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8/20/2019

Levaduras cerveceras y su manejo en fábrica Santiago de Chile, 16 agosto 2019 Diego Libkind ([email protected]) INFO CURSOS: [email protected] Pagina FB: https://www.facebook.com/JCYTCerveza/ www.ipatec.conicet.gob.ar Laboratorio de Microbiología Aplicada, Biotecnología y Bioinformática (MABBLev), Instituto Andino Patagónico de Tecnologías Biológicas y Geoambientales (IPATEC), CONICET-UNComahue, Bariloche, Argentina.

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CONICET

Clara Bruzone

Andrea Trochine

DOCTORANDOS

Martín Moliné

Proteomica, antioxidantes y Nicolas Bellora Levaduras oleaginosas Genómica, protectores solares bioinformática

FONCyT - CONICET

Equipo de trabajo del MABBlev

¿Quienes somos?

Paula Nizovoy Juan Eizaguirre Bioremediación y genómica

Lucia Pajarola

Diego Libkind Levaduras

Lucía Microbiología de Alimentos y Biotecnología

Levaduras cerveceras – Becaria POSDOC

Rubi Duo Saito Julieta Burini Mailén Latorre

Propagación Caracterización Protectores solares, Biodiversidad hongos en ambientes extremos, levaduras y eubayanus y aplicación metagenómica desarrollo cerveza mejoramiento cepas cerveceras

Contaminantes cerveceros

Luciana Cavallini Técnica Laboratorio

Personal de apoyo: Maria Fernanda Dominguez, Carlos Bertoli, Gertrudis de van Broock Tesinistas: Ariel Favier, Ignacio Breackman. Pasantes: Rodrigo Acosta

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Laboratorio de Microbiología Aplicada, Biotecnología y Bioinformática de Levaduras (MABBlev)

¿Qué hacemos?

1) Investigación, Desarrollo e Innovación (I+D+i) 2) Docencia universitaria y capacitaciones 3) Servicios Tecnológicos y Asesorías 4) Organización de eventos

¿Qué hacemos?

Biodiversidad

Investigación, Desarrollo e Innovación (I+D+i)

Nuevas Especies de levaduras

Genómica de levaduras UV

MIC

Protectores solares naturales

Desarrollo de levaduras nativas cerveceras

OTROS: - Producción de pigmentos - Biocombustibles - Enzimas anticongelantes

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DOCENCIA y CAPACITACIONES DOCENCIA UNIVERSITARIA Lic./ Prof. Ciencias Biológicas (UNComahue) - Evolución / Biología Celular y Molecular / Microbiología Doctorado en Ciencias Biológicas (UNComahue) - Biodiversidad y Biotecnología de Levaduras CAPACITACIONES - Manejo de Levaduras Cerveceras - Microscopía Cervecera - Curso de re-utilización de levaduras - Control de contaminantes cerveceros - Curso de Perfeccionamiento en elaboración - Análisis Sensorial de cerveza - Introducción a los estilos y apreciación de la cerveza - Curso de conservación y propagación de levaduras - Curso de laboratorio cervecero - Levaduras 2.0

SERVICIOS y ASESORIAS

Servicios analíticos y tecnológicos - Análisis Físico-químico, microbiológico y sensorial de Cervezas. - Análisis calidad del Lúpulo (alfa, beta, HSI, aceites, etc.). - Banco de levaduras y bacterias de cerveza. - Propagación de levaduras cerveceras (inóculo líquido). - Medición oxigeno disuelto en fábrica. - Test de múltiples cepas cerveceras a micro-escala. - Búsqueda y domesticación de levaduras para el agregado de valor Asesorías - Manejo de Levaduras Cerveceras - Armado de laboratorio cervecero - Re-utilización de levaduras - Selección de cepas - Proceso fermentativo

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Centro de Referencia en Levaduras y Tecnología Cervecera Ampliar Capacidades en: -

Investigación y desarrollo Provisión de servicios Capacitación teórica y práctica Producción de levaduras Producción experimental de cerveza Interacción con la sociedad Vinculación tecnológica

Edificio Modelo: - Arquitectura sustentable - Energías renovables - Eficiencia energética y térmica - Aprovechamiento y tratamiento de efluentes - Implementación de tecnologías innovadoras

¿De donde surge nuestra información? Múltiples asesorías y análisis a productores cerveceros y prov. Proyectos PROCAL / PAC con Cervecerías Proyectos de I+D: MINCyT /Min. Educación / Min. Producción Trabajos de investigación en laboratorio y fábrica: Doctorales y posdoctorales (becas CONICET) Mayor relevaminto de capacidades cerveceras en Argentina Fuerte Interacción con American Society of Brewing Chemists

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¿Qué vamos a ver hoy? - Repaso de cuestiones básicas de levaduras (nivelación). - Levaduras domesticadas vs salvajes. Levadura cervecera: ¿una levadura más?. - Características de los distintos formatos de levaduras cerveceras. - Compuestos de sabor y aroma de la levadura: ¿Por qué hacen lo que hacen?. - Control y optimización del proceso fermentativo: una deuda pendiente

- Eligiendo mi levadura: haciendo la diferencia. - Interacción de la levadura y otros ingredientes. - Lo que se viene: Levaduras no convencionales = cervezas no convencionales - En busca de la mejor cerveza, ¿y si bajamos el estrés?

