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Facultad de Ciencias Programa de Educación Continua

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

Educación Continua y Consultorías

PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA

Profesor: Julián Esteban Contreras Patiño

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La Cromatografía Líquida de Alta eficiencia, high performance liquid chromatography (HPLC) representa hoy por hoy el mayor mercado en el mundo del instrumental analítico, la popularidad de esta metodología se debe a su gran versatilidad (cubre un amplio espectro de aplicaciones), excelente capacidad para el análisis de trazas (ppm o ppb), rapidez y adaptabilidad al análisis cuantitativo. La HPLC se utiliza en casi todos los laboratorios industriales, organismos oficiales de control, universidades y en todos los laboratorios donde se realicen investigaciones farmacéuticas, medicas, de síntesis orgánica, bioquímicos, biológicos, de control del medio ambiente y alimentarios.

Una de las mayores limitaciones de HPLC es la falta de operadores experimentados. El entrenamiento en técnicas modernas de HPLC en las universidades es escaso, casi nulo.

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Objetivo Por medio de este curso se busca establecer los conceptos básicos de esta metodología químico analítica, basados en los fundamentos teóricos y prácticos, proporcionando ejemplos que faciliten su comprensión.

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Historia de la Cromatografía Friedrich Ferdinand Runge 1750-1867 químico, descubrió la Cafeína, productos del alquitrán, el tinte azul anilina, cromatografía en papel

Mijaíl Semiónovich Tsvet 1872-1919 botánico, fundador Crom Colum. En 1903 lleno un tubo con carbonato de calcio y un extracto, aisló clorofilas a y b. inulina/huevo, probo 120 mezclas; CROMATO-GRAFIA

Kuhn, Lederer y Winterstein 1931 usaron la técnica para separar pigmentos de plantas, aumento el tamaño de las columnas, Crom. preparat.

Consden, Gordon y Martin 1944 lograron

John Martin y Richard Synge 1940-1950

separar mezclas complejas de aminoácidos en papel por LLC.

Establecieron los principios de la C. de reparto, promovieron la C papel, C gases, y la C líquida de alta resolución. LLC Premio Nobel 1952.

N. H. Ray Gas

DuPont y Wilson 1954

Porath y Flodin 1959

chromatography. II. The separation and analysis of gas mixtures by chromatographic methods J. appl. Chem., 1954, 4, 21

crearon la crom. en fasevapor (gas), varios equipos.

introdujeron la crom. de filtración de gel.

Wiley, McLaren y Harrington 1955 CG/Ms 10 kHz

1960

Sober y Peterson 1956 Prepararon las primeras celulosas para intercambio iónico.

cromatografía líquida de alta resolución HPLC

“75 Years of Chromatography - A Historical Dialogue. L.S. Ettre A. Zlatkis (Editors) Journal of Chromatography Library - Volume 17 Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam Feb. 1979, 530 pages

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Formas de Cromatografía Liquida

1. Cromatografía Liquido-Solido (LSC) o de Adsorción. 2. Cromatografía Liquido-Liquido (LLC) o de partición. 3. Cromatografía de Fase Ligada (BPC).

4. Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC). 5. Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC).

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Definición IUPAC; La Cromatografía es un método, usado primariamente para la separación de los componentes de una muestra, en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras la otra se mueve. Keulemans; es un método físico de separación en el cual los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases una fase estacionaria de área superficial alta y la otra es un fluido que percola a través de la estacionaria. Stewar; Grupo de métodos por los cuales, los componentes de una muestra son separados y donde los resultados pueden ser usados para cualificar y cuantificar los componentes de la muestra.

Cromatografía Fase estacionaria Sólido

Gel Líquido

Fase Móvil Líquido

Gas

Fluido supercrítico

Retenido en un sólido

Puede ser un sólido, un gel o un líquido. Si es un líquido, puede estar distribuido en un sólido, el cual puede o no contribuir al proceso de separación. El líquido puede también estar químicamente unido al sólido (Fase ligada) o inmovilizado sobre él (Fase inmovilizada).

Giddings; simplemente dice, la cromatografía es un método de migración en zona. 7

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Definición

Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (cromatografía líquida), un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía con fluido supercrítico). En la cromatografía de gases se usa el término fase líquida, caso más común de la fase estacionaria “líquida”, frente a fase gaseosa para la fase móvil “gaseosa”.

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Clasificación de la cromatografía:

Las diversas formas de cromatografía se pueden clasificar teniendo en cuenta diversos criterios: 1. Clasificación por la forma física del sistema de cromatografía. 2. Clasificación por la fase móvil empleada. 3. Clasificación por la fase estacionaria utilizada. 4. Clasificación por el modo de separación. 5. Clasificiación por la cantidad de muestra aplicada.

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Terminología de la cromatografía: •

El analito es la sustancia que se separa durante la cromatografía, esta contenido en la muestra.

•

Cromatografía analítica se utiliza para determinar la existencia y posiblemente también la concentración de analito (s) en una muestra.

•

Cromatografía preparativa se utiliza para separar una cantidad representativa de analito (s) en una muestra, para ensayos posteriores.

•

Un cromatograma es el resultado visual de la cromatografía. En el caso de una separación óptima, diferentes picos o patrones en el cromatograma corresponden a los diferentes componentes de la mezcla separada.

•

Cromatografía fase normal esta técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es bastante polar.

•

Cromatografía fase reversa consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl (trialquilclorosilanos), dónde la R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17.

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Terminología de la cromatografía: •

El eluyente es el disolvente que llevará el analito, antes de.

•

El eluato es la fase móvil que sale de la columna, después de.

•

Una serie de eluotropica es una lista de disolventes clasificados de acuerdo a su poder liberador, teniendo en cuenta la polaridad del disolvente.

•

La fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida.

•

La fase estacionaria es la sustancia que se fija a la partícula en la columna durante el procedimiento de cromatografía.

•

El tiempo de retención es el tiempo que tarda un analito en particular, para pasar a través del sistema (desde la entrada de la columna al detector) bajo condiciones establecidas.

La sigla HPLC se debió a "High Pressure Liquid Chromatography" fueron cambiadas cuando se dieron cuenta de que la presión sólo constituía una herramienta que forzaba a la fase móvil a atravesar la columna, sin constituirse por sí en una variable del sistema. Sin embargo, y ante la "universalidad" del término "HPLC", se decidió simplemente buscarle otro significado, resultando" High Performance Liquid Chromatography".

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Fase ligada; Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna. Fase inmovilizada; Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.

Percolación; En física, química y ciencia de los materiales, la percolación se refiere al paso lento de fluidos a través de materiales porosos. Ejemplos de este proceso son la filtración y la lixiviación. Fluido supercrítico (FSC); es cualquier sustancia que se encuentre en condiciones de presión y temperatura superiores a su punto crítico que se comporta como “un híbrido entre un líquido y un gas”, es decir, puede difundir como un gas (efusión), y disolver sustancias como un líquido (disolvente). 8

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Pasos para la caracterización Metal Problema de Tóxicos de muestras investigación Comp.s Activos

La mayoría de los métodos cromatográficos de análisis son en los casos más favorables selectivos, pero no específicos. Por ello, cuando se trata de muestras complejas la separación del analito de las posibles interferencias es una etapa esencial.

Plasma cuarto estado de agregación de la materia, un estado fluido similar al estado gaseoso pero en el que determinada proporción de sus partículas están cargadas eléctricamente, son buenos conductores eléctricos y sus partículas responden fuertemente a las interacciones electromagnéticas de largo alcance. BTEX; benceno, tolueno, etilbenceno y xileno.

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Tecnología de alimentos y Productos Naturales.- Puede realizarse la caracterización de Aceites Esenciales y Aromas, los cuales son empleados en la elaboración de saborizantes, aromatizantes, licores, perfumes, artículos de aseo, y como materias primas para productos farmacéuticos. Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados están: los hidrocarburos aromáticos, BTEX, pesticidas organoclorados y organo-fosforados en muestras de aguas superficiales, subterráneas, suelos y lodos.

Química Forense.- Es posible la aplicación de la cromatografía de gases y la espectrometría de masas en la detección y cuantificación de analitos de interés en la química forense. Por ejemplo la determinación, cuantificación de alcohol en sangre, análisis de licores, entre otros.

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Campos de Aplicación:

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Clasificación por la forma física del sistema de cromatografía En relación con la forma física del sistema, la cromatografía puede ser subdividida:

Líquida

Cromatografía en columna

Gaseosa Supercrítica

Papel Cromatografía plana

Capa fina

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Clasificación por la fase móvil empleada. Cromatografía líquida

Cromatografía gases

Cromatografía de fluidos supercriticos

(CLC) (HPLC)

(GC)

(CSC)

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Clasificación por la fase estacionaria utilizada. TLC CLC HPLC GSC cromatografía gas-sólido

Sólida Fase estacionaria

Líquida

GC – GLC cromatografía gas-líquido

Modificada

HPLC/CLC (matriz + Link + GFunc)

Pc análisis Graficas Columna Inyector

Eluyente

Bomba

Detector

Residuos

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Clasificación por el modo de separación. Adsorción: es un proceso físico o químico por el cual átomos, iones o moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material 1- Adsorción Absorción: es un proceso físico o químico en el cual átomos, moléculas o iones pasan de una primera fase a otra incorporándose al volumen de la segunda fase.

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2- Partición El coeficiente de reparto (K) [también llamado coeficiente de distribución (D), o coeficiente de partición (P)], de una sustancia, es el cociente entre las concentraciones de la sustancia en dos fases formadas por dos disolventes inmiscibles en equilibrio.

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Separación Cromatográfica: La cromatografía es un sistema de separación dinámico, porque continuamente se producen equilibrios entre los componentes de la mezcla a separar y las fases móvil y estacionaria (fija). La interacción de la mezcla con las dos fases está influenciada por fuerzas intermoleculares diferentes; iónicas, polaridad y efectos específicos de afinidad y solubilidad.

Fase móvil

Líquido Gas Fase estacionaria

↑Areas

Fase móvil polaridad

Líquido Fase estacionaria

↑Areas 14

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Serie Eluotrópica – polaridad de los solventes Un disolvente es una sustancia en la que se diluye un soluto (un sólido, líquido o gas químicamente diferente), resultando en una disolución. La constante dieléctrica y el momento dipolar de una disolvente, son propiedades complementarias usadas para caracterizar su polaridad.

Investigar una serie eluotrópica, disolventes próticos y apróticos

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En el proceso de separación se establece un equilibrio entre la concentración del componente presente en la fase móvil y la fase estacionaria, es decir una competición entre las fases por el componente. A esto se le denomina partición o reparto del componente distribuido entre las fases.

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Formas de cromatografía líquida

• Cromatografía de fase químicamente unida (BPC) Fase normal (F.N.) y Fase reversa (F.R.) El 90 % de las separaciones cromatográficas modernas se efectúa sobre material químicamente modificado, con un amplio rango de polaridad y de selectividad: octadecilo, octilo, hexilo, butilo, etilo, ciano, diol, fenilo, amino, nitro, amonio cuaternario, resto sulfónico, etc. F.R. (RP-HPLC), Principio: La estructura hidrofóbica es responsable de la partición del analito entre la superficie hidrofóbica y metanol. F.E.: Superficies hidrofóbicas en sílica gel RP-C18, RP-C8 y grupos fenilo. F.M.: Metanol o acetonitrilo y agua. Aplicaciones: compuestos poco solubles en agua o metanol, proteínas, péptidos, azúcares, ácidos grasos, fármacos. F.N. (NP-HPLC), Principio: utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de interés es polar. F.E.: Sílica. F.M.: hexano o cloroformo. Aplicaciones: Compuestos hidrofílicos e isómeros estructurales. La NP-HPLC cayó en desuso en los años setenta con el desarrollo de la fase reversa debido a la falta de reproductibilidad. • Cromatografía de intercambio iónico (IEC) Principio: Adsorción reversible de iones en F.E. con grupos funcionales de cargas opuestas. F.E.: Para cationes; SO32-, CO32-. Para aniones; NH4+, NH3+-R. F.M.: Buffer con pH y fuerza de buffer controlados. Aplicaciones: Todos los compuestos ionizados, aniones, cationes, azúcares, ácidos carboxílicos, aminas, etc.

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Formas de cromatografía líquida

• Cromatografía Líquido-Sólido (LSC) o de adsorción. Principio: Adsorción de los analitos en la superficie polar de la sílica gel, ligeramente ácida. F.E.: Sílica gel (pH 2-8); Alúmina (pH 2-12). F.M.: Disolventes no-polares como hexano, CHCl3 (en raras ocasiones agua). Aplicaciones: Para muestras no-polares y semi-polares; solubles en hexano; isómeros posicionales. • Cromatografía de exclusión (GPC) Cromatografía Permeación en Gel-GPC y Cromatografía Filtración Gel-GFC GPC, Principio: Los poros internos de la F.E. excluyen a los analitos en función de su volumen hidrodinámico y su PM. F.E.: estireno, 8% DVB, con diámetros de poro de 80, 100, 150, 300, 500 o 1000 Å. F.M.: Tolueno, Decalina o THF. Aplicaciones: Polímeros orgánicos, poliestirenos, polietilenos, metacrilatos. GFC, Principio: es una técnica que se utiliza como primer paso para analizar una mezcla compleja de proteínas o para caracterizar la distribución de pesos moleculares de polímeros solubles en agua como la poliacrilamida. F.E.: geles hidrofilicos, Sephadex. F.M.: buffer o agua. Aplicaciones: Biopolímeros solubles en agua.

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Formas de cromatografía líquida Cromatografía Quiral: Los isómeros son compuestos que tienen la misma formula, pero difieren en la orientación espacial de sus grupos funcionales, entre estos encontramos los enantiomeros, los cuales tienen las mismas propiedades físicas y químicas y solo se pueden separar en ambientes quirales. Cromatografía HILIC: Una técnica que se viene trabajando desde hace aproximadamente 50 años, pero que ha tenido auge recientemente debido a al surgimiento de la Cromatografía liquida 2D o bidimensional y LCMS, y que genera una mejor separación de compuestos altamente polares como por ejemplo los Azucares.

IIC

NPC HILIC

1. Fase estacionaria 2. Analitos 3. Fase Móvil

RPC

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Cromatografía de exclusión por tamaño, SEC •Usa las características físicas de los analitos. •Los componentes más grandes que el límite de exclusión de la columna no se pueden separar. •Se requiere preparar una curva de calibración con un conjunto de patrones de calibración de PM conocido. •Hay dos tipos de SEC: Una utiliza disolvente orgánico y la otra utiliza disolvente acuoso como fase móvil: La que utiliza disolvente acuoso se denomina cromatografía de filtración en gel (GFC) o SEC acuosa. El método GFC fue desarrollado por J.Porath y P.Flodin en 1959. La que utiliza disolvente orgánico se llama cromatografía de permeación de gel (GPC) o SEC orgánico. El método de GPC fue desarrollado por J. Moore EE.UU. en 1964.

http://shodexhplc.com/lessons/leccion-3-cromatografia-de-particionadsorcion/?lang=es

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Cromatografía de afinidad, AFC

•Ofrece la mayor especificidad selectividad para el aislamiento purificación de biomoléculas.

y y

•Se basa en interacciones bioespecíficas gracias a las cuales la columna de AFC absorbe únicamente de la muestra los componentes que presentan afinidad con los ligandos acoplados al soporte cromatográfico. •Cuando el compuesto retenido es eluido, se consiguen niveles de pureza extraordinarios. •Algunas matrices permiten una fácil inmovilización de diversos tipos de ligandos.

http://www.teknokroma.es/userfiles/hplc/603-606.pdf

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Cromatografía de interacción hidrofóbica, HIC o RFC •Separa las moléculas por su hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las biomoléculas a la superficie hidrofóbica de la resina en una solución salina y su elución mediante una gradiente salino negativo. •El mecanismo de separación es similar al de la fase reversa, su selectividad es diferente, con lo que ambas técnicas son complementarias. •Como regla general, las proteínas que pueden ser fraccionadas mediante la precipitación con sulfato amónico, pueden ser separadas por esta técnica. •El termino HIC es común cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos, en tanto que RPC se emplea para la separación de moléculas hidrofóbicas y no a macromoléculas biológicas. http://www.teknokroma.es/es/Productos/cromatografia-de-hplc/5/biocromatografia/44/177/interaccion-hidrofobica-hic.aspx

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Cromatografía de intercambio iónico, IIC •Proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. •Se usa en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo proteínas, nucleótidos y aminoácidos.

•Basandóse en las interacciones de Coulomb, la fase estacionaria muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta. •La cromatografía de intercambio catiónico retiene catiónes debido a que la fase estacionaria tiene grupos cargados negativamente, mientras que la cromatografía de intercambio aniónico retiene aniónes debido a que la fase estacionaria tiene grupos cargados positivamente.

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Fuerzas intermoleculares en la cromatografía liquida ¿Cuales son las F. intermoleculares? Fuerzas repulsivas

Repulsión de Pauli Átomo - átomo Repulsión ion-ion del mismo signo

Na+ Na+ Ion-Ion signo contrario Ion-dipolo

Fuerzas intermoleculares

Fuerzas de Coulomb Ion-dipolo inducido

Na+ ClCl-

R-Fe3+ - O2+

Fuerzas hidrofóbicas

Fuerzas atractivas Fuerzas de van der Waals

H-F dipolo-dipolo Dipolo instantáneo-dipolo -OCO+ inducido

Puentes de Hidrogeno

Cuanto más intensas sean las fuerzas intermoleculares y mayor su cantidad aumenta la energía que se necesita para vencerlas. Hielo vapor 20

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Na+ Na+

Ion-Ion signo contrario

Na+ Cl-

Son las que se establecen entre iones de igual o distinta carga: • •

Los iones con cargas de signo opuesto se atraen Los iones con cargas del mismo signo se repelen

La magnitud de la fuerza electrostática viene definida por la ley de Coulomb. Con frecuencia, este tipo de interacción recibe el nombre de puente salino. Son frecuentes entre una enzima y su sustrato, entre los aminoácidos de una proteína o entre los ácidos nucleicos y las proteínas.

Asociación

Disociación 21

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Ión-dipolo Son las que se establecen entre un ión y una molécula polar. Por ejemplo, el NaCl se disuelve en agua. Esta solvatación de los iones es capaz de vencer las fuerzas que los mantienen juntos en el estado sólido. La capa de agua de hidratación que se forma en torno a ciertas proteínas y que resulta tan importante para su función también se forma gracias a estas interacciones

CL -

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Ión-dipolo inducido Tienen lugar entre un ión y una molécula apolar. La proximidad del ión provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula apolar que la convierte transitoriamente en una molécula polarizada. En este momento se produce una atracción entre el ión y la molécula polarizada. Un ejemplo de esta interacción es la del ión Fe++ de la hemoglobina y la molécula de O2, la especie ion triyoduro ( I3- ), se explica en base a la interacción entre el yodo ( I2) y el ion yoduro ( I-).

Sal

-

+

+

-

Polar Apolar

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Interacciones hidrofóbicas Las moléculas hidrofóbicas tienden a asociarse en un medio acuoso, lo hace por razones termodinámicas: las moléculas hidrofóbicas se asocian para minimizar el número de moléculas de agua que puedan estar en contacto con las moléculas hidrofóbicas. Este fenómeno se denomina efecto hidrofóbico y es el responsable de que determinados lípidos formen agregados supramoleculares.

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Fuerzas de polaridad (dipolo-dipolo, fuerzas de Keesom) Cuando dos moléculas polares (dipolos) se aproximan, se produce una atracción entre el polo negativo de una y el positivo de la otra. Esta fuerza entre dos dipolos es mas intensa cuanto mayor es la polarización de las moléculas, dicho de otra forma, cuanto mayor sea la diferencia de electronegatividad de los átomos.

Puentes de hidrógeno Un puente de hidrógeno es la fuerza atractiva entre un átomo electronegativo y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a otro átomo electronegativo.

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Dipolo inducido

Fuerzas dipolo-dipolo inducido (fuerzas de Debye) Entre una molécula polar y una molécula apolar. En este caso, la carga de una molécula polar provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula apolar y la convierte, de modo transitorio, en un dipolo. Gracias a esta interacción, gases apolares como el O2, el N2 o el CO2 se pueden disolver en agua.

-

+

-

+

+

-

+

-

Polar

Apolar Polar Apolar

Polar 27

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Fuerzas dipolo instantáneo-dipolo inducido Las fuerzas de dispersión son fuerzas atractivas débiles que se establecen entre sustancias no polares, aunque también están presentes en las sustancias polares. Se deben a las irregularidades que se producen en la nube electrónica de los átomos de las moléculas por efecto de la proximidad mutua. La formación de un dipolo instantáneo en una molécula origina la formación de un dipolo inducido en una molécula vecina. Aumentan con el tamaño y la asimetría de las moléculas. Son mínimas en los gases nobles (He, Ne), algo mayores en los gases diatómicos (H2, N2, O2) y mayores aún en los gases poliatómicos (O3, CO2).

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Cromatografía liquida y fuerzas intermoleculares

Las fuerzas que intervienen en este proceso de migración de la fase móvil hasta el final de la columna son las fuerzas intermoleculares, estas son fuerzas de atracción entre moléculas, son más influyentes en los líquidos y en los sólidos, determinando el grado de interacción de las moléculas a la resina a una determinada temperatura y presión.

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Interacción molecular

Fuerzas intermoleculares en la cromatografía liquida Están biomoléculas

No

poliméricas presentes

Hay interacciones especificas y selectivas

Separación por tamaño y velocidad

Si

No

Si

No

Son iones los involucrados

Si Fuerzas de afinidad

Están iones y moléculas polares presentes

Si

Hay moléculas polares

Fuerzas Ion-dipolo

No

Fuerzas Ion-ion

Si

No Hidrofobicidad *Fuerzas de Van der Waals

Hay hidrógenos unidos a N, O o F? No

*Fuerzas dipolo-dipolo Exclusión

Si Puentes de hidrogeno

Afinidad Hidrofobicidad

Intercambio iónico

Adsorción y Reparto *diferentes tipos de interacciones dipolo-dipolo

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Características de los tipos de cromatografía. Método

Aplicación

Cromatografía de Compuestos orgánicos adsorción polares o poco polar, FNC Crom. fase normal Cromatografía de Compuestos orgánicos partición apolares o poco polar, FRC Crom. fase reversa

Cromatografía de Compuestos con grupos inter iónico iónicos o ionizables, IIC Cromatografía de Compuestos PM variado, SEC (GFCac, filtración y exclusión por GPCorg, permeación) tamaño Cromatografía de Compuestos biológicos del tipo receptorAfinidad ligando, AFC

Fases Móvil Estac.

Principio de separación

líquido-sólido

Adsorción Adsorbente sólido

Polaridad

líquido-líquido líquido-sólido

Adsorción-partición Adsorbente líquido

Polaridad

líquido-sólido

Competición Intercambio iónico

Nat. iónica

líquido-sólido

Gel poroso Peso molecular

líquido-sólido

Propiedad del analito

Tamaño

Comp. Inmovilizado Forma Llave -cerradura estructura

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En Resumen Modalidades de Cromatografia

Naturaleza Fase móvil

Gas : C. Gaseosa GC Líquido: C Líquida LC •Capa Delgada TLC •Columna Abierta •HPLC *

Naturaleza Fase Estacionaria •

•Liq-Sol •Liq-Liq •Gas-Liq •Gas-Sol

Fenómeno en Columna (LSC) (LLC) (GLC) (GSC)

Líquido/Gas SFC :SFC

Cantidad Muestra Aplicada

• • • • • •

Afinidad Adsorción Partición Gel poroso Intercambio Iónico Hidrofobicidad

2.

Tamaño molecular

• •

Permeación por gel Filtración por gel

•Analítica: Pg – g •Semipreparativa: g – gramos •Preparativa: gramos-

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Características de HPLC Vs GC. Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia

Cromatografía de Gases

Método

Separa, identifica (dep. detector) y cuantifica compuestos solubles que dependiendo de las interacciones entre las moléculas a ser separadas, la fase estacionaria y el solvente usado.

Separa, identifica (dep. detector) y cuantifica compuestos que pueden ser vaporizados sin descomposición

Acrónimo

HPLC

GC

Tipo de analitos

Moléculas orgánicas, biomoléculas, Iones y polímeros. Volátiles o no, termolábiles o no (amplio rango)

Movilidad de la muestra

Bombas con altas presiones

Gas transportador

Fase móvil

Diferentes tipos de solventes con polaridades distintas o mezclas de estos, buffes

Gases inertes N2, H2, He

Columnas

Los tamaños van de 5 a 50 cm, hay muchos tipos de columnas

Los tamaños van de 20 a 100 m, separa muchos compuestos

Detectores

Ultravioleta- visible (UV/Vis), Arreglo de fotodiodos (PDA), espectrometría de masas (MS) e Índice de Refracción, conductividad. Se requiere de un detector altamente sensible y "universal".

Moléculas orgánicas volátiles. Sustancias orgánicas volátiles, NO termolábiles, peso molecular promedio ( GC, viscosidad; la selectividad > HPLC, solventes. 34

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Características de HPLC Vs GC. Dónde encaja la HPLC: desde lo no polar a lo altamente cargado

Cromatografía líquida

Cromatografía Gases

Polycyclic aromatic hydrocarbon Butylated hydroxyanisole Butylated hydroxytoluene Tertiary butylhydroquinone Trimethylsilyl Polychlorinated biphenyls Propilenglicol Organometallic

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Instrumental

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Instrumentación La cromatografía líquida moderna ha experimentado muchos desarrollos: • nuevas fases estacionarias • bombas que permiten entregar caudales estables que varían entre μL y mL • detectores con celdas intercambiables • válvulas accionadas por microprocesadores • control global de uno o más equipos cromatográficos • desarrollo automático de métodos • Conexión con otros sistemas cromatográficos HPLC – SFC Sistema integrado

HPLC integrado Shimadzu LC-2010HT Mejor aprovechamiento del espacio, menos cables, tuberías y conexiones expuestas y quizás menores riesgos.

Sistema modular

Prominence Shimadzu Modular HPLC Los módulos son instrumentos individuales que permiten armar el equipo según la necesidad del analista y aumentar su complejidad según los avances y requerimientos.

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Instrumentación Instrumentación 1. Reservorio; contiene la fase móvil 2.

Bomba; impulse la fase móvil dentro del Sistema de elución del HPLC.

3.

Inyector (auto-muestrador); permite introducir la muestra al sistema de análisis

4.

Columna (pre-columna, guarda columna y horno); Sistema de protección de la columna y análisis (separación) de la muestra.

5.

Detector; es un transductor que tiene como función los cambios de registro y y la identificación del paso de los componentes de acuerdo a la elución.

6.

Colector de fracciones; recibe y almacena las fracciones de eluato que contienen los componentes separados.

7.

Computador; Sistema de recolección, graficación, análisis y almacenamiento de datos. 39

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Reservorios

Puede ubicarse algunos centímetros sobre el nivel de la bomba para que la fuerza de gravedad dirija el solvente hacia ésta, manteniendo llenas las conexiones. Puede emplearse cualquier frasco de buena calidad (vidrio o polímero resistente como politetrafluoroetileno), con una tapa adecuada para evitar el ingreso de partículas al sistema (el mismo envase comercial del solvente). Al extremo del tubo de salida de solvente se conecta un filtro de acero (buzo) con 2 o 1Oμm de porosidad. Algunos sistemas necesitan procesos de desgasificación continua ultrasonido. La formación de burbujas de aire en el interior de los pistones, con la consiguiente pérdida de precisión en el caudal y consiguiente falta de reproducibilidad en las mezclas y gradientes.

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Tuberías

Tuberías

La fase móvil empleada debe circular por tuberías que conectan las diferentes partes del equipo; los reservorios con las bombas, la bomba con el inyector, éste con los detectores conectados en serie, y los detectores con un colector de fracciones. Las tuberías deben ser inertes y resistentes a altas presiones. Se emplean tubos de acero inoxidable (316 o 304) o polímeros (polipropileno o teflón). Tuberías demasiado largas conducen a ensanchamientos extracolumnares importantes. PEEK, poliéter éter cetona; son compatibles, químicamente inertes y pueden usarse en lugar de los tubos de acero inoxidable en la mayoría de los sistemas analíticos líquidos. 41

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Tuberías

Tuberías

Factores a tener en cuenta; Diámetros internos Presiones Resistencia química Resistencia biológica Resistencia mecánica

Acero Inoxidable, Los tubos de Ac Inox, Grado 304 para uso general cromatográfico ó Grado 316 para aplicaciones con máxima resistencia a la corrosión, son adecuados para confeccionar columnas, conexiones en HPLC PEEK™, Es un poliéter mecánicamente resistente y con las características para ser conectados con férulas metálicas ó de polímero. Excelente inercia química y biocompatibilidad.

PTFE, Inerte: ideal para transferir fluidos a baja presión como líneas de solvente en HPLC

PEEKSil™, La combinación de PEEK con un interior de sílice fundida combina la cualidades de ambos materiales: Resistencia química y mecánica, compatibilidad con todos los solventes y total biocompatibilidad.

Tubo de Acero Inoxidable 316 mecanizado, Este tubo se corta lectroquímicamente y tiene un tratamiento de electropulido, asegurando bordes perfectamente perpendiculares sin rebabas.

Tubo GLT™, Se ha desarrollado y patentado la producción de tubo de acero inoxidable con revestimiento interno de vidrio (Glass Lined Tubing).

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Uniones Conectores

Conexiones o uniones

Con. Waters SS rosca Con. Valco SS rosca

Con. SS Fingerlok

férula

tornillo

tornillo

férula

Picos corridos y ensanchamiento

Las uniones permiten conectar las tuberías, y con ellas, los distintos componentes del sistema cromatográfico. Al fabricar una unión, la férula queda fijada a la tubería y luego al realizar el primer ajuste esta no se puede mover. Existen dos tipos de uniones, las convencionales  y las universales  ; donde la férula está constituida por un polímero deformable y el tomillo posee una cabeza algo mayor y fresada. La selección incorrecta de los conectores y el mal ajuste férula tubería puede llevar a complicaciones

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Uniones Conexiones o uniones

Incorrecto ajuste Unión/tubo en el extremo de la columna

Longitudes requeridas del vástago (distancia de la tubería más allá del extremo de la férula) para los fabricantes de herrajes de columnas comunes

Conector de columna/precolumna Volúmenes muertos creados (sombreados o entre dos en rojo) cuando se utilizan combinaciones de tuercas / columnas casquillos de otros fabricantes

Férula híbrido de titanio/PEEK utilizado en una tuerca de dedo y tubo metálico para conexiones de columna UHPLC

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Bombas Conexiones o uniones

Las bombas de HPLC impulsan la fase móvil a través de todo el sistema. Su caudal de trabajo puede ser muy variable (µL/min – mL/min), según la escala de trabajo escogida. Las bombas utilizadas en el HPLC son muy potentes, libres de pulsos, constantes, reproducibles y precisas, la presión puede ser hasta de 6000psi (lbs/in2) y todos los componentes deben ser resistentes a la corrosión. Existen tres tipos de bombas: bombas recíprocas, bombas de presión constante o neumática y bombas de jeringa. Las primeras son las de uso más difundido; son muy versátiles y fáciles de adaptar a la rutina del laboratorio. 43

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Bombas

Columna

Pistón

Fase móvil

Fase móvil Pistón

Reservorio

Bomba reciproca o pistón

Bomba neumática o constante

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Bomba reciprocante de pistones (va y viene, sube o baja) Columna Fase móvil

Pistón

Fase móvil

Reservorio

35 y 400 µL.

Bomba reciproca o pistón

La mayor parte de los equipos cromatográficos utilizan bombas con pistones de tipo reciprocante. Existen varios tipos de bombas: de un solo pistón, de dos pistones (equipos nuevos), de tres pistones, bomba tándem, y bomba a pistón y diafragma. Esquema de un cabezal de bomba de pistón, a) y b) entrada y salida de solvente de limpieza del pistón, e) pistón, d) y e) válvulas de entrada y salida. Cuando el pistón retrocede por el mecanismo inverso se cierra la válvula de salida y se abre la de entrada dejando que el solvente llene la cámara del pistón. 44

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Bomba reciprocante de pistones (va y viene, sube o baja)

Se generan pulsos indeseables ya que durante este ciclo no circula fase móvil, se recomienda; empleo de atenuadores o amortiguadores de pulsos, empleo de dos o más pistones sincrónicos, uso de una bomba tándem (cabezal con dos pistones de diferente tamaño, movidos a distinta velocidad). Las fases móviles constituidas por solventes puros no causan problemas, pero las soluciones salinas pueden producir depósitos por evaporación que rayan los pistones, es recomendable lavar el sistema con un solvente apropiado luego de emplear fases móviles salinas.

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Bomba de diafragma con pistón y soporte Bombas de diafragma con pistón

El elemento de bombeo en este caso es un diafragma flexible, colocado dentro de un cuerpo cerrado que se acciona desde el exterior por un mecanismo reciprocante, que hace aumentar y disminuir el volumen debajo del diafragma. El diafragma está constituido por un material flexible, en general acero inoxidable o politetrafluoroetileno - teflón (PTFE).

Un par de válvulas convenientemente colocadas a la entrada y la salida forzan el líquido a circular en la dirección de bombeo.

La diferencia principal es que el mecanismo de acción solo mueve el diafragma en la dirección de la succión, por el empuje de un resorte. La fuerza de este resorte es la que determina la presión máxima de bombeo. Bombas de diafragma con resorte. 45

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Bomba de jeringa Dispositivo de desplazamiento continuo, donde el recorrido del pistón y el volumen desplazado es, en los casos en que se aplica, suficiente para efectuar un número determinado de ensayos completos, sin necesidad de recargar su cámara. La principal ventaja de estas bombas es la total ausencia de pulsos ya que la cámara no necesita ser recargada, mientras que la principal desventaja está dada por el caudal y/o el tiempo necesario para recargar esa cámara cuando se vacía. Este tipo de bomba no es compatible con los sistemas convencionales, con caudales de 1 o más mL/min, pero es el sistema ideal para la modalidad microbore y capilar, en las cuales el rango de trabajo se limita a pocos µL/min.

Aumento de la sensibilidad de un sistema microbore a velocidades de flujo lineales comparativos.

Microbore HPLC columns for both general and specialized use.

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Válvulas Check para bomba de pistón

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Válvulas Check para bomba de pistón Factores que afectan la válvula Check: Aire, residuos de muestra o fase móvil y solventes como ACN.

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Características de las bombas línea de base errática

Caudal o flujo. Los equipos convencionales operan con caudales entre 0.1 y 10.0 mL/min y trabajan con presiones de hasta 6000 psi. Exactitud en el caudal. La exactitud en la medición del caudal se refiere a la divergencia entre el caudal de trabajo establecido y el caudal real entregado (medir volumen de salida). Ruido. Se refiere a las variaciones (pulsaciones) que presentan las bombas del tipo reciprocante, y que conducen a variaciones en el caudal del solvente entregado, en intervalos cortos de tiempo, se deben a: mal funcionamiento de las válvulas de retención, precipitación de sustancias y a la aparición de burbujas de aire. Deriva. La deriva es un cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega de solvente que se produce en intervalos de tiempo muy largos, que conducen a diferencias en las áreas de los picos.

línea de base causado por la presencia de aire

Sistema de corte. Es conveniente el sistemas de corte de caudal cuando se superen los valores límites de presión tanto superior como inferior, evitando; por excesos en la presión, que se dañen los componentes más sensibles como columnas y celda de los detectores. Por defecto en la presión, permite detectar las pérdidas de solvente o la incorporación de burbujas de aire al agotarse la fase móvil.

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Sistemas de Gradientes Las eluciones isocráticas sirven para las necesidades básicas, son capaces de separar un número limitado de picos, 10 o 12. Para sistemas más complejos, o cuando hay “diferente polaridad" de los componentes, se puede optar por dos alternativas: la corrida multidimensional (columna switching, acoplamiento CL-CL) o la utilización de un gradiente de solventes. Elución isocrática

Elución con gradiente

No confundir la programación de solventes con la programación de caudales. La primera involucra un cambio de la fuerza de elución, mientras que la segunda se refiere a la modificación del caudal o flujo de trabajo. Isocrática

El gradiente de solventes se gradúa, por la velocidad de cambio del solvente "débil" al "fuerte“, (contenido porcentual de los componente FM). Existen básicamente dos tipos de formadores de gradientes: los de baja presión y los de alta presión.

Gradiente en rampas

Gradiente lineal o curvado

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Sistemas de Gradientes

Different strategies of gradient elution.

Efectos de la velocidad de flujo de eluyente en la resolución en HPLC Gradiente.

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La composición de eluyente se cambia continuamente hacia condiciones que favorecen la disociación del medio de cromatografía. La posición de elución difiere entre las sustancias dependiendo de su fuerza de unión

Separación típica de Isocrático y Gradiente de contaminantes ambientalmente persistentes.

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Gradientes

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IIC, pH can alter resolution of a method

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Figure 18: Use of an isocratic hold to improve resolution in the mid-section of a gradient elution chromatogram.

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Gradientes 35% 15%

15%

30% 15%

15% 35%

13%

13% 35%

10%

10%

Figure 1 Chromatograms showing the influence of composition of mobile phase on the separation of the five triazines in the core-shell column. Chromatographic conditions: (a) 0 to 5 min, isocratic at 15% ACN, 5 to 7 min, linear gradient of 15 to 35% ACN, 7 to 9.5 min: isocratic at 35% ACN, 9.5 to 12 min, gradient of 35 to 15% ACN, and finally, 12 to 15 min, isocratic at 15% ACN; (b) 0 to 5 min, isocratic at 15% ACN, 5 to 7 min, linear gradient of 15 to 30% ACN, 7 to 9.5 min: isocratic at 30% ACN, 9.5 to 12 min, gradient from 30 to 15% ACN, and finally, 12 to 15 min, isocratic at 15% ACN; (c) similar as (a) but starting and finishing the elution with 13% ACN; (d) similar as (c) but starting and finishing the elution with 10% ACN. Flow rate = 1.5 mL min-1, sample volume = 20 µL, detection at 223 nm.

Column; 50 × 4.6 mm internal diameter (i.d.) OnyxTM C18 monolithic column coupled to 5 × 4.6 mm C18 monolithic guard column from Phenomenex® (Torrance, CA, USA)

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Bombas binarias y cuaternarias Existen básicamente dos tipos de formadores de gradientes: los de alta presión y los de baja presión. Los gradientes de alta presión utilizan una bomba de alta presión para cada solvente individual y el solvente se mezcla en una cámara de bajo volumen. Los gradientes de baja presión emplean, sólo una bomba y válvulas solenoides que entregan cada solvente en una cámara de mezclado de pequeño volumen.

La bomba binaria se basa en un diseño en serie de dos pistones y dos canales. Los flujos individuales de bombeo de cada una de estas bombas recíprocas están controlados electrónicamente, permitiendo mezclar proporcionalmente el solvente de los dos canales.

Puesto que la mezcla de solventes se produce después de las bombas, se denomina “mezcla a alta presión”. 12

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Bombas binarias y cuaternarias La desgasificación del disolvente es imprescindible en un sistema de gradiente a baja presión por lo que el desgasificador de vacío forma parte del sistema de la bomba cuaternaria.

La bomba cuaternaria está compuesta por un des-gasificador de vacío y una bomba de gradiente de cuatro canales. Esta última comprende una válvula de partición de alta velocidad y un dispositivo de bomba. Proporciona un gradiente por mezcla a baja presión.

• • •

Menor reproducibilidad del gradiente Efectos de Cavitación (burbujas) Líneas de base ruidosas y erráticas (inmiscibilidad)

Bomba de gradiente de cuatro canales

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Bomba y válvulas solenoides

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Desgasificador de disolventes En el momento que se comienza una nueva botella de solvente, su contenido se expone a la atmósfera y empieza a acumular gases disueltos

Los gases que acumulan los disolventes, sobre todo el oxígeno, pueden ocasionar problemas de interferencias en los detectores de fluorescencia y electroquímicos del HPLC. El nitrógeno disuelto en el eluyente puede producir burbujas en la columna de HPLC de forma que cuando el eluente entra en el detector pueden producir picos falsos o bien provocar desviaciones en la línea de base, mientras que el CO2 puede ocasionar la modificación de pH de los eluyentes. Se desgasifica por vacío, sonicado o burbujeo de un gas inerte, He.

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Inyectores Conexiones o uniones

El inyector es una válvula que permite introducir la muestra en solución sin interrumpir el flujo a través del sistema, orientan el caudal hacia la columna, pasando o no según su posición, a través del loop en el cual se introduce la solución a inyectar. Las válvulas pueden accionarse manual o automáticamente. El loop es intercambiable, de modo que la cantidad de muestra inyectada puede escogerse entre una serie de medidas estándar (en los inyectores convencionales, entre 5 y 2000 µL). Se debe llenar con 3 a 5 volúmenes. 12

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El rotor tiene un rango de pH que depende de los diferentes materiales; Tefzel, ETFE (etilenetetrafluoroetileno) fluoropolimero, PEEK, (Poliéter éter cetona) y Vespel marca comercial de una gama de alto rendimiento de poliimidas, plásticos fabricados por DuPont.

Mantener el inyector en la posición "inject" (paso principal) el tiempo necesario para permitir que la fase móvil fluya a través del loop, esto se controla solo en los automuestreadores, en la posición de “load” debe permanecer el equipo.

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Inyectores

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Detectores Conexiones o uniones

La separación real de cada componente en la muestra se realiza dentro de una columna, sin embargo, esta separación tiene que ser “registrada” para que seamos capaces de verlo. El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite "ver" y ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componentes de una muestra a la salida de la columna cromatográfica. No hay un detector universal que pueda revelar todos los compuestos, hay muchos detectores para el análisis LC. Los componentes separados de un equipo HPLC se controlan y se comunican electrónicamente.

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Detectores

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Visión y los colores

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Detectores PDA Conexiones o uniones

Three-dimensional chromatogram of SR extract. Highperformance liquid chromatography photo-diode array analysis was used to produce a three-dimensional chromatogram in order to confirm and quantify the major components of SR extract (baicalin, baicalein and wogonin). SR, Scutellariae Radix.

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Características de los Detectores Amplio rango dinámico de respuesta. Es el rango de concentraciones de una sustancia en análisis, en la que un cambio en la concentración produce un cambio en la señal. Como puede deducirse, esto incluye tanto la respuesta lineal como no lineal. Respuesta lineal. El detector debe medir alguna propiedad del analito que se incremente linealmente al aumentar su concentración. Analito ∝ Respuesta lineal (concentración). Ensanchamiento de banda extra-columnar. se refiere a la pérdida de eficiencia, tanto por las dimensiones de la celda (3 a 12µL) como la longitud y diámetro de la tubería de conexión. Responder a todos los solutos. La situación ideal es, obviamente, que el detector responda a todo tipo de solutos. Tener una constante de tiempo baja. La constante de tiempo de un detector indica la velocidad con que éste responde a un cambio instantáneo de la concentración del analito. Los valores habituales en un detector cromatográfico son; Resp. rápida 0.5, 1.0 y 5.0 Resp. Lenta. No afectarse por cambios de temperatura. En lo posible los cambios de temperatura no deben modificar la señal emitida por los detectores. Poseer una buena relación señal/ruido. El ruido de un detector es la combinación de los términos de ruido largos y cortos en un tiempo, se deben a la electrónica propia del instrumento, a variaciones de temperatura, oscilaciones en la línea eléctrica o a fluctuaciones en el caudal. 12

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Detectores Generales; índice de Refracción Los detectores generales miden el cambio de alguna propiedad física de la fase móvil que contiene el analito en comparación con la misma fase móvil pura. Ejemplos típicos son el detector de índice de refracción y el de conductividad. Este detector mide la diferencia de índice de refracción entre el solvente puro y el solvente que contiene la muestra. Es un detector universal y no destructivo, poco sensible, lo cual limita su campo de aplicación y es afectado por cambios de temperatura. No puede utilizarse gradiente de solventes. Existen tres tipos diferentes de detectores de Índice de Refracción: Fresnel, Deflexión, Interferométrico. Opera según la ley de Fresnel, "la cantidad de luz reflejada en una interfase líquido/vidrio varía con el ángulo de incidencia y con el índice de refracción del líquido".

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Detectores Generales; índice de Refracción

Filtro IR

3µL

Se emplea en muestras que no tienen absorción UV, tal como azúcar, alcohol, o iones inorgánicos, obviamente, no puede ser medida por un detector de UV., donde la intensidad observada por un detector RI es comparable a la concentración del analito.

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Detectores Generales; índice de Refracción En el interferométrico, la luz emitida por la fuente se polariza y divide en dos haces por un divisor de onda. Luego atraviesan la celda de referencia y la de medida. Finalmente, se recombinan por una segunda lente y por un divisor de onda para llegar al fotomultiplicador. Cuando se produce una diferencia en los índices de refracción de las celdas se da un cambio de fase entre ambas ondas y se origina una diferencia en la intensidad de luz que llega al fotomultiplicador.

Un detector diferencial que, al contrario del Fresnel, sólo usa un prisma para todo el rango de índices de refracción, pero emplea celdas de mayor tamaño, del orden de 8 a 10μL.

Una celda contiene la fase móvil pura, y a través de otra celda fluye el eluído de la columna. Cuando se produce un cambio del índice de refracción, es registrado por el sistema óptico.

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Detectores generales; Otros detectores Efluente de columna Regulador de presión

Nebulización

Gas Nitrógeno Nebulizador Tubo de calentamiento

Evaporación fase móvil

Gotitas de muestra

Detección Fuente de luz laser

Detector evaporativo de dispersión de luz (ELSDE, vaporativo Light Scattering Detector), ofrece una buena sensibilidad para analitos no volátiles a nivel de ng. El eluyente de la columna se nebuliza y después se evapora para formar partículas finas. El analito es entonces irradiada con un haz de láser y la radiación dispersada es detectada. Se analizan lípidos, azúcar y analitos de alto peso molecular. El ELSD se puede utilizar por el método del gradiente.

Detector Escape

Detector de conductividad, Se basan en cambios de conductividad de la fase móvil en presencia de moléculas de analito, formado por dos celdas asiladas que contiene dos electrodos a los que se aplica una diferencia de potencial, de manera que se mide la resistencia que ofrece la mezcla eluida. Mas utilizado en GC. Útil para la determinación de analitos iónicos. Su límite de detección esta entre 0,5 y 1 ng. es sensible a los cambios de temperatura y no puede emplearse en elución en gradiente. 12

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Detectores selectivos; Detector UV Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna cualidad propia del soluto, por ejemplo el detector UV, que producirá una señal proporcional a la absorbancia por el soluto a una longitud de onda dada. Otro, detector de fluorescencia, empleado para la detección de solutos con fluorescencia natural o conferida por reacción (derivatización) con un reactivo fluorogénico.

Es el detector más empleado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal, y permite detectar analitos en el orden de los ng. No es destructivo y puede emplearse con gradientes de solventes. En general permiten cambiar el volumen de su celda, típicamente con volúmenes de 1 a 12 µL.

El detector UV opera en el rango 190 a 350 nm, y en algunos equipos se puede extender a la zona del visible del espectro (350 a 700 nm) recibiendo así el nombre de detector UV Visible.

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Detectores selectivos; Detector UV Detector de onda fija o fotométrico

Este detector opera a longitudes de onda prefijadas (254Hg, 214 Zn, 229Cd), suelen emplearse filtros que permiten trabajar a 313, 334, 365 y con filtros de óxidos de fósforo a 280 nm. Estos filtros, al ser irradiados con la lámpara de mercurio emiten a estas longitudes de onda.

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Detectores selectivos; Detector UV Detector de onda variable o espectrofotométrico Este detector es simplemente un espectrofotómetro, en el cual se reemplaza el compartimiento de cubetas por una celda de flujo. Emplea una lámpara de emisión contínua (Deuterio o Xenón). La luz se enfoca en un monocromador, habitualmente una red de difracción, y la luz monocromática escogida se dirige a la celda y de allí al fotomultiplicador. Los detectores UV, VIS, y PDA se clasifican como detectores de absorbancia. Proporcionan una buena sensibilidad para que compuestos que absorbe la luz a nivel ~ pg. Detectores UV y VIS visualizan el resultado obtenido en dos dimensiones (intensidad de la luz y el tiempo), pero PDA añade la tercera dimensión (longitud de onda).

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Análisis de compuestos que presenten diferente longitud de maxima absorción y tiempos de retención,.

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This paper describes the development and validation of a simple and efficient bioanalytical procedure for simultaneous determination of alprazolam, clonazepam, diazepam in human serum samples using high performance liquid chromatography with photodiode-array detection, regarding a fast elution methodology in 4 min

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Detectores selectivos; Detector UV Selección de una celda de flujo

Evite el uso de soluciones alcalinas con pH > 9.5 que pueden atacar el cuarzo y perjudicar el rendimiento óptico. Los solventes acuosos permiten el crecimiento de algas. Cuando deje el HPLC sin funcionar, bombee fase móvil con al menos 5-10% de solvente orgánico (por ejemplo: acetonitrilo o metanol ). Si va a estar largo tiempo sin usar la celda de flujo o va a transportar el equipo, dejarla con Isopropanol. Utilice la celda de flujo más grande para obtener el

Respete los límites de presión dela las celdas de mejor límite de detección. Utilice celda de flujo flujo. más pequeña para obtener la mejor resolución de los picos.

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Detectores selectivos; Detector UV y fluorescencia Detector de ordenamiento o arreglo de fotodiodos, PDA

aberración cromática y un doblete acromático

En los dispositivos "convencionales", la red de difracción se ubica antes de la celda, la que recibe la luz monocromática seleccionada. En el detector PDA se emplea un sistema óptico invertido: la celda se ilumina con luz "blanca" y la luz emergente de la celda llega a la red de difracción y de allí hacia el elemento fotosensible. En lugar de una fotocélula se emplea un conjunto de fotocélulas o fotodiodos montados en un chip de silicio. De esta forma, se consigue medir todo el espectro de absorción del eluato en tiempo real. Monocromador de excitación

El detector de fluorescencia. se utiliza para el análisis de sustancias con fluorescencia "natural" o por derivatización con un reactivo fluorogénico. Presenta una alta sensibilidad y selectividad. Se utilizan dos longitudes de onda, una de excitación y otra de emisión. Al excitar la muestra a una longitud de onda varios componentes de la muestra podrían absorber energía, pero pocos emitirán a la longitud de onda elegida.

Monocromador de emisión

Fotomultiplacador de control Rejilla Lámpara de Xenón

Modulador

Red de difracción

Rejilla Divisor de Haz

Red de difracción Fotomultiplacador

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Detectores selectivos; Detector electroquímico Detector electroquímico

Este tipo de detectores responden a analitos susceptibles de reducirse u oxidarse. Es un detector muy sensible, unas 1000 veces más sensible que el detector UV, y altamente selectivo. La selectividad se debe, a que detecta compuestos capaces de ser oxidados y reducidos, y a que puede disminuirse el número de esos compuestos detectados por una elección del potencial aplicado.

La cubeta de flujo admite varios electrodos de referencia. Varios modos de detección se pueden usar, incluidos los modos de corriente continua, amperométrico pulsante y de barrido 12

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Detectores selectivos; Detector electroquímico Este detector emplea tres electrodos: el electrodo de trabajo, el de referencia y el auxiliar. En el electrodo de trabajo se mantiene el potencial a un valor seleccionado, respecto a un electrodo de referencia (Ag/AgCl); potencial fijo y estable, y se mide la corriente que pasa entre el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, en función del tiempo. Un potenciostato provee la diferencia de potencial entre el electrodo de trabajo y el auxiliar, que se monitorea por feedback desde el electrodo de referencia.

La desgasificación es esencial, la presencia de aire disuelto da lugar al gasto de potencial en la reducción del oxígeno, lo que crea señales ruidosas y baja sensibilidad.

El electrodo de carbón es compatible con solventes orgánicos, como fases móviles se emplean buffers (ya que deben ser conductoras), en general de fosfatos, de concentración menor a 0.02M para permitir el empleo de modificadores orgánicos (metanol, acetonitrilo, THF). 12

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Espectrometría de masas Ionización Sistema de espectrometría de masas

Electrospray ionization (ESI)

Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)

Fuentes de ionización

HPLC

Ionización por impacto electrónico Ionización química Fuente de bombardeo con átomos rápidos Desorción con láser Ionización a presión atmosférica: Electronebulización asistida con un gas: electrospray Ionización química a presión atmosférica Fotoionización a presión atmosférica

Atmospheric pressure photoionization (APPI)

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Espectrometría de masas Ionización Sistema de espectrometría de masas

Electrospray ionization (ESI) La fase móvil con el analito se nebulizan a un elevado voltaje asistidos con una corriente coaxial de N2 generando un fino aerosol, con formación de microgotas altamente cargadas (la solución ya contiene iones) A medida que el solvente se evapora, la densidad de carga en las gotas aumenta y al llegar al límite Rayleigh la gota sufre explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas. Los iones libres de solvente (desolvatados) se mueven hacia el analizador de masa.

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Espectrometría de masas Ionización

Sistema de espectrometría de masas

Atmospheric pressure chemical ionization (APCI)

Atmospheric pressure chemical ionization (APCI) La fase móvil y el analito se nebulizan (dispersan en pequeñas gotas) y vaporizan a elevada temperatura, y entran en la región corona (entre la aguja y el capilar). Las moléculas de fase móvil se ionizan en la región corona por electrones provenientes de una descarga eléctrica, transformándose en iones gaseosos reactivos (solvente cargado). Estos iones reactivos (iones formados de la fase móvil) reaccionan con las moléculas de analito, ionizándolas Reacciones de ionización positiva negativa

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Espectrometría de masas Ionización

Sistema de espectrometría de masas

Atmospheric pressure photoionization (APPI) El solvente y la muestra se nebulizan y son completamente vaporizados por calefacción. La ionización del solvente y la muestra ocurre por bombardeo con fotones a partir de una lámpara UV. Mecanismos de ionización por APPI

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Espectrometría de masas Ionización

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Espectrometría de masas Analizador de masas Sistema de espectrometría de masas

Los analizadores de triple cuadrupolo (QqQ) que operan en monitoreo de reacciones múltiples (MRM) se utilizan mayormente para la cuantificación de analitos. En el modo MRM, el primer cuadrupolo filtra un ión precursor específico; luego el segundo, la celda de colisión, genera fragmentos (iones producto); finalmente, éstos se filtran en el tercer cuadrupolo

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El cuadrupolo, se compone de 4 barras alargadas en formación cuadrada, conectadas eléctricamente entre sí en pares opuestos. A dichos pares (polos) se les aplica una tensión de radiofrecuencia y voltaje variable que sintoniza con un determinado ion. Cuando existe sintonía entre el ion que está pasando por ellas y la frecuencia aplicada, dicho ion continúa su camino desviándose todos los demás no sintonizados fuera del cuadrupolo y de esta manera no impactan en el detector.

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Analizador de tiempo de vuelo (TOF), El TOF es el analizador que más comúnmente se acopla a la fuente MALDI, la determinación de la masa en una región de alto vacío se realiza mediante una medida muy precisa del período de tiempo desde la celeración de los iones en la fuente (source) hasta que impactan con el detector.

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Analizador de trampa iónica (ITD), Es un dispositivo formado por tres electrodos, el sistema tiene el mismo fundamento que el analizador de cuadrupolo. Se aplican, simultáneamente, una corriente continua y un potencial de radiofrecuencia, de tal forma que los iones generados quedan confinados dentro del anillo toroidal. Los iones son expulsados de la cámara tras la aplicación de rampas de radiofrecuencia. Conforme aumenta el voltaje, aumenta la amplitud de su movimiento oscilatorio hasta ser expulsados.

