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ERITROPOYESIS La eritropoyesis es la formación de eritrocitos. Las primeras células sanguíneas se forman por proliferación de las mesenquimatosas en los islotes del saco vitelino, las células periféricas de estos islotes, forman la pared de los endotelios vasculares y las células centrales se convierten en células primitivas, las que disponen de hemoglobina y tienen núcleo. Esta fase se conoce como la mesoblástica. A media que se desarrolla el embrión,la eritropoyesis produce eritrocitos libres de núcleo, en el hígado, bazo, timo, nódulos linfáticos y posteriormente en el último periodo de la vida fetal y después del nacimiento la médula ósea se constituye en el principal órgano de producción de hematíes. En la edad temprana del animal toda la médula ósea es activa pero en el adulto solamente los extremos de los huesos largos, el esternón, pelvis, costillas y cresta del ilion conservan tejido proliferativo, mientras que el resto de ella se llena de tejido adiposo y de células reticulares. MEDWAY, SCHALM, GARCIA, SMITH. Todas las células sanguíneas circulantes se derivan de las “células hematopoyéticas primordiales indiferenciadas“ las cuales se desarrollan hacia la serie que el organismo estimule de acuerdo a su necesidad; la maduración de estas permite la diferenciación en dos series principales: la linfoide y la mieloide esta última incluye: eritrocitos, monocitos, granulocitos trombocitos y mielocitos. Así por ejemplo la eritropoyesis es desarrollada como respuesta a la hipoxia tisular que genera la producción de eritropoyetina (glicoproteina de 34 kilodaltones de peso molecular ) por parte del riñón y otros mecanismos hormonales como los andrógenos que ejercen una acción doble: ciertos derivados estimulan la síntesis de eritropoyetina por el riñón y otros estimulan directamente las células precursoras. La hormona del crecimiento también estimula indirectamente la eritropoyesis por medio de la eritropoyetina. La acción de otras hormonas no está completamente establecida como la depresión que causan los estrógenos y la acción estimulante de hormonas tiroideas y glucocorticoides. El eritropoyetinógeno producido en el hígado y las interleuquinas 3 y 1 producidas por linfocitos son consideradas como hemopoyetinas que estimulan la diferenciación de la célula pluripotencial hacia el desarrollo de la serie eritrocítica. Durante la vida fetal la eritropoyetina es producida por el hígado desde la mitad de la gestación y al final de ella el riñón es el encargado de sintetizarla al igual que en la vida adulta. A partir de las células primitivas multipotenciales, surgen los precursores eritroides más tempranos “células formadoras de colonias de eritrocitos“(CFC–E) cuya división celular es rápida por la acción de eritropoyetina y otras citocinas (interleuqina 1 e interleuqina 3). Del mismo modo existen células formadoras de colonias que van a originar granulocitos y monocitos (CFC–GM ) y unas células formadoras de colonias de granulocitos (CFC–M). A partir de la célula generadora de eritrocitos CFC-E se forma el proeritroblasto, que es una célula grande, el cual a través de distintas fases de maduración origina los glóbulos rojos (eritroblasto policromatófilo, eritroblasto ortocromático, reticulocito y eritrocito). En el eritroblasto basófilo, se inicia la síntesis de la hemoglobina la cual aumenta en concentración a medida que el eritrocito madura y pierde su capacidad de mitosis; el reticulocito aun contiene una pequeña cantidad de cromatina que se observa como un material basófilo, formado por los restos del aparato de Golgi y otros organelos citoplasmáticos dispuestos en forma reticular. El proceso de maduración a nivel de la medula ósea hasta llegar a eritrocito tarda 4 días y uno en sangre periférica. SACRISTÁN, MST, MEDWAY. DENNY J., ECKERT. Regulación de la Eritropoyesis La vida media de los eritrocitos en las especies animales es bastante limitada, en el canino es de 110 a 122 días, para el bovino adulto 160dias, bovino hasta los 3 meses 55 días, el equino 140 a 150 días, para el ovino 70-153 días, caprino 125diás, felino 68 días, porcino 63 días, conejo 68 días, pollo 20 días, por consiguiente su producción es constante manteniendo una población circulante suficiente que en condiciones normales transporte el oxigeno necesario a los tejidos. Intestino Plasma Tejidos Delgado fe++ absorbido de la dieta

fe+++ + B1- globulina

fe++ de reserva ferritina

hemosiderina

Transferrina

Hem

Médula ósea Hb ( apoptosis )

Verdohemoglobina

Porfirina

Hem

Bilirrubina

Globina fe++ Reutilización

Albúmina Eritrocitos Nuevos Bilirrubina libre Bilirrubina no conjugada

Sangre BI

Eritropoyesis

Hem + Porfirinas Nuevas

Hemoglobina para formar nuevos eritrocitos

Hígado Bilirrubina conjugada

BD

Bilis Intestino ( Bacterias )

Estercobilinógeno

Circulación enterohepática de pigmentos biliares Urobilinógeno

Pigmento de Heces

Riñón Urobilinógeno en orina + Bilirrubina negativa

Figura 3.1 Hematopoyesis: utilización del hierro en la eritropoyesis, tanto el que se absorbe en el intestino como el resultante de la apoptosis. Circulación normal de los pigmentos biliares. BI : Bilirrubina indirecta no conjugada BD : Bilirrubina conjugada, hidrosoluble directa. Estados fisiológicos y patológicos pueden generar disminución en el transporte de oxigeno lo cual modifica la producción de eritrocitos por parte de la médula ósea, la que responde a los niveles de eritropoyetina, la cual produce una elevación en el número de células precursoras de proeritroblastos y provoca también una aceleración en la síntesis de hemoglobina y en la salida de los reticulocitos, generándose un paso de la población de células que están en almacenamiento hacia la circulación, inicialmente pasan del tejido mieloide a los senos venosos y a la vena central los glóbulos rojos maduros que están en deposito y los reticulocitos, si estos no son suficientes se complementan con metarrubricitos y eritroblastos policromatófilos lo cual indica, un estado regenerativo de la población de hematíes. Esta respuesta es considerada como favorable al organismo ya que en pocos días en sangre periférica termina su maduración y el animal recupera su volumen celular y el transporte de oxigeno y de nutrientes se normaliza. El desarrollo de la eritropoyesis requiere además del estimulo dado por la eritropoyetina y por las demás sustancias mencionadas anteriormente, de nutrientes como la vitamina B12(Cianocobalamina), el ácido fólico(ácido pteroilglutámico) indispensables estos para la síntesis del ácido desoxirribonucleico (ADN) el cual realiza la producción de hemoglobina en el núcleo del proeritroblasto cuya función se va

concluyendo a medida que la célula pierde su núcleo por extrusión o cariorrexis; si quedan restos del núcleo en el citoplasma, aparecen como cuerpos de Howell – Jolly. El reticulocito conserva restos de ARN en forma de red o de gránulos que solamente son visibles con el uso de colorantes vitales como el nuevo azul de metileno,el violeta cristalino y el azul brillante de cresilo. Estas células muestran su inmadurez por su mayor tamaño y su basofilia citoplasmática si se compara con los glóbulos rojos normales en un frotis sanguíneo. También son necesarios en la maduración de eritrocitos el hierro que forma parte de la molécula de hemoglobina; el 65% hace parte del pigmento respiratorio, el 4% forma parte de la mioglobina aunque en algunas especies es algo superior como en el caso del caballo y el perro 1% de las enzimas oxidativas(citocromos,citocrooxidasa, catalasa, peroxidasa). El 15% se halla en forma de ferritina y hemosiderina, sustancias estas que son reserva de hierro, el 0.1% es concentrado en la transferrina que es un compuesto de transporte que conduce el hierro a la médula ósea y el 15% restante esta en forma de hierro libre. Además en la eritropoyesis se requiere cobre el cual hace parte de la coenzima que interviene en la fijación del hierro a la molécula de hemoglobina. El cobalto que forma parte de la molécula de vitamina B12 la cual es sintetizada en los rumiantes por las bacterias del rumen para lo cual se requiere un suministro adecuado de cobalto,esta vitamina es almacenada en el hígado, en humanos es necesaria una mucoproteina,el “factor intrínseco” para ser absorbida a nivel intestinal. En animales como el perro y el cerdo la extirpación del estómago, duodeno y parte del yeyuno no impide la absorción de la vitamina B12. MEDWAY, SACRISTÁN, GANON, DOXEY, BIRCHARD, SMITH, SCARAMAL Metabolismo de la Hemoglobina La hemoglobina es una hemoproteina que consta de cuatros grupos hemes en un tetraedro. El hem es una porfirina en cuyo centro está un átomo de hierro en forma ferrosa. La porfirina tiene cuatro anillos pirrólicos unidos por cuatro puentes de meteno. El núcleo porfirina tiene substituciones de cuatro metilos: dos vinilos y dos grupos de ácido propionico. La parte proteica de la hemoglobina en bovinos está compuesta de dos cadenas idénticas alfa y dos beta. Las cadenas alfa tiene 141 aminoácidos, mientras que la beta tienen 145. En la misma especie existen diferentes tipos de hemoglobina (HbA y HbB); las cadenas alfa de ambas moléculas son idénticas, pero las beta de la HbB difieren de las de la HbA en los aminoácidos de las posiciones 15, 18 y 119. En la HbA estos tres aminoácidos son: serina, histidina y asparagina. También existen diferencias en la cadena beta en otras especies, como oveja y cabra. Los mamíferos tienen durante la vida fetal una hemoglobina diferente a la de los adultos,la cual tiene mayor afinidad por el oxigeno es llamada HbF, esta disminuye a partir del nacimiento hasta que desaparece totalmente; en el caso de los bovinos esto ocurre a los ochenta días. La hemoglina fetal difiere de la hemoglobina adulta en la base de la fracción globínica. La síntesis de la hemoglobina termina cuando ya el núcleo se pierde del eritrocito. Una basofilia difusa en la célula indica que la síntesis de la hemoglobina es completa. La médula ósea contiene una gran reserva de reticulocitos, aproximadamente igual a los eritrocitos nucleados presentes. Cuando existe una demanda de eritrocitos, los reticulocitos son los primeros entrar a la sangre. Después de la hemorragia la producción de eritrocitos puede aumentar de 4 a 10 veces. Formas de Hemoglobina La oxidación del hierro de la hemoglobina de la forma Fe++ a Fe+++ produce la formación de metahemoglobina; una metahemoglobina que sobrepase de 1.5g/dl causa cianosis clínica y puede presentarse por exposición a una severa tensión oxidantes(nitritos, nitratos, de libados de la anilina y drogas)o una alteración genética; en estos casos se debe a una deficiencia de metahemoglobina reductasa NADH dependiente de una sustitución hereditaria de aminoácidos en la cadena alfa o beta cerca al sitio de adherencia del hem. La caboxihemoglobina se produce como resultado de la exposición al CO. La partícula hem tiene gran afinidad por el CO la cual puede ser superior 200 veces que la afinidad que presenta por el oxigeno; los pacientes registran un rojo cereza en lugar del color cianótico. Las principales causas puede ser la contaminación industrial, el tabaco o el alquitrán. La concentración de un 30% de metahemoglobina o de

