• Author / Uploaded
• Marilu Menchu

Citation preview

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS Facultad de Ciencias Químicas Campus IV Tapachula

PRACTICA NUM. :4: GRUPOS SANGUINEOS INTEGRANTES:  Menchu Méndez Rosario Aurora  Nuila Menchu Omayra Maricela  Torres Moreno Rocío del Carmen  Zamudio Castellanos Fabiola Yeseline GRUPO Y SEMESTRE: Séptimo semestre grupo “A” CATEDRATICO: Q.F.B. Y E.H.D.L Luis Humberto Rosales Furucawa

Tapachula Chiapas a 3 de noviembre de 2011

LABORATORIO DE HEMATOLOGIA



OBJETIVOS

Al finalizar la práctica el alumno será capaz: Identificar la importancia de la determinación de los grupos sanguíneos. Tipificar los grupos sanguíneos ABO/ABH y Rh. Comprobar los grupos sanguíneos con la prueba inversa.



INTRODUCCION

Los diversos grupos sanguíneos se determinan por la presencia de determinados antígenos eritrocitarios, de igual manera por los antígenos plaquetarios, leucocitarios y séricos. Dichos antígenos son el producto directo o indirecto de la actividad de los genes y se transmiten hereditariamente según las leyes mendelianas. Dichos genes transmiten generalmente caracteres codominantes, es decir, que se transmiten tanto a individuos homocigotos como heterocigotos. Cuando la herencia de los grupos sanguíneos está relacionada con la de otros, se dice que ellos constituyen un sistema de grupo sanguíneo. Todos los antígenos de los grupos sanguíneos han sido definidos serológicamente por los hallazgos de los anticuerpos correspondientes. Cabe señalar que las posibles combinaciones entre los diferentes grupos sanguíneos son tantas que el tipo sanguíneo puede considerarse una característica peculiar de cada individuo. La importancia a clínica de los antígenos sanguíneos se debe a sus propiedades sensibilizantes y a la capacidad de reaccionar con sus correspondientes anticuerpos. Se han definido más de 400 antígenos eritrocitarios, entre ellos se encuentran unos llamados o de alta incidencia, que están presentes en casi todos los individuos, mientras que existen otros que son extremadamente raros denominados o de baja incidencia. El conocimiento de los antígenos y anticuerpos sanguíneos es de gran importancia en la medicina clínica, especialmente en la prevención y tratamiento de las reacciones transfusionales. Puesto que muchos de los antígenos están ampliamente expresados en otras células y líquidos del organismo, pueden considerarse como sistemas de histocompatibilidad. Algunos de los antígenos eritrocitarios se encuentran expresados en el recién nacido, mientras que otros se expresan mucho después. Los anticuerpos eritrocitarios están constituidos fundamentalmente por inmunoglobulinas IgG, IgM y raramente IgA, estos son aloanticuerpos naturales; estos generalmente son de tipo IgM anticuerpos que no pueden atravesar la barrera placentaria, sin embargo los anticuerpos inmunes (generados ante un reto inmunológico) son de tipo IgG y pueden atravesar la placenta, por ellos se genera la EHMF.

Las IgM son llamados Acs completos ya que son capaces de aglutinar a hematíes con Ag correspondientes en medio salino, fijan el complemento y los hematíes se lisan, sin embargo estos son activados a una temperatura de entre 4o C y 20 o C por lo que no tiene relevancia en la Medicina clínica, sin embargo existen algunos que se activan a 37o C (anti-A, anti-B, anti-AB) todos ellos causan hemolisis intravascular. En cambio los IgG actúan a 37oC, son denominados anticuerpos incompletos o sensibilizantes porque son incapaces de aglutinar hematíes en medio salino. SUERO DE COOMBS Los sueros de Coombs pueden ser “poliespecíficos o monoespecíficos”. Los llamados poliespecíficos contienen, además de los anticuerpos contra fracciones “Fc” de las inmunoglobulinas humanas, anticuerpos contra la fracción C3d del Complemento que puede estar presente sensibilizando la membrana eritrocitaria, en la presencia o ausencia de anticuerpos fijados. Los sueros monoespecíficos contienen anticuerpos contra solamente un tipo de inmunoglobulina (IgG, IgM o IgA) o contra fracciones del Complemento (C3c o C3d). Los anticuerpos contra la fracción C4 no deben estar presentes en los sueros poliespecíficos, para evitarse reacciones cruzadas con antígenos del grupo sanguíneo Chido/Rodgers (ISBT= 017CH/RG). Sin embargo la sensibilización de los hematíes puede ponerse de manifiesto de manera in vitro por uso de antinmunoglubulina humana como reactivo, que es un anticuerpo capaz de unirse a las moléculas de IgG o de la fracción C3d del complemento fijadas a la membrana eritrocitaria. La prueba se denomina directa cuando se aplica el estudio de hematíes que pudieron ser sensibilizados in vivo en el propio organismo. La prueba será indirecta cuando se ponga en manifiesto, mediante el mismo procedimiento, la sensibilización de hematíes in vitro con diversos fines como; investigación de Acs antieritrocitarios en suero problema, determinación de fenotipo eritrocitario mediante el empleo de Acs de especificidad definida, pruebas cruzadas transfusionales, entre otras. Generalmente los anticuerpos incompletos no generan una hemolisis rápida intravascular a comparación con los Acs completos, sino que provocan una hemolisis extravascular como consecuencia de la acción del sistema mononuclear fagocítico sobre los hematíes sensibilizados. La sensibilidad esta prueba puede ser aumentada por procedimientos que cambian la primera etapa de la reacción; es decir la fijación de los anticuerpos durante la incubación. Los más utilizados son: adición de albúmina o polietilenoglicol al medio, uso de medios de baja fuerza iónica (LISS) y la utilización de glóbulos rojos ya tratados por enzimas proteolíticas.

Factor Rh

Los antígenos del sistema Rh son de naturaleza proteica. El antígeno D posee la mayor capacidad antigénica. Los genes responsables de este sistema se localizan en el cromosoma 1. Existen dos teorías sobre el control genético: Teoría de Fisher: Tres genes C, D, E (presentan antígeno D aquellas combinaciones que contengan el alelo D como por ejemplo cDe). Teoría de Wiener: En determinados casos se expresa un antígeno D débil Du (rh-) como consecuencia de: 1. La represión del gen D por un gen C en posición trans (cromosoma opuesto). 2. La existencia de un alelo Du. 3. La formación de un antígeno D incompleto.

Teoría de Tippet (1986): Tippet emite la teoría de la existencia de dos genes RHD y RHCD, que son secuenciados en 1990 por Colin y colaboradores. La enfermedad del Rh es provocada por una madre Rh- que concibe un hijo Rh+. Los anticuerpos de la sangre materna destruyen los Rh+ del bebé. Si la madre piensa tener un segundo hijo debe aplicarse una vacuna que elimina los anti-Rh, llamada la gammainmunoglobulina. Ésta debe ser aplicada dentro de las 72 horas después del primer parto, ya que si se tiene un segundo bebe con Rh+ la madre producirá anti-Rh en exceso que destruirá la sangre del hijo, produciendo una enfermedad llamada Eritroblastosis fetal (anemia severa), si es que el hijo nace, porque por la producción en exceso de los anti-Rh el hijo puede morir intrauterinamente. Los grupos sanguíneos Rh (descubierto por Landsteiner y Wiener en 1940) tiene un interés clínico similar a los grupos ABO dada su relación con la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) y su importancia en la transfusión.



MATERIAL

EQUIPO: Centrifuga Baño Maria

A) BIOLOGICO Muestra sanguínea obtenida con EDTA, eritrocitos conocidos de los grupos A, B , eritrocitos sensibilizados ( A, A1, B, O , RH )

B) DE LABORATORIO Gradillas, Placas de aglutinación, tubos de ensaye de 12 x 75, aplicadores de madera, Pipetas Pasteur.

C) REACTIVOS Sueros hemotificadores, albumina, suero de Coombs ( antiglobulina humana) , SSI.

METODOLOGIA En tubo (método directo) 1) Obtención de la muestra sanguínea. Separación del plasma y concentrado Eritrocitario, mediante centrifugación: 2500 rpm/5min.

2)

3) Preparar una solución al 1 % de eritrocitos con solución salina isotónica.

4) Colocar 7 tubos de ensaye y agregarle lo siguiente, primero se agregan los Acs (1 gota d c/reactivo). 1. - Anti-A 2. - Anti-A1 3. - Anti-B 1 2 3 4 5 6 4.-Anti-AB 7 8 1 5.- Anti-D 6.- Albúmina 7.- Coombs 8.- Suero del paciente (testigo).

Una vez separado el plasma, se realiza un lavado al concentrado eritrocitario. Se agrega solución salina y procedemos a centrifugar 5 min/2500 rpm. Repetir el procedimiento 3 veces.

0.1 ml de concentrado eritrocitario + 9.9 SSI. Homogenizar con cuidado

5) Agregar una gota de la solución de eritrocitos a cada uno de los tubos que contienen los reactivos.

6) Homogenizar y centrifugar 2500 rpm/1 min.

1 1

2 3

4 5 1

2 3

6 7 8

7) observar los tubos después de la centrifugación, observar la presencia de aglutinación moviendo los tubos con cuidado.

1

2 3

4 5 1

6 7 8

4 5 1

6 7 8

En tubo (método inverso)

1) Obtención de la muestra sanguínea. Separación del plasma y concentrado Eritrocitario, mediante centrifugación: 2500 rpm/5min. Separar el plasma.

6) Homogenizar y centrifugar 2500 rpm/1 min.

1

2 3

4

2) Colocar en tubos una gota del plasma (muestra problema) después los eritrocitos sensibilizados del grupo (1 gota de cada uno): 1.- A1 2.- A2 1 2 3 4 3.- B 4.- O 5.- O

7) observar los tubos después de la centrifugación, observar la presencia de aglutinación moviendo los tubos con cuidado.

1

2 3

4

Determinación de la variante D

1) Poner una gota de la suspensión de eritrocitos de la sangre de la muestra problema en un tubo de ensaye. Agregar una gota de suero anti-D

3) Los glóbulos rojos no deben estar aglutinados, puesto que indicaría que es positivo; y necesitamos que este negativo para continuar con la prueba.

5) Decantar el sobrenandante del último lavado. Agregar una gota del suero de Coombs, homogenizar. Centrifugar 2500 rpm/1min. Observar si hay o no aglutinación. Las Du positivas aglutinaran, si no aglutinan se informa como Rh negativo, Du negativo.

o

2) Incubar a 37 C durante 15 minutos. Después centrifugar 2500 rpm/1 min.

4) Después de cerciorarse que el resultado es negativo, se agrega SSI, centrifugamos. Este procedimiento se repite tres veces.

6) Para mayor confianza de la prueba, se realiza un “consumo de Coombs”, que consiste en agregar eritrocitos Rh positivos sensibilizados. Con lo cual debemos observar aglutinación, de lo contrario se realizara de nuevo la prueba.

Método en placa 1) En una placa de porcelana colocar una gota de los siguientes rx: 1. - Anti-A A A1 B AB Rh 2. - anti-A1 3. - anti-B 4. - anti-AB 5. - anti-D

1) A cada uno de los pocillos de la placa, agregar una gota de la suspensión de eritrocitos al 1%. Homogenizar con un palillo de madera (uno por cada pocillo); continuar agitando la placa por rotación durante dos minutos.

3) observar la placa, buscando aglutinación; cuya presencia significa un resultado positivo.

A A1 B AB

Rh



OBSERVACIONES



RESULTADOS



A) Método en placa

FOTO



B) Método en tubo



FOTO

Grupo: “A”

Grupo: “A”

Rh: Positivo (+)

Rh: Positivo (+)

Tubo control Negativo: Negativo Tubo de Coombs: Negativo Tubo testigo: Negativo



C) Prueba inversa

Tubo A1: Negativo 

Tubo A2: Negativo FOTO Tubo B: Positivo Tubo O: Negativo



D) Investigacion de la variante Du Tubo O: Negativo

Rh: Negativo “Du Negativo” 

FOTO



DISCUSIONES

La literatura menciona que los pacientes con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el plasma de su sangre y los pacientes con sangre del tipo B tiene la combinación contraria; glóbulos rojos con antígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el plasma. Mediante la realización de la práctica lo pudimos observar, a través de la aglutinación que no es más que la reacción de los antígenos presentes en membrana de los eritrocitos y los anticuerpos del plasma del paciente. También pudimos comprobar que los individuos con sangre del tipo O ó 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus glóbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos.



CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA



Sans J. et al. (2006). Hematología Clínica. Editorial Elvesier. 5ª edición. Pág. 809-811.



Miale J. (1985). Hematología: Medicina de laboratorio. Editorial Reverte. Pág. 536, 537.