• Author / Uploaded
• SandraJustino

Citation preview

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN MARCOS Universidad del Perú, decana de América

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE GENÉTICA Y BIOTECNOLOGÍA

Ensayo Cometa en linfocitos y monocitos humanos de sangre periférica.  Horario: Martes , 1 pm- 5pm (G-2)

 Docente responsable : Margarita Rosa Eugenia Velásquez Reinoso

 Docentes invitadas : Dalia Violeta Churampi Mancilla Eva Andrea Dueñas Villavicencio.

 Curso: Genética Humana

 Fecha de realización: Lunes 23 y 30 de Noviembre del 2017

 Fecha de entrega de informe: Viernes 10 de Noviembre del 2017  Alumna: Justino Templadera Sandra Susan

15100115

Resumen

Desde hace varias décadas el ensayo Cometa, o electroforesis alcalina de células individuales, se ha convertido en un método establecido para el estudio del daño de ácido desoxirribonucleico, con múltiples aplicaciones en ensayos de genotoxicidad, estudios de biomonitoreo en humanos, epidemiologia molecular y ecotoxicología. En la mayoría de estudios, los linfocitos de sangre periférica son utilizados como modelo celular. Sin embargo, en los últimos años, la aplicación de esta técnica se ha extendido a las células germinales, con el fin de evaluar la integridad del ADN espermático así como una herramienta fundamental para investigaciones sobre daño y reparación del ácido desoxirribonucleico. Asimismo este ensayo se distinguió por su simplicidad, sensibilidad, versatilidad, rapidez y economía. Es una poderosa técnica que se basa en la visualización microscópica de las imágenes del ácido desoxirribonucleico después que las células son embebidas en agarosa, lisadas y sometidas a una electroforesis alcalina. Esta metodología básica ha sido ampliada, y permite ahora, detectar con alta sensibilidad una gran variedad de daños del ácido desoxirribonucleico en cualquier tipo de células, pero es importante tener claro que su especificidad no es absoluta. El objetivo de esta práctica de laboratorio evaluar el daño celular inducido por agente genotóxico (peróxido de hidrógeno), en linfocitos de sangre periférica para análisis de las rupturas de simple cadena y sitios abásicos producidos en el DNA por el agente como criterio de genotoxicidad mediante la electroforesis alcalina de células individuales mediante el Ensayo Cometa.

INTRODUCCION

La mayor parte del material hereditario, DNA, se localiza en el núcleo celular como bases químicas, Adenina, Guanina, Citosina y Timina; el orden y secuencia de estas determina la información para construir y mantener un organismo. Existen diferentes tipos de daños al DNA que inducen ciertas lesiones introduciendo desviaciones a su conformación normal de doble hélice. Un agente genotóxico, es capaz de producir modificaciones de las características particulares del DNA; el H2O2 es un agente capaz de dar lugar a múltiples reacciones, llegando a producir un daño celular. El daño celular producido por estos agentes al encontrarse en elevadas cantidades, ocurre sobre diferentes macromoléculas, tal es el caso de lípidos, proteínas y DNA, conociéndose a este daño como estrés oxidativo. En el DNA, el estrés oxidativo puede dar lugar a fenómenos como mutaciones y carcinogénesis. Los linfocitos humanos periféricos representan una población celular donde el DNA está predominantemente en la etapa pre-sintética del ciclo celular, fase Go. Los linfocitos humanos poseen un núcleo denso y citoplasma escaso. Se distinguen dos tipos principales de linfocitos, células T y B. El número total de linfocitos en un dulto saludable puede ser aproximadamente 500x 109 , y alrededor del 2% (10 x 109 ) están presentes en la sangre periférica y el resto se ubican en otros tejidos, como en timo, nodos linfáticos, tejido linfático del intestino, bazo y médula ósea. Para interpretar aberraciones cromosómicas, es de gran importancia conocer si el grupo de linfocitos periféricos pertenece al grupo de redistribución; cerca del 80% de los linfocitos (400 x109 ), pertenecen a este y el tiempo total de recirculación es de cerca de 12 horas. Empleando los linfocitos de sangre periférica como modelo experimental no solo puede detectarse el daño cromosómico que ha sido inducido en los linfocitos en la sangre periférica, sino también aquellos que han sido inducidos en cualquiera de los órganos donde estas células se distribuyen en el cuerpo. Singh y colaboradores (1988) introdujeron una técnica en microgeles que involucra la electroforesis alcalina (pH 13) para detectar el daño al DNA en células individuales; se refiere a la migración del DNA en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis, que al ser observada la célula al microscopio, por fluorescencia o tinción con plata, presenta la apariencia de un cometa, con una cabeza, región nuclear, y cola, formada por fragmentos nucleares que han migrado en dirección del ánodo, por lo que es conocido como Ensayo Cometa, debido al patrón de migración del DNA que se produce.La integridad de nuestro DNA es un aspecto fundamental para la salud y el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo , sabemos que el material genético es sucptible a ser dañado por numerosos agentes y/o procesos , asi por ejemplo la guanina es especialmente suceptible a las especies reactivas de oxigeno producidas durante el metabolismo normal de la célula(Collins, 1999 ; Halliwell , 2000; Moller y Loft , 2002) .Si se acepta que el daño en DNA es perjudicial , la prevención del mismo o , en su defecto , el incremento en la eficiencia de reparación , cabe considerarlos como beneficiosos ; así surge la necesidad de contar con herramientas sensibles y fiables que nos permitan profundizar en los aspectos relacionados con la detección de daño en el ADN , así como su protección y reparación y una de estas herramientas es el ensayo cometa. El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula es una herramienta sensible y confiable, con un método rápido, de bajo consto y útil para la detección de daño y reparación del ADN en distintas poblaciones celulares (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007) existiendo tres tipos de ensayo el cometa alcalino , cometa neutro y el de reparación de DNA .Es una prueba sencilla y de bajo costo en la que las células de los tejidos blanco no tienen que estar en proliferación activa ni experimentar fase mitótica (Prieto y Llópiz 1999), permitiendo medir

cualitativa y cuantitativamente el daño al ADN de células individuales de forma no invasiva (Bajpayee et al. 2005). En la actualidad existen dos versiones del ensayo Cometa: una, introducida por Sing y colaboradores, y otra, desarrollada por Olive y colaboradores. Las dos versiones son similares en principio, pero la mayor diferencia está dada en los valores de pH de la electroforesis. El método de Sing, conocida como electroforesis alcalina porque emplea pH > 13, mientras que el método de Olive, emplea electroforesis con pH de 8,3 y se conoce como electroforesis neutra. Ambos métodos son capaces de detectar ruptura de doble cadenas de ADN(DSB) , pero el método alcalino detecta además, ruptura en una cadena de ADN ( SSB) y sitios álcali-labiles(ALS). Por esta razón el ensayo en condiciones alcalinas es el más usado (Singh NP et al. 1991). En el desarrollo de la técnica las células son embebidas en agarosa y colocadas sobre láminas portaobjetos para ser sometidas a una electroforesis de condición neutral o alcalina, que se ejecuta posterior a la lisis por acción de altas concentraciones de sales y detergentes (Mudry y Carballo 2006, Arencibia y Rosario 2009). Las células con mayor frecuencia de rupturas de cadena doble, rupturas de cadena simple y sitios álcali lábiles muestran una migración significativa del ADN hacia el ánodo (Fairbairn et al. 1995, Zúñiga 2009). El fundamento bioquímico básico de la técnica es la migración del ADN en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis, con lo cual las células con daño se visualizan al microscopio con apariencia de cometas, donde la cabeza la constituye la región nuclear con material genético intacto y la cola la conforman los fragmentos de ADN en migración, de los que hacen parte roturas y puntos sensibles al álcali (Cossio et al. 2004, Liao et al. 2009). El largo o extensión de los cometas, es directamente proporcional al daño inducido sobre el material genético y es indicador de la sensibilidad de la prueba. Su sensibilidad supera en más de 100 veces a las pruebas citogenéticas y que permite detectar roturas de simple cadena y sitios lábiles a los álcalis. Este ensayo puede ser aplicado a cualquier célula eucariótica y permite el análisis del daño genético al nivel de células individuales. Dado que esta técnica permite el análisis de diferentes tipos celulares en un mismo individuo, brinda una información más acabada de los niveles de daño al ADN a diferencia de los estudios citogenéticos que utilizan casi siempre el linfocito de sangre periférica.

Obtención de resultados : Al observar las carencias inherentes a cada nuevo método, distintos científicos se dedicaron a buscar algún sistema más simple . Así, una nueva forma de conteo basada en la clasificación visual fue recomendada por Collins et al.(1995), método que resulta especialmente útil en aquellos laboratorios que no cuentan con experiencia previa en el ensayo cometa ya que no requiere ni de sistemas ni de programas sofisticados . El ojo humano es una herramienta capacitada para discernir distintos grados de daño , de acuerdo a la apariencia del cometa . El método consiste en clasificar el nivel de daño en 5 categorías que van de 0 (celulas sin migración ) a 4 (casi todo el DNA en la cola ) , mostrando una muy buena resolución . TCS : Expresádo en unidades arbitrarias según la fórmula:

Este método , denominado conteo visual , se ha descrito como una aproximación rápida , simple y que no requiere de costosos sistemas de análisis , por lo que su uso ha sido ampliamente recomendado y utilizado (Collins et al. 1997c). En la fase post analítica para la confirmación de los resultados, no existen valores guías, pero se realiza bajo condiciones de aseguramiento de calidad. En cada ensayo, se emplea un control negativo y otro positivo, lo que permite analizar la variabilidad de diferentes grados (desde 04).

Ventajas del Ensayo Cometa : El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula provee ciertas ventajas ante otras pruebas que evalúan el daño genotóxico por efecto. En este test los datos son colectados a nivel de células individuales, proveyendo información de la distribución intercelular del daño y de la reparación. Así mismo se requiere sólo pequeños números de células para ser llevado a cabo y virtualmente cualquier población de células eucariotas puede ser utilizada en el proceso (Tice et al. 2000, Di Giorgio et al. 2001, Frenzilli et al. 2009). Por medio de este ensayo es posible evaluar el daño en células no proliferativas, lo que representa también un gran beneficio sobre otras técnicas que si lo requieren (Prieto y Llópiz 1999). En la electroforesis de una sola célula además se ha reportado mayor sensibilidad de detección de daño con respecto a otras pruebas de citogenética clásica. Estudios comparativos en donde se evalúan los efectos genotóxicos de la radiación por rayos X en linfocitos humanos, establecen que el daño se incrementa con las dosis de radiación proporcionadas a la muestra tanto en el test de micronúcleos como en el ensayo cometa, sin embargo la sensibilidad del ensayo cometa es significativamente superior, puesto que el daño es detectado incluso a bajas exposiciones (He et al. 2000). El ensayo del cometa alcalino es considerado también en otros estudios comparativos de carácter farmacéutico para la evaluación de nuevas drogas, junto con la prueba de aberraciones cromosómicas, mostrando un alto grado de valor predictivo (Hartmann et al. 2003). A nivel general este test de genotoxicidad es bastante flexible permitiendo la detección de un amplio rango de daños que

pueden ocasionarse en el ADN y consta de un proceso sencillo y de rápida ejecución, por lo que es posible la obtención de resultados el mismo día en que se ha tomado la muestra y se ha realizado el protocolo (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007) Desventajas del Ensayo Cometa A pesar de que la técnica ha sido ampliamente empleada y aceptada a nivel mundial, existen algunas desventajas en su proceso de evaluación.  La primera de ellas hace referencia al estricto manejo y preparación de los reactivos y el número de variables que pueden afectar un óptimo desarrollo, pues cualquier alteración en la concentración de la agarosa, el estado de las distintas soluciones de trabajo, el pH, la temperatura y los tiempos de cada paso, pueden cambiar drásticamente el resultado a analizar debido a la alta sensibilidad de la técnica (Zúñiga 2009).  La segunda desventaja es la imposibilidad de detectar el efecto de agentes aneugénicos que son agentes químicos que, a nivel molecular, impiden la fijación de las fibras del huso al cinetocoro , los cuales también son eventos de gran participación en los procesos carcinogénicos (Mudry y Carballo 2006).  La tercera desventaja y la más nombrada, hace referencia a la falta de estandarización en el análisis de las muestras y la representación de los datos que se obtienen en los estudios, ya que aunque muchos investigadores abarcan el tema, proponen constantemente nuevas formas de valoración, sin definir un único proceso de evaluación que permita la comparación entre laboratorios (Zúñiga 2009).

Aplicaciones Esta técnica es altamente sensible para evidenciar daño genotóxico inducido, identificando posibles mutágenos y cancerígenos, entre otros aspectos, tanto en estudios in vivo como in vitro (Ritter y Knebel 2009); ha sido sugerida y aplicada en estudios de cáncer, evaluación de genotoxicidad ambiental y laboral, estudios de prevención de exposición a productos químicos y biomonitorización en general (Machado et al. 2009).

Aplicaciones clínicas      

El diagnóstico prenatal La Susceptibilidad de Cáncer La terapia de Cáncer La diabetes Mellitus La artritis de Rheumatoide Lupus Erythematosus sistémico entre otros

Biomonitoreo     

Envejecimiento El ejercicio Mala nutrición El ozono El biomonitoreo ambiental, acuático/terrestre.

Materiales y Métodos

1

Células embebidas en agarosa sobre un portaobjetos

2

Lisis

3

Denaturación

4

Electroforesis

5

Neutralización

6

Tinción

Figura . Organigrama de la técnica ensayo cometa

El trabajo se realizó con la intervención de una mujer sana de 20 años de edad , quien no presenta historia de exposición a genotóxicos, sin contacto cotidiano con químicos, no fumadores, no expuestos a fármacos por dosis terapéutica, ni evidencia de anomalías genéticas. Estos criterios de inclusión se manejaron de manera estricta, para mantener la validez interna del estudio y evitar resultados falsos positivos. La muestra de sangre se realizó por punción endovenosa en el laboratorio 105 de la Facultad de Ciencias Biológicas (UNMSM) , en tubos con heparina . Las células evaluadas se obtuvieron por suspensión celular , en la verificación con Peróxido de Hidrogeno . El ensayo cometa se desarrolla mediante una serie de pasos o etapas que corresponden a: (1) el preparado de láminas, en las que las células a evaluar son embebidas en agarosa y colocadas sobre portaobjetos; (2) la lisis celular por acción de altas concentraciones de sales y detergentes con los que se degradan las membranas, los residuos de RNA y otras proteínas; (3) la

denaturación del ADN; (4) la electroforesis, que permite la migración del material genético dañado hacia el ánodo; (5) la neutralización, en la que se eliminan restos de sales presentes en los geles y se renaturalizan las cadenas de ADN en la cabeza del cometa; (6) la tinción y (7) el análisis (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Ahora bien, el proceso de estandarización de la técnica se lleva a cabo de manera independiente en cada laboratorio, estando en la mayoría de ocasiones sujeto a modificaciones del protocolo original por las condiciones características, así como de los reactivos y materiales que se dispone. El carácter individual de la estandarización permite al mismo tiempo autonomía a los distintos grupos de investigación, al momento de introducir variaciones en el manejo del tiempo y empleo de otras concentraciones en las soluciones de trabajo. Para esta práctica se siguió el siguiente protocolo:

Se extrajo 8ml de sangre periférica en tubos con heparina, seguido de centrifugación a 1000 rpm por 10 minutos , se transfirió con mucho cuidado las 2 fases en un tubo de centrifuga de 15 ml, Adicionando al tubo de centrífuga, un mismo volumen de solución PBS(1x), se coloco , con mucho cuidado, la mezcla de sangre y PBS(1x), gota a gota por los costados en un nuevo tubo de centrífuga al que previamente se le adicionó 6 ml de Ficoll hypaque , seguido de una centrifugación a 2000 rpm durante 20 minutos y se descartó la porción superior del centrifugado (plasma sanguíneo).

Figura . Capas formadas después de la centrifugación

Se aspiró 2000ul del anillo blanquecino que contiene los linfocitos y monocitos y se colocó en un nuevo tubo de centrífuga, adicionándose aprox. 8 ml de PBS(1x), al tubo de centrífuga, seguido a esto se centrifugo por 20 minutos a 4000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se obtuvo un precipitado blanquecino que se re suspendió en 1ml PBS, nuevamente se centrifugo por 15 minutos, descartándose la fase superior y se resuspendió nuevamente en 1ml de PBS(1x),. *Se tomó 100 μl de la suspensión teñido con azul de tripan , es importante conocer la viabilidad de nuestras células , como la cantidad o concentración de estas , ya que si hay una gran cantidad no se obtendrá los resultados esperados , se observara células superpuestas , las celulas se contabilizaron en la cámara de Neubahuer .Aproximadamente se obtuvo 2x105 cel/ml.  En otro un tubo de centrífuga, se pasó una alícuota de 500 μl de la suspensión de células y se agregó la dilución de peróxido de hidrógeno H2O2 (300 μM), y se dejo reposar durante 30 min. (Control positivo).  En otro tubo de centrífuga, se pasó una alícuota de 500 μl de la suspensión de células y se agregó 500 μl de agua destilada y se dejo reposar por 30 min. (Control negativo). En ese lapso se preparan las láminas de la siguiente manera; las láminas previamente lavadas y secadas se les agrega un volumen de 500 – 1000 μl de agarosa de normal punto de fusión (ANF)1% , se dejan secar por 20 minutos a 60 °C, transcurridos los 30 min de reposo de los tubos, se homogenizan y centrifugan a 1000 rpm por 10 minutos, se descarta el sobrenadante y se agrega 1000 μl de agarosa de bajo punto de fusión (ABF)1%. Rápidamente colocar esta mezcla goteando 2 veces en las láminas ya preparadas con ANF (tanto del control positivo y negativo). Colocar inmediatamente un cubreobjetos sobre ambas gotas y dejar enfriar a refrigeración por 5 min a 4°C . Retirar el cubreobjetos con mucho cuidado, de inmediato agregar de 75 a 80 μl de ANF y colocar los cubreobjetos, dejar enfriar a refrigeración por 5 min a 4°C .