¿Qué NO voy a hacer hoy? - No voy a decirles paso a paso como tratar cada problema de fermentación ni de levaduras (no se puede!) - No voy a decir “esta es la única manera de hacer…” - No voy a parar de decirles depende - No voy a tomarles un examen

No veremos reutilización/propagación Paciencia con las preguntas / slides

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¿Qué es lo más importante en la elaboración de CERVEZA? 1°

EL CERVECERO/A

2°

LIMPIEZA y SANITIZACIÓN – (Diseño de equipo)

3°

UNA BUENA FERMENTACION

Cerveza de calidad

Fermentación LIMPIA

Ausencia de otros Microorganismos (Monocultivo)

Adecuada Limpieza y Sanitización Equipo sanitario

Aporte adecuado de la levadura al flavor

Manejo correcto de la levadura

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¿Qué significa ser UNICELULAR? ¿Sencillo?

pH

Esquema de la estructura interna de una célula de levadura

T° Membrana

NO difiere mucho de una célula humana

Muy susceptibles a cambios del ambiente… físico y químico

¿Qué significa ser UNICELULAR? - Crecimiento rápido (cuando están dadas las condiciones)

Pero no tan rápido como las bacterias

Célula hija = clon

0min

25min

90min

- Reproducción sexual – ascosporas en tétradas

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¿ Qué es la fermentación alcohólica ? Etanol (alcohol) CO2 (gas)

Glucosa Maltosa Maltotriosa

Calor >500 compuestos que aportan al sabor y aroma (buenos y malos):

Compuesto Acetaldehido Alcoholes superiores Ésteres Precursores diacetilo Compuestos sulfurosos

Descriptor

¿Por qué?

Manzana verde

Obtención de energía (ATP)

Solvente

Síntesis de aminoácidos

Fruta, solvente

Síntesis de ácidos grasos

Manteca

Síntesis de aminoácidos

Goma y fosforo quemado

Síntesis de aminoácidos

Compuestos fenólicos

Clavo de olor, especiado

Genes POF – levadura fenólicas

¿Qué aporta cada ingrediente?

Agua Malta Lúpulo Levadura

Rueda de aromas y sabores

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Aromas y sabores son el resultado del metabolismo de la levadura, en particular durante su crecimiento La duración del periodo de crecimiento celular y su intensidad van a definir el perfil de flavor generado El crecimiento celular depende de: - Disponibilidad nutrientes (densidad, O2, Zn, Ca, Mg..). - Temperatura, presión, pH - Inóculo inicial Compuestos de sabor

En fermentaciones ALE eficientes este periodo representa las primeras 24-36 hs

Compuestos de aroma

Levaduras (hongos unicelulares)

> 1800 especies conocidas

Saccharomyces

(hongo del azúcar)

?

(levaduras DOMESTICADAS

Saccharomyces cerevisiaepara (ALES, vino) hacerpan, cerveza) Saccharomyces pastorianus (LAGERS) Híbrido (Ale + S. eubayanus)

Levaduras domesticadas = Adaptadas a las condiciones de fermentación a través de la constante re-utilización y selección por los maestros cerveceros

Levaduras cerveceras

Ale

Lager

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Lobo ancestral

Razas europeas

Lobo actual Pastores

Caza

Deportivo

Trabajo

Asiático

DOMESTICACION

Levadura ancestral

Levaduras domesticada

Salvaje actual Pan

Cerveza

Vino

Destilados

Bioetanol

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Levaduras Cerveceras = Levaduras Domesticadas MALX AGT1

ATENUACION Mosto Cervecero Glucosa (5-10%) Maltosa (60-70%)

Membrana celular

Maltotriosa (15-20%)

Baja atenuación (Windsor /EUBY)

Alta Atenuación: US-5, nothingham Capacidad atenuación determinada genéticamente

Principales levaduras de Cervecería Levaduras Ale

Levaduras Lager

S. cerevisiae

S. pastorianus (S. carlbergensis, S. uvarum, S. bayanus……) ?????

Agente fermentación originario (6000 A.C) Gran número de cepas y variabilidad

Aparición más reciente (cientos de años) en relación a la práctica de fermentación a menores temperaturas (Baviera). Híbrido entre una levadura ALE y una levadura adaptada al frio: S. eubayanus

Posee ventajas selectivas a bajas temperaturas. Dos variantes principales (Saaz y Frohberg) Bajo número de cepas y variabilidad

Levadura más estudiada

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Mapa genómico de levaduras cerveceras y especies relacionadas (Dunn & Sherlock, 2008)

ALE y vinos Algunas levas belgas?

Grupo 1 (Saaz)

Grupo 2 (Frohberg)

S. kudriavzevii

Belgian

(Gonzalez et al., 2008; unpublished)

S. cerevisiae S. pastorianus?

S. uvarum

S. eubayanus S. bayanus

CBS 380T NBRC 1948

Británicas Alemanas (Alt-Kolsch)

(Libkind et al., 2011)

Diversidad genómica de levaduras ALE Trigo / belgas Domesticación de levaduras industriales

PAN

Domesticación fuerte < Off-flavors > Uso de maltotriosa < reproducción sexual < sobrevivencia en naturaleza

Sampaio, J.P.; Libkind, D. and Huztler, M. 2017 Gallone et al., 2016

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Ancestro Ale de las levaduras LAGER

Current Biology 2016

Levaduras (hongos unicelulares)

> 2000 especies conocidas

Saccharomyces

(hongo del azúcar) (levaduras DOMESTICADAS

Saccharomyces cerevisiaepara (ALES, vino) hacerpan, cerveza) Saccharomyces pastorianus (LAGERS) Híbrido (Ale + S. eubayanus)

- Nuevos híbridos seleccionando parentales - Uso de cepa de S. eubayanus (H41 - ACAB) - Levadura Saccharomyces de otras industrias de fermentaciones (GRIMOR) - Otras levaduras Sacaromiceticas salvajes - Farmhouse yeasts

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Levaduras

> 2000 especies conocidas

Levaduras no convencionales para la producción de cerveza Cervezas belgas, lambicas, geuze, Sour beer

Brettanomyces anomalus Brettanomyces bruxellensis Candida tropicalis

Mayor producción esteres (frutado) y/o fenoles

Candida shehatae Torulaspora delbrueckii

Modificación aroma lúpulo

Saccharomycodes ludwigii Zygosaccharomyces rouxii

Bajo contenido alcohol Bio-flavoring

Levadura

Fermentaciones África

Pichia / Hanseniaspora Williopsis saturnus

Características

Temp. fermentación: 20-22°C. Duración 30 días. Produce bajos niveles de ésteres: etil acetato, entre 1,26 y 3,86 mg/l; etil hexanoato, entre 0,03 y 0,05 mg/l ; etil

Brettanomyces anomalus octanoato, entre 0,19 y 0,72 mg/l. Genera un flavor complejo, frutado y característico por la presencia de fenoles. Puede modificar monoterpenos del lúpulo.

Fermentación lenta (entre 12 y 27°C). Cervezas con buen flavor. Generan compuestos responsables del Brett-flavor, como 4-vinilguaiacol, 4-etilguaiacol, 4-etilfenol,

Brettanomyces bruxellensis hexanoato y etil octanoato. Produce poco isoamilacetato. Con potencial para crear nuevos estilos de cerveza.

Torulaspora delbruekii

Temp. Ferm.: 20-28°C. Alcohol: 0,8 a 4% (v/v). Flavour con agradables notas frutadas (etil acetato, isoamilacetato). Pueden generar altas concentraciones de alcoholes superiores y acetaldehído. Glicosidasas (aroma lúpulo). Con potencial para su uso en cerveza. Uso en vino.

Candida shehatae

Mosto de 9° P fermentado a 14°C genera cervezas de bajo contenido alcohólico (0,3% v/v aprox) y flavour similar a cervezas sin alcohol. Los niveles de diacetilo bajos. Se necesitan más estudios para evaluar su uso en cerveza

Candida tropicalis

Fermenta glucosa, sacarosa y maltosa. La fermentación a 30°C de extracto de malta con esta levadura produce cervezas con aprox. 1,5% de alcohol. Genera pocos compuestos aromáticos. Antes de ser utilizada en la elaboración de cerveza se debe investigar la patogenicidad de la cepa empleada.

Levadura utilizada comúnmente en Alemania e Italia para la producción de cervezas con bajo contenido de alcohol. No fermenta maltosa ni maltotriosa en mosto

Saccharomycodes ludwigii cervecero. En general desarrolla un flavor agradable en fermentaciones a 20°C con densidades de aprox. 7°P. Dependiendo de la cepa, el contenido total de alcoholes varía entre 43 y 76 mg/l , y el de ésteres entre 1,2-15 mg/l. Puede generar off-flavors por debajo del límite de detección.

Posee alta tolerancia osmótica. Las concentraciones de etanol y compuestos del flavour durante la fermentación depende de la cepa utilizada, aunque todas ellas

Zygosaccharomyces rouxii producen bajos niveles de isoamilacetato. En mostos con alto contenido de dextrinas (12°P) fermentados a 20°C pueden producir altas concentraciones de alcoholes superiores (92-196 mg/l) y esteres totales entre 4,42 y 71,15 mg/l. Tiene potencial para producir cervezas aceptables.

Pichia kluyveri

Limitada capacidad para fermentar glucosa. Con potencial para la producción de cervezas con bajo contenido alcohólico. Temp. de fermentación: 20-22°C. Puede generar isoamilacetato (1,96-4,94 mg/l), etil hexanoato (0,02-0,07 mg/l), etil octanoato (0,12-0,13 mg/l) e isoamilalcohol (1,8-2 mg/l). El co-cultivo con S. cerevisiae aumenta la concentración de isoamil e isobutil acetato. Su aplicación comercial aún no ha sido implementada.

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LEVADURAS CERVECERAS ¿de dónde las obtengo?

Fuentes de levadura:

Levadura re-utilizada

Laboratorio especializado

-Propia -Otra cervecería

Levadura seca

Levadura liquida

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Características de los dos formatos Levadura seca

Categorías

Secas

Líquidas

Pureza

Media - Alta

Alta

Levadura líquida

(contaminantes)

100% importadas Disponibilidad limitada y variable

Re-utilización

Limitada

ok

Precio

Bajo (10v menos)

Alto? *(reutilizo?)

Propagación

No recomendable

Posible

Comportamiento

Menor floculación y esteres

Ok

Variedades

Limitada (10%)

Ilimitada >100

Almacenamiento

Prolongado (años)

Reducido (sem./meses)

Uso

Principiantes

Avanzados que tienen buen manejo y reutilizan

Surgiendo Laboratorios en Argentina

¿Qué formato de levadura se utiliza en Argentina? Respuestas: 384

92%

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Participantes Ciencia y Cerveza Santiago de Chile

¿Qué levadura utilizan mayormente? Respuestas: 383

¿Diferenciación productiva?

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LEVADURAS CERVECERAS Consejos de hidratación https://ipatec.conicet.gov.ar/presentaciones/

Pasos de rehidratación (1) (Levadura Ale) Membrana

• Esparcir la levadura en la superficie de agua potable (10 veces la cantidad de levadura) de la canilla limpia y sanitizada* a aproximadamente 25°C (Ale y Lager) • No mezclar !!! • Dejar reposar 15 Min. sin mover a 30 – 35 C (tapado) • La presencia/ausencia de espuma no es indicador de vitalidad • Sanitizar todos los elementos que entren en contacto con el agua o la levadura con alcohol 70% y exponer lo menos posible al aire (se contamina).

*En caso de tratarse de agua de montaña o deshielo con pocas sales, se recomienda agregar solo un poco de mosto. Sanitizar agua: hervir por lo menos 15 min y luego enfriar a baño maría (primeros minutos de hervido dejar abierto para eliminar cloro luego dejar siempre tapado). Esterilizar agua: Usando olla a presión ~ 25 min.

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Pasos de rehidratación (2) Membrana

(Levadura Ale) • Después de 15 Min. mezclar gentilmente hasta que la levadura esté en suspension. • Dejar reposar 5 min. • Atemperar gradualmente, cada 5 min agregando alicuotas del mosto enfriado. Evitar que la levadura sufra cambios de temperatura mayores a 5-7°C. • Sanitizar todos los elementos que entren en contacto con el agua o la levadura con alcohol 70% y exponer lo menos posible al aire.

Pasos de rehidratación (3) (Levadura Ale) Membrana

• •

•

Una vez alcanzada la temp de fermentacion ± 5°C inocular inmediatamente en fermentador sanitizado recientemente (ej. con peracético no mas de 5 hs antes).

•

Tiempo total proceso hidratación: nunca menos de 30 min y no más de 60 min.

•

Aireación del mosto aparentemente innecesaria pero recomendable, en particular si no se respeten las cantidades de levaduras adecuadas (ver abajo) o se desea re-utilizar:

Si la temperatura de fermentation es mayor entonces se debe poner menos cantidad.

Tasa de inoculación para temperatura de fermentación: 19°C:

Si es una cerveza de mayor Densidad inicial poner mas levadura

ALE: 0,8 (Fermentis) - 1 g/L (Lallemand) LAGERS: el doble

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Levaduras secas, recuperación luego de la re-hidratación

Dudas frecuentes en uso de levaduras secas

- ¿Por qué debo usar mas de 0,5 gr/L si el sobre de 11gr me dice que sirve para 20 lts?

- ¿Inoculación directo al mosto o hidrato primero?

- ¿Cuánto uso si hago múltiples lotes/batch para un fermentador?

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Inoculación para batch multiples (multifilling) Dilución baja D: 1.050

1048

1049 3

1)

02

2 1

Se comporta y se inocula como un single batch (Batch simple)

2 1

1 4 hs

4 hs Dilución alta D: 1.025

D: 1.038

D: 1.050

3 2) 1

24 hs

2

Reproducción celular alta

1

24 hs

2

Reproducción celular baja

Se inocula sólo el 1er batch (1/3 de levadura)

Fuentes de levadura:

1

Homogenización!!

Levadura re-utilizada

Laboratorio especializado

-Propia -Otra cervecería

Omega Yeast Imperial Yeast

Levadura seca

Levadura liquida

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LEVADURAS CERVECERAS ¿Cómo las elijo?

