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• Jherson Guillermo Bonifacio Espinoza

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE ZOOTECNIA Departamento académico de ciencias animal

“Zootecnia camino a la calidad educativa “

EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE PIGMENTOS FOTOSINTÉTICOS

CURSO

:

DOCENTE

:

ALUMNOS

Fisiología Vegetal Gonzales Huiman; Fernando S. :

Bonifacio Espinoza; Jherson.

TINGO MARIA – 2014-I

I.

INTRODUCCION.

Uno de los procesos metabólicos más importantes de las células vegetales lo constituye la Fotosíntesis. Durante la fase luminosa de la misma es imprescindible la participación de diferentes pigmentos fotosintéticos que se encuentran dentro de los plastidios, y que le confieren la coloración característica de las hojas de las plantas. Los pigmentos de mayor importancia son las clorofilas: la clorofila A que tiene un color verde azulado, y la clorofila B de color verde amarillento. También son importantes los carotenoides, de color anaranjado-rojizo, y las xantofilas de color amarillo. El surgimiento de los métodos cromatográficos está marcado precisamente por el estudio realizado por el científico ruso M.S.Tswett, quien en 1903 publicó un trabajo sobre la separación de pigmentos vegetales a través de una columna llena de un compuesto adsorbente (yeso, alúmina, almidón u otro) al aplicar un extracto de plantas preparado con solventes orgánicos (etanol, acetona, benceno, etc.). La separación de estos pigmentos se puede realizar también mediante cromatografía en capa fina o en papel, utilizando diferentes sistemas de solventes. La fotosíntesis, proceso que permite a los vegetales obtener la materia y la energía que necesitan para desarrollar sus funciones vitales, se lleva a cabo gracias a la presencia en las hojas y en los tallos jóvenes de pigmentos, capaces de captar la energía lumínica. Entre todos los caracteres más externos de los vegetales, el más notable y característico es probablemente el color. El color no es únicamente un carácter llamativo de la vegetación, sino que, además, algunos de los pigmentos que lo condicionan están estrechamente ligados a las actividades fisiológicas del propio vegetal. Por consiguiente, el estudio de cómo las plantas viven y se desarrollan requieren el previo conocimiento de los pigmentos vegetales.

Objetivos:   

Demostrar que los pigmentos fotosintéticos pueden ser extraídos fácilmente con solventes orgánicos. Separar por diversos métodos los pigmentos fotosintétizantes. Estudiar algunas de las propiedades físicas y químicas.

II.

II.1.

REVISION LETERARIA

Pigmentos fotosintéticos.

Los mas importantes son las clorofilas, pigmentos verdes con estructuras policíclicas que se parecen a la protoporfirina de la hemoglobina, la molécula esta compuesto de un sistema de anillos heterocíciclicos (cuatro anillos pirrólicos sustituidos y un quinto anillo no pirrólico) además contiene una larga cadena hidrofóbica de un alcohol, el fitol, esterificando a un acido sustituyente de un de los pirroles. El sistema de anillos heterocíclicos tiene un estructura con alternancia de enlaces sencillos y doble (conjugados) que constituyen el grupo cromóforo responsable de la absorción de la luz. Los cloroplastos de las plantas superiores contienen siempre dos tipos de clorofila. Una invariablemente la clorofila A, mientras que la segunda es la clorofila B, que sólo difiere de la clorofila a en que tiene un grupo aldehído en lugar de un grupo metilo en el anillo ll. La mayoría de las plantas superiores contienen aproximadamente el doble de clorofila A que de clorofila B. en organismos fotosintetizadores inferiores existen otras clorofilas con pequeñas diferencias químicas. Además de las clorofilas, las membranas tilacoidales contienen pigmentos secundarios que también absorben la luz, llamados conjuntamente pigmentos accesorios. Entre ellos se encuentran los carotenoides que incluyen a los carotenos, no oxigenados, y las xantofilas, decolores rojo al amarillo y las ficobilinas que son pigmentos tetrapirrólicos pero no cíclicos, presentes en lagas rojas y en cianobacterias e incluyen a la ficocianina (azul) y a la ficoeritrina (roja). La acción neta del agua en fotosíntesis es dividir el agua proporcionando el hidrogeno necesario para las reducciones y eliminando el oxígeno como un producto intermedio. 12 H20 ---------- LUZ -------------> 24 H+ + 6 O2 Los átomos de hidrógeno se emplean en reducir el dióxido de carbono con la ayuda de ATP para dar carbohidratos y agua. 6 C02 + 24 H---------- 18 ATP ----------- > C6H12O6 + 6 H20 La reacción completa se puede describir como: 6 C02 + 12 H20 ------- LUZ ----> C6H12O6 + 6 H20 + 6 O2

Para fijar una molécula de CO2 en la forma de carbohidratos se precisa de 4 átomos de hidrogeno y 3 moléculas de ATP. Ahora se sabe que la energía absorbida como luz en los cloroplastos genera también ATP. De hecho, cloroplastos aislados pueden realizar el proceso fotosintético completo. En eucariotas la fotosíntesis tiene lugar en el cloroplasto, que se sabe desde hace tiempo que tiene características procarióticas. Se cree que han evolucionado de cianobacterias o especies relacionadas que establecieron una relación simbiótica con una célula eucariota no fotosintética que las englobó. La célula y la cianobacteria estarían en una relación beneficiosa para ambas al compartir el organismo fotosintético los carbohidratos producidos con la célula y esta proveyendo de otros componentes a la cianobacteria. El procariota cedería poco a poco su independencia y su pared celular, transfiriendo parte de su contenido genético a la célula. El resultado es un cloroplasto que mantiene un DNA circular de pequeño tamaño con la información para ciertas proteínas de la membrana necesarias que no pueden ser fácilmente transportadas o dirigidas hacia el orgánulo desde el citoplasma. Ocasionalmente se encuentran organismos fotosintéticos que tienen cloroplastos que retienen algunas características más de cianobacterias. II.2.

¿Qué son los pigmentos?

Si es posible encontrar en el reino vegetal todos los matices y combinaciones de colores del espectro, existe un predominio general de los colores primarios: verde, amarillo, rojo, azul. Estos colores son conferidos a los vegetales por determinados compuestos químicos definidos, llamados pigmentos. El color particular que presenta un determinado órgano vegetal depende generalmente del predominio de uno u otro o la combinación de ellos. Se debe tener claro que cuando un vegetal presenta un color blanco, es debido a la falta de tales pigmentos. La luz solar que incide sobre ellas no es absorbida selectivamente como ocurre en las partes coloreadas, sino que es transmitida o reflejada prácticamente sin sufrir modificación.

Las Clorofilas. El color verde tan uniformemente presente en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b . Se encuentran prácticamente en todas las plantas con semilla, helechos, musgos y algas. Pueden formarse en las raíces, tallos, hojas y frutos a condición de que estos órganos estén situados por encima del suelo y queden expuestos a la luz. También aunque aparentemente falten en algunas hojas de color rojo o amarillo, cuando se extraen las otras sustancias colorantes de estas, puede comprobarse incluso allí la presencia de las clorofilas, que estaban enmascaradas por los demás pigmentos. II.3.

¿Dónde están los pigmentos?

Estos pigmentos se encuentran en el interior de la células vegetales específicamente en una organela llamada cloroplasto . Los cloroplastos son simplemente plástidos que contienen pigmentos clorofílicos. Los compuestos clorofílicos están ligados químicamente con las estructuras internas del cloroplasto (membrana tilacoides) y se hallan retenidos en estado coloidal. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son los xantofilas y carotenides. II.4.

¿Cómo se dividen los solventes?

Los pigmentos clorofílicos son insolubles en el solvente universal llamado agua. Pero sí son solubles (afinidad química) en solventes orgánicos como por ejemplo alcohol etílico y acetona. A los solventes que extraen simultáneamente todos los pigmentos de la hoja se los suele llamar extractantes. Existen otros solventes que presentan afinidad por algunos pigmentos y se los llama separadores, como por ejemplo el tetracloruro de carbono y el éter de petróleo. En el método de extracción simple, como se desarrolla más adelante se utilizará como extractante el alcohol etílico y como separador el tetracloruro de carbono. Estos dos solventes orgánicos responden en forma diferente a los pigmentos clorofílicos, como así también a sus diferencias físicas que hacen que sean dos líquidos no misibles y con diferente peso específico. En el segundo método por cromatografía se utilizará como extractante la acetona y como separador el éter de petróleo. Este método se trata de una separación más fina de los pigmentos, y se basa en la absorción y solubilidad diferenciales de varias sustancias entre las que se incluyen los pigmentos. Un soporte inerte como papel de filtro para la corrida y unos granos de carbonato de calcio para deshidratar la muestra, son los componentes necesarios para desarrollar la técnica.

II.5.

Clorofila.

Pigmento que da el color verde a los vegetales y que se encarga de absorber la luz necesaria para realizar la fotosíntesis, proceso que transforma la energía luminosa en energía química. La clorofila absorbe sobre todo la luz roja, violeta y azul, y refleja la verde. La gran concentración de clorofila en las hojas y su presencia ocasional en otros tejidos vegetales, como los tallos, tiñen de verde estas partes de las plantas. En algunas hojas, la clorofila está enmascarada por otros pigmentos. En otoño, la clorofila de las hojas de los árboles se descompone, y ocupan su lugar otros pigmentos. La molécula de clorofila es grande y está formada en su mayor parte por carbono e hidrógeno; ocupa el centro de la molécula un único átomo de magnesio rodeado por un grupo de átomos que contienen nitrógeno y se llama anillo de porfirinas. La estructura recuerda a la del componente activo de la hemoglobina de la sangre. De este núcleo central parte una larga cadena de átomos de carbono e hidrógeno que une la molécula de clorofila a la membrana interna del cloroplasto, el orgánulo celular donde tiene lugar la fotosíntesis. Cuando la molécula de clorofila absorbe un fotón, sus electrones se excitan y saltan a un nivel de energía superior (véase fotoquímica) esto inicia en el cloroplasto una compleja serie de reacciones que dan lugar al almacenamiento de energía en forma de enlaces químicos. Hay varios tipos de clorofilas que se diferencian en detalles de su estructura molecular y que absorben longitudes de onda luminosas algo distintas. El tipo más común es la clorofila A, que constituye aproximadamente el 75% de toda la clorofila de las plantas verdes. Se encuentra también en las algas verde azuladas y en células fotosintéticas más complejas. La clorofila B es un pigmento accesorio presente en vegetales y otras células fotosintéticas complejas; absorbe luz de una longitud de onda diferente y transfiere la energía a la clorofila A, que se encarga de transformarla en energía química. Algunas bacterias.

II.6.

Carotenoides.

Actúan como pigmentos accesorios en el proceso de la fotosíntesis .Existen dos tipos de pigmentos carotenoides :carotenos y xantofilas .Los carotenos son hidrocarburos isoprenoides que no contienen oxígeno y están formados por largas moléculas con un sistema de enlaces conjugados alternantes, dobles y Sencillos , rematados en cada extremo por un anillo de ciclohexano insaturado- tienen color amarillo-anaranjado . Las xantofilas tienen una estructura muy similar a la de los carotenos y su diferencia estriba en la incorporación de oxígeno en los extremos de la molécula. Según el grupo que se incorpore existen variedades dentro de las xantofilas. Son de color amarillo. Los luminosos colores otoñales característicos de las hojas de muchas plantas se deben a la presencia de otros pigmentos que contribuyen a los procesos que se dan en la fotosíntesis al captar longitudes determinadas de la luz solar. Estos pigmentos, llamados carotenoides, sólo se ven cuando la hoja muere en otoño. II.7.

Pigmentos accesorios.

Son pigmentos que absorben la energía luminosa y la pasan a la clorofila a (pigmento principal), que es el pigmento más relacionado con la transferencia de electrones hacia los enlaces químicos. Los pigmentos accesorios permiten a las algas vivir en una variedad de lugares mucho mayor a la que se podría tener si carecieran de ellos. Debido a que la composición e intensidad de la luz cambia con el incremento de la profundidad del agua. Las características de la luz recibida y absorbida por las algas marinas depende en gran medida de la profundidad donde están. La variación en la composición pigmentaria para un uso optimo de la luz disponible es por lo tanto

muy importante. La longitud de onda corta (más energética) no Penetra más allá de 5 metros de profundidad. Las algas pardas y verdes se instalan en la zona litoral superior, en tanto que en la zona profunda predominan las algas rojas. Esto se puede observar generalmente en la zona intermareal rocosa, las algas ubicadas mas arriba corresponden a Ulva (lechuga de mar) y Enteromorpha (algas verdes). Las algas pardas generalmente están ubicadas en la zona media y baja del intermareal, este es el caso de Lessonia nigrescens ("huiro negro") y Durvillaea ("cochayuyo"). Por último las algas rojas las podemos encontrar en mayor abundancia y diversidad en la zona submareal, como por ejemplo, Gracilaria chilensis (pelillo) y Chondracanthus chamissoi (chicoria de mar).

III.

III.1.

MATERIALES Y METODOS.

Lugar y Fecha.

La presente práctica se desarrolló en el laboratorio de agronomía de La Universidad Nacional Agraria de la Selva el día martes 03 de Junio del presente año a horas de 02 a 04 p.m., en la ciudad de Tingo María, Provincia de Leoncio Prado, Departamento de Huánuco a coordenadas geográficas: Latitud Sur: 9º17’08”, Longitud Oeste: 75º59’52”, a 660m s.n.m, con un temperatura promedia de 27º C aproximadamente. III.2.

Materiales.



Plantas: hojas de alfalfa.



Instrumental: mortero de porcelana, embudos de separacion, vasos, cocina eléctrica, pipetas de 10 ml, buretas de 100 ml, , pisetas, soporte de madera o metal, etc.



Reactivos: Acetona a 80 %, Éter de petróleo 90%, Éter etílico, KOH al 20 % en metanol, Água destilada.

III.3.

Metodología.

1. Extracción de los pigmentos de los cloroplastos: Hierva 20g de hojas frescas en agua durante 2 min. No más, inmediatamente transferirlas a una licuadora y licuarlo con 80ml. De acetona al 80% luego lavamos el vaso de la licuadora con los otros 20ml. De acetona y filtramos. 2. Separación de los pigmentos del cloroplasto: Hicimos por el método de la distribución de los pigmentos frente a solventes inmiscibles. Esto naturalmente esta en función del coeficiente de participación de cada pigmento, ósea del grado que una sustancia o grupo de sustancias es fraccionada por dos solventes inmiscibles.

3. Separación por solventes inmiscibles: a) Vertimos 80ml. Del extracto acetonico en un embudo de separación y añadimos 50ml. De éter de petróleo y cuidadosamente agite por unos minutos (1-2). Deje reposar hasta observar la formación de dos capas, la capa superior contiene a los pigmentos fotosintetizados disueltos en el éter de petróleo, la capa inferior es una mezcla de acetona, antocianinas y agua los que son intersolubles. b) Descartamos la capa inferior abriendo la llave del embudo reteniendo solamente la porción superior. Lavamos con agua destilada 3-4 veces, descartando en cada separación la porción inferior. c) E seguida añadimos 40ml. De metanol al 90% (toxico), y mezclamos cuidadosamente, se observa la formación de dos capas. La porción es éter de petróleo, que retiene a la clorofila y al caroteno. En el inferior esta la clorofila b y la xantofila disuelta en el metanol. d) Transferimos la porción inferior a otro embudo de separación, sin dejar pasar liquido de la poción superior contenida en el embudo inicial que denominamos “embudo A” el cual contiene a la clorofila a y el caroteno, el “embudo B” que contiene la clorofila b y la xantofila. Embudo A; vierta 20ml. De KOH al 20% en etanol recientemente preparado, tape, agite y deja en reposo. Note la formación de dos capas. Vierta 20ml. De agua destilada, mezcle nuevamente y deja en reposo. Las dos capas que se forman contienen respectivamente la superior caroteno y la inferior la clorofila a. Embudo B; vierta 40ml. De éter etílico, lave cuidadosamente con 20ml. De agua destilada, repitiendo el proceso 2 – 3 veces descartando sucesivamente la porción inferior que contiene metanol y agua. La clorofila b y la xantofila ahora están contenidas en un extracto de éter etílico. Vierta 20ml. De KOH al 20% en metanol. Tape bien el embudo, agite con cuidado y deje en reposo durante 10min. Añada luego de los 10min, 20ml de agua destilada y deje en reposo hasta que se separen en dos capas. La capa superior contiene xantofila y la inferior clorofila b. así se tiene separados los cuatro pigmentos principales de los cloroplastos, en función de sus coeficientes de partición en líquidos inmiscibles.

IV.

RESULTADOS

Al añadir 50 ml. de éter de petróleo se produce la separación de los pigmentos formándose dos capas (A y B). Pigmentos Fotosintetizantes disueltos en éter de petróleo

A B Mezcla de Acetona, Antocianina y Agua

Añadimos 40 mL de metanol al 90% y se forman otras dos capas (C y D).

Éter de petróleo con Clorofila y Caroteno

C A

D Clorofila b y Xantofila disuelta en Metanol

Tubo A. Con KOH

Tubo B. Éter Etílico

Caroteno

Xantofila E

C

EE C

Clorofila

Clorofila

La extracción, separación e identificación de los pigmentos fotosintéticos se realizo de las hojas de pasto. Pigmentos Xantofila Caroteno Clorofila A Clorofila B

Observaciones Verde amarillento claro. Verde amarillento oscuro Verde oscuro Verde claro

V.

DISCUSIÓN

LUDWING, (1984), menciona que la extracción de pigmentos del cloroplasto esta basado en la acción de solvente orgánicos sobre los líquidos del cloroplasto dentro de los cuales se hallan disueltos, los pigmentos liposolubles, por lo que estos pueden ser extraídos. Así mismo, para la separación de los pigmentos del cloroplasto por solventes inmiscibles, permite separar una mezcla de sustancias en función de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles. Estos conceptos se pudieron comprobar en la realización de esta práctica, existiendo así una concordancia de lo que se menciona en la teoría y los resultados obtenidos en la práctica.

VI. 

CONCLUSIÓN

Se logró determinar que los pigmentos fotosintéticos pueden ser extraídos fácilmente con solventes orgánicos.



Los pigmentos fotosintetizantes se pueden separa por diversos métodos.



Se llegó a estudiar algunas de las propiedades físicas y químicas.

VII.     

BIBLIOGRAFÍA

DELVIN ROBERT, M. 1980. Fisiología Vegetal.1ra Edición. Editorial OMEGA Barcelona-España.468 p. LUDWING, E. 1984. Manual de Laboratorio de Fisiología Vegetal .Costa Rica. 165 p. MARTINEZ, E. 1995. La Fotosíntesis. 2da edición. Edit. Mundi Prensa. Madrid – España. Pg. SALDIVAR, R. 1994. Fisiología Vegetal 1: Nutrición y transporte. Edit. Síntesis S. A. España. SANCHEZ DIAZ, M.; APARICIO TEJO, P. y PEÑA CALVO, (1980) Prácticas de Fisiología Vegetal.

VIII.

ANEXO: (Procedimiento De La Práctica) 1.- Pesamos las hojas

2.- Colocamos en agua

2.- Hervir por 2min.

4.- separamos las hojas del agua hervido

5.- obtención de antocianinas

6.- licuamos las hojas con acetona

acetona

7.- Filtramos el licuado

8.- medimos en una probeta el filtrado

9.- hechamos al embudo de separacion

10.- observamos la separación de las fases

11.- lavado con agua destilada

Como resultado obtuvimos las separaciones de los pigmentos. Clorofila a + carotenos

Clorofila b + xantofila