Tercera capa de agarosa de punto de fusión normal

Se retira las láminas de la refrigeradora , luego se retira el cubreobjetos con mucho cuidado.  Colocar las láminas ya preparadas en un coplin con solución de Lisis durante 24 h (1 semana) (EN OSCURIDAD), la solución lisis contenía NaCl, EDTA, Trisbase , estos componentes permiten que el núcleo reviente , y el material genético quede expuesto.  Denaturación. En cuanto al proceso de desenrrollamiento del ADN , se coloca la cámara de electroforesis horizontal en la mesa y se debe mantener fría con ayuda de hielo picado ,se vierte el buffer de electroforesis (NaOH 10 N y EDTA 200 mM) con un pH> 13 ,en este paso es crucial la temperatura del buffer que no debe ser menor a 15°C, para esta práctica se utilizó agentes químicos para la denaturación pero este proceso también se puede realizar con agentes físicos , las láminas portaobjetos se dejan reposando en la cámara durante 20 min (tiempo de desenrollamiento).  Electroforesis .Mientras transcurre el tiempo de desenrollamiento , se configuran los parámetros de la fuente de poder a 25 V, 300 mA y 20 min para la corrida electroforética , el ADN migrara hacia el ánodo , la resolución de la muestras dependerá asimismo del % de agarosa empleada y la fuerza iónica.  Neutralización. Se retiraron las láminas con ayuda de pinzas y se deja secar , se colocaron las láminas en la charola de lavados y se les agrega solución de Trisma Base 0.4M, pH 7.5 , aproximadamente el volumen completo de una pipeta Pasteur por muestra , se dejan reposar 5 min y se repite el lavado, se escurren y se sumergen en etanol anhidro 70% por 10 minutos para deshidratar , se escurren y se sumergen en agua destilada para la hidratación por 10 minutos . Las hebras de ADN separadas anteriormente por medio de la electroforesis y ubicadas en la cabeza del cometa se renaturan a su super enrrollamiento, debido a que sus lazos están intactos pero el ADN contenido en la cola permanece extendido por sus daños.  Tinción .Se tiñeron con solución de Nitrato de Plata durante 20 minutos los del control negativo y los de control positivo con Giemsa, la ventajas de utilizar el Giemsa es que la lámina puede almacenarse indefinidamente , los resultados son más fáciles de analizar , y es poco toxico , con respecto al nitrato de plata , su principal ventaja es que muy sensible , poco toxico pero tiene la desventaja que la lámina tiene un corto tiempo de almacenamiento ,se paraliza la tinción agregándole ácido acético al 1% por 5 minutos , finalmente se hizo la lectura al microscopio de los resultados .

Resultados

Se fotografiaron 5 campos , de una sola lamina , tanto para el control positivo como negativo , en términos generales se debió contabilizar aproximadamente 2x105 cel/ml si se sigue el protocolo adecuadamente , adicionalmente se puede observar la viabilidad de células mediante la tinción con un colorante biológico (azul de tripan) .

Figura . Conteo de células mononucleares en la cámara de Neubahuer

Se observa una gran cantidad de células mononucleares por área, ya que se obtuvo una gran cantidad de células mononucleares(Se aspiró 2000ul del anillo blanquecino que contiene los linfocitos y monocitos y se colocó en un nuevo tubo de centrífuga, adicionándose aprox. 8 ml de PBS(1x) para la diluirlo )

Figura .Alta concentración de células mononucleares y una célula no viable

Con esta muestra se trabajó, ya que se disminuyó la concentración de células mononucleares , al diluirlo en PBS(1x) una vez más , en un volumen .

Figura .Baja concentración de células mononucleares .

Resultados esperados

Células mononucleares sin exposición a ningún agente físico , químico o biológico como rayos UV , rayos x , H2O2 , acrilamida , entre otros. El nucleo se mantiene compacto , las células fueron teñidas con Giemsa .Aumento 1000 x .

Figura

. Control negativo

Células mononucleares con exposición a H2O2 (300uM) por 30 minutos. Se observan células con diferentes frecuencias del grado de daño apreciado en los cometa, siendo el de más frecuencia el de tipo 3 , donde el tamaño de la cola sobrepasa el tamaño de la cabeza , las células fueron teñidas con Nitrato de Plata .Aumento 1000 x .

Figura

. Control positivo

Resultados obtenidos

Figura

. Control negativo

Células mononucleares sin exposición a ningún agente físico , químico o biológico como rayos UV , rayos x , H2O2 , acrilamida , entre otros. En este caso el nucleo no observa muy compacto , hasta se puede confundir con núcleos con ADN dañado tipo 1 , esto se debe a varios factores como el tiempo de exposición en la solución de Lisis , el tiempo de denaturación y electroforesis , las células fueron teñidas con Giemsa, .Aumento 1000 x .

Células mononucleares con exposición a H2O2 (300uM) por 30 minutos. Se observan células con diferentes frecuencias del grado de daño apreciado en los cometa, siendo el de más frecuencia el de tipo 3 , donde el tamaño de la cola sobrepasa el tamaño de la cabeza , las células fueron teñidas con Nitrato de Plata , no se observa una buena resolución .Aumento 1000 x .

Figura

. Control positivo

En cuanto a la evaluación de resultados , se realizó la clasificación visual recomendada

por Collins et al.(1995), método que resulta especialmente útil en aquellos laboratorios que no cuentan con experiencia previa en el ensayo cometa ya que no requiere ni de sistemas ni de programas sofisticados . El ojo humano es una herramienta capacitada para discernir distintos grados de daño , de acuerdo a la apariencia del cometa . El método consiste en clasificar el nivel de daño en 5 categorías que van de 0 (células sin migración ) a 4 (casi todo el DNA en la cola ) .

Células

Clasificación

0 -> sin daño

2 -> El tamaño entre la cabeza y la cola es proporcional

3-> El tamaño entre la cabeza es menor que la cola

*No se puedo realizar un conteo de células, por lo tanto no se pudo aplicar el TCS (Expresado en unidades arbitrarias según la fórmula) , ya que los núcleos no poseían una buena resolución y no había fotos de campos totales , para realizar el % de las células de acuerdo a su daño.

Las curvas mostradas en la figura se llevaron a cabo teniendo en cuenta que las dosis de daño aplicadas a la sangre periférica constituían la variable independiente, que podía hacer variar la variable dependiente, en la que se evaluaba el efecto causado (daño en los cometas), por la longitud de cola y el porcentaje de ADN en cola.

Finalmente, después de analizar todos los ensayos de verificación se propuso una escala cualitativa de daño a partir de los cometas observados en los ensayos hechos, tal y como se aprecia en la figura .

Discusión

El ensayo cometa o electroforesis de una sola célula es una herramienta sensible y confiable, con un método rápido, de bajo consto y útil para la detección de daño y reparación del ADN en distintas poblaciones celulares (Di Giorgio et al. 2001, Hwang y Bowen 2007), cabe mencionar que la utilización de muestras de sangre ha sido una herramienta muy eficaz en la evaluación de la genotoxicidad con H2O2 en esta pratica , empleando principalmente linfocitos aislados , además , los linfocitos al estar en circualcion , podemos considerar que su estado celular , nuclear y metabolico (incluyendo el DNA) , refleja la exposición global del organismo , los linfocitos aislados son muy sensibles para el análisis del potencial genotoxico (Elhajouji et al.,1994; Surralles et al., 1995) . Los linfocitos son parte de la línea linfoide del sistema inmune y se encuentran en los organos linfoides , en particular los linfocitos de sangre periférica reprensentan un sistema muy vetajoso ya que son fáciles de obtener , son ciculantes y están en contacto con las genotoxinas , constituyen una población celular sincrónica , su tasa de reparación es baja , sin embargo existen algunas desventajas , tales como : A veces los linfocitos que se estimulan pueden no ser las células diana del agente que se pretende evaluar , presentan una capacidad metabólica limitada , al no ser una población homogénea , las subpoblaciones de linfocitos solo difieren en sus funciones , en sus características físicas , tamaño y permeabilidad de membrana , asimismo en la sensibilidad frente a determinados agentes , tanto físicos como químicos , esta desventaja es importante y ha de tenerlo presente en los resultados . Para el aislamiento de células mononucleares se realizó el protocolo convencional con la obtención de 8ml de sangre periférica por punción endovenosa y heparinizada , la cual es centrifugada y el sobrenadante es transferido a otro tubo que contenía Ficoll hypaque . La técnica de Ficoll hypaque es una técnica de centrifugación por gradiente de densidad para separar células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de otras células de la sangre, se obtuvo aproximadamente 2000 uL de anillo blanquecino que contiene los linfocitos y monocitos,la cual fue diluido para obtener una menor concentración de celulas por campo aprovechando una de las ventajas del ensayo cometa como es la de necesitar pequeños número de células , y así observar mejores resultados , encontrando células dispersas . Es importante conocer la viabilidad de nuestras células , en este practica se utilizó un colorante biológico , el azul tripán , asimismo como la cantidad o concentración de estas , ya que si hay una gran cantidad no se obtendrá los resultados esperados , se observara células superpuestas , la cantidad indicada para obtener resultados óptimos es de aproximadamente 2x105 cel/ml aunque este cantidad también depende de las células con las que se este trabajando , por ejemplo en caso de queratinocitos, se utilizan aproximadamente 10 000 células en la camara de neubauer . Con respecto al tipo de ensayo cometa a realizar , si neutra o alcalina , ¿De que depende? Dos años más tarde Olive en el año 1990, introdujo otra versión alcalina de este ensayo, con esta variante se detectan SLA convertidos en RSC. Por lo tanto, en la actualidad existen dos versiones del ensayo Cometa: una, introducida por Sing y colaboradores, y otra, desarrollada por Olive y colaboradores. Las dos versiones son similares en principio, pero la mayor diferencia está dada en los valores de pH de la electroforesis. El método de Sing, conocida como electroforesis alcalina porque emplea pH > 13, mientras que el método de Olive, emplea electroforesis con pH de 8,3 y se conoce como electroforesis neutra. Ambos métodos son capaces de detectar ruptura de doble cadenas de ADN, pero el método alcalino detecta además, sitios alcalinos lábiles y RSC.