carboxihemoglobina es mucho más grave que un descenso de hematocrito del 30% porque cada tetrámero de hemoglobina con único hem oxidado o unido a ligando será fisiológicamente inútil. SMITH. Destrucción del eritrocito y destino de la hemoglobina En los animales sanos los eritrocitos son fagocitados por las células retículoendoteliales del bazo, hígado, médula ósea, ganglios linfáticos y otros tejidos, la hemoglobina resultante es degradada en partículas hem y globina, posteriormente el hem deja libre el hierro, la globina y la protoporfirina. El hem es convertido en biliverdina por la enzima hemoxigenasa. Luego sobre esta actúa la biliverdinareductasa transformando la biliverdina en bilirrubina. La cual queda libre en el sistema retículoendotelial y luego pasa a la sangre fijándose a la albúmina en ese caso no es excretada por el riñón, es captada por el hígado y conjugada por varios sistemas enzimáticos, microsómicos como la glucuronil- transferasa lo cual le da características de hidrosoluble y recibe el nombre de bilirrubina conjugada que pasa hacer parte de la bilis y es excretada al intestino, donde las bacterias la degrada transformándola en estercobilinógeno o urobilinógeno el cual por circulación entero- hepática va a circulación general y se elimina por el riñón como urobilina constituyéndose en un pigmento castaño oscuro. En condiciones de hemólisis se libera de hemoglobina en el plasma, donde se fija a la haptoglobina(alfa2 – globulina) el complejo hemoglobina – haptoglobina es rápidamente detectado por macrófagos que lo depuran en el sistema retículoendotelial. En ausencia de haptoglobina, la hemoglobina libre del plasma es disociada en hem y globina, y el hierro del hem es oxidado a ferrihemo o hematina, estas se adhiere a la albúmina para formar metahemoalbumina la cual es un indicador de hemólisis intravascular. El plasma normal contiene también una beta1-globulina denominada hemopexina, que también se fija a las partículas hem y se a observado que su aumento acompañe a estados patológicos de la destrucción de eritrocitos. SMITH, MEDWAY, SCHALM, GANON .

GLÓBULOS ROJOS Los glóbulos rojos de los mamíferos son discos circulares planos no nucleados. Los glóbulos rojos del hombre y caninos son discos circulares y bicóncavos. Con los colorantes de Giemsa o Wright toman un color rojizo o ladrillo. En los animales mamíferos (aves, reptiles) son elípticos y nucleados. Los miembros de la familia de los camellos (dromedarios, llamas, alpacas) tienen eritrocitos ovalados, no nucleados. La estructura del eritrocito es la de una malla esponjosa o estroma, entre cuyas redecillas se encuentra depositada la hemoglobina y está rodeada por una condensación lipoprotéica que le sirve como membrana de envoltura. El diámetro de los eritrocitos expresado en micras varía entre 5 a 7.5 u y el grosor de 1-2 u. TABLA 1. Diámetro de los eritrocitos en diferentes especies de mamíferos. ESPECIES Oveja Cabra Caballo Bovino Cerdo

Diámetro promedio en micras 5.0 5.0 5.6 5.6 6.2

Gato Perro Hombre

6.5 7.3 7.5

Los glóbulos rojos están compuestos de agua de 59-64 % y sólidos totales el resto, o sea 3641% . De los sólidos totales el 90 % está formado por la hemoglobina y el 10 % está formado por el estroma globular. El estroma globular está compuesto principalmente de proteínas, lípidos como lecitina, colesterol y sales inorgánicas. La función primaria de los eritrocitos es transportar la hemoglobina y ésta a su vez sirve para transportar el O2 y el dióxido de carbono, por eso se le denomina pigmento respiratorio. Además los eritrocitos por medio de su masa contribuyen el volúmen sanguíneo e influyen en la dinámica del flujo sanguíneo. El periodo de vida de un eritrocito oscila en las diferentes especies entre 60 y 160 días. TABLA 2. Período de vida de los eritrocitos en diferentes especies animales. _________________________________________________________________ Especies Período de vida en días _________________________________________________________________ Bovino adulto 160 Bovino 3 meses 55 Caballo 140-150 Ovejas 70-153 Cabra 125 Perro 110-122 Gato 68 Cerdo 63 Conejo 68 Pollo 20 _________________________________________________________________ Los eritrocitos son formados en la medula ósea cada día por millones y destruídos en igual número por las células del sistema retículo endotelial que se encuentra en el bazo, hígado, medula ósea y ganglios linfáticos. La masa de células rojas circulantes y el tejido eritropoyético en la medula ósea constituyen la unidad funcional, el eritrón. Para que los eritrocitos sean producidos, se deben cumplir ciertos requerimientos: debe haber un adecuado suministro de proteínas para la producción de globina, hierro y otros elementos tales como cobre, cobalto y vitaminas. Debe haber un adecuado suministro del factor hematopoyético el cual es el responsable de una maduración ordenada normal, además debe haber una adecuada cantidad de protoporfirina y ciertas vitaminas. Si todos esos factores están presentes en cantidades normales, la maduración de los precursores de los eritrocitos ocurrirá en un proceso ordenado en el cual las células en el estado apropiado de maduración comenzaran a sintetizar las moléculas de hemoglobina normal.

En ausencia de esos factores, puede ocurrir una eritropoyesis anormal. Esto puede aparecer como producción de eritrocitos incompletamente hemoglobinados o como células anormales caracterizadas por ser deficientes en número y por tener anormalidades morfológicas. La eritropoyesis anormal puede no siempre resultar en una deficiente producción de eritrocitos o de hemoglobina, si no bajo algunas circunstancias, se pueden producir números excesivos de eritrocitos. Los estados fisiológicos o patológicos pueden afectar el eritrón resultando en un cambio absoluto o relativo por encima o por debajo del nivel normal: a) atrofia o anemia b) hipertrofia o policitemia c) hidremia o hemodilución d) deshidratación o hemoconcentración. El eritrón en estado de salud permanece en balance delicado, con la producción diaria de eritrocitos igual al de la destrucción de eritrocitos viejos.. La rata de reemplazo de eritrocitos en un individuo normal es increiblemente rápida, casi un millón de eritrocitos son reemplazados cada segundo por ejemplo en un perro sano de 15 kg. En respuesta a la anemia, los tejidos hematopoyéticos normales pueden sufrir un aumento hasta de 6 a 8 veces en la producción de eritrocitos. Para el tratamiento efectivo del paciente anémico es básico una comprensión del proceso de eritropoyesis y los factores endógenos y exógenos que intervienen en su regulación. La función principal del eritrocito es la de servir como transportador de la hemoglobina por medio de la cual son los principales transportadores de oxígeno a las células y tejidos del cuerpo. La incorporación de la hemoglobina en una célula especial para la circulación en la corriente sanguínea hace posible la compleja estructura y actividades especializadas de los vertebrados. La hemoglobina en solución, a la concentración encontrada en los eritrocitos de los mamíferos, no aumenta la viscocidad de la sangre. A tal concentración, sin embargo ejerce una presión osmótica cerca de tres veces mayor que la causada por las proteínas plasmáticas solas. Esta presión podría tener profundos efectos en el movimiento de fluídos a traves de las paredes de los capilares y particularmente sobre la filtración en los glomérulos renales. Esos efectos son evitados colocando la hemoglobina dentro de una célula que es capaz de pasar a través de la luz de los capilares más pequeños. Otra ventaja es obtenida al estar la hemoglobina en el interior del eritrocito, es que está en un ambiente ligeramente más ácido que el plasma, al cual la hemoglobina es más eficiente como pigmento respiratorio. Otra ventaja del empaquetamiento de la hemoglobina en unidades celulares son: la hemoglobina es removida del pool metabólico general , impidiendo su rápido recambio ( la vida media de la hemoglobina libre en el plasma es cerca de 3 horas, lo opuesto a semanas y meses dentro de los eritrocitos ) y la hemoglobina es mantenida en estrecha proximidad al sistema enzimático para mantener su estado químico requerido para el transporte del oxígeno. SINTESIS DE LA HEMOGLOBINA La hemoglobina es una proteína conjugada que consta de heme y de globina. Cada molécula consta de 4 unidades de heme y cada unidad está asociada con una cadena polipéptida individual. Síntesis del heme

El heme consta de un anillo de protoporfirina ( tipo III ) en el centro del cual hay un átomo de hierro en el estado ferroso. La estructura básica consta de 4 anillos pirrólicos unidos por 4 puentes metenos para formar el núcleo de porfina común a todas las porfirinas. La succinil-coenzima A ( Co A ) y la glicina formada en el ciclo del ácido tricarboxílico, reaccionan para formar ácido delta- aminolevulínico ( ALA ). Este ácido es sintetizado únicamente en la mitocondria, y la enzima ALA-sintetasa es un factor limitante en toda la secuencia de síntesis del heme. El fosfato de piridoxal ( vitamina B6 ) es necesaria para la actividad de glicina requerida para su condensación inicial con succinil-Co A. La deficiencia de vitamina B6 produce una anemia hipocrómica. El ácido pantoténico es un componente de la coenzima A, su deficiencia produce una anemia hipocrómica. Dos moléculas de delta- ALA reaccionan para formar porfobilinógeno ( PBG ). Cuatro moléculas de PBG reaccionan, formando el anillo tetrapirrólico componente del uroporfirinógeno III. Para la formación de éste se requieren tanto de la uroporfirinógeno I sintetasa y la uroporfirinógeno III cosintetasa. El uroporfirinógeno III es convertido a coproporfirinógeno III y luego a protoporfirinógeno, el cual al ser oxidado produce protoporfirina III. Esta posteriormente se combina con 4 moles de hierro en estado ferroso para formar heme, ( Diagrama 1 ), 4 moléculas de éste se conjugan con 4 moléculas de globina para formar una molécula de hemoglobina. El heme es sintetizado en la mitocondria y los eritrocitos maduros no lo pueden sintetizar debido a la falta de las mitocondrias y del núcleo. Tanto la ALA-sintetasa involucrada en el primer paso de la síntesis del heme y la heme sintetasa involucrada en el último paso de la síntesis son enzimas intramitocondriales y por lo tanto están limitadas a los precursores eritroides incluyendo los reticulocitos. La protoporfirina III se acumula en alguna medida en los eritrocitos maduros y por lo tanto está aumentada cuando hay reticulocitosis como en hemorragia o hemólisis agudas. Las condiciones asociadas con reducción en la formación del heme (ejemplo anemia por deficiencia de hierro, anemia de infección crónica e intoxicación por plomo) resultan en un aumento de la protoporfirina libre en el eritrocito. El plomo produce profundas alteraciones en la síntesis de la hemoglobina, reduce la síntesis de heme inhibiendo la ALA-sintetasa, ALA-dehidrasa y heme sintetasa y tambien retarda la biosíntesis de globina inhibiendo la formación de cadenas de polipéptidos. Puesto que la anemia por intoxicación por plomo se debe en parte a la inadecuada formación de hemoglobina , la anemia es progresiva y se caracteriza por la presencia de muchos eritrocitos nucleados en la sangre, basofilia punteada prominente en eritrocitos maduros y también en los policromáticos. La reticulocitosis está ausente o es escasa. La deficiencia de hierro aumenta el riesgo de la intoxicación por plomo. Además de la protoporfirina de la molécula de hemoglobina, las otras dos porfirinas naturales, la coproporfirina y la uroporfirina se encuentran en cantidades trazas en las heces y la orina; la primera tambien se encuentra en eritrocitos jóvenes y su excresión se aumenta cuando se intensifica la eritropoyesis. La porfirinuria es un término que se aplica para indicar la excresión aumentada de porfirinas en la orina, ésta es parda o color vino tinto debido a la gran cantidad de porfirinas presenters. Un ejemplo, además de su aumento después de hemorragias o enfermedades hemolíticas agudas, es la presentación aumentada de coproporfirina III en la orina en intoxicación por plomo. La porfiria es una enfermedad del metabolismo de las porfirinas y generalmente es congénita; tanto la coproporfirina y la uroporfirina son producidas en cantidades excesivas y puesto que la última tiene predilección por los dientes y huesos esas estructuras tienen un color pardo rojizo.

ACIDO SUCCINICO -

COENZIMA A (del ciclo de

GLICINA + SUCCINIL COA

ALA sintetasa (intramitocondrial)

ACIDO DELTA AMINOLEVULINICO

ALA dehidrasa (contiene cobre) PORFOBILINOGENO (PBG) PBG de aminasa POLI - PIRRIL UPG I sintetasa

UPG III cosintetasa UPG I sintetasa

Uroporfirina

UROPORFIRINOGENO III (UPG)

Uroporfirina

UROPORFIRINOGE

UPG decarboxilasa COPROPORFIRINOGENO III (CPG)

Coproporfirina III

Coproporfirin

CPG oxidasa

PROTOPORFIRINOGENO III (PPG) PPG oxidasa

PROTOPORFIRINA III Fe ++ Heme - sintetasa (intramitocondrial) Pb

HEME

Se excretan en orina y heces

COPROPORFIRINOGENO

Diagrama 1. Representación esquemática de los pasos de la producción del heme. La globina requerida para la formación de hemoglobina es sintetizada en el citoplasma. La información genética contenida en la secuencia del DNA del núcleo es transportada al citoplasma para que los poliribosomas ensamblen las proteínas que van a formar las cadenas específicas de globina. La rata de síntesis de heme y globina puede ser alterada por varios factores como inanición, radiaciones ionizantes e intoxicación por plomo. Destrucción de los eritrocitos El promedio de vida de los eritrocitos varía con las especies, en el perro es de 120 días y en el gato de 70 días. El envejecimiento de los eritrocitos está acompañado por los cambios en el contenido enzimático y la estructura de la membrana celular haciendo que la célula sea menos deformable la cual es objeto de remoción por el bazo. En estado de salud los eritrocitos seniles abandonan la circulación por dos rutas: la fagocitosis por las células del sistema fagocítico mononuclear ( sistema retículoendotelial ) es la ruta principal ( hemólisis extravascular ) y por medio de la lisis intravascular y liberación de hemoglobina libre , la cual es una ruta menor. En la anemia hemolítica se producen rutas similares de destrucción. MATERIALES ESENCIALES PARA LA PRODUCCION DE ERITROCITOS La composición química de los eritrocitos incluyen: lípidos, proteínas, carbohidratos, minerales, vitaminas etc.. Cuando hay insuficiencia de esos factores que son los más críticos para la producción de eritrocitos se produce eritropoyesis anormal. Un perro mantenido en un estado anémico por repetidas remociones de sangre y alimentado con una dieta baja en proteínas no puede producir la cantidad usual de globina para la síntesis de hemoglobina aún en presencia de un exceso de hierro; en estas condiciones utiliza proteínas de sus propios tejidos y proteínas plasmáticas para producir hemoglobina. El hierro, cobre y cobalto son los principales minerales requeridos para la producción de eritrocitos. El hierro es una parte integral de la molécula de hemoglobina y por lo tanto es absolutamente esencial para la síntesis de hemoglobina. El cobre es un cofactor para la enzima ALA dehidrasa requerida para la síntesis del heme. El cobalto es requerido en la molécula de la vitamina B 12 (cianocobalamina) la cual es esencial para la eritropoyesis normal interviniendo en la síntesis del DNA. En casos de deficiencia de vitamina B 12 los períodos intermitóticos son prolongados y la maduración se detiene en el estado de pro-rubricito y rubricito, haciendo que esas células sean más grandes y más numerosas en la medula ósea; aunque la mitosis es lenta por falta de síntesis de nucleoproteínas la síntesis de hemoglobina continúa llegando a una eventual extrusión del

núcleo y producción de algunos eritrocitos más grandes de lo normal; esos rubricitos grandes se les denominan megaloblastos, la anemia es macrocítica normocrómica. Las vitaminas esenciales para la eritropoyesis son las del complejo B : riboflavina ( B 2 ), piridoxina ( B 6 ), niacina, folato, tiamina y vitamina B 12. ERITROCINETICA Características de la célula primordial hematopoyética.: la célula primordial es multipotencial; su morfología es desconocida, pero parace ser similar a un linfocito pequeño. Esta célula primordial se autoreplica o se diferencia en una célula primordial unipotencial, ésta incluye células primordiales unipotenciales que van a producir la serie de células eritrocíticas, o la serie granulocítica-monocítica ( neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos ), o la serie megacariocítica (plaquetas). La célula primordial unipotencial eritrocítica se autoreplica y por acción de la eritropoyetina se produce diferenciación a un rubriblasto. ( Diagrama 2 ) Producción de eritrocitos Se ha postulado que las células primordiales primitivas pluripotenciales indiferenciadas en la medula ósea dan lugar a células unipotenciales cada una comprometida en la producción de las series eritrocítica, granulocítica-monocítica o megacariocítica. La eritropoyesis en mamíferos comienza con la diferenciación de células primordiales pluripotenciales en dos células eritroides progenitoras: las desencadenadoras de unidadeseritroides (BFU-E ) y su progenie las unidades-eritroides formadoras de colonias ( CFU-E ), éstas últimas, bajo la influencia de la eritropoyetina, posteriormente dan lugar a los precursores eritroides morfológicamente reconocibles, los rubriblastos, los cuales sufren por lo menos 4 mitosis hasta producir eritrocitos maduros.

Una variedad de factores endógenos o exógenos influyen en la hematopoyesis; esos factores incluyen microambiente hematopoyético inductivo ( HIM ), ciertos factores hormonales tales como actividad promotora desencadenante ( BPA ) y algunas otras sustancias que influyen en la diferenciación inicial. La eritropoyetina y el Ca++ juegan un papel importante en la diferenciación a rubriblastos y los estados posteriores.

Diagrama 2. Secuencia de diferenciación de célula primordialy eritropoyesis. La eritropoyetina es el regulador fisiológico principal de la eritropoyesis en humanos y animales en condiciones de salud y anemia. Normalmente se encuentra en pequeñas cantidades en el plasma y en la orina. El estímulo fundamental para la eritropoyesis es la hipoxia tisular, ya sea como consecuencia en el tamaño del eritrón ( anemia ) o como resultado de la alteración de la saturación de oxígeno de la hemoglobina.

En condiciones de hipoxia se aumenta la elaboración de la eritropoyetina la cual estimula la eritropoyesis. La hipoxia atmosférica, anémica o cardiopulmonar aumentan la eritropoyesis por aumento en la producción de eritropoyetina, y la hiperoxia y policitemia causada por transfusión de eritrocitos, disminuyen la eritropoyesis por disminución en la producción de eritropoyetina. Los riñones son el sitio principal de producción de eritropoyetina en el adulto de muchas especies. Hay un número de hormonas que juegan un papel fisiológico en controlar el tamaño del eritrón : la pituitaria , adrenales, tiroides y gónadas participan en la regulación de la eritropoyesis en gran medida a través de los efectos sobre el metabolismo y requerimientos de oxígeno, aumentando por lo tanto la producción de eritropoyetina. Los andrógenos, hormona tiroidea estimulante ( TSH ), hormona adrenocorticotrópica ( ACTH ), hormona del crecimiento, prolactina, cortisona ,tiroxina, epinefrina, norepinefrina y angiotensina producen aumento en la producción de eritropoyetina, mientras que el estrógeno ejerce una acción inhibitoria sobre la eritropoyesis

Eritrocitosis: Al incremento en el número de eritrocitos por arriba de los valores normales en la sangre, se le conoce como eritrocitosis. Esta condición puede ser relativa o absoluta, ésta última puede ser primaria o secundaria. Un hematocrito de 0.60 L/L es sospechoso de eritrocitosis, que puede ser relativa o absoluta y un hematocrito tan grande como de 0.70 L/L por lo general sugiere eritrocitosis primaria. Las manifestaciones clínicas de la eritrocitosis absoluta resultan del incremento persistente de la masa de eritrocitos, asociado con la expansión del volumen sanguíneo. La congestión y la cianosis de las mucosas es una manifestación de la disminución del transito de la sangre oxigenada. El aumento excesivo de eritrocitos incrementa la viscosidad de la sangre y la resistencia vascular pulmonar, así como la disminución en la toma cardiaca. Las alteraciones tienden a disminuir el flujo, reducen la oxigenación de los tejidos, producen disturbios neurológicos, e incrementa el riesgo de trombosis. El transporte de oxigeno se altera con incremento del hematocrito por arriba del 0.50 L/L. Eritrocitosis relativa: Resulta de la pérdida del volumen plasmático, como sucede en deshidratación. Otra forma resulta del incremento de eritrocitos en la circulación, como sucede en la contracción del bazo, la contracción puede incrementar hasta en 0.25 L/L el valor del hematocrito en sólo 3 minutos. Eritrocitosis absoluta primaria: La eritrocitosis verdadera, también conocida como Rubra vera es una enfermedad mieloproliferativa, en ella se producen más eritrocitos, leucocitos y plaquetas. Eritrocitosis absoluta secundaria: Se asocia con aumento en la producción de eritropoyetina como una respuesta fisiológica compensatoria por parte de los riñones a consecuencia de

hipoxia tisular, algunos ejemplos son: adaptación a grandes alturas, tetralogía de Fallot en perros, gatos y caballos, o como resultado de la producción autónoma independiente del aporte de oxígeno a los tejidos como sucede en: carcinoma renal o en carcinoma hepatocelular. La diferenciación entre eritrocitosis primaria y secundaria requiere de un análisis detallado mediante estudios físicos, radiografías de tórax y pruebas de laboratorio, necesarias para establecer el diagnóstico. Ocasionalmente se hace necesario cuantificar PO2 y eritropoyetina. PO2 arterial es baja y eritropoyetina alta en eritrocitosis absoluta secundaria, PO2 es normal y la concentración de eritropoyetina baja en eritrocitosis primaria. I CURSO DE PATOLOGÍA CLÍNICA VETERINARIA Y CORRELACIÓN CLÍNICO PATOLÓGICA LABORATORIO ZOOLAB. MAYO 3 – AGOSTO 17 DE 2.006. CALI COLOMBIA

ALTERACIONES DE LA CELULARIDAD DE LA MÉDULA ÓSEA La valoración microscópica de la médula ósea (MO) debe ser metódica y completa. En el momento de recoger la muestra de médula debe tomarse una muestra de sangre periférica para su estudio. La historia del caso, los síntomas clínicos y otros resultados laboratoriales son también importantes para establecer un resultado concluyente. La citología aspirativa nos permite valorar la morfología individual de cada célula y realizar el conteo diferencial, aunque es limitada para valorar la estructura y la celularidad de la médula ósea por lo que en estos casos preferimos usar la técnica de biopsia. Para una óptima interpretación de un examen citológico de médula y su arquitectura son necesarias una extensión y una biopsia. Valoración de una muestra Un frotis teñido por el método de Romanowsky debe ser observado en su totalidad con un objetivo de pocos aumentos (4x - 10x) para detectar si la muestra es válida. Debemos apreciar si está bien teñido, si existe más de un fragmento de médula y si sus células están bien distribuidas (formando una monocapa) y no existe una gran rotura celular. Valoración de la celularidad

Esta valoración debe ser realizada con un objetivo de pocos aumentos. Es importante verificar que existen partículas de médula (estroma y células asociadas) si están presentes los osteoblastos, los osteoclastos y los megacariocitos. Una celularidad inadecuada y la ausencia de partículas, normalmente nos indica una técnica de aspiración con contaminación sanguínea. La tasa de células adiposas por células hematopoyéticas se puede determinar examinando la proporción de espacios adiposos por células por partículas aspiradas. MÉDULA ÓSEA NORMAL Para una buena valoración se debe observar el mayor número posible de partículas, pues la celularidad puede variar en cada área. La celularidad normal presenta variaciones con la edad del animal. La médula de animales muy jóvenes contiene muy pocas células adiposas, en ellos aparece un 25% de adipocitos y un 75% de células hematopoyéticas. En los adultos, la proporción es del 50% y en animales viejos la proporción es de 75% de adipocitos y 25 % de células hematopoyéticas. Cuadro 1 – Mielograma del perro (Adaptado de Keller, P. & Freudiger, U. 1983).

Alteraciones de la celularidad de la médula ósea En relación a las alteraciones de la celularidad y teniendo en cuenta que la citología aspirativa no es el mejor método para valorar la celularidad global de la médula ósea, esta puede ser clasificada en hipocelular, normo celular (teniendo en cuenta la edad del animal) o hipercelular sin confundir los casos de hemodilución. MÉDULA HIPOCELULAR Una MO hipocelular se caracteriza por tener pocos fragmentos medulares. Estos tienen una baja tasa células/adipocitos. Son normalmente una incertidumbre entre que sea una aplasia medular o una mielofibrosis o simplemente

una

muestra

insuficiente.

La

presencia

de

un

número

considerable de adipocitos juega a favor de una auténtica médula pobre en células pero necesita una confirmación histológica.

Figura 1: Médula ósea hipocelular (May-Grünwald/Giemsa, 10x) Si una médula es hipocelular, ha de verificarse si están presentes partículas de MO y si estas contienen células hematopoyéticas y además confirmar los resultados con una toma de nuevas muestras. Una reducción de la celularidad puede estar asociada a una única línea celular o abarcar a todos los tipos celulares. MÉDULA NORMOCELULAR Estos tipos medulares presentan varios fragmentos medulares, con una tasa normal células/adipocitos (Cuadro 1). Una médula normocelular puede ser normal o contener alteraciones displásicas, discrásicas u organismos que indiquen alteraciones patológicas. Las alteraciones displásicas son aquellas relativas a la morfología celular causadas por un proceso patológico. Las alteraciones discrásicas son proporciones anormales de diferentes estadios de desarrollo de una serie celular o proporciones anormales de diferentes series celulares.

Figura 2: Médula ósea normocelular (May-Grünwald/Giemsa, 10x) MÉDULA HIPERCELULAR

Figura 3: Médula ósea hipercelular (May-Grünwald/Giemsa, 10x) En este caso la médula presenta una gran abundancia de fragmentos, con elevada tasa de células/adipocitos. Debemos tener en cuenta que algunos procesos neoplásicos que cursan con médula hipercelular pueden presentar extensiones con pocos o ningún fragmento celular.

Figura 4: Médula ósea hipercelular, macrófago central (May-Grünwald/Giemsa, 100x) HEMODILUCIÓN La regla general de hemodilución es el caso más frecuente que afecta a la valoración cuantitativa de una extensión de MO. El conteo será así realizado sobre sangre de MO, dificultando la valoración del porcentaje de células medulares en comparación con las células sanguíneas. Presencia y proporciones relativas de todas las series celulares y fases de maduración El paso siguiente para la valoración de la MO es saber si están representadas todas las series celulares o si cada una de ellas presenta todos los estadios de maduración y si el núcleo y el citoplasma maduran de un modo sincrónico. En una MO normal todas las series celulares están bien representadas, mostrando todas los estadios de maduración y siendo el número de las células maduras siempre superior a la de inmaduras. VALORACIÓN DE LA SERIE MEGACARIOCÍTICA Los megacariocitos son fáciles de identificar con objetivos de pocos aumentos (4-10x) (Cuadro 1). Ellos tienden a estar concentrados junto a las partículas de la médula, pues generalmente se encuentran adyacentes a las paredes de los senos vasculares.

Por norma cada fragmento de médula contiene varios megacariocitos. Menos de tres por fragmento sugiere hipoplasia megacariocítica. El número máximo no está bien establecido, no obstante más de 50 sugiere hiperplasia megacariocítica. En condiciones normales el equivalente al 50 % de los megacariocitos se deben encontrar en estado maduro. VALORACIÓN DE LAS SERIES GRANULOCÍTICA Y ERITROCÍTICA Para valorar correctamente esta serie debemos investigar si la maduración es correcta o si existe una relación normal de células maduras e inmaduras, si están ordenadas o si están presentes todas las fases de maduración y en las proporciones correctas, si existen alteraciones morfológicas (Cuadro 1). Las cantidades, proporciones y morfología de la serie granulocítica y de la eritrocítica son valoradas usando objetivos (10-100x). No es necesario realizar un conteo diferencial detallado de cada fase de maduración y es suficiente una valoración global sobre si la proporción de las células en fase de proliferación es o no normal.

Figura 5: Médula ósea, precursores eritroides y un precursor mileoide (MayGrünwald/Giemsa, 100x) Índice mieloide-eritroide (IM-E) El índice mieloide/eritroide se obtiene dividiendo el número de células de la serie granulocítica por el número de las células nucleadas de la serie eritroide. Este estudio debe hacerse con un objetivo 100x, usando aceite de inmersión.

Usualmente son diferenciadas 500 células y preferiblemente 1000. Todas las células,

incluso

las

degeneradas,

son

incluidas

en

el

conteo

independientemente de su estado de maduración. Las células restantes son excluidas del cálculo de este índice. Para

minimizar

eventuales

diferencias

en

la

distribución

celular,

aproximadamente la mitad de las células deben ser diferenciadas en fragmentos de MO distintos y las restantes en espacios entre estos. El conocimiento de la celularidad medular y de la calidad del aspirado es esencial para interpretar los resultados obtenidos. El índice m/e puede verse afectado por la contaminación con sangre periférica una vez que este contiene granulocitos pero no células eritroides nucleadas. En realidad, para efectos clínicos, cuando se tiene experiencia en examinar muestras de MO, no es necesario determinar exactamente estos valores, sino valorar si esta relación es normal, alta o baja. El IM-E es bastante variable según los diferentes autores, pudiéndose considerar una media normal del IM-E de 1:1 a 2:1 (variando de 0.5:1 a 4:1) (Cuadro 1). Este índice nos da una relación de la hematopoyesis mieloide y eritroide y debe ser interpretado con relación al número absoluto de eritrocitos y granulocitos sanguíneos. El índice está aumentado cuando existe hiperplasia mieloide o hipoplasia eritroide y está disminuido cuando existe hipoplasia mieloide o hiperplasia eritroide. Los resultados del hemograma son usados para determinar qué líneas celulares están aumentadas o disminuidas y que desvíos del IM-E van a causar. ÍNDICES DE MADURACIÓN ERITROIDE Y MIELOIDE Estos índices se realizan para detectar asincronías en la maduración celular y deben compararse siempre con los conteos celulares en sangre periférica. El índice de maduración eritroide es una suma de células eritroides en maduración (eritroblastos ortocromáticos), dividida por la suma de las células eritroides en fase proliferativa (proeritroblasto, eritroblasto basófilo y eritroblasto

policromático). El valor normal del índice de maduración eritroide es de 3,6 (Cuadro 1). El índice de maduración mieloide (IMM) es la suma de células mieloides en maduración (metamielocitos, células en banda y neutrófilos segmentados), dividida por la suma de las células mieloides en fase proliferativa (mieloblastos, promielocitos y mielocitos). El valor normal de IMM es de 8.8 (Cuadro 1). Los valores normales de los índices IME y IMM reflejan la predominancia de las fases de maduración sobre las fases de proliferación en un MO normal. Si el IM-E es un indicador fiable de la respuesta medular, los índices IME e IMM resultan útiles en la identificación de las alteraciones de los patrones de maduración para detectar asincronías de maduración. Valoración de los depósitos de hierro La MO es el principal órgano almacenador de hierro del organismo; aproximadamente el 60% de las reservas corporales de hierro se encuentran en forma de hemoglobina, 4% son mioglobina, 1% está en las enzimas que contienen el grupo hemo y 0.1 % están en forma de transferrina. La valoración del contenido de hierro de la MO es un test bastante específico para excluir el diagnóstico de anemia ferropénica si no hay presencia de hierro corável en la médula. El hierro es almacenado en agregados pequeños sólo en forma de ferritina y como masas mayores e insolubles de hemosiderina. Para la identificación definitiva del hierro es necesaria una coloración específica como el Azul de Prusia. La hemosiderina se tiñe de azul oscuro con este tipo de coloración. La ferritina no puede ser vista microscópicamente con las coloraciones de rutina para aspirados citológicos de médula ósea. Es importante que sean examinadas partículas óseas, porque los macrófagos tienden a concentrarse en esas áreas. En un aspirado de mala calidad se puede encontrar poco o ningún hierro aunque en la médula existan unas cantidades adecuadas de hierro.

COMENTARIOS GENERALES SOBRE CITOLOGÍA DE LA MO A LOS ESTUDIOS DE MO SE APLICAN LOS SIGUIENTES PRINCIPIOS GENERALES: a) Los megacariocitos son las mayores células de la médula, con todos los estadios

de

maduración

razonablemente

bien

representados.

En

las

extensiones de MO los megacariocitos están concentrados en la base o bordes de la preparación. b) Las células de las líneas eritrocítica y granulocítica sufren mitosis y disminución de tamaño en cada estadio sucesivo de maduración. Además, las células en la misma fase de maduración pueden tener tamaños diferentes. La clasificación no se basa en el tamaño sino en las características citoplasmáticas y nucleares. c) Las primeras células blásticas contienen nucleolos que se colorean de azul claro debido a su contenido en RNA. Después de la primera división mitótica, el nucleolo pierde su color pero puede persistir una estructura en forma de anillo. d) El citoplasma de las células blásticas es basófilo y se colorea de un azul sucesivamente más claro a medida que la maduración prosigue. El citoplasma de las células inmaduras de la serie eritroide es mas basófilo comparado con la serie granulocítica. e) Los mieloblastos, en general, no contienen gránulos citoplasmáticos. En los promielocitos aparecen gránulos azurófilos. Los mielocitos son los que presentan gránulos específicos. El estadio de metamielocito es bastante variable en tamaño y ocasionalmente pueden ser vistas células bastantes grandes. Los gránulos de la serie eosinofílica muestran una gran variación de tamaño durante todo el proceso de maduración. f) En las células blásticas la cromatina nuclear es difusa y finamente punteada. El inicio de la condensación se da en los promielocitos y proeritroblastos tornándose más pronunciada en cada estadio sucesivo de maduración de la serie. La cromatina nuclear se colorea más oscuro en la serie eritrocítica que

en la granulocítica, porque la primera tiene un contenido en DNA mayor. El patrón de cromatina nuclear en el eritroblasto policromático se asemeja a una rueda de carro, en cuanto que en la serie granulocítica la cromatina maciza se torna finalmente concentrada junto a la membrana nuclear quedando irregular en el neutrófilo maduro. g) El núcleo y el citoplasma normalmente maduran en conjunto. Las enfermedades que deprimen la hematopoyesis pueden hacer que falten divisiones mitóticas lo que produce formas gigantes con patrones nucleares bizarros. Tales formas son vistas con frecuencia en patologías de los gatos. La aparición en células de la serie granulocítica de núcleos dobles, citoplasmas espumosos, objetos aislados granulares y azules oscuros (cuerpos de Döhle) y gránulos azurófilos dispersos o uniformemente distribuidos son todos indicación de granulopoyesis aberrante o anormal. h) Las células de la serie granulocítica son más susceptibles a la rotura durante la preparación de la extensión que las de la serie eritrocítica. i) Los linfocitos maduros están presentes en pequeñas cantidades en los aspirados de MO de los animales domésticos. Son normalmente más numerosos en los gatos (10 a 15%) que en el resto de las especies. En el perro son menos del 1% de los constituyentes celulares de la médula. La dilución de las preparaciones de MO con sangre da aumento del número de linfocitos en la muestra especialmente en aquellas especies en las que el número de linfocitos en sangre es superior al de neutrófilos (por ejemplo la vaca). j) Los plasmocitos no son frecuentes en un MO normal. Aparecen en números elevados en enfermedades con exposición antigénicas persistente como el mieloma. Representan del 1 al 3% de todas las células de la MO. (Fig. 6)

Figura 6: Médula ósea, plasmocito y eritroblastos en diferentes estadios (MayGrünwald/Giemsa, 100x) k) Los estadios de neutrófilo en banda y reticulocitos preceden inmediatamente a la célula madura de su respectiva serie. Ambos son clasificados como células inmaduras y su presencia en número elevado en la corriente sanguínea indica una intensificación de su producción por la MO.

Figura 7: Médula ósea, macrófago que fagocita hematogonias (MayGrünwald/Giemsa, 40x)

Figura 8: Médula ósea, macrófago con amastigotes de leishmania (MayGrünwald/Giemsa, 100x)