Parámetros de selección de levaduras cerveceras Atenuación

Tolerancia alcohol

Floculación Sedimentación

Especiado (fenoles)

Frutado (esteres)

ALTO

MEDIO

Nothingam?

BAJO

Windsor?

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Diversidad de levaduras líquidas a disposición

Diversidad de levaduras líquidas a disposición

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BANCO DE LEVADURAS DEL MABB 170 levaduras cerveceras (cepas) Otras 12 %

y… Bacterias / Brett / otros

LAGER 27 %

LEVADURAS ESPECIALES (38 cepas) Especiales 27 % Belgas N° cepas

Trigo

Kölsch/Alt

15

13

10

20-26

18-23

16-21

Atenuación

75-85

70-78

72-80

Floculación

Baja/Media

Baja

Media

Tolerancia Etanol

Media/Alta

Media

Media

T. Ferm. (ºC)

Flavor

Fenoles, ésteres frutados

Clavo de olor (fenol), banana, sulfuros

ALE 34 %

Limpias, ésteres, algo sulfurosas, realzan lúpulo.

BANCO DE LEVADURAS DEL MABB Otras 12 %

159 levaduras (cepas)

LAGER 27 %

LEVADURAS ALE ( 47 cepas)

Especiales 27 %

Americanas

ALE 34 %

Inglesas

Irlandesas /Escocesas

Otras

N° cepas

12

19

7

11

T. Ferm. (ºC)

18-23

18-21

18-21

18-22

Atenuación (%)

65-80

63-80

69-75

65-85

Floculación

Media/Alta

Alta/Muy Alta

Media/Alta

Baja/Media

Tolerancia Etanol

Media/Alta

Media

Media/Alta

Media/Alta

Flavor

Cervezas limpias, realzan lúpulo. Versátiles

Cervezas claras, maltosidad, azucares residuales, esteres

Maltosidad, ésteres frutados, algo de diacetilo.

Predomina maltosidad, ésteres variados.

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FLOCULACION - Nutrientes y factores de crecimiento Inducida por la falta de nutrientes y por condiciones de estrés. Falta de Oxígeno en inicio de Fermentación (No actúa directamente: Ácidos grasos insaturados y esteroles)

- Edad y tamaño de las levaduras Células viejas (mas cicatrices y arrugadas) floculan más e intensamente Más arrugadas, más grandes*, más floculinas

*Incrementa sedimentación

Floculinas

Residuos Manosa pared celular

Etanol

Temperatura Temperatura FACTORES QUE AFECTAN LA FLOCULACION

Nutrición

Mecanismo sensorial

FACTORES QUE AFECTAN LA INTERACCIÓN CELULA-CELULA Agitación

Fuerza iónica

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FLOCULACION FLOCULACION Otros: pH, manejo de levaduras: (Lav. ácido, T° conservación, forma de cosecha), Presencia de Calcio en mosto frio (ALE: 100-200ppm, Lager: 40-60 ppm)!! Carácter variable: Número de re-utilizaciones!

Fenoles

POF+

Brettanomyces y otras levas salvajes

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Belgas, trigo, EUBY

Fenoles

POF+

Brettanomyces y otras levas salvajes

Levaduras Ale domesticadas para cerveza (Británicas, americanas, alemanas, etc.)

Británicas Alemanas (Alt-Kolsch)

Diversidad genómica de levaduras ALE Trigo / belgas Domesticación de levaduras industriales

PAN

Domesticación fuerte < Off-flavors > Uso de maltotriosa < reproducción sexual < sobrevivencia en naturaleza

Sampaio, J.P.; Libkind, D. and Huztler, M. 2017 Gallone et al., 2016

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Las levaduras afectan los aportes de aroma y sabor del lúpulo

Biotransformaciones que realiza la levadura

    

Precursores de aroma glicosilados son liberados Alcoholes monoterpenos son isomerizados Acidos se convierten en (ethyl) esteres Los esteres son trans-esterificados o hidrolizados Compuestos carbonilos, epoxides, y eteres son reducidos a alcoholes/ dioles

Acción de las GLICOSIDASAS

pH optimo de la enzima b-glucosidasa

3

4

5

Otros terpenoides que pueden estar glicosilados:

6

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Las levaduras se defienden… ataque enzimático a componentes del lúpulo

Biotransformaciones que realiza la levadura (pH)

Precursores de aroma glicosilados son liberados Isomerización de alcoholes monoterpenos Acidos se convierten en (ethyl) esteres Los esters son trans-esterificados o hidrolizados Compuestos carbonilos, epoxides, y eteres son reducidos a alcoholes/ dioles

Isomerización de terpenoides durante la fermentación

Concentracion Concentración

    

Acción enzimática

Mirceno Mirceno

Tiempo (días) Tiempo (días)

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IBUs: Medido / Predicho

Influencia cepas sobre IBU Ratio La mayoría tiende a reducir IBUs

INGLESA

INGLESA

AMERICANA

INGLESA AMERICANA

IRISH

INGLESA

INGLESA

INGLESA

BELGA

HEFE

KOLSCH

WHITELABS

Cepas Levaduras de trigo (¿dónde esta mi lup …)

Levaduras amargas

Para que me sirve saber todo esto? - El uso de diferentes levaduras impacta significativamente en la percepción del flavor derivado del lúpulo.

- Timing para dryhopping más efectivo - Uso de levaduras muy productoras de enzimas gliosidasas puede modular y potenciar el flavor del lúpulo. - Importancia de las levaduras no convencionales para agregar al proceso por su capacidad de bio-saborizante (bioflavoring): Torulaspora, Kluyveromyces, Hanseniaspora, Pichia, etc.

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¿PREGUNTAS?

LEVADURAS CERVECERAS ¿Y si tomamos el control? Ale

Lager

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¿Qué puedo controlar y cómo? En búsqueda de optimizar y estandarizar el desempeño fermentativo se requiere controlar variables

Cepa de levadura

Características organolépticas deseadas Análisis Sensorial

-Cantidad y calidad de levadura a inocular -Temperatura fermentación -Nutrientes mosto + -Micronutrientes (Zn…) -Oxígeno Desempeño

- Ca: 60-100 ppm -Hidratación (seca) -Sanitización -pH (5.2)

Herramienta de comunicación

- Contacto levadura/mosto

-

Off-flavors estrés (sulfuro, vegetales). Fermentación lenta o frenada

Fermentación lenta o frenada Bajos esteres (frutado)

No se alcanza densidad final deseada Off-flavors estrés (sulfuro, vegetales) No se alcanza densidad final deseada Acetaldehido

CANTIDAD LEVADURA

TEMPERATURA FERMENTACION OXIGENO ZN

Factor

+

Fermentación muy rápida (explosiva) Fase LAG muy corta Off-flavor autolisis: goma quemada Mas alcoholes superiores, esteres, fenoles* Mas alcoholes superiores, diacetilo, esteres. Fermentación lenta o frenada

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8/20/2019

Calidad de levadura:

¿Mortalidad /Viabilidad? Viabilidad vs. Vitalidad % Levaduras vivas

Condición fisiológica de las Levaduras vivas

ó

Cultivo en placa (UFC) !No existe método estándar!

Tinción vital

Test poder de acidificación

Próximos cursos!!!

LEVADURAS CERVECERAS ¿Cuánto uso?

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Tasa de inoculación ¿Por qué la cantidad de levadura es importante? Sub-inoculación

Exceso crecimiento levadura para alcanzar densidad crítica Mayor estrés osmótico levadura

INICIO Retraso inicio fermentación (Lag: 24-48 hs)

Contaminación!!

Freno en fermentación

Menor atenuación (azúcares residuales)

Contaminación!!

Alcoholes superiores, esteres, diacetilo, comp. azufrados

FINAL

Baja calidad de levadura para re-utilización (Células estresadas!)

Tasa de inoculación

Células nuevas Células viejas

¿Por qué la cantidad de levadura es importante? Sobre-inoculación Fermentaciones muy rápidas y violentas INICIO

Autolisis por muerte de levaduras

Bajos esteres FINAL

Falta de cuerpo, baja retención espuma Aromas y sabores por autolisis levadura (goma, sulfuro) Baja calidad de levadura para re-utilización (Células Viejas!)

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Tasa de inoculación

Células nuevas Células viejas

¿Por qué la cantidad de levadura es importante? Inoculación apropiada Fermentaciones eficientes y rápidas (Lag 1072 100% extra

15-19°C Aumento 50% inoculo

20 ppm

Método aireación O2 ppm Agitación, 5 min.

2,71

O2 Puro, 30 seg.

5,12

O2 Puro, 60 seg.

9,20

O2 Puro, 120 seg.

14,08

Datos locales para 500 lts 15 min, piedra 0,5 micrones, caudal: 1 Lt/min

20 Lts mosto, 1.077 a 24°C. (1Lt/min con piedra aireadora de 0,5 micrones)

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Nutrientes del mosto Un mosto «pura malta» debería proveer todos los nutrientes necesarios para la fermentación excepto: 1) ZINC División celular Co-factor enzimas responsables producción alcohol

Aditivos nutricionales para levaduras:

Fuente balanceada de nitrógeno, minerales (Zn) y vitaminas. X 500 Grs =???$ 1 gr (? $) para 100lts

Últimos minutos hervor, Whirpool

Alternativa: -Agregado de 0,2-0,3 ppm zinc (ZnCl2 o ZnSO4) (en fermentador).

Densidad

Influencia de la concentración de Zinc en la fermentación

Zn

Fermentación mas lenta, atenuación reducida

+

Tiempo (hs) J. Am. Soc. Brew. Chem. 69(4):214-219, 2011

Levadura Lager

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LEVADURAS CERVECERAS nutrición y subproductos

Compuesto de sabor

Subproducto de:

¿Por qué se produce?

Puntos críticos de control en proceso y nutrición

Diacetilo (VDK)

Síntesis de aminoácidos valina y leucina

Las proteínas celulares (estructurales, transporte, enzimas)

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Pediococcus y Lactobacillus

Cepa de levadura Cosecha prematura Oxígeno insuficiente [Zinc] insuficiente Tasa de inoculación baja Temperatura* > FAN

Ésteres (ej. La síntesis de acetato de etilo, ácidos grasos y acetato isoamílico, esteroles caproato de etilo, caprilato de etilo)

Bloques de construcción de membrana

1. Cepa de levadura (estrés) 2. Presión hidrostática* 3. Factores que aumenten crecimiento levadura 4. Mayor relación C/N 5. Temperatura 6. Tiempo 7. Densidad inicial 8. > claridad del mosto

Acetaldehído

Energía (ATP)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Glucólisis

Zymomonas

Cepa de levadura Mayor claridad mosto* FAN de malta Exceso Oxígeno disuelto Presión gas Separación prematura leva

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Compuesto de sabor

Subproducto de:

¿Por qué se produce?

Puntos críticos de control en proceso y nutrición

Síntesis de aminoácidos alcohol isoamílico, (las vías alcohol amílico anabólicas y activo, alcohol de catabólicas)

Las proteínas celulares (estructurales, transporte, enzimas)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Sulfídicos y Sulfurosos

Las proteínas celulares (estructurales, transporte, enzimas)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Alcoholes superiores (Ej.

isobutilo y N-propil alcohol)

Síntesis de los aminoácidos metionina y cisteína

Cepa de levadura (Ale) Sobre-oxigenación > Temperatura Ferm. > Presión hidrostática > FAN Vitalidad y viabilidad de levadura 7. Mala nutrición

Cepa de levadura Bajo vigor leva Deficiencia vitam./zinc Contacto de cobre* Mosto con trub Cosecha tardía de levadura

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Esteres

Esteres más relevantes en el flavor de la cerveza sintetizados por las levaduras Compuesto

Valores umbrales (mg/l)

Descripción aromática

Etil acetato

30

Solvente, frutado

Isoamil acetato

1,2

Banana

Cervezas de trigo

Ester acetato Isobutil acetato

0,5

Frutado

Feniletil acetato

0,3

Rosas, miel

Etil hexanoato

0,21

Manzana, anisado

Etil octanoato

0,9

Manzana, pera, banana,

Ester Etilo

ananá, floral, frutado

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Tipos de ésteres y factores que afectan su síntesis Regulación de las enzimas alcohol acetil transferasas (ATF) y producción de ésteres de acetato frente al incremento de diferentes parámetros de fermentación

Loviso & Libkind, 2018 Rev. Arg. de Microbiología

LEVADURAS CERVECERAS ¿A que las sometemos? La fermentación

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¿A qué se enfrenta la levadura? Shock frio

Anaerobiosis Estrés Oxidativo y Osmótico, Iso-α

Estrés nutricional y por etanol

X4-5 (Ale)

Cantidad

Glucosa y fructosa

Densidad levaduras

Densidad mosto

Muerte (autolisis)

Maltosa Maltotriosa

Temperatura Etanol Tiempo Densidad levaduras

Oxigeno

Densidad mosto

Temperatura

Etanol Membrana Membrana

Etapas de la fermentación Shock frio

Anaerobiosis Estrés Oxidativo y Osmótico

LAG

Estrés nutricional, por etanol, pH

EXPONENCIAL ESTACIONARIA

( esteres (Temp +) - Modificación flavor del lúpulo.

Temp. Temp. Inoculación fermentación

CONSIDERACIONES - Vitalidad Leva - Contacto con leva/líquido - Temperatura/Tiempo

Maduración Enfriado

-1 o 4°C

Temp. maduración (1-2°C)

Tiempo

Metabolismo y detección del diacetilo

Mejorar estabilidad física

Test forzado de diacetilo: Materiales: 2 vasos, Aluminio, Baño caliente, Baño de hielo, Termómetro

Tomar 2 muestras de cerveza verde. a) Poner en baño a 60-70°C b) Temperatura ambiente Luego de 20 minutos enfirar “a” hasta llegar a temp. Ambiente Detectar olfativamente en ambas.

www.ipatec.conicet.gob.ar

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Cinética de los precursores del diacetilo en función de la temp. fermentación

Precursores diacetilo (ppm)

Maduración en caliente En pocas horas se pueden remover los precursores de diacetilo

Tiempo (hs)

Acondicionamiento y Maduración en frío FACTORES: Tiempo y Temperatura

Tiempo < Temperatura

En algunos casos con un solo día alcanza pero depende de la temperatura!!)

-0°CNinguna cerveza debería congelarse a -1°C (0,42°C – cada 1% alcohol)

- Sedimentación de levadura (se lleva polifenoles, ej. taninos) - Precipitación de polifenoles y proteínas del Chill haze

> Genera sabores suaves e integrados, mejora estabilidad física del producto y reduce chill haze

CLARIFICACION

-3 días-

Ca

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Tipos de Carbonatación Carbonatación según Estilos

Carbonatación natural: • Generada por la levadura gracias al agregado de azúcares simples, re-fermentación. • Sacarosa, glucosa, miel, extracto de malta, melazas, etc.

Estilo

En Botella

Carbonatación artificial (forzada): • Manipulando la temperatura y/o la presión. • En línea (para cervecerías) o directo en el tanque.

Límite Límite inferior superior

Ales británicas

1,5

2,0

Porter, stout

1,7

2,4

Ales belgas

1,9

2,4

Lager europeas

2,2

2,7

Ales y lagers americanas

2,2

2,7

Lambicas

2,4

2,8

Lambicas frutadas

3,0

4,5

Alemana de trigo

3,3

4,5

En Cornelius / Kegg / Barril

Cálculo de azúcar para re-fermentación • Suponemos una Porter fermentada a 20 °C y madurada a 4 °C. • Volumen de CO2 disuelto es de 0,9 (OJO!!). • Según el Estilo debería carbonatar 2,4 volúmenes de CO2. • Entonces debo agregar 1,5 volúmenes de CO2. Utilizando glucosa (azucar maiz) para re-fermentar, sabiendo que 4 gr equivalen a 1 volumen de CO2 en 1 litro. • Por lo tanto debería agregar, 4 * 1,5 = 6 gr/lt de glucosa. • Mantener a temperatura de fermentación por al menos una semana. • Luego madurar en frío.

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Autolisis en re-fermentación en Botella y sus potenciales ventajas organolépticas El exceso de levadura en re-fermentación en botella conduce a aromas no deseados, producto de autólisis no controlada

Autolisis: pH, Temp., Alcohol, presión hidrostática

Pared celular

Cuando se re-fermenta con levaduras “frescas” y a baja concentración, se pueden obtener efectos positivos de la autolisis.

Extracto de levadura

Redondez Sensación en boca

Fases de la etapa fría de la elaboración y puntos de control

Activación Inicio crecimiento celular Consumo O2 Aclimatación/lag

ACONDICIONAMIENTO

MADURACION

FERMENTACION Fermentación secuencial azucares Crecimiento celular Compuestos flavor Atenuativa

Remoción acetaldehído/pre. diacetilo Modificaciones enzimáticas Caliente

Clarificación

Carbonatación

Armonización flavor

Embotellado/ embarrilado

Reducción chill haze

Servicio Frío

Parámetro de final/inicio:

Herramienta:

Vista/oido

Densímetro

Test forzado/análisis sensorial

Vista/análisis sensorial

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Fases de la etapa fría de la elaboración y puntos de control ACONDICIONAMIENTO

MADURACION

FERMENTACION

8 – 12 hs

36/48 - … hs

24 - … hs

Aclimatación/lag

Atenuativa

Caliente

24 – …. hs

Frío

Mínima: 12+36+24+24 = 96 hs = 4 días Máxima: ???

Camino critico hacia la calidad y sustentabilidad cervecera Librarse de contaminantes (monocultivo)

Fermentación un poco más limpia, mayor estabilidad producto, descarte de lotes nulo.

Manejo correcto de la levadura (reducción estrés) Fermentación limpia, mayor productividad y levadura apta para re-utilizar

Re-utilización

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Cervecero, Levaduras y Estrés Las levaduras cerveceras por su naturaleza unicelular y por las condiciones de fermentación sufren múltiples tipos de estrés que generan la síntesis de productos secundarios indeseables. La reducción del estrés de las levaduras a través de una correcta manipulación y control del proceso es fundamental para lograr cervezas de calidad... entre muchas otras cosas!. Estrés LEVADURA

ESTRES

Felicidad CONSUMIDOR

Felicidad CERVECERO

FELICIDAD

Aplicable a todo ser vivo…. también a las LEVADURAS.

¿PREGUNTAS?

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Cocimiento Número 1 2 3 4 5 6 7 8 9

TCC 1 - 2 Cocimientos % levad. Airear 100 Si Si

TCC 3 Cocimientos % levad. Airear 100 Si Si Si

TCC 4 - 5 Cocimientos % levad. Airear 20 Si 80 Si Si Si

TCC 6 - 9 Cocimientos % levad. Airear 20 Si 80 Si Si Si Si Si no no 15´ con co2

Este esquema de dosificación de levaduras y aireación queda sujeto al cumplimiento de los estándares de diacetilo, nivel de ésteres en producto terminado y al cumplimiento de los tiempos de fermentación. Esquemas alternativos deberán validarse con la Dirección de Brewing and Quality. - El “% levadura” indica el porcentaje a adicionar al cocimiento respectivo en relación al total necesario para el TCC. - Si el tiempo de llenado es mayor a 15 horas, los cocimientos que entren luego de la 15° hora no serán aireados y será necesario realizar una inyección final de 15´ de aire o CO2 para homogeneizar el tanque.

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