Por esta razón el ensayo en condiciones alcalinas es el más usado y es el que utilizamos en esta practica . En el preparado de las láminas los protocolos varían entre una y tres capas de agarosa. La preparación es esencial por dos objetivos principalmente, siendo el primero de ellos brindar un soporte adecuado a las células a analizar y el segundo lograr la mejor visualización posible sin ruido que imposibilite el posterior análisis (Zúñiga 2009). Cuando se emplea una única capa de agarosa la suspensión celular mezclada con el gel se coloca directamente sobre una lámina portaobjetos limpia y desengrasada. El empleo de una sola capa es una posibilidad poco usada actualmente, puesto que su uso requiere de mucho cuidado en la manipulación y además es mayor el trabajo para la visualización de los cometas (Zúñiga 2009). Lo más común es el uso de tres capas de agarosa a modo de sándwich. En este caso las células de interés son suspendidas en agarosa de bajo punto de fusión, generalmente a 37°C, y colocadas entre una primera y tercera capa (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009) . La primera es una capa de agarosa de punto de fusión normal que sirve de base a la capa celular, para conferirle mejor adherencia (Zúñiga 2009). La última o tercera capa de agarosa es igualmente de bajo punto de fusión y juega principalmente un papel protector (Zúñiga 2009), aunque en nuestro caso la tercera capa utilizada fue de normal punto fusión Algunos laboratorios han eliminado esta tercera capa y han dejado el protocolo con solo dos, puesto que se ha demostrado que no dificulta el proceso y permite mejores resultados ante otras modificaciones (Liao et al. 2009). Cada capa debe solidificarse antes de agregar una capa superior (Ritter y Knebel 2009). En la capa celular, bien sea la segunda o primera, debe manejarse la concentración de agarosa y la dilución celular con mucho cuidado. Si la cantidad de células por unidad de área es grande, el análisis tiende a verse afectado, con mayor efecto en los estudios en los que el daño inducido es alto y por tanto mayor la migración esperada del ADN, pues en estos casos se visualizará un solapamiento de colas y es imposible la medición rigurosa del daño causado. Por su parte, la concentración de agarosa puede dificultar la migración del ADN. Normalmente se sugiere una mezcla de aproximadamente 10000 hasta 50000 células en 10 µl de suero con 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión, a una concentración final entre 0.5 y 1.5% (Tice y Vásquez 1999). Los microlitros de muestra y agarosa varían también de acuerdo a sí las células a analizar han pasado por un cultivo o se adicionan de manera directa sin antes ser estimuladas (Speit et al. 2003, Bajpayee et al. 2005, Speit y Schütz 2008). Con respecto a la primera capa de agarosa (punto de fusión normal) 1% , se estableció la ejecución de un proceso de deshidratación previa a la aplicación de la segunda capa a 60°C por 20 minutos , ya que de no ser así, se manifestaba el fenómeno de desprendimiento de geles, es posible presumir que entre más delgada sea la primera capa, mayor será la adhesión al portaobjetos, así como también será mejor la estabilidad proporcionada a la segunda capa del preparado (Zúñiga 2009). En el caso de la segunda capa de agarosa, lo único importante a mencionar es que al ser embebidas las células a estudiar, la agarosa de punto de fusión normal debe mantenerse a 37°C, de lo contrario se comete el error experimental de denaturar por calor el ADN de las células. La solución de Lisis está conformada por los diferentes componentes NaCl , EDTA , Trizma base , DMSO y Tritón , ahora dependiendo de la célula a estudiar es que varían las concentraciones de estos componentes existiendo una concentración óptima para cada componente y para cada tipo de célula ,por ejemplo la solución de lisis conformada por Tris HCl pH 8, EDTA 0,5M y

SDS 10%, no es óptima pues con su uso la membrana celular de linfocitos de sangre periférica ya que la célula no es degradada . Esto posiblemente se debe a que el SDS no es un detergente tan fuerte como el Tritón X-100, lo cual no garantiza la lisis de los linfocitos(Jiménez y Martínez 2000), que la solucion de lisis no contenga DMSO , también es un error , ya que fundamentalmente este sirve para limpiar los radicales generados por el hierro liberado de la hemoglobina (Tice y Vásquez 1999), asimismo según estudios realizados por ( Angela Vergara , 2010) se e llegó a la conclusión de que el buffer de lisis bajo ninguna circunstancia debe ser reutilizado, pues este habiéndose utilizado aunque sea solo una vez con anterioridad, genera un daño agregado en el ADN . Esto puede explicarse potencialmente por el daño oxidativo que causa en el ADN la liberación de hierro ocasionada durante la lisis de los eritrocitos (Mudry y Carballo 2006). Este daño no se evidencia en un primer uso del buffer por la acción del DMSO en su concentración adecuada (10%), sin embargo puede plantearse que para un segundo evento de uso o posteriores eventos de uso el DMSO no cumple con este fin, debido a que la concentración de este en la solución ha disminuido o se ha agotado, encontrándose el buffer de lisis contaminado por radicales oxidantes. El buffer de lisis por un tiempo prolongado, permite evidenciar los resultados esperados (Figura ) , tal como lo exponen Güerci et al. 2006, Mudry y Carballo 2006, Sotil et al. 2007 y Zúñiga 2009, se estableció el de 17 horas es un tiempo adecuado para la lisis de celulas mononucleares , únicamente con el fin de agilizar la consecución de resultados; pues las medidas cuantitativas evaluadas para lisis de 17 horas y 22 horas, en ambos casos, tuvieron gran similitud al compararse con los controles trabajados por Henderson et al. 1998, por lo tanto es de esperarse buenos resultados a las 24 hrs que fue lo obtenido (Fig ) El problema de los núcleos del control negativo , se piensa que fue debido al tiempo de denaturacion , se conoce que el uso de tiempos cortos de reposo alcalino y corrida electroforética da buenos resultados , ya que estudios realizados con muestras de control negativo a periodos largos de denaturacion y electroforesis presentaba nucleos concéntricos mas no compactos como lo observado en la figura ( ) , esto indica que la denaturación ha sido tal, que se ha afectado negativamente el ADN, ocasionando que posterior a un proceso de neutralización no se vuelva a condensar el material genético, como es el proceso normal esperado. Debido a que se comprobó experimentalmente que el tiempo no es un factor que afecte la corrida electroforética, este se disminuyó con el fin de agilizar la obtención de resultados, además de evitar la exposición de las láminas a mayor tiempo en el buffer a pH > 13, al cual se lleva a cabo la descondensación del ADN por efecto de la denaturación. Por otro lado en el proceso de electroforesis, se fijó para el protocolo final un nivel bajo del buffer en la cámara electroforética, ya que de lo contrario la corriente se escapa a través del buffer y no de los geles, evidenciándose en muestras de un control positivo el daño en la periferia de la cabeza de los cometas y no en la existencia de cola,si a pesar de que la muestra es control positivo y no se oberva cola esto se atribuye a una electroforesis no óptima. En la etapa de la neutralización embargo se recomienda aumentar el número de lavados en el proceso de neutralización, únicamente si se observa mucho background en los controles negativos . La electroforesis era llevado a cabo durante los siguientes 20 min a 25 V utilizando una fuente de alimentación compacta de electroforesis , La cola del cometa se forma debido a que los fragmentos de ADN que en ella se encuentran son menos pesados que el resto de la cadena de ADN y por tanto su velocidad de migración hacia el polo positivo es mayor. En nuestros experimentos, la sangre completa se ha utilizado con éxito y, por lo tanto, elimina la necesidad de aislamiento de linfocitos. Además, dado que la duración de la migración depende sobre el

porcentaje de agarosa en el gel y sobre la duración de electroforesis, debería ser posible usando agarosa de mayor porcentaje geles o tiempos electroforéticos más cortos para cuantificar cantidades mayores de ADN daño en células individuales. Por el contrario, aumentar la duración de la electroforesis quizás permitiría una evaluación de niveles extremadamente bajos de daño en el ADN. Este paso se realiza con el mismo buffer empleado en la denaturación. La electroforesis llevada a cabo en el ensayo cometa, es diferente a las convencionales, pues en este caso se necesita que el ADN migre solo una fracción de milímetros, lo que se consigue con la exposición de los portaobjetos a bajos voltajes por corto tiempo, entre 0,5 – 5 V/cm y 5 – 30 minutos (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Las condiciones óptimas de voltaje y amperaje dependen generalmente de la migración evidenciada en los controles negativos. Los fragmentos de ADN inducidos por agentes genotóxicos migran hacia el ánodo (Faust et al. 2004). El resultado efectivo de la técnica, además de un número de pasos, está mediado por el control de otros factores como la constitución de la matriz de agarosa, el nivel de pH, la temperatura, el tiempo de lisis y electroforesis y el voltaje y amperaje con los que se lleva a cabo el ensayo (Tice et al. 2000, Arencibia y Rosario 2009, Liao et al. 2009). Así pues, la apariencia de los cometas difiere notablemente por los procesos de lisis y electroforesis empleados (Klaude et al. 1996). Neutralización Este paso se lleva a cabo para neutralizar los álcalis presentes en el o los geles de agarosa. Generalmente se realizan tres lavados con buffer Trizma pH 7,5 con duración cada uno de 5 minutos (Mudry y Carballo 2006, Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Si en los portaobjetos se evidencia ruido de fondo pueden realizarse mayor número de lavados o ampliar el tiempo de los mismos. En la neutralización las cadenas de ADN separadas por el tratamiento alcalino en la cabeza del cometa se renaturalizan, puesto que el material genético está intacto, mientras que el ADN de la cola permanece como monocaternario (Liao et al. 2009, Zúñiga 2009). Finalizada la neutralización, los preparados pueden ser teñidos o deshidratados para su análisis inmediato o posterior respectivamente. Si se decide realizar preparados permanentes, se pasan las láminas sucesivamente por varios alcoholes, con lo que se logra la deshidratación de los geles (Klaude et al. 1996). Tinción La tinción o colorante utilizado es específico para ADN. Los colorantes más empleados son el Bromuro de Etidio, en algunos estudios también se han empleado técnicas no fluorescentes como la tinción con nitrato de plata (Cossio et al. 2004). A la hora de presentar los resultados, es de destacar que tampoco existe un método estadístico estándar, sin embargo, generalmente los datos son presentados a manera de histogramas de frecuencia en función de distintas propiedades como: momento de cola, dispersión de la longitud de la cola, porcentaje de ADN que migra, entre otras (Ejchart y Sadlej 2003, Moller 2006). Otros trabajos sugieren el uso de curvas de calibración para estandarizar los parámetros que permiten cuantificar el daño evaluado entre laboratorios, teniendo en cuenta las dosis de daño a las que han sido expuestas las células in vitro y el momento o porcentaje de ADN en cola (Güerci et al. 2006).

El peróxido de hidrogeno (H2O2) es un compuesto químico conocido ampliamente por su poder oxidante. En el material genético produce alteraciones que se expresan a manera de rupturas de cadena sencilla y doble, además de modificaciones de bases sensibles al álcali (Marnett 1987). La inestabilidad que causa el peróxido de hidrógeno en el ADN es generada por la formación del radical OH (Fairbairn et al. 1995), el cual está considerado como la principal especie derivada del oxigeno que contribuye a la oxidación endógena a nivel celular. Aunque la exposición al H2O2 también puede dar origen a reacciones en cadena en donde se forman diferentes intermediarios reactivos, son las rupturas de cadena sencilla, de cadena doble y los sitios sensibles al álcali, los puntos de interés por la sensibilidad de la versión alcalina del ensayo cometa (Cossio et al. 2004). Se escogió el peróxido de hidrogeno para la verificación de la estandarización llevada a cabo, pues es un compuesto altamente utilizado como control positivo en estudios de genotoxicidad dentro de los que se encuentra el ensayo cometa (Sotil et al. 2007, Soler et al. 2008) y además, es bien conocido su efecto en linfocitos humanos, monocitos, fibroblastos neonatales humanos, hepatocitos, sangre periférica humana y líneas celulares de mamíferos roedores (Rojas et al. 1999). Por los resultados obtenidos se puede establecer una medida cualitativa de daño evaluada (Figura ) . En la practica solo se expuso todas las células a una dosis de (300 uM por 30 minutos ) , pero otras investigaciones emplearon dosis de 0,249M y 0,499M, donde se aprecia un efecto dosis dependiente, en donde a medida que se incrementa la concentración varía de forma creciente el daño. Esto permite plantear que la misma cantidad de ADN, se encuentra más afectada a una concentración más alta, lo que se evidencia en fragmentos más pequeños que migran más rápido que la cabeza del cometa y por tanto recorren una mayor longitud hacia el polo positivo, formando la cola. Las concentraciones de peróxido de hidrogeno aplicadas en este ensayo se tomaron del trabajo realizado por Henderson et al. (1998), quienes reportan daño, citando medidas como la longitud de cola y el momento de cola. A diferencia de Henderson et al. (1998), los valores de los momentos de cola y de las longitud de cola obtenidos en el presente ensayo son más altos. La diferencia entre evaluar linfocitos de sangre periférica y línea celular de linfoblastos, es que estos últimos tienen capacidad de división y por lo tanto están activas las enzimas que participan en los mecanismos de reparación celular (O’Donovan 1995), observándose diferentes niveles de daño en la célula . En la Figura ( ) se observa dos grados de daño celular a pesar de ser las mismas celulas y estar expuestas a una misma dosis y tiempo de peróxido , esto particularidad posiblemente se deba a que los leucocitos de la sangre periférica se encuentran en diferentes tiempos de vida por lo que es mas probable el daño ocasionado afecte en mayor proporción a las células senescentes o viejas , que las células más jóvenes (Ramana 1998).

Conclusiones

Los tiempos establecidos, los reactivos y la forma en la que se llevaron a cabo los procesos de cada una de las etapas del ensayo cometa, permitieron establecer el desarrollo adecuado de la técnica para la obtención de resultados verídicos, en los que no se aprecia el efecto negativo de ninguna de las variables examinadas. Se evidenció un comportamiento de dosis efecto, con una escala de menor a mayor daño (0-3) en el siguiente orden dependiendo de las condiciones de fisiológicas de la células , por ejemplo el tiempo de vida de las células mononucleares , siendo las células senescentes las mas afectadas . Esta escala de daño está íntimamente ligada a las propiedades intrínsecas de cada agente genotóxico evaluado. La estandarización realizada del ensayo cometa se comprobó satisfactoriamente al comparar los resultados negativos y positivos existente para el agente genotípico H2O2 (300 uM x 30 minutos) La técnica del ensayo cometa , permite la detección sensible del daño del ADN, así como la evaluación de la reparación del ADN en células individuales. En las aplicaciones descritas anteriormente, hemos observado heterogeneidad celular tanto en la respuesta al daño del ADN (con H202) .

Recomendaciones



Para posteriores ensayos de genotoxicidad se sugiere realizar pruebas de viabilidad celular, con el fin de disminuir el error experimental de diagnosticar un resultado falso positivo por citotoxicidad.  Todas las soluciones después de realizadas se deben mantener en refrigeración a 4°C, para procurar la estabilidad de los buffers, al igual que ambas preparaciones de agarosa. La solución de tinción, tanto stock como de trabajo, fueron la excepción, pues se mantuvieron a temperatura ambiente y protegidas de la luz.  Todos los tampones utilizados en este ensayo no deben haber sido preparados con un tiempo superior a un mes para mejores resultados, de acuerdo con los criterios de control de calidad.

Bibliografía

1. Ramalho AT,Sinjevaric I, Natarajan AT. Use of the frequency of micronuclei as quantitative indicator of X ray induced chromosomal aberration in human peripheral blood lymphocytes. Comparison of two methods. Mutat Res 1988;207:141-6. 2. Singh NF, Mc Coy MT, Tice RR, Scheneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 1988;175:184-91. 3. Ames, B. N. (1983) Science 221, 12561264. 4. Rydberg, B., and Johanson, K. J. (1978) in DNA Repair Mechanism (Hanawalt, P. C., and Friedberg, E. C., Eds), pp. 465468, Academic Press, New York. 5. Conrad, J., Muller, N., and Eisenbrand, G. (1986) Chem. Biol. Interact. 60, 57-65. 6. Arencibia Arrebola D.F., Rosario Fernández L.A., “Actualización sobre el ensayo cometa y de micronúcleos in vitro”, Toxicología, 20, 24-41, 2003. 7. Zúñiga Venegas, L.A. “Optimizaciones metodológicas del ensayo del cometa y su aplicación en biomonitorización humana”. Tesis Doctoral en Genética, Universidad Autónoma de BarcelonaBarcelona, España, 2009. 8. Singh NP, Mccoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Expl Cell Res 1988; 175:184-191. 9. Singh NP, Tice RR, Stephens RE, Schneider EL. A microgel electrophoresis technique for the direct quantitation of DNA damage and repair in individual fibroblasts cultured on microscope slides. Mutat Res 1991; 252: 289-296. 10. Olive PL, Banáth JP, Durand RE. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiat. Res. PubMed. 1990 Apr;122(1):86-94. 11. Singh NP, Tice RR, Stephens RE, Schneider EL. A microgel electrophoresis technique for the direct quantitation of DNA damage and repair in individual fibroblasts cultured on microscope slides. Mutat Res. PubMed. 1991 Jun;252(3):289-96. 12. Collins AR, Gaivao I. DNA base excision repair as a biomarker in molecular epidemiology. Molecular aspects of medicine. 2007 May 18;28:307-22. 13. Collins AR. The Comet Assay for DNA Damage and Repair, Principles, Applications, and Limitations. Molecular Biotechnology. 2004 March [cited 2011 Sept 10];26(3):3. Availablefrom: http://hinarigw.who.int/whalecomwww.springerlink.com/whalecom0/content/e6 2l3p154h35ttn8 /fulltext.pdf 14. Mc Kelvey-Martin VJ, Green MHL, Schmezer P, Pool-Zobel BL, De Meo MP, Collins A, et al. The single cell gel electrophoresis assay (Comet assay): a European review. Mutat Res. PubMed. 1993 Jul;288(1):47-63. 15. Hartmann A, Schumacher M, Plappert-Helbig U, Lowe P, Suter W, Mueller L, et al. Use of the alkaline in vivo comet assay for mechanistic genotoxicity investigations. Mutagenesis. PubMed. 2004 Jan;19(1):51-9. 16. Cook PR, Brazell IA, Jost E. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA. Journal of Cell Science. PubMed. 1976 Nov 1;22(2):303–24. 17. Kassie F, Parzefall W, Knasmuller S. Single cell gel electrophoresis assay: a new technique for human biomonitoring studies. Mutat Res. PubMed. 2000 Jul;463(1):13-31.