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Curso Básico de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) (High Performance Liquid Chromatography) (High Priced Liquid Chromatography!!!!) BUAP-CUV Sep.,12, 2008

Definición.

   Cromatografía  es  una  técnica  analítica    basada  en  la  separación  parcial  o  total    de  los  componentes  de  una  mezcla    como  consecuencia  de  su    migración  diferencial  en  un  sistema  dinámico  formado  por  una  fase estacionaria y una fase móvil. 

2

Proceso de separación cromatográfica

Fase móvil Mezcla

Fase  estacionaria

Inyección

3

Migración Separación de los componentes de una muestra

Elución

Etimología

El  botánico  ruso  Mikhail  Semyonovich  Tswett (1872-1920), es conocido como el  “padre  de  la  cromatografía”,  como  resultado  de  sus  experimentos  en  los  cuales usó columnas tipo gis “chalk” para  separar  pigmentos  extraídos  de  hojas.  Tswet  presentó  los  principios  básicos  de  su  método  de  separación  en  1902,  después  publicó  dos  artículos  en    1906  en  los  cuales  llamó  al  método 

cromatografía. 4

Clasificación De acuerdo a la naturaleza de la fase móvil, la  cromatografía se clasifica en :   CROMATOGRAFIA DE GASES (Gas)   CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS (Líquido)   En ambos casos , la fase  estacionaria se encuentra  contenida en una tubería llamada COLUMNA. 

5

Clasificación

Cromatografía GSC Empacada Capilar GLC Empacada Capilar

6

LSC Partición (Reparto) Exclusión por tamaño. Intercambio iónico.

Mecanismos de Separación Xm

S

PARTICIÓN

ADSORCION

EXCLUSIÓN

7

INTERCAMBIO IÓNICO

Aplicaciones Generales Clínica Polímeros

Bioquimica

Farmacéutica Alimentos y Bebidas Forense

Ambiental y Forestal 8

Agropecuaria

Aplicaciones Generales Insecticidas: carbamatos, organofosforados Fungicidas: benzimidazoles, carbamatos Herbicidas y reguladores del crecimiento: ureas, fenilureas, triazinas, glifosatos( diquat/paraquat)

Aflatoxinas: B1, B2, G1, G2 Micotoxinas: deoxinivalenol (DNO) Acidos Fenólicos, Carbohidratos Proteínas, Aminoácidos Antocianinas Vitaminas Liposolubles e Hidrosolubles Drogas de Abuso Antibióticos,Esteroides,Analgésicos

9

Sistema  Cromatográfico, BOMBA

FASE MÓVIL

COLUMNA

INYECTOR

DETECTOR 10

SISTEMA DE DATOS

Proceso de separación cromatográfica

11

Tiempo de Retención tR

t´r= trto

1 < κ ´ < 20 to= tiempo muerto tr= tiempo de retención absoluto 12

Factor de Capacidad

13

Resolución (R) •

Mide la separación entre dos picos

•

Considera la distancia y el ancho entre dos picos adyacentes

14

Resolución (R)

R = ___( tr2-tr1 )___ 1/2(W1 + W2) tr2 ,tr1 = tiempos de retención de ambos  picos W1,W2= anchos de pico en la base

15

Resolución (R)

Resolución vs Concentración. •Para columnas nuevas es recomendable que R> 1.5

16

Resolución (R) La curva Gaussiana representa la distribución estadistica resultante de las moléculas en el espacio que ocupan

17

Resolución (R) Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

La eficiencia de la columna es una función de la longitud de la columna y del tamaño y uniformidad de las partículas 18

Resolución (R) Existen tres fuentes que contribuyen al ensanchamiento de bandas:

19

Eficiencia (N) [número de platos teóricos]

• Mide los efectos de ensanchamiento de pico que se presentan cuando un componente migra a través de la columna

20

Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)

•

La HETP relaciona la longitud de la columna con el número de platos teóricos.

•

21

Valores de HETP más pequeños -> columna más eficiente.

Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP)

•

La Ecuación de Van Deemter es una  expresión teorica que define la eficiencia de la  columna.  Es la suma de los tres elementos que  contribuyen al ensanchamiento de las bandas

22

Altura Equivalente de un Plato Teórico (HETP) A = Difusión de Eddy B = Difusión Longitudinal C = Resistencia a la  transferencia de masa µ = Flujo de fase móvil

23

Eficiencia

(N, Número de Platos teóricos )

•   Número de veces que un      

componente  presenta  un estado  de equilibrio  entre las  dos fases

•   Se expresa cuantitativamente  como el Número de Platos Teóricos

24

Selectividad, α

•   Selectividad es 

la medida de que  una columna pueda  distinguir entre dos  componentes

Se ajusta al hacer  cambios de fase  móvil y fase  estacionaria

25

Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

26

Resolución vs Selectividad, Capacidad y Eficiencia

•  Rs = 0.8

•  N = 7000 •  α = 2.1

27

• .κ ´~1

Teória en práctica

• pico1 Tr=5.0 • pico2 Tr=6.2

28

• • • •

To=1.3

•

Calcular:.κ ´, α, R, N y HETP

W1=0.13 W2=0.15 L=25cm

Definiciones en Resumen

Eficiencia • Cuan estrechos son los picos – Medida del desempeño de la columna/fase estacionaria

Factor de Capacidad • Cuan bien es retenido un compuesto

Selectividad • La retención relativa de 2 compuestos

Resolución • La separación relativa de 2 compuestos • Evalua la separación en su totalidad 29

Optimización de una Separación – Factor de Capacidad

Para optimizar el Factor de Capacidad: Ajustar la fuerza del solvente Cambiar la fase estacionaria (columna)

30

Optimización de una Separación– Selectividad Para optimizar la Selectividad (separación): Cambiar la composición de la fase móvil Usar aditivos en la fase móvil Cambiar la fase estacionaria Cambiar el pH y/o la temperatura

31

Optimización de una Separación– Eficiencia Para optimizar la eficiencia de la columna : Disminuir el tamaño de partícula Emplear el flujo acorde al mínimo de la grafica HETP Emplear un solvente menos viscoso Incrementar la temperatura de la columna Incrementar la uniformidad de la partícula

32

II.

Instrumentación

2.1 Fase móvil 2.2 Sistema de bombeo 2.3 Inyectores 2.4 Columnas 2.5 Detectores

33

SISTEMA CROMATOGRAFICO BOMBA

FASE MÓVIL

COLUMNA

INYECTOR

DETECTOR 34

SISTEMA DE DATOS

2.1 Fase Móvil - Caracteristicas Preparación de la Fase Móvil Seleccionando la Fase móvil correcta •

• • • • •

35

• •

La consideración principal al elegir un sistema de  solventes es seleccionar uno que separe  adecuadamente los analitos. Además de la calidad en  la separación, la fase móvil debe:  No alterar la columna ni sus características Ser compatible con el detector Disolver la muestra Tener una viscosidad baja Permitir la recuperación fácil de la muestra, si es  necesario. Ser de pureza elevada y no tóxico Ser comercialmente disponible a un precio razonable

2.1 Fase Móvil - Preparación

A)  FILTRACIÓN MEMBRANAS

36



Material



Tamaño de Poro

2.1 Fase Móvil - Preparación B)  DESGASIFICACIÓN

 Ultrasonido

H e

 Gas Inerte

37

 Agitación y  vacío

2.1 Fase Móvil - Preparación B)  DEGASIFICACIÓN

38

2.1 Fase Móvil - Preparación C)  PREMEZCLADO  Es recomendable medir los volumenes individuales y mezclarlos en un reservorio comun.  Cuando se mezclan solventes orgánicos con agua siempre se obtiene un ∆ V de mezcla negativo.  Para preparar MeOH/Agua 50/50, no se debe colocar 500 ml de metanol en el matraz aforado y añadir 500 ml de agua porque no serian suficientes para llevar al aforo.

39

2.1 Fase Móvil - Preparación D)  BUFFERS  Los buffers seran necesarios cuando se analicen muestras que contengan analitos ácidos o básicos.  Las concentraciones recomendadas son del orden de 10 a 20 mM; de ser necesaria una mayor concentración asegurarse que no se presente precipitación.  Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).  El pH debera ajustarse en el buffer acuoso (teniendo considerado la modificación del pH por el solvente orgánico).

40

2.1 Fase Móvil - Preparación D)  BUFFERS  Recordar que el intervalo de amortiguamiento es de máximo +/-1.5 unidades en torno al valor de pka (ver tabla).

41

2.1 Fase Móvil - Preparación D)  BUFFERS 

42

2.1 Fase Móvil – Mantenimiento Preventivo

ACERO INOXIDABLE

PEEK

P/N: 43

P/N:

28-211524-00   SOLVENT BOTTLE FILTER 10 µM,  TITANIUM  27-180387-00

SOLVENT RESERVOIR FILTER, 10  UM, SS 

Pureza de disolventes Verifique con los proveedores el rango apropiado de  trabajo en UV de los disolventes •El oxígeno disuelto incrementa la abs en la región del  UV  lejano.Esnecesario  desgasificar  para  lograr  alta  sensibilidad en esta  región. •La  absorción  del  oxígeno  causará  drift  y  ruido.  Depende de la temperatura •Las  sales  de  par  iónico  (TMA)  pueden  contener  impurezas  que  absorben    en  la  región  UV.  Usar  de  la  más alta pureza 44

Cuidados con disolventes Preparación de la Fase Móvil Filtración •

45

Mantener los reservorios tapados.

Solventes Preparación de la Fase Móvil Solventes para fase inversa • • •

•

46

La mayoría de la LC por fase reversa utiliza agua  como el componente principal de la fase móvil El agua es el líquido polar más común Casi todos todos los compuestos, excepto los más  polares o más iónicos, experimentan una fuerza  hidrofóbica fuerte que los conduce a la fase  estacionaria y causa su retención Se debe utilizar siempre agua grado hplc

Solventes Preparación de la Fase Móvil Solventes para fase inversa • •

47

El ajuste de la concentración orgánica del modificador  B es el medio primario de cambiar la retención Los tres más comunes son acetonitrilo, metanol y  tetrahidrofurano

Solventes Preparación de la Fase Móvil Solventes para cromatografia de iones • • • • • • • 48

La cromatografía en fase normal utiliza mezclas. utiliza un buffer acuoso a un pH que mantenga a los  analitos con carga. Para los ácidos, el pH debe ser mayor a 5 Para las bases, el pH debe ser menor a 5 Mientras que la concentración del buffer aumenta,  aumenta la fuerza solvente y la retención disminuye Se puede agregar solvente orgánico para cambiar la  retención y la selectividad El metanol se elige generalmente porque proporciona una  mejor solubilidad

Solventes Preparación de la Fase Móvil Solventes para cromatografia de iones • • •

49

El reactivo de par iónico es generalmente un ion de  cadena corta Para la separación de bases protonadas se utiliza el  pentan sulfonato, hexan sulfonato, o el heptan sulfonato  Para la separación de ácidos ionizados, se emplea el  tetraetil-amonio o el tetrabutil-amonio

Solventes Preparación de la Fase Móvil Programación de Solventes •

• •

•

50

Las condiciones a considerar cuando se elige la fuerza  óptima de fase móvil son resolución, duración del análisis  y el factor de la capacidad La resolución debe siempre ser por lo menos 1.5 para  análisis de cuantificación Tiempos de análisis más cortos pueden ser alcanzadas  usando un solvente más fuerte para los picos  suficientemente resueltos Una buena referencia es hacer que todos los picos se  eluyan con con valores de k ' entre 1-20

2.1   Bombas - Caracteristicas

51



Operar a presiones elevadas



Libre de pulsaciones



Inerte



Operar con gradiente de solventes

Objetivo de la Bomba En la cromatografía clásica, la separación se realiza por  efecto  de  la  gravedad  (Tamaño  de  partícula  50-100  micrometros,  tiempo  de  separación  de  una  a  varias  horas) La disminución de tamaño de partícula como soporte de  la  fase  estacionaria  (3,  5  o10  micras)  exige  forzar  al  líquido  a  cruzar  a  través  de  la  columna  por  medio  de  una bomba. Las  bombas  comerciales  basan  su  diseño  en  pistones  reciprocantes 52

Funcionamiento de la Bomba

FASE MÓVIL

FASE MÓVIL 53

Funcionamiento de la Bomba •El  disolvente  es  entregado  por  la  bomba  con  el  pistón  reciprocante.(10 μL/min -10 mL/min) •El diseño  del  pistón  con un control electrónico de  su movimiento  (stroke) proporciona un flujo ligeramente pulsante. •Un damper reduce la pulsación del flujo. •Una cámara de mezclado proporciona una homogenización de los  disolventes atras del punto de inyeccion de la muestra. •Un transductor de presión convierte la presión del sistema en una  salida eléctrica que se despliega en la pantalla

54

Funcionamiento de la Bomba •El  movimiento  del  pistón  es  controlado  por  la  rotación  de  la  leva  (cam). •Un ciclo completo en la bomba consiste del movimiento del pistón  para  llenar  el  cabezal,  en  el  cual  el  pistón  viaja  en  reversa  (alejandose del cabezal de la bomba) y un movimiento de entrega ,  en la cual el pistón viaja en el sentido del cabezal de la bomba. •Durante el movimiento de entrega, el disolvente es descargado a  través de la vávula check. •La  rotación  de  la  leva  (cam)  es  determinado  por  un  software  de  control del motor.

55

Mantenimiento Preventivo en Bomba



Mala repetibilidad de tiempos de reten-

ción: - Fugas (visibles o no visibles)

56



SELLOS



PISTÓN

Solución: Cambio de pieza dañada



Válvulas check

2.1   Bombas– Tipos de Bombas Isocrática



Gradiente

Composición

%B



57

Tiempo

2.1   Bombas– Análisis Isocratico

58



Estabilidad en la línea base



Tiempo de análisis largo



Presión Constante



Resolución limitada

Solventes Preparación de la Fase Móvil Separación isocratica o por gradiente •

•

59

La fase móvil isócratica no puede resolver todas las  separaciones • Algunas muestras son demasiado complejas • Resolución pobre de picos tempranos • Ensanchamiento de picos  y coleo de los picos finales  En la elución por gradiente de solventes, la fuerza de la  fase móvil se incrementa por cambio de la composición de  los solventes en un cierto tiempo • Elegido para una amplia gama de muestras o de  biopolímeros • Limpia la columna durante cada corrida • Empleada para estimar condiciones isocraticas óptimas

2.1   Bombas– Análisis con Gradiente

 Resolución de Mezclas Complejas  Tiempo de Análisis Corto  Variación de la Presión  Inestabilidad de Línea Base  Vida útil de la Columna Limitada

60

2.1 Bombas– Análisis con Gradiente

Composición

%B

Tiempo

61

2.1 Bombas– Desarrollo de un Gradiente Tiempo

%A

(min)

%B

Etapa

0

Prerun

0

100

20

80

20

Gradiente

30

80

20

Isocratico

35

100

0

Cond. Inicial

40

100

0

Equilibrio

Isocratico te n ie d a Gr

Cond. Inicial

Equilibrio 62

2.3 Inyector Manual - Caracteristicas

 

Válvula de 6 puertos



2 posiciones: carga e inyección

Utiliza un loop / requiere cambio de loop para inyectar diferentes volumenes



Jeringa para introducir la muestra

Limpieza manual de línea de inyección



63

2.3 Inyector Manual - Funcionamiento

64

2.3 Inyector Manual - Mantenimiento Preventivo

 Filtración de la Muestra  Jeringa (aguja) apropiada

 Loop correcto  Limpieza correcta del 65

inyector

2.3 Inyector Automatico – características

 

Válvula de 6 puertos / 2 posiciones

Utiliza un loop / no requiere de cambio de loop para volumenes menores

 

2 posiciones: carga e inyección

Aguja / Jeringa para introducir muestra en forma programada



Limpieza automática de la línea de inyección.



66

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de Operación



Jeringa  El vólumen de muestra es medido con una jeringa de 250 uL.

 El interior de la jeringa debe estar libre de burbujas.

De observarse burbujas: Verificar la degasificación del solvente de enjuague.

Verificar el buen estado de la punta del émbolo.

Verificar que la aguja no este tapada.

Es necesario verificar que no se 67

presenten fugas provenientes del émbolo de la jeringa.

2.3 Inyector Automatico- Consideraciones de Operación



Válvula de Inyección  La muestra es introducida por una válvula automática de seis puertos.

 Emplea tambien un sello/rotor que puede rallarse. (mala repetibilidad de áreas)

La falla se evidencia cuando se observan gotas de líquido en la punta de la aguja, crecen y se desprenden.

 Y además, un incremento en la presión tambien incrementa la intensidad del goteo.

68

2.3 Inyector Automatico- Resumen de funcionamiento



Importante  Jeringa y tuberia libre de burbujas.  No fugas en jeringa.  Presurización de vial solo funciona si HeadSpace Pressure esta habilitado.

 Recomendado solo con septas nuevas.

La aguja de aire es insertada hasta la parte superior del vial, por lo que los viales solo llenarlos hasta 2/3 de alto (Contaminación Cruzada).

69

2/3 máximo

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo

Factores que afectan la Repetibilidad de Areas A.

MUESTRA

B.

MODOS DE INYECCIÓN

C.

LOOP

D.

70

EFECTO MEMORIA (Contaminación cruzada)

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo A) CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA



Compatible (soluble) con la fase móvil. Disuelta en un solvente de la misma polaridad (o más debil que la fase móvil).



Libre de partículas suspendidas (Filtrada)



71

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo B) MODOS DE INYECCIÓN Modo Parcial

Modo Total

72

Hasta el 50 % del volumen del loop

Toma de 3 a 2 veces el volumen del loop

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo

Tamaño:

C) Material y tamaño del LOOP

5, 10, 20, 50, 100,200, 500 (µ l),1, 2,5 (ml) Material: Acero Inoxidable, Titanio,PEEK

73

2.3 Inyector Automatico- Mantenimiento Preventivo D) EFECTO MEMORIA

Contaminación cruzada

74

Se evidencia en la inyección de un blanco inmediato posterior.

Son residuos de muestra (o estándar) de la inyección anterior.

2.4 Columnas para HPLC

Diagrama

75

2.4 Columnas para HPLC

¿Cómo funcionan? La fase estacionaria esta empacada dentro la columna no se mueve.

La fase móvil esta circulando dentro la columna a una velocidad regulada (flujo constante) arrastrando a la muestra. 76

2.4 Columnas para HPLC

¿Cómo funcionan? Si el analito es más soluble en la fase móvil que en la fase estacionaria, el analito migrará dentro de la columna con poca interacción con la fase estacionaria.

77

2.4 Columnas para HPLC

¿Cómo funcionan? Si el analito es más soluble en la fase estacionaria, migrará más lentamente dentro de la columna, y dependiendo de la magnitud de la interacción, el tiempo invertido será más o menos grande. 78

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Dimensiones

79

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006

2.4 Columnas para HPLC

Efecto del cambio en la longitud de la columna

80

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características •Tipo de soporte

• Silica, polimero. 

•Grupo químico enlazado

• C18, C8, C4, CN, NH2, Si 

•Tamaño de partícula

Longitud 3, 5, 10, 15, 25 cm)

• 2, 3, 5, 10 um

•Tamaño de poro y Area Superficial (60 ~ 200 A)        (100 ~ 500 m2/g)

•Densidad de ligando • 2 ~ 4 µ

81

Diámetro Interno (1, 2, 4, 4.6 mm)

mol /m2

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características •Tipo de soporte • Silica (SiO2)  es el material dominante. Posee una alta  resistencia mecánica y permite fabricar partículas  uniformes. 

82

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características •Tipo de soporte • Silica (SiO2)  posee una  superficie polar que  permite ser  modificada para darle  propiedades no  polares por  tratamiento químico.  • Tiene como limitante  el que se degrada  fuera del intervalo de  pH de 2 a 8. 83

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características •Tipo de soporte La Silica (SiO2)  tiene como limitante el degradarse  fuera del intervalo de pH de 2 a 8.

84

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características •Tipo de soporte • Polímero. Poliestireno divinil benceno  entrecruzado, polieteres y metacrilatos son los  más comunes. • Tienen como desventaja que regularmente  poseen menos eficiencia comparadas con las  columnas de Si.  • Tienen como ventaja la operación en el intervalo  de pH de 1 a 14. • Existen nuevos materiales como son la Zirconia  que permiten operar a temperaturas elevadas. 85

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características Grupo químico enlazado • C18        C8        C4        CN        Ph        NH2        Si 

No Polar Fase Reversa

86

Polar Fase Normal

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características Grupo químico enlazado • C18        C8        C4        CN        Ph        NH2        Si  C18: Muy hidrofobica, estable y primer elección. C8:   Menos hidrofobica, requiere menos solvente orgánico. CN:  La menos hidrofobica, no muy estable. Ph:   Para compuestos de mediana polaridad. Recomendada  para aromáticos. C4: Recomendadas para análisis de proteinas. NH2: Recomendada para carbohidratos. Si: Adecuada para compuestos orgánicos de polaridad media  87

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características Tamaño de poro  y Area Superficial • 200 ~ 60 A     Area Superficial (100 a 500 m2) •            Mayor densidad en fase enlazada  •          Mayor retención (más hidrofóbica) • No recomendado para  biomoleculas.

88

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por Características Densidad de ligando  (Carga de carbono [peso Fase Enlas/peso Silica]) • 2 ~ 4 µ mol/m2

89

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por tecnologia

90

(Pureza de SiO2)

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por tecnologia (Pureza de SiO2)

91

Modern HPLC for Practicing Scientists, Michael W. Dong, Wiley – Interscience, 2006

2.4 Columnas para HPLC

Clasificación por tecnología (Fase estacionaria modificada)

92

2.4 Columnas para HPLC Clasificación por Tecnología (Resumen 1)

93

2.4 Columnas para HPLC Resumen

94

2.4 Columna – Mecanismos de Separación Tipo de interacciones ♦No polares -  fuerzas de van der Walls ♦covalentes – Formación de  puentes moleculares ♦Polar - dipolares y puentes de hidrógeno ♦Ionicas - cationicas y  anionicas

95

2.4 Columna – Selección de Columnas METODO EXISTENTE SATISFACTORIO

SELECCIONAR LA COLUMNA ESPECIFICA

SELECCIONAR COLUMNA NUEVA MUESTRA

PESO MOLECULAR < 2000

PESO MOLECULAR > 2000

SOLUBLE EN ORGÁNICO

SOLUBLE EN AGUA

SOLUBLE EN ORGÁNICO

SOLUBLE EN AGUA

EXCLUSIÓN

EXCLUSIÓN

PERMEACIÓN 96

FILTRACIÓN

SOLUBLE EN

SOLUBLE EN METANOL

HEXANO

ADSORCIÓN

FASE ENLAZADA NORMAL

FASE

ENLAZADA REVERSA

INTERCAMBIO IÓNICO

Mercanismos de adsorción Dependiente de la concentración de soluto y la  temperatura (Isotermas de adsorción) Retención de Compuestos polares Orden de elución: menor polaridad más rápido Columnas: sílica & alumina

97

2.4 Columna – Adsorción

98

2.4 Columna – Partición

Fase enlazada  Normal

S m K = Cs Cm

99

 Reversa

2.4 Columna – Fase Normal enlazada

100

Características del mecanismo Interacciones: Polares (puentes de H2, fuerzas de van Der Walls). Retención: Favorecida por disolventes no polares. Elución: Fuerza de disolvente aumenta con la polaridad (hasta disolvente medianamente polares) Columnas : Ciano y amino

101

2.4 Columna – Fase Normal

102

2.4 Columna – Fase Reversa

103

Caracteristicas del mecanismo Interacciones: No polares (inducción de dipolo, dipolo-dipolo) Retención: Favorecida con disolventes polares Elución. Fuerza de disolvente aumenta disminuyendo polaridad

104

2.4 Columna – Fase Reversa Es la técnica de HPLC más popular: • Las columnas son estables y de rápido equilibrio. • El orden de elución es predecible:  Si más  hidrofobico el soluto ->  mayor retención. • Agua es uno de los solventes más importantes • Permite cambios en la selectividad por la adición  de modificadores • Fase reversa incluye algunas variantes:  • Regular, supresión de iones, ionización  controlada, par iónico y formación de quelatos  metálicos.

105

2.4 Columna – Fase Reversa

106

Mecanismos de fase reversa: Fase reversa  clásica Los solutos  no polares son retenidos por la fase  estacionaria . La elución se logra por cambio en la polaridad de la  fase móvil (disminución de polaridad) Fase reversa clásica

107

2.4 Columna – Fase Reversa Fase reversa clásica

108

Mecanismos de fase reversa:  Control de la ionización •Algunos  solutos  presentan  ionización  a  un  valor  determinado de pH. •Los solutos en forma no ionizable son retenidos por la  fase  estacionaria.  Al  cambiar  a  su  forma  ionizable    eluyen de la columna. •Se emplean  soluciones de fosfatos, boratos, citratos. •Concentración máxima (recomendada) 0.01M •Compatibilidad de solubilidad con la fase orgánica •Compatibilidad con el detector

109

2.4 Columna – Intercambio Ionico carga fija Ión de la muestra

+

 Catiónico

+

-

contraión

110

resina

 Aniónico

2.4 Columna – Intercambio Ionico

111

2.4 Columna – Intercambio Ionico

Base sílica Base polímero

112

2.4 Columna – Exclusión

SOLUBILIDAD EN ORGÁNICO (GPC)

SOLUBILIDAD EN AGUA (GFC)

113

2.4 Columna – Exclusión

Bomba

Fase móvil

Banco de columnas Sistema de datos Detector

114

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados Uso: •

Almacenar la columna en un solvente recomendado por el fabricante.

•

Colocar tapones durante no-uso.

• Siempre “lavar” columna con un solvente fuerte. • Siempre utilizar guardacolumