOLUMEN DEL AFORO DE LA MASA DE LA SUSTANCIA DE REFERENCIA Para este caso, ia incertidumbre que corresponde a1 volumen de aforo del peso (masa) de la sustancia de referencia, tiene como fuente de incertidumbre a un matraz volumetrico de 250 mL marca "Y". En Ia figLira 5, se representa de manera parcial el modelo fisico de Ia f6rmula 6, considerando unicamente las iuentes de incertidumbre correspondientes a Ud' A continuaci6n se describe el calculo de la incertidumbre estandar de cada propiedad metro16gica del matraz volumetrico de 250 mL. Es importante mencionar que este material volumetrico como tal, no tiene asociadas ni resoluci6n ni linealidad como fuentes de incetiidumbre.

Uc

MATRAZ VOLUMETR1CO \ DE 250 mL I

\

\

--------------------------------------~~ ~ EXACTITUD

(d1l~

!

TEMPERATURA

REPETIBILIDAD

(d4)

U d

(d2) Figura 5. Representaci6n parcial del modelo flsico de la f6nnula 6, considerando las fuentes de incertidumbre correspondientes a Lid'

ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

Apendice IV. Estimaci6n de la incertidumbre

to.1 Estimacion de I_ incertidumbre (5 d, ) .sodado. I. ex_ctitud Exactitud: la tolerancia maxima como requisito, establecida por la FEUM en Capitulo de Generalidades es ± T = ± 0.12 mL. Ya que e1 matraz volumetrico presenta una respucsta de todo 0 nada, os decir se mide 250 mL 0 no se mide estc volumen, su distribucion estadistica es rectangular, por 10 que su incertidumbre estandar (Sd 1 )' se calcula aplicando la formula 11, sustituyendo val ores se tiene:

matraces en diferentes dias por distintos analistas (variaci6n inter analista-dia-matraz). Se recomienda, si es posible, a1 menos efectuar e1 estudio de variaci6n inter-matraz, pero si no es posible realizarlo; como ya se ha mencionado, la magnitud de esta incertidumbre estandar no se considerara a1 combinar las incertidumbres estandar. Estudio de laboratorio reproducibilidad inter-matraz Al realizar un estudio de variaci6n inter-matraz con diez mediciones del volumen de tres matraces volumetricos diferentes, de 250 rnL, mediante un metodo gravimetrico, se obtienen los siguientes resultados: Mediciones de volumen (mL) de tres matraces volumetricos de 250 mI_

Esta estimaci6n es una incertidumbre tipo B.

Matraz 1

Matraz 2

Matraz 3

250..0.17

249.991

250..044

2

250..0.0.6

250..0.19

250..0.16

3

249.986

250..011

250..059

4

249.992

250.0.0.4

250..0.16

5

250..0.0.6

249.990

249.996

6

250..0.15

250..00.7

250..0.30.

7

249.986

250..0. 11

250..047

8

249.985

249.990.

250..0.36

9

250..00.3

25D.G22

249.995

10.

250..0.0.0.

249.996

250.027

Medici6n 10.2 Estimaci6n de la incertidumbre (5d ,) asodada a I. repctibilidad Para estimar la repetibilidad se llcvD a cabo un estudio de laboratorio, utilizando un mismo matraz volumetrico de 250 mL, efectuando diez mediciones de volumen mediante un metodo gravimetrico. Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla: Su incertidumbre es estimada por la desviaci6n estandar (S) de estas mediciones, 1a cual se calcula con la f6rmula 17. Procedimiento: Ca1cular las siguientes sumatorias para

n;;;= 10:

:2> ~ 249.991 + 250.0 19+ .. + 249.996 ~2500.04100

:2>2 ~249.9912 ~

+250.019 2+ ... +249.996'

625020. 50145

Ca1cular de la desviaci6n estandar, sustituycndo valores:

s=

lOx 625020. 50 145- (2500.04100)

~0.0.1193

2815

2

Para estimar la reproducibilidad, estos resultados deben ser anaHzados mediante un analisis de varianza, aplicando un modele con un criterio de clasificaci6n y un diseno aleatorio. El modelo os:

10-1

Yij =J.1+Ui +O)(i)

rnL

Par 10 tanto: S d 2 = 0 . 0. 1193 mL

(23)

D6nde: Valor de la .i-e5ima medici6n del volumen en el i-esimo matraz volumetrico. !1 = Media general de la medici6n del volumen. aj = Estimador de Ia reproducibilidad entre matraces (efecto de la fuente de variaci6n matraces); tambien se Ie denomina efccto del i-esimo tratamiento. C:i(i):=· Error 0 repetibilidad 0 fuente de variaci6n intramatraz (intra-tratamiento).

Yij =

Esta estimaci6n es una incertidumbre tipo A. 10.3 Estimacion de la incertidumbre (5 d ,) asoeiada a la reproducibilidad La incertidumbre estandar asociada a la reproducibilidad, es un estimador diflcil y laborioso de obtener, ya que puede ser estimado a partir de mediciones utilizando diferentes matraces en diferentes dias (variaci6n inter-matraz), mediciones de diferentes matraces en diferentes dias (variaci6n inter dia-matraz) y mediciones de diferentes

En este modelo aj representa la reproducibilidad de la medicion del volumen entre matraees y 8j(1) Ia repetibilidad de Ia medici6n en cada matral.; e1 cual tambien es un estimador de la repetibilidad de la medici6n.

ESTIMACI6N DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

2816

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edici6n.

ANAuSIS DE VARIANZA Procedimiento Las formulas para llevar a cabo este amllisis estadistico se muestran en la tabla l. Calculos preliminares:

Y"=LLY;; =Yll +Y12 + "+YJIO +Y21 +Y 22 +"'+Y210 +Y31 +Y32 +"'+Y310 ~ ~

=

250.017+ 250.006+ .. + 250.000+ 249.991+ 250.019+ .. + 249.996+ 250.044+ 250.016+ .. + 250.027 7500.30300

Y, .=LYI! =250.017+250.006+ ... +250.000 = 2500.041

Y, .=LY2j =249.991+250.019+ ... +249.996 =2500.266 3 .=LY3! =250.044+250.016+ ... +250.027 = 2499.996

Y

LYi =2500.041' +2500.266 2 +2499.996 2 =18751515.07245 2

=250.017' +250.0062 + .. +250.000' +249.9912 +250.019'+ ... +249.996' +250.044' +250.0162 + .. +250.0272 =1875151.51383

Establecer el numero de tratamientos (t) y el nllmero de replicas (r). Para este estudio: t= 3 r = 10

Calcular los grados de libcrtad: gl r = t -1 = 3 ~! = 2

Calcular la suma de cuadrados: 18751515.0 7245 10 =0.00418

7500.30300' 3x 10

18751515.07245 sec = 1875151.51 3 8 3 -------10

= 0.00658 Calcular la media de cuadrados:

SC, 0.00418 MC, = - - = - - : - gl, 2 = 0.0020925 MC

e

= SCe

gl, = 0.0002438

0.00658 27

Deterrninar el valor de Feat

ESTIMACI6N DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

Apcmdice IV. Estimaci6n de la incertidumbre

Feat

MC,

0.0020925

MC.

0.0002438

Obtener el valor de

2817

8.58

Ftab

EI valor de Ia Flab se obtiene de Ia tabla 1 del capitulo de Estadistica para ensayos bio16gicos.

F tab = F 2 ,27 =3.354 Los resultados obtenidos se presentan en Ia tabla 3. Tabla 3. Amilisis de varianza para el estudio de precision.

'Fuente de variacion

Grados de Iibertad

cuadrados

Media de cuadrados

Fea!

Flab

2

0.00418

0.0020925

8.58

3.354

27

0.00658

0.0002438

Reprodueibilidad 0 tratamiento Repetibilidad

0

error

Suma de

Estimacion de la reproducibilidad (5",)

de temperatura ambiente del laboratorio, donde es ejecutado el metodo analitico, de por 10 menos un ano y determinar la temperatura maxima Cemlx) Y la temperatura minima (Tmin)· Calcular Ia diferencia absoluta de dichas temperaturas (ITmax- 201 Y IT mill - 201) Y seleccionar la diferencia absoluta mayor (i1.T), la cual representa una diferencia conservadora. Otra opcion para el caleulo de i1.T, es investigar el intervalo de temperatura del sistema de aire acondicionado instalado en ellaboratorio.

Para obtener el valor del estimado de la reproducibilidad, se utiliza la siguiente formula:

Ca1cular la incertidumbre estandar con la siguiente formula:

Interpretacion de Ia tabla de amilisis de varianza Ya que F ('al > F lao (8.58 > 3.354), se presenta efecto dcI tratamiento, par 10 que el estimado de la reproducibilidad es mayor que cero (5 d , > 0). Por el contrario, 81 F cal < Flab' se hubiera conc1uido que Ia magnitod de Ia reprodueibilidad seria cero (5", = 0).

(24)

s=

Vxaxb,.T

(25)

J3 Al sustituir se obtiene:

S d3

0.0020925 -0.0002438 - - - - - - - - - ~O.OI360mL 10

Esta estimacion de la incertidumbre es tipo A.

10.4 Estimacion de la incertidumbre correspondiente a la temperatura de aforo, de la medicion de volumen del material volumetrico Los materiales volum6tricos, general mente no son utilizados a las condiciones de temperatura a Ia cual se calibr6 (20°C); deb ida a esto y al efecto de Ia dilataci6n del disolvente por efecto de la temperatura, se presenta un error en la medicion del volumen, debido a la expansion 0 contraccion del volumen del disolvente; por 10 que este efecto deben't considerarse como fuente de incertidumbre como un error sistematico. Para efectuar este calculo se deben tener registros

Donde: V= volumen de aioro del material volumetrico (mL). a = coeficiente de expansion volumetrica del solvente utilizado para el aforo ('e l ). /l,T~ diferencia absoluta mayor respecto de 20 "e ("e). En estc caso se trata de un material que mide 0 no mide 250 mL, la distribucion utilizada en el caleulo de la incertidumbre estandar es la rectangular. Para este caso: a) EI metodo utiliza para el afaro de Ia masa de Ia sustancia de referencia un matraz volumetrico de 250 mL, par 10 que V ~ 250 b) EI metoda indica que para el aforo se utilice agua, cuyo coeficiente de expansion es 0.00021 °C·]; por 10 que a~ 0.00021. c) En los registros anuales de temperatura del laboratorio el valor maximo fue de 24°C Y el minimo de 18 "e; par 10 tanto /l,T~ 4.

ESTIMACI6N DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

2818

Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, undecima edicion.

Al sustituir valores en la f6rmula 25 se obtiene: 250x 0.0002 Ix 4

J3

0.12124mL

Esta cstimaci6n es una incertidumbrc tipo B. 10.5 Combinacion de Ia inccrtidumbre de los componentes secundarios correspondientcs al volumen de aforo de la mas a de Ia sustancia de referenda (Ud) La eombinaci6n de la ineertidumbre de los componentes seeundarios re1acionada al volumen de atoro de la masa de la sustancia de referencia, se basa en Ia f6rmula 8, debido a que estas magnitudes tienen las mismas unidades (mL): (26)

Al sustituir val ores se obtiene:

Sd

=

J0.06928

12. ESTIMACION DE LA JNCERTlDUMBRE (uy) CORRESPONDIENTE A LA COMBINACION DE LA INCERTIDUMBRE DE LOS COMPONENTES PRIMARIOS Para estimar la ineertidumbre del mensurando uy es neeesario combinar la incertidumbre estimdar relativa utilizando la f6rmula 7 ya que la ineertidumbre de estos componentes no tienen las mismas unidades; por 10 tanto es necesario utilizar las magnitudes de los componentes primarios al aplicar el metodo anaHtieo a la muestra. El analista reporta las siguientes magnitudes de aeuerdo a 1a formula 6: Informacion de los componentes primarios neeesaria para estimar la incertidumbre del contenido del analito en la muestra. Tabla 4.

2

2

+ 0.000122 + 0.0 1360 + 0.1 2 I 24'

~0.1408ImL

La anh-rior magnitud es el estimador asociado a

Ud·

n.

ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE (u,) CORRESPONDIENTE A LA PUREZA DE LA SUSTANCIA DE REFERENCIA En general, las sllstancias de referencia en su certi'ficado deben infonnan la incertidumbre de! valor de la pureza certificada, 1a eual es expresada como incertidumbre cxpandida: (27) En donde: Factor de cobertura con una eonfianza del 95 % y g. 1. correspondientes al procedimiento de estimaci6n (en el caso de que este no sea reportado se asume un valor de 2). Ue = Incertidumbre estandar de la pureza.

k=

Magnitud de los componentes primarios

Incertidumbre estandar de los componentes primarios

/",=0.617 A=a

S" ~O. 00486 A

lncertidumbre estandar relativa de los componentes primarios Sia ~ 0.00486 A / 0.617 A ~ 0.00788

b

S,,~

0.01249 A

SI,!b ~ 0.01249 A / 0.622 A ~ 0.02008

m.~0.0314g~c

S,.~

0.000164 g

S,ic ~0.000164 g / 0.0314 g ~ 0.00522

Sd~

0.14081 mL

Sid ~ 0.14081 mL /250 mL ~ 0.00056

S~=

0.01%)

0.01% / Sie 99.98 % ~ 0.00010

0.622 A

l.~

~

v~

250 mL

P

99.98 % = e

=

~

d

~

Al sustituir en la f6rmula 7, se obtiene el dlleulo de Ia incertidumbre estandar del modele matematico:

y

Procedimiento De un certiticado se obtiene 1a siguiente informaci6n: Valor de la pureza certificada (%J: 99.98 lncertidumbre cxpandida (%): ± 0.02 En el documento no se informa el valor del factor de cobertura por 10 que k ~ 2. A partir de la formula 26 se calcula la incertidumbre: S,

~0.02!2~O.01

%

~

J0.00788

2

+ 0.02008' + 0.005222 + 0.00056 2 + 0.000 10 2

~ 0.02220 Para obtener la incertidumbre es necesario calcular el eontenido de analito en la muestra con la formula 6

O.617A 0.0314g 99.98

Y~--.

por 10 tanto este es el estimador de

Ue•

0.622A 250 mL

ESTIMACION DE LA INCERTIDUMBRE DE METODOS ANALiTICOS FARMACOPEICOS

.--~

100

Apendice IV. Estimaci6n de la incertidumbre

2819

14.1 Derivacion parcial

0.0001246"'£ ~ 124.57,lglmL mL

14.1.1 Calculo de la derivada parcial de "y" con respecto a I",:

Por 10 que la incertidumbre a reportar es:

1m

sy

= -xY=0.02220x124.57 = 2. 7654 ~ ~gI y

81 m

13. INFORME DE LA INCERTWUMBRE EXPANDWA DEL RESUL TADO ANALInCO

(uy)

(28)

Donde la magnitud de 2 cs un factor cobertura asociado a un nivel de confianza del 95 %.

=

uy

Uy

I[e, .u(x,)l' i,d

il=llI ax

i!y

u ( x, ) -j'

(29)

8i m

81

m

250

100

p

I V 100 1m mr P _ ' -_ _ _ _ _--'- = - - x - - x 1,.2

100

V

(31 ) Al sustituir la magnitud de los componcntes pnmanos (magnitudes de entrada) segun la tabla 4:

_(I",

m,.

PI

oy

o -x--x-, I,. V 100 )

0.617

az ,.

az ,.

~6222

0.0314 99.98

x---x--

250

100

= -0.000200266

14.1.3 Calculo de 1a derivada parcial de "y" con respecto a mr:

oy

am,

1m mr P -x--x1 V 100

p

1m -x-x-

am

I

V

(32)

100

Al sustituir Ia magnitud de los componentes pnmarios (magnitudes de entrada) segun 1a tabla 4:

Jim rn,

oy

El procedimiento de Ia estimaci6n y desarrollo consta de los siguientes pasos:

0.622

ill

a -'-" x-'_· x -

a

y Silo

0.0314 99.98 __ x _ __ x _ _

14.1.2 Calculo de 13 derivada parcial de "y" con respecto a I,.:

i

Donde: uy = Valor estimado de Ia incertidumbre est