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La espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FTICR-MS), los iones son atrapados en una celda, generalmente con estructura cúbica, compuesta por tres pares de placas. Un par sirve para mantener al ion atrapado, otro sirve para excitarlo, y el último realiza las labores de detección. Los átomos que se desean analizar se introducen en el interior de esta celda, y un haz de electrones provoca su ionización. Estos adquieren un movimiento circular ciclotrónico, causado por un poderoso campo magnético. La frecuencia de este movimiento es característica, y depende de la masa del ion y de la intensidad del campo.

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Espectrometría de masas Modos de adquisición de la señal Modo SCAN: consiste en hacer barridos entre dos masas para tener una información total del contenido de la muestra a analizar. Es el modo a emplear en análisis cualitativo para la identificación de compuestos por búsqueda en biblioteca de espectros. También puede utilizarse para análisis cuantitativos.

MSD* es un detector universal

Sensibilidad media cuando se trabaja con el TIC

En modo SCAN Muy selectivo y con buena sensibilidad cuando se trabaja con iones extraídos EIC.

*detector selectivo de masas

TIC (Total Ion Chromatogram): cromatograma correspondiente a la suma de abundancias a todas las masas adquiridas. Menor sensibilidad.. Figura 3 El cromatograma de iones totales (TIC) de LC-MS y el cromatograma de iones electivos (EIC) de la solución de muestras de tabaco curado por combustión en modo iones positivos. EIC (Extracted Ion Chromatogram): cromatograma correspondiente a una determinada masa (extraída del bárrido). Mayor sensibilidad..

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Espectrometría de masas Modos de adquisición de la señal Modo SIM: consiste en una monitorización selectiva de iones característicos de los compuestos presentes en la muestra. En modo SIM el MSD es un detector muy sensible y muy selectivo. Es el modo a emplear para análisis cuantitativo de trazas de compuestos conocidos. MSD* es un detector muy select. y senc. En modo SIM

La comparación de las respuestas de los iones (cualificadores), el patrón confirman la identificación del compuesto. La sensibilidad se incrementa con la reducción del nº de masas seleccionado y la selectividad con el aumento de la masa monitorizada. La modalidad SIM con cuadrupolo proporciona, especialmente a nivel de trazas, una mejor reproducibilidad cuantitativa que el modo SCAN

Espectros de masas en modo SIM de OPP. Muestra de AEL (a); espectro de patrón de OPP guardado en biblioteca (b)

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Espectrometría de masas Modos de adquisición de la señal

Modo SRM El control de reacción seleccionado es un método usado en espectrometría de masas en tándem en el que se selecciona un ión de una masa particular en la primera etapa de un espectrómetro de masas en tándem y se selecciona un producto iónico de una reacción de fragmentación del ión precursor en la segunda Espectrometría de masas para su detección.

Tenemos 3 péptidos entrando en el masas. El péptido A de interes, se selecciona esa masa en la primera fase (MS1). Con esto ya nos quitamos el péptido C, sin embargo, tenemos al péptido B que nos daría “ruido” en la medición de nuestra proteína. Para ello pasamos los péptidos por la celda de colisión y de los fragmentos generados solamente seleccionamos en una segunda fase (MS2) aquellos que provengan de nuestro péptido de interés A.

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Q1 Quadrupole

Ion Source

Q2 Collision Cell

Q3 Quadrupole

Ion Optics

Detector

Scan, SIM, or ion guide

Scan Mode Q1 Scan Q3 Scan Product ion scan Precursor ion scan Neutral loss scan

CID or ion guide

Scan, SIM, or ion guide

Q1 Scan Ion guide

Q2 Ion guide Ion guide

Q3 Ion guide Scan

SIM

Fragment

Scan

Scan

Fragment

SIM

Scan

Fragment

Scan

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■Q3 Scan (more common)

Q1:Pass all ions

Q2:Pass all ions

Q3:Scan

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Q3:SIM

Q1:Scan Q2:CID

• Q1 : modo scan

• Q2 fragmenta los iones usando el gas y la energía de colisión • Q3 operata en modo SIM para seleccionar una específica m/z generada de todos los precursores • Elucidación de la estructura

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Espectrometría de masas Detectores Detector de copa de Farada; Consiste en un simple electrodo, normalmente en forma de copa o caja, que recibe el impacto de los iones a detectar. Los iones se neutralizan por transferencia de electrones, y la señal se mide como una corriente analógica igual o superior a la corriente iónica original, dependiendo de la forma del electrodo. Es un detector de baja sensibilidad y gran sencillez.

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Multiplicador de electrones secundarios; Son los detectores más utilizados en espectrometría de masas, es el multiplicador de electrones de dínodos. El cátodo y los sucesivos dínodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de electrones al ser alcanzadas por iones o electrones de elevada energía. El ión a detectar choca con el primer dínodo, provocando la emisión de un elevado número de electrones, que van a incidir sobre el segundo dínodo. El proceso de multiplicación se repite sucesivamente en los demás dínodos, obteniéndose al final del sistema una amplificación de señal del orden de 106 a 108. Es un detector mucho más sensible que el de copa Faraday.

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Detector "Channeltron" Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en espectrometría de masas para uso general. Es similar al multiplicador de electrones clásico, con la principal diferencia de que no tiene múltiples dínodos discretos, sino que está formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces terminado en forma de espiral o caracol, cuyo interior está recubierto por un óxido de plomo semiconductor de composición y características especiales.

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Sistema de toma y procesamiento de datos

Computador e impresora

El resultado del ensayo cromatográfico es un gráfico o cromatograma, de cuya interpretación pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas. Una computadora, permite con el software apropiado tanto el registro gráfico del cromatograma, como los cálculos apropiados, la manipulación de datos, el almacenamiento de ensayos, la generación de reportes e incluso el manejo global de varios cromatógrafos.

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Disolventes La fase móvil en HPLC cumple un rol fundamental, ya que puede por sí misma modificar completamente la selectividad de las separaciones en fase normal y es, a la vez, el verdadero "motor" de las separaciones en fase reversa, es la variable del sistema que permite mayor variación, dando esos pequeños retoques necesarios para lograr una perfecta separación. En HPLC es posible lograr un número muy grande de diferentes separaciones con una columna, tan sólo variando la composición de la fase móvil. Propiedades de los solventes

Un solvente apropiado para HPLC debe cumplir con algunos requisitos, entre los cuales podemos destacar los siguientes: Alto poder solubilizante

Baja reactividad

Compatibilidad con el detector

Alto punto de ebullición

Baja viscosidad

Alto grado de pureza

Seguridad 12

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Disolventes Poder solubilizante Es conveniente que el solvente de disolución de la muestra sea la misma fase móvil. De no ser así, debe tenerse en cuenta tanto la miscibilidad entre el solventes, como la posible precipitación de componentes de la muestra. Miscibilidad; se refiere a la propiedad de los líquidos para mezclarse en cualquier proporción, formando una fase homogénea. La precipitación se da por una reacción química, por evaporación del solvente, por enfriamiento o por cambio de polaridad del disolvente.

Los compuestos menos solubles precipitan en la cabeza de la columna, lo que genera un aumento de la presión luego de varias inyecciones, la aparición de picos extraños al cromatograma verdadero (impurezas retenidas). Si la precipitación se da en un sector central de la columna, y se interrumpe el caudal del solvente, o no puede restablecerse, la columna no podrá ser lavada ni recuperada.

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Disolventes Poder solubilizante

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Disolventes Poder solubilizante

Se muestran varios solventes “misibles universales”, como el THF miscible con la mayoría de disolventes. El IPA es una elección muy popular como solvente intermedio cuando hay cambio de eluyentes de fase reversa a fase normal y viceversa.

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Disolventes; Propiedades de los solventes Efecto de la fuerza del disolvente Los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, se les denomina disolventes “fuertes”. Para revelar cuantitativamente la polaridad de los disolventes se han desarrollado varios índices (índice de polaridad, parámetro de solubilidad, la fuerza eluotrópica). Índice de polaridad; se basa en las medidas de solubilidad para la sustancia en cuestión en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo débil), nitrometano (un aceptor de protones de dipolo intenso) y etanol (un donador de protones de dipolo intenso). (Snyder, 1978). Parámetro de solubilidad; es una medida de las fuerzas entre moléculas o, de la presión interna de una substancia. (Hildebrand, 1962). Fuerza eluotrópica; Este parámetro define la energía de adsorción de cada disolvente por unidad de superficie de sílice respecto al valor del pentano, que es igual a “zero”. *donde, t1r y tnr son los tiempo de retención del primero y del ultimo compuesto, tg es el tiempo de gradiente.

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Si los disolventes son miscibles, se pueden hacer combinaciones binarias, ternarias o cuaternarias variando las proporciones.

En cromatografía en “fase reversa”, la fuerza de arrastre de la fase móvil es menor cuanto mayor sea el valor de εo. Reglas generales para las operaciones en gradiente a) El empleo de gradiente se justifica cuando se trata de mezclas con un amplio rango de polaridad. b) Se hace un gradiente (entre el 5% y el 100% de disolvente fuerte, en 40-60 minutos), para decidir si se utiliza una elución isocrática o en gradiente. • •

Si [(t1r-tnr)/tg] > 0,25, utilizar elución en gradiente. Si [(t1r-tnr)/tg] < 0,25, utilizar elución isocrática.

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Disolventes; Propiedades de los solventes Reactividad Los solventes con un elevado grado de reactividad no se utilizan en HPLC, ya que pueden reaccionar con la muestra (modificación), la fase estacionaria (alteración), o los componentes del equipo cromatográfico (oxido/reducción). Adición nucleofílica

FM

FE

Compatibilidad con el detector utilizado El detector de HPLC más difundido es el espectrofotométrico UV-Vis, es habitual elegir un solvente "transparente" a la longitud de onda de trabajo. UV 400-200 y Vis 400-700 nm 12

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Disolventes; Propiedades de los solventes Punto de ebullición Si el solvente tiene bajo punto de ebullición, su volatilidad es alta y la composición de la fase móvil varia durante la corrida, da lugar a la formación de burbujas, irregularidades del caudal y atascamiento de pistones. Un alto punto de ebullición se correlaciona, con alta viscosidad, alta presión y baja eficiencia de separación. En general, se prefieren los solventes de punto de ebullición intermedio. Viscosidad

Con solventes viscosos, la eficiencia de la separación es menor porque se dificulta la transferencia de masa del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria, y aumenta la presión. p= 2.1 f L dp2 D2

P f L dp D

Presión (Atm) obtiene con agua a un caudal de 1 mL/min Factor que vale 1000 para columnas de acero Longitud de la columna (cm) Tamaño de las partículas expresada en µm El diámetro interno de la columna medido en mm. 12

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Disolventes y aditivos de “fase reversa” Disolventes de “fase reversa” Las fases móviles de fase reversa están constituidas por mezclas de solventes polares, en general agua, y un modificador orgánico (metanol, acetonitrilo, THF), con o sin el agregado de aditivos (sales inorgánicas o reactivos de apareamiento iónico). El agua; es el solvente más utilizado en HPLC. El agua destilada y desionizada presenta sustancias orgánicas de tipo ftalatos, cloraminas, trihalometanos, etc., que no se eliminan y que actúan como “recubrimientos líquidos" de la columna, modificando su selectividad.

Evaluación de la calidad del agua para cromatografía, (C18) a 254 nm

15 minutos (MeOH)

Algunos métodos de purificación son destilación doble con permanganato de potasio o pasaje a través de columnas o cartuchos (copolímero de estireno y divinilbenceno, C18). El metanol es el modificador orgánico más utilizado, en mezclas con agua o buffers, se prefiere por su poder disolvente de sales. El acetonitrilo tiene una selectividad muy diferente al metanol y constituye, la primer alternativa ensayada cuando se busca cambiar. Almacenar en la oscuridad y bien cerrado es muy higroscópico. 12

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El tetrahidrofurano, es un solvente que tiende a formar rápidamente peróxidos, por lo cual se lo suele comercializar con antioxidantes, no debe utilizarse con el detector UV. El THF grado HPLC no contiene estabilizantes, se recomienda adquirir envases pequeños y confirmar su estado de pureza.. El dioxano tiene una selectividad semejante al tetrahidrofurano, pero su alta viscosidad limita su uso en en HPLC, salvo como aditivo en pequeñas proporciones. Hoy en día, los nuevos equipos funcionan con presiones más altas (4x107 Pa, 6000 psi) y solventes de alta pureza son disponibles. Por lo tanto, algunas fases móviles menos comunes merecen nueva investigación. Entre los disolventes disponibles con alta pureza y bajo absorbancia en UV-VIS, esta el etanol, un disolvente que es mucho menos tóxico que el metanol y acetonitrilo. Es un modificador de fase móvil prometedor para el uso rutinario de laboratorio, especialmente a temperaturas altas, donde la viscosidad de la fase móvil es menor.

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Disolventes y aditivos de “fase reversa” Aditivos de “fase reversa” Numerosos métodos cromatográficos requieren el uso de sales en la fase móvil, generalmente para el control y regulación del pH o de la fuerza iónica; requieren alta pureza (Porapak Q o C18 o carbón activado.

Los fosfatos son muy usados en cromatografía de fase reversa debido a su baja absorción UV. Los buffers de acetato o de citrato se utilizan menos. El primero porque presenta una alta absorción al UV y el segundo porque forma complejos con la sílice de las columnas reduciendo su vida útil.

No se recomienda el uso de sales de haluros, formiatos y sus ácidos ya que atacan al acero inoxidable (cambiar por titanio y PTFE).

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Disolventes y aditivos de “fase reversa” Control del pH; Cuando un ácido esta 2 unidades de pH por encima o por debajo de su pKa, estará > 99% ionizado o no ionizado, respectivamente. Las bases son ionizadas por debajo de su pKa y no ionizados por encima de su pKa. La forma no ionizada será menos polar (más hidrofóbica), por lo tanto, a pH bajo, los ácidos serán más retenidos, mientras que bases serán más retenidos a pH alto. Las aminas se utilizan habitualmente para reducir el tailing (asimetría de pico) de los picos de sustancias de carácter básico. Las alquilaminas de uso más común son la trietilamina, etilamina, dietilamina y dibutilamina, en bajas concentraciones (1 - 20 mM).

Los ácidos más utilizados son el acético y el fosfórico. Se los emplea generalmente para controlar el pH en RPLC. Los reactivos de apareamiento iónico, empleados para el análisis de sustancias orgánicas iónicas o ionizables. Básicamente, existen dos tipos de reactivos de apareamiento iónico: las sales de tetraalquilamonio empleadas para el análisis de solutos ácidos y los alquilsulfonatos, para los solutos básicos. 12

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No ionizada

No ionizada

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pH de trabajo; Influencia del pH

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pH de trabajo; Influencia del pH

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pH de trabajo; Influencia del pH

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pH de trabajo; Influencia del pH

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pH de trabajo; Influencia del pH

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Columnas; Criterios de Selección pH de trabajo; Limitaciones

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pH de trabajo; Limitaciones

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pH de trabajo; Limitaciones

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pH de trabajo; Limitaciones

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Disolventes de “fase normal” En cromatografía de fase normal, donde se emplean solventes no polares, el problema más frecuente es la desactivación de la columna de sílice o alúmina por adsorción de agua. Para eliminar el agua de los solventes, se puede utilizar un desecante como el sulfato de sodio anhidro, la alúmina básica o tamices moleculares de 4 Á. Los éteres etílico, propílico e isopropílico tienen una alta presión de vapor, y son altamente inflamables y susceptibles de formar peróxidos, por ello su uso es muy limitado en HPLC. Los hidrocarburos halogenados todos los compuestos halogenados pueden contener trazas de ácido clorhídrico o bromhídrico, muy reactivos frente al acero inoxidable. • El cloruro de metileno es uno de los hidrocarburos halogenados más estables. Su degradación térmica se produce a temperaturas mayores a los 120 oC con producción de ácido clorhídrico y trazas de fosgeno. • El cloroformo se puede descomponer a la luz, en presencia o no de aire, formando fosgeno y ácido clorhídrico. En NP la presencia del etanol (estabilizante) modifica la polaridad y selectividad de la fase móvil, por lo que los cromatogramas obtenidos utilizando cloroformo con o sin estabilizador pueden diferir. • El tetracloruro de carbono no se utiliza en HPLC, dado que es muy sensible a la ruptura oxidativa por exposición al aire, humedad o luz y es un solvente tóxico. • El 1,1,2-tricloro-l,2,2-trifluoretano (FC-113) Este solvente se caracteriza por su baja toxicidad, alto grado de pureza y buena transparencia UV (corte a 231 nm) con una fuerza de elución comparable a la del n-hexano 12

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Los hidrocarburos alifáticos son solventes muy transparentes a bajas longitudes de onda y poco viscosos. Debido a estas propiedades son especialmente adecuados para trabajar en HPLC. Desafortunadamente, suelen contener trazas de olefinas o benceno los que dificultan su empleo por debajo de los 260 nm.

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Disolventes; Preparación de las fases móviles Preparación de las fases móviles Naturalmente, el trabajar con solventes de alto grado de pureza, implica también el empleo de materiales volumétricos muy limpios. Un factor a tener en cuenta es la posible contracción de volumen, que se produce al mezclar solventes muy polares (Metanol-agua, 98 mL, no usar probeta).

Filtración La filtración de las fases móviles se considera como parte de un tratamiento preventivo para cuidar el adecuado funcionamiento del equipo de HPLC. El empleo de guardacolumnas, altamente recomendado, constituye un filtro final previo a la columna. La filtración se efectúa por medio de membranas de 0.45 ó 0.22 µm de porosidad en equipos de filtración adecuados y es útil para eliminar tanto las partículas como las bacterias. Se recomienda descartar los primeros mililitros del filtrado. Las soluciones a inyectar también deben filtrarse, idealmente a través de membranas semejantes a las empleadas para la fase móvil, si la cantidad de muestra es muy pequeña, se puede reemplazar por centrifugación. 12

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Disolventes; Preparación de las fases móviles Desgasificación Los gases disueltos en la fase móvil pueden producir varios inconvenientes, entre ellos: liberación de burbujas en el cabezal de la bomba, el caudal es irregular, y se producen variaciones en la línea de base y en los tiempos de retención. formación de burbujas en la celda del detector, en este caso, se producen oscilaciones en la línea de base y aparición de picos espurios por descompresión. pérdida de sensibilidad en los detectores de fluorescencia, el oxígeno molecular contribuye al decaimiento de la eficiencia fluorescente de una molécula. alta corriente residual en “detectores electroquímicos”, trabajando en forma reductiva, el oxígeno disuelto consume parte del potencial. oxidación de analitos, la presencia del oxígeno puede oxidar ciertos analitos durante la corrida cromatográfica. aumento en la línea de base de los detectores UV, la presencia de oxígeno en la fase móvil puede producir un aumento de la línea de base en los detectores UV.

Absorbancia del metanol, a distintas longitudes de onda, saturado con los diferentes gases.

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Métodos de desgasificación La cantidad de gas disuelto en un líquido depende de tres factores: Temperatura (Si el proceso de disolución es exotérmico, a ↑ T < solubil.; si es endotérmico a ↑ T > solubil.), Presión (solubil. ∝ Pa) y la Afinidad. • Reflujo. Consiste en el calentamiento o la ebullición a reflujo de la fase móvil con la ayuda de agitación durante unos 15 minutos. • Burbujeo de un gas inerte. Se puede realizar en forma continua o por cortos períodos de tiempo. Se realiza a través de una pieza de acero inoxidable sinterizado ("buzo'') con diámetro de poro de 2 a 10 µm, ya un caudal de unos 80-100 mL/min. • Ultrasonido. El ultrasonido es una onda electromagnética, producida por la propagación de un choque mecánico generado por un cristal piezoeléctrico. Genera ondas alternas de compresión-descompresión, dando lugar a la formación e implosión de micro-burbujas (cavitación). • Vacío. Es el método más frecuente, si se prepara fase móvil" para más de un día, debe filtrarse y desgasificarse a diario.

Cavitación 12

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Mantener constante L / dp mientras se reduce el tamaño de partícula permite separaciones más rápidas mientras se mantiene la integridad de la separación

La relación L/dp es útil cuando se trata de determinar qué material de empaquetado (tamaño de partícula) y longitud de columna pueden ser necesarios para una aplicación dada.

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Cromatografía de Fase Ligada El Material de Relleno

El material de relIeno de una columna de BPC está constituido por partículas, definidas por una serie de características: • morfología • tamaño • porosidad • estructura química

Morfología, el material empleado puede adoptar básicamente dos formas, irregular o esférica, con un tamaño comprendido entre los 2 y 60 µm de diámetro.

Las columnas analíticas modernas se rellenan con partículas de entre 3 y 10 µm de diámetro.

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno La porosidad de la partícula es la relación entre el volumen interno de los poros y el volumen de la partícula. Básicamente, se habla de microporos cuando su diámetro es menor que 20 A, mesoporos cuando su diámetro está comprendido entre 20 y 500 A y macroporos cuando es mayor que 500A.

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno La porosidad es responsable de los fenómenos de exclusión y de la velocidad de transferencia de masa de soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria (término "C" de la ecuación de Van Deemter: H = A.u + B/u + C.u.

Gráfico de Van Deemter

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno El área superficial, parámetro que determina la capacidad de retención de la fase estacionaria, está compuesta por el área externa (superficial) de la partícula, con sus depresiones y prominencias, y por el área de las paredes internas de los poros. donde (p) es la densidad del sólido (aproximadamente 2 g/mL) y dp el diámetro de la partícula (Unger).

Una partícula de 10 µm tiene as de 0.3 m2/g.

Pd diámetro de partícula

Cuanto menor sea el tamaño de partícula, el área superficial se hace más grande, relativamente. Además cuanto mayor sea el número de poros, mayor será el área superficial.

Solo las moléculas que penetran en los poros participarán de los procesos separativos. 12

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Tipos de geles envasados El gel de sílice o silicagel empleado para cromatografía de adsorción es un sólido amorfo y poroso, de gran área superficial (30 a más de 500 m2/g), alto volumen de poro (0.4 - 1.2 m1/g) y un diámetro de poro uniforme y comprendido entre 60 y 300 A Puente de hidrogeno Hidroxilo libre partículas poros siloxanol vecinal

Químicamente, puede definirse como un óxido de silicio hidratado, de tipo (Si02.H20)n, en el cual sus átomos metálicos internos están ligados entre sí por átomos de oxígeno (puentes siloxano Si-a-Si) y los superficiales a grupos hidroxilo, constituyendo los grupos silanoles (SiOH). Estos silanoles pueden ser de tipo "libre", "vecinal" o "geminal" y son los responsables de la actividad superficial.

unión siloxano

siloxanol geminal

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Gel de polímero, en principio en HPLC, casi siempre se utiliza geles de sílice. Sin embargo, columnas a base de polímeros se están haciendo populares. Las columnas utilizan varios tipos de polímeros como, Poliestileno (copolímero de estireno-divinilbenceno) (2) polimetacrilato (3) Polihidroximetacrilato (4) alcohol polivinílico Otros gel, aparte de sílice y geles de polímeros, los geles utilizados incluyen sustancias naturales tales como celulosa, agarosa, dextrina, y quitosano, y miembros de cerámica tales como hidroxiapatita y zirconia. Sin embargo, el uso es muy limitado.

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno Preparación de la fase ligada (BP)

La mayor parte del material disponible comercialmente está formado por silicagel a la cual se ha unido un grupo funcional por unión covalente de tipo siloxano (Partícula-Si-O-R). Tipos de reacciones Tipo éster (Si-OR); por la baja estabilidad a la hidrólisis de la unión éster esta unión fracasó en LC. 1. Partícula-SiOH + R-OH  Partícula-Si-OR + H2O

Tipo amino (Si-NR2); Preparada por reacción de la silicagel con cloruro de tionilo y el producto de ésta reacción con una amina. Esta fase es más estable, pero sólo en el rango de pH entre 5 y 7. 2. Partícula-SiOH + SOCl2  Partícula-Si-Cl 3. Partícula-Si-Cl + HNR2  Partícula-Si-NR2 + H2O

Tipo Carbono (Si-CR3); Este tipo de BP, no tuvo difusión en LC., el orden de reacción 2. y seguida por una reacción con un Grignard (bromuro de naftil, bencil o alquil magnesio). Siloxano (Si-O-SiR3); Es la de mayor difusión (prácticamente total en rellenos de base sílica). Se sintetiza por reacción de los silanoles de la sílica con organo-n-halo-silanos (clorosilanos), que pueden ser (a) monofuncionales, (b) bifuncionales y (c) trifuncionales.

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno Reacciones Siloxano (Si-O-SiR3)

Alquil clorosilano

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Cromatografía de Fase Ligada; el Material de Relleno

Algunas de las rutas de síntesis de la fase ligada a silicagel, mostrando la unión de un organo-monoclorosilano a un silano libre

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En general, a mayor carga carbonada (CH2)n o a mayor lipofilicidad del sustituyente, corresponde mayor retención. Bondapak CN

Bondapak Fenil

Bondapak C18

Retención en tres columnas para una mezcla de (1) Fenilefrina, (2) Fenilpropanolamina, (3) Nafazolina (4) Clorfeniramina

Tipos de relleno

de fase ligada

IPC cromatografía por supresión iónica (pKa)

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Cromatografía en fase reversa Mecanismo de retención Se ha sugerido que el modo de interacción entre el soluto y la fase ligada puede ser de tres tipos, partición del soluto entre la fase móvil y una fase estacionaria líquida, adsorción sobre una fase estacionaria sólida, o bien un proceso mixto partición-adsorción. En RPLC,la fase estacionaria es no polar y la fase móvil es muy polar (en general mezcla de agua y un modificador orgánico, MeOH, AcN o THF) las únicas fuerzas de interacción posibles deberían ser las de Van der Waals y un aumento de entropía. La interacción entre moléculas de soluto y de solvente es mucho más débil que la interacción de las moléculas de solvente entre sí. Como consecuencia, el soluto es expulsado de la fase móvil y forzado a penetrar en la fase estacionaria, que actúa como receptor pasivo

Efecto solvófobo, las flechas indican las fuerzas que tienden a unir y las fuerzas que tienden a separar

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Cromatografía en fase reversa Triethanolamine

ε = 0,95

ε = 0,65

El soluto es expulsado de la fase móvil y forzado a penetrar en la fase estacionaria, que actúa como receptor pasivo. La magnitud de la interacción soluto-BP, será mayor cuanto mayor sea el tamaño del grupo apolar y consecuentemente, la superficie de contacto. Por el contrario, las funciones polares del soluto favorecerán la interacción con los solventes polares y reducirán la retención.

Cambio de la selectividad por variación del modificador orgánico. Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18

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Cromatografía en fase reversa Ordenar de acuerdo al orden de salida en la columna. Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18 MeOH – H2O (60-40)

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Cromatografía en fase reversa Ordenar de acuerdo al orden de salida en la columna. Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18 ACN – H2O (70-30)

MeOH – H2O (60-40)

Orden de salida de los compuestos

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Cromatografía en fase reversa Ordenar de acuerdo al orden de salida en la columna. Columna LiChroCART 125-4 con LiChrospher RP18

MeOH – H2O (60-40)

El mecanismo de separación en RP HPLC se basa en la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. La elución o el arrastre del soluto mediante la fase móvil, se inicia con un eluyente de elevada polaridad (fase A). Para lograr la desorción secuencial de los solutos unidos, se disminuye la polaridad de la fase móvil. Esto se hace mediante la adición gradual de solventes orgánicos a la fase móvil A, como son el metanol o el acetonitrilo (fase B), es la que presenta menor polaridad y tiene el mayor poder de elución. La fuerza del solvente está definida cuantitativamente por el parámetro εo.

Orden de salida de los compuestos

Salen en el mismo orden pero mas cerca los picos 12

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Cromatografía en fase reversa

Retención en función de la longitud de la cadena hidrocarbonada de la BP. Fase móvil: MeOH-H20 (80:20). La recta indica la longitud de cadena critica

La Cadena Hidrocarbonada, En RPLC, se observa que para igual carga de carbono, a mayor longitud de cadena corresponde mayor retención y para igual longitud de cadena alquílica, a mayor cobertura, mayor retención. 12

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Cromatografía en fase reversa RP Regular, A mayor polaridad del soluto, mayor predilección de éste por la fase móvil y menor tiempo de retención. Los solutos no polares tendrán comportamiento inverso. Control de la Ionización (Supresión Iónica), El término "control de la ionización" se prefiere a "supresión iónica", lo que se busca es controlar la separación, permitiendo (o impidiendo) la presencia de la forma no disociada del analito (pH Vs pKa) .

Formas de Cromatografía en Fase Reversa

Apareamiento Iónico, la fase móvil contiene un contraión a la del analito formando un complejo "neutro" que se transporta dentro de la columna. IPC permite la separación de solutos iónicos y no iónicos en un mismo cromatograma. Complejación con Iones Metálicos, La unión entre un metal (Ag,Cu, Cd, Ni, Zn) y el doble enlace (olefinas o isómeros geométricos) se produce por transferencia electrónica, entre el compuesto orgánico que actúa como donante y el metal, que funciona como aceptor de electrones. RP en Medio No Acuoso, la RP empleada con fase móvil de baja polaridad, sin agua agregada, tiene muchas veces la suficiente selectividad y poder de retención para permitir su resolución..

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Cromatografía en fase reversa Control de la Ionización (Supresión Iónica)

Apareamiento Iónico

Complejación con Iones Metálicos

RP en Medio No Acuoso

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Cromatografía en fase reversa Aplicaciones La cromatografía líquida en fase reversa es, como se ha indicado, la modalidad de mayor empleo en HPLC.

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Cromatografía Intercambio Iónico En la cromatografía de intercambio iónico (lEC), la fase estacionaria contiene grupos funcionales iónicos y retiene el soluto, de características iónicas pero de signo opuesto, intercambiándolo por un proceso reversible con iones de la fase móvil.

La retención se debe a dos procesos independientes, en primer lugar, a una reacción reversible entre el soluto y el grupo cargado de la fase estacionaria (intercambio iónico) y en segundo lugar, a una distribución del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria, semejante a la que ocurre en fase reversa.

Las especies ionizables, por su parte, corresponden a los ácidos y bases débiles y sus sales, que coexisten en su forma iónica y no iónica, en proporción determinada por el pH del medio de disolución.

"C", correspondiente a la distribución del analito entre la fase móvil y la fase estacionaria

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Cromatografía Intercambio Iónico En el pH correspondiente al pKa, la forma iónica y no iónica coexisten en igual proporción. Dos unidades de pH por encima del pKa, el ácido contendrá un 99 % de forma iónica y dos unidades por debajo del pKa, sólo el 1 % de la forma iónica. La mismo se cumple para una base débil.

Asociado 99%

2 unidades

Disociado 2 unidades

99%

Proporción de la forma iónica en función del pH para un ácido débil de pKa 5.0

La primer variable a ajustar en la IEC de compuestos ionizables es el pKa/b. La segunda variable está dada por la concentración del buffer y eventualmente una sal agregada. El catión o anión de igual carga a la del soluto compite con éste para la ocupación de los sitios activos de intercambio y la fuerza iónica modifica la posición de los equilibrios

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Cromatografía Intercambio Iónico Polímeros orgánicos, IEC describe varios tipos de polímeros, formados por reacción de ácido acrílico o metacrílico con poliaminas o con divinilbenceno, de epiclorhidrina con aminas, de formaldehido con fenol o con m-feniléndiamina. El mas empleado es, el copolímero EDVB.

Intercambiadores iónicos en IEC

Intercambiadores de Fase Ligada, Constituido por un soporte, silicagel, al cual se une un grupo ionogénico ácido o básico, fuerte o débil. Se producen partículas muy pequeñas de hasta 3 µm de diámetro, con un estrecho rango de distribución, áreas superficiales de más de 500 m2/g y diámetro de poro entre 60 y 250 Á. (grado de sustitución) Oxidos Inorgánicos, Todos los óxidos y sales insolubles son intercambiadores iónicos potenciales, sus propiedades anfotéricas están dadas por su pH isoeléctrico (pH con carga neta cero). Por encima del pI, el óxido tendrá carga negativa (intercambiador catiónico) y por debajo de ese pH tendrá carga positiva (intercambiador aniónico), se han empleado para la separación de iones en HPLC. Intercambiadores Peliculares, estos materiales están compuestos por una fina capa de material de intercambio que recubre un core inerte, generalmente de vidrio o micropartículas de sílica. El empleo actual de materiales peliculares está muy limitado, a la confección de guarda columnas.

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Cromatografía Intercambio Iónico Polímeros orgánicos EDVB

La principal ventaja de los polímeros orgánicos respecto de los de fase ligada reside en su amplio rango de pH de trabajo, entre 1 y 13. La principal desventaja, se debe los fenómenos de hinchamiento-compactación.

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Cromatografía Intercambio Iónico Materiales de relleno

SAX

WAX

SCX

WCX

strong o weak anion o cation exchanger

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Cromatografía Intercambio Iónico La fase móvil

Variables en Cromatografía de Intercambio iónico

La fase móvil en IEC es una solución acuosa de pH y fuerza iónica controlados por un buffer y puede contener cantidades moderadas (30%) de un modificador orgánico. Un aumento de la temperatura reduce la viscosidad de la fase móvil, lo que resulta en un aumento de la eficiencia. Sin embargo, debe manejarse con cuidado con rellenos de base sílica ya que su solubilidad aumenta a altas temperaturas, especialmente por efecto del pH y la fuerza iónica. Detector de Conductividad. Detector Espectrofotométrico (nitrito, nitrato, ioduro, iodato, bromuro) Detector Electroquímico

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Cromatografía Quiral La cromatografía quiral se puede dar de diferentes maneras, sin embargo las mas comunes son por complejos de inclusión o por afinidad especifica.

Complejos de Inclusión o Fases de Cavidad

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Cromatografía Quiral Afinidad Especifica o Intercambio de Ligandos Se utiliza una fase móvil que contenga un metal como por ejemplo Cu2+, para inmovilizar dicho metal y generar la interacción especifica que genera la separación de dos especies isómeras.

L-Prolina

Eluent : 8mM CuSO4 aq. Flow rate : 1.0mL/min Detector : UV(230nm) Column temp. : 50°C

Sample : DL-Aspartic acid 0.02%, 50μL 1. D-Aspartic acid 2. L-Aspartic acid

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Cromatografía de Exclusión Molecular Entre los métodos clásicos de cromatografía líquida: adsorción, partición, fase reversa, intercambio iónico y exclusión, la cromatografía de exclusión molecular (SEC por size exclusion chromatography) fue el último en ser desarrollado.

Según la naturaleza de los compuestos que se han de separar por SEC, esta metodología se clasifica en cromatografía de filtración por gel (GFC por gel filtration chromatography) empleado en proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o de permeación por gel (GPC por gel permeation chromatography) empleado en polímeros sintéticos y elastómeros; cauchos, plásticos, resinas.

Si bien la aplicación de la SEC al análisis de compuestos de bajo peso molecular no se encuentra demasiado difundida, es útil para la separación de compuestos siempre que los mismos tengan una diferencia de mínimo, 10% en sus pesos moleculares

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Cromatografía de Exclusión Molecular Entre los métodos clásicos de cromatografía líquida: adsorción, partición, fase reversa, intercambio iónico y exclusión, la cromatografía de exclusión molecular (SEC por size exclusion chromatography) fue el último en ser desarrollado.

Según la naturaleza de los compuestos que se han de separar por SEC, esta metodología se clasifica en cromatografía de filtración por gel (GFC por gel filtration chromatography) empleado en proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono o de permeación por gel (GPC por gel permeation chromatography) empleado en polímeros sintéticos y elastómeros; cauchos, plásticos, resinas.

Si bien la aplicación de la SEC al análisis de compuestos de bajo peso molecular no se encuentra demasiado difundida, es útil para la separación de compuestos siempre que los mismos tengan una diferencia de mínimo, 10% en sus pesos moleculares 12

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Cromatografía de Exclusión Molecular Por su parte, Screenivasan y col, utilizaron esta metodología para la separación de Aspirina de su producto de hidrólisis, el ácido salicílico, compuestos cuyos pesos moleculares difieren sólo en 28.05 unidades. La cromatografía de exclusión separara sustancias en base a su tamaño efectivo en solución. Como el tamaño efectivo de una molécula en solución y su peso molecular son parámetros proporcionales (en determinadas condiciones), esta modalidad cromatográfica suele utilizarse tanto para la determinación del peso molecular y como la distribución de pesos moleculares.

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Cromatografía de Exclusión Molecular Ventajas de la SEC Entre las ventajas de la SEC podemos enumerar las siguientes: •

Separación por dimensión molecular, válida no sólo para el análisis directo sino como método preliminar de fraccionamiento de muestras complejas, para su posterior estudio por otros métodos.

•

Picos angostos. Como el volumen de elución es pequeño, no mayor del volumen de exclusión, la dispersión es baja y la detectabilidad alta.

•

Tiempos de separación cortos y predecibles, pues toda la muestra eluye antes o en el volumen de exclusión.

•

Elución predecible, en base a su peso (dimensión) molecular.

•

No hay pérdida de muestra, ya que no existe interacción con la fase estacionaria.

•

No hay desactivación de la columna, pues en ella no se acumulan impurezas por fenómenos químicos de retención aunque puede, por supuesto, bloquearse mecánicamente con partículas si se inyectan muestras sin filtrar o que precipiten en contacto con la fase móvil, o bien sufrir disolución de lecho según la naturaleza de su matriz, tipo de solvente, condiciones operativas, etc).

Se denomina al volumen del efluente que corresponde al pico de la curva trazada para determinar el perfil de elusión.

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Desventajas de la SEC La SEC no está, sin embargo, libre de algunas desventajas, entre ellas: •

Limitada capacidad de picos, típicamente no más de 10 o 12, ya que todos deben eluir entre Vt y Vo.

•

Incapacidad de resolver muestras de peso (dimensión) molecular similar.

•

La resolución no puede manipularse. La elección de la fase móvil sólo tiene por objeto evitar la interacción muestra-fase estacionaria y no existe la "selectividad" disponible en otros métodos como variable de ajuste. El único modo de aumentar la resolución es el aumento de la longitud de la columna (o acople de varias columnas).

•

El efecto de la temperatura debe tomarse con cuidado, ya que influye sin duda sobre la dimensión de la molécula.

Volumen de permeación total Vt Volumen ínter-partículas Vo

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Cromatografía de Exclusión Molecular El volumen de retención de un compuesto determinado (VR) está dado por la suma del volumen entre las partículas, y el volumen de los poros accesible a un tamaño molecular determinado. Volumen íntra-partícula Vi, volumen disponible en los poros

Kd volumen de retención de un compuesto (VR)

Volumen ínter-partículas vo, volumen disponible, fuera de las partículas. Coeficiente de distribución del soluto en el gel Kd, Volumen de permeación total Vt

Si Kd = O, VR = Vo Comprende a las moléculas cuyo tamaño es mayor al de los poros del gel. Si Kd = 1, VR = Vo + Vi Comprende a las moléculas que eluyen en la zona de permeación total. Si O < Kd < 1, las sustancias se separan selectivamente en la columna cromatográfica. 12

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Cromatografía de Exclusión Molecular Geles Blandos, los dextranos son geles blandos que tienen muy baja resistencia mecánica y se emplean en columnas largas a muy bajas presiones y con caudales moderados, existen otros materiales como poliacrilamida, polisacáridos y agarosas, no pueden utilizarse en HPLC porque el caudal y la alta presión generada. Sephadex LH20 Y G25

La Fase Estacionaria

Geles Semirrígidos, geles del tipo semirrígido denominados también macroporosos, están constituidos por polímeros con un elevado grado de entrecruzamiento, son estables mecánicamente y poseen poros permanentes, a temperaturas elevadas pierden su resistencia mecánica. Geles Rígidos, Los materiales de relleno rígidos son materiales inorgánicos, típicamente vidrios porosos y sílica porosa que se asemejan más a vidrios que a geles. Estos materiales son estables a altas temperaturas, poseen una distribución de poros estrecha y bien definida y sus permeabilidades son independientes de la presión.

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Cromatografía de Exclusión Molecular

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Cromatografía de Exclusión Molecular

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Cromatografía de Exclusión Molecular

Las columnas clásicas de SEC tienen habitualmente 25 a 30 cm de longitud, 0,4 hasta 0.8 cm de diámetro interno, y se rellenan con partículas de 4 a 10 µm de diámetro.

La eficiencia de las columnas se mide en función del número de platos teóricos, Una columna de 10 µm de tamaño de partícula tiene una eficiencia mayor a 20.000 platos/m, mientras que una columna rellena con un gel blando, con un tamaño de partícula de 50 µm tiene una eficiencia de 1500 platos/m. (UPLC 110000platos/m)

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Cromatografía de Exclusión Molecular La fase móvil En SEC la resolución no depende de la naturaleza de la fase móvil sino de la eficiencia de la columna y de la pendiente de la curva de calibración. La fase móvil no es un simple vehículo inerte de los solutos disueltos sino que debe cumplir ciertos requisitos: debe ser un "buen" solvente para el polímero, tener capacidad de hinchar al gel, no presentar soluciones de polímero demasiado viscosas y evitar los fenómenos de retención secundaria. Las columnas de GFC presentan mayores problemas de adsorción de solutos al material de relleno. La sílice contiene grupos silanol, de naturaleza acídica, que pueden actuar como intercambiadores de cationes. La poliacrilamida y los dextranos por su parte presentan una pequeña cantidad de grupos carboxilo que pueden actuar de la misma forma. 12

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Cromatografía de Exclusión Molecular Cromatografía de Permeación por Geles La cromatografía de permeación por geles (GPC) se utiliza para el análisis de polímeros sintéticos y elastómeros y tiene su origen en el año 1964, se diferencia de la cromatografía de filtración por geles (GFC) sólo en el tipo de sustancias analizadas y en el vehículo empleado como fase móvil. En GPC la fase móvil por excelencia es el tetrahidrofurano debido a que resulta ser un buen disolvente de la mayoría de los plásticos. Existen algunos polímeros de alto peso molecular, poliolefinas (polietileno) y poliamidas (nylon), que no se disuelven a temperatura ambiente, pero lo hacen a mayor temperatura (100 – 150oC).

Análisis GPC de un copollmero de óxido2,6 polidimetilfenileno y poliestireno. Columna: PLGel 5 µm, 108 Å, y 104 Å, Fase móvil: THF, Caudal: 1 ml/min, Temp:40 oC, Detector: UV 254 nm.

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Cromatografía de Exclusión Molecular El volumen de inyección debe mantenerse dentro de ciertos límites para evitar el ensanchamiento de banda y la concentración de analito debe mantenerse baja para operar en la zona lineal de la isoterma de distribución

Los copolímeros fueron identificados con los códigos IxCyn, IxSyCzn y SxIyCzn donde los subíndices indican la proporción en peso de cada uno de los comonómeros en el bloque (determinada por 1H-RMN) y el superíndice, el peso molecular promedio en número en kg/mol de todo el copolímero (determinado por GPC ).

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Cromatografía de Exclusión Molecular Cromatografía de Filtración por Geles La cromatografía de filtración molecular (GFC), es una modalidad de la SEC que se ocupa de la separación de polímeros biológicos solubles en agua o en solventes polares (IR, UV).

Las columnas de GPC empleadas para el análisis de polímeros sintéticos no resisten los solventes polares por lo cual no pueden utilizarse como material de relleno para las columnas de la GFC; los materiales rígidos como la sílica poseen grupos silanol que causan adsorciones indeseadas y desnaturalizan los biopolímeros

50mM Sodium phosphate buffer(pH7.0) + 0.3M NaCl, 1.0mL/min, UV(220nm

La detección de péptidos y proteínas se efectúa a 210 nm (absorción de la unión peptídica) o a 280 nm (absorción de los grupos fenilalanina y triptofano presentes en la molécula). Se recomienda una fase móvil conteniendo un buffer de fosfatos pH 7.4 0.15 M, cloruro de sodio 1 M y 1 % de dodecilsulfato de sodio. 12

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Cromatografía de Exclusión Molecular Cálculo del Peso Molecular Peso Molecular y Distribución de Pesos Moleculares

Un polímero tiene un único valor de Mn, Mw o Mz, pero Mv varía con el solvente y la temperatura.

Mn es sensible a cambios en los pesos moleculares bajos

Un polímero está formado por unidades que se repiten en cadenas. La variabilidad en la longitud de la cadena de un polímero se genera en el proceso de producción, debido a variables termodinámicas y cinéticas. En este caso no es posible definir un peso molecular único y debe indicarse el peso molecular promedio y la distribución de pesos moleculares. La cromatografía de exclusión molecular es capaz de evaluar esa distribución y de determinar el peso molecular medio numérico (Mn), el peso molecular medio ponderal (Mw), el peso molecular medio de centrifugación (Mz) y la dispersidad o polidispersidad (D).

• • • • •

Mn, resulta de tomar el peso total de la muestra y dividirla por el número de moléculas contenida en ella. Mw, resulta de sumar las fracciones en peso de cada especie y multiplicarla por el peso molecular de la fracción. Mz, es sensible a las fracciones más pesadas de todas y puede obtenerse por GPC o por centrifugación. Mv, se refiere a la viscosidad del polímero. D, la dispersidad de un polímero es el cociente entre Mw y Mn, se relaciona con la desviación estándar de la distribución.

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Cromatografía de Exclusión Molecular Curvas de Calibración Calibración Simple Para determinar el peso molecular de una macromolécula (por ejemplo una proteína o un polímero de baja dispersión) basta con correlacionar el volumen de elución del máximo del pico de la sustancia desconocida con una curva de calibración construida con polímeros estándar de baja dispersidad y pesos moleculares conocidos. El peso molecular se determina por comparación del volumen ( o tiempo) de elución de las fracciones con los correspondientes a la curva de calibración.

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Cromatografía de Exclusión Molecular

Comparación de la eficacia de separación de dos columnas. Tres componentes debían ser separados. Cada columna proporciona la curva de calibración. La columna que tiene menor pendiente proporciona una mejor separación entre los tres componentes. 12

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Cromatografía de Exclusión Molecular Calibración Universal Grubisic y cops propusieron que el volumen hidrodinámico Vb de un polímero se relaciona con su viscosidad intrínseca en la “fase móvil” de HPLC, y que éste puede utilizarse para generar una curva de calibración universal para todos los polímeros. En general, se ha encontrado que esta calibración es útil para la mayor parte de los polímeros, excepto para el caso de electrolitos o materiales excesivamente ramificados, siempre que se pueda precisar con exactitud los valores de las constantes de Mark -Houwink Skurada, lo cual no siempre es posible en la práctica.

Otros métodos Existen otras modalidades para calcular el peso molecular de un polímero, algunos muy simples como los que multiplican el peso molecular referido al poliestireno por un factor Q para el cálculo del peso molecular real, y otros muy complejos como los que involucran la calibración con estándares polidispersos. El método del factor Q es sencillo y resulta bastante exacto para el análisis de poliolefinas utilizando poliestireno como estándar.

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Selección de columnas

Las diferentes compañías que suministran las columnas tiene en sus catálogos una guia para la mejor elección de la columna que Yo voy a requerir.

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Cromatografía; Preparación de las muestras La preparación de las muestras es una etapa decisiva en todo método de análisis en especial en la determinación de microcomponentes (trazas) y en los casos donde la muestra que rodea al analito es muy compleja, depende de muchos factores como ser •

Propiedades físicas y químicas del analito, el conocimiento de algunas de las características fisicoquímicas del analito es esencial en el diseño de un método para la preparación de las muestras. Es conveniente conocer su estructura química, peso molecular, solubilidad, propiedades ácido base (pKa) y respuesta frente al tipo de detector seleccionado.

•

Concentración de analito en la muestra, este factor tiene importancia decisiva. Para analitos en altas concentraciones en general se requieren preparaciones de muestras sencillas como la solubilización y filtración. Analitos en bajas concentraciones, por su parte, pueden requerir metodologías más elaboradas que involucren numerosas operaciones para lograr una solución cuya concentración sea "aceptable“.

•

Naturaleza de la matriz de la muestra, La remoción de los componentes de la matriz puede ser un paso crítico en los casos donde la concentración de analito en la muestra se detecta con dificultad o no se detecta.

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Cromatografía; Preparación de las muestras •

Forma en la que se presenta el analito en la muestra, en muestras de origen biológico el analito puede no encontrarse como tal sino unido a proteínas transportadoras (análisis de fármacos en suero o plasma), metabolizado como éster, amida o éter de los ácidos sulfúrico o glucurónico (análisis de diversas sustancias en orina) o metabolizado a otra sustancia diferente.

•

Compatibilidad de los medios de solubilización, Se requiere que la solución a inyectar sea compatible y miscible con la fase móvil. Es recomendable que el solvente de la muestra sea la misma fase móvil o, en su defecto, un solvente débil. Si se disuelve en un solvente fuerte, algunas sustancias pueden precipitar con las fases móviles acuosas, dar picos anchos. La clasificación de solventes “suaves” o “fuertes” para referirse a su poder disolvente sólo tiene sentido en función del material que se desea remover.

•

Tipo de detector y compatibilidad, La sensibilidad y selectividad del detector tienen un rol muy importante en el diseño de los métodos para la preparación de las muestras. En la selección de un medio para la solubilización del analito debe considerarse su compatibilidad con el detector a utilizar.

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Cromatografía; Preparación de las muestras

Metodologías convencionales

Tratamiento Previo, tanto para el tratamiento previo como para posteriores pasos de purificación pueden utilizarse las operaciones de la química analítica como: liofilización, evaporación, filtración, centrifugación, precipitación, y solubilización.

Desproteinización, las proteínas en las matrices biológicas deben eliminarse antes de inyectar la muestra en el HPLC para evitar que precipiten dentro del cromatógrafo. Se realiza con la adición de varios agentes, entre ellos: solventes orgánicos (acetona, metanol, acetonitrilo), sales, ácidos o cationes (túngstico, tricloroacético, perclorico, metafosforico; Hg2+, Cd2+, Fe3+, Cu2+y Zn2+), o bien por ultrafiltración. Extracción líquido-sólido, también denominada lixiviación, comprende la solubilización del analito presente en una muestra sólida previamente molida con un solvente adecuado (Soxhlet y SFE).

Extracción líquido-líquido, es la distribución (partición) de un analito entre dos líquidos inmiscibles. Las sustancias neutras de características no polares pueden extraerse desde sistemas acuosos a orgánicos directamente. Las sustancias con características ioniza bies requieren la supresión de su disociación modificando el valor del pH del medio. Filtración, tanto las muestras como los estándares a inyectar deben estar totalmente libres de partículas en suspensión. Las partículas presentes en las muestras pueden rayar los sellos del inyector, o bloquear algún componente del equipo cromatográfico especialmente tuberías o filtros de columnas o guardacolumnas. 12

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Cromatografía; Preparación de las muestras Extracción en Fase Sólida La extracción en fase sólida se lleva a cabo en pequeñas columnas o cartuchos de plástico (usualmente polipropileno). Estas columnas se rellenan con cantidades variables (desde 100 hasta 500 mg) de distintos materiales. El relleno de las columnas es de mayor granulometría (típicamente de 40 µm) y con una pequeña distribución de tamaños de partícula. Los materiales para el relleno comprenden desde adsorbentes polares como la sílica, hasta poco polares como la sílica unida a los grupos C18, también por materiales de intercambio iónico y las resinas Amberlite XAD-2, XAD-4, y XAD-7, el DVB y el Porapaq.

Columnas para concentrar compuestos a nivel de trazas

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Cromatografía; Preparación de las muestras Derivatización La derivatización se refiere a la reacción química que se produce entre el analito y un reactivo determinado ya sea dentro o fuera del equipo cromatográfico. Si se efectúa antes de inyectar la muestra, la derivatización se denomina precolumna y los derivados se separan en la columna cromatográfica. También puede realizarse después de inyectar la muestra, en cuyo caso se denomina postcolumna.

Mejorar la detección, Esta es la causa por la que se producen derivatizaciones químicas en HPLC, muchos compuestos que no poseen grupos cromóforos o fluoróforos y no pueden ser detectados.

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Mejorar la selectividad, En este caso la derivatización se utiliza para separar compuestos que, de otra manera, o bien no se pueden separar o bien la separación resulta muy compleja. La derivatización para mejorar la selectividad es muy rara en HPLC (combinación de fases estacionaria y móvil), un caso especial se refiere a la separación de isómeros ópticos.

Derivatización de ácidos grasos

Derivatización de amino ácidos

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Cromatografía; Preparación de las muestras Reactores Para definir un método de análisis por derivatización post-columna de las muestras se debe conocer el tiempo para completar la reacción. En general no es necesario que la reacción alcance su punto máximo, y puede operarse sin dificultad con reacciones incompletas. Mezcladores Los mezcladores, como su nombre lo indica, tienen la función de mezclar el eluyente de la columna cromatográfica con el reactivo para la derivatización. Para efectuar la mezcla suele utilizarse una pieza en T.

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Cromatografía; Bases de la Separación

Cuando la muestra y la fase móvil son forzados a atravesar la fase estacionaria, entran en juego distintos tipos de interacción entre cada uno de estos componentes. Interacciones hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, interacciones dipolares y electrostáticas, son las responsables de la mayor o menor afinidad de cada uno de los componentes de la muestra por la fase móvil o la fase estacionaria.

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Cromatografía; Bases de la Separación El cromatograma comienza en el momento en que la solución en ensayo es inyectada. A partir de ese punto, las señales encontradas en el cromatograma pueden clasificarse como: Volumen de elución (Ve) es el volumen de fase móvil eluida entre la inyección y la elución de la concentración máxima del soluto. Volumen muerto (Vo) es el volumen total de solvente entre el punto de inyección y el de detección, exceptuando el correspondiente a las partículas de fase estacionaria (soluto que no se retenga en la fase estacionaria).

Línea de base: es la porción del cromatograma donde sólo se aprecia la elución de la fase móvil, sin señal debida al soluto. Tiempo de retención (tr) es el tiempo medido entre la inyección y la elución de la concentración máxima del sol uta enésimo (máxima señal). La distancia entre este máximo de la señal y la línea de base es la altura del pico (hn) en cuestión.

vo Línea de base

vb

vc

vd

tb

tc

td

ve te

to

Vr = tr(min) F(mL.min-1) 12

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Cromatografía; Bases de la Separación Velocidad lineal (u): es la velocidad a la cual la fase móvil se desplaza a través de la columna no es sólo función del caudal sino también de la sección interna de la misma. Coeficiente de partición o distribución (K) Relaciona la concentración de soluto en la fase estacionaria o móvil.

línea de base

Factor de retención (K´) mide la relación entre el tiempo que las moléculas del analito están en la fase estacionaria y el que están en la fase móvil.

Anchura del pico

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El valor de k' puede ajustarse modificando la fuerza de elución de la fase móvil; • en fase reversa, k' disminuye al aumentar la proporción del componente orgánico (MeOH, AcN, THF) y aumenta al aumentar la proporción de agua. • en fase normal, k' disminuye al aumentar la proporción de solvente polar y aumenta al aumentar la proporción del no polar. • en cromatografía de intercambio iónico, k' disminuye al aumentar la concentración del contraión (buffer o sal agregada), o la proporción de solvente orgánico. La variación del pH de la fase móvil puede aumentar o disminuir k' de acuerdo a las características ácido-base del analito.

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Cromatografía; Bases de la Separación Factor de separación (α): es el cociente entre los factores de capacidad (k') de un par de picos. Si no existe separación, α es igual a la unidad y su valor aumenta cuando aumenta la separación. La selectividad es una manera de medir la eficiencia de una separación cromatográfica.

Constante de Distribución

Factor de capacidad

Modificación del componente "activo" de la fase móvil (en fase reversa, MeOH por AcN o THF; en fase normal, cloroformo por cloruro de metileno o metil terc butil éter), modificación del pH de la fase móvil, empleo de aditivos (reactivos de apareamiento, complejantes, etc) y cambio de la fase estacionaria. • •

α > 2 se tiene una mala separación, son necesarios periodos largos para realizarla. Si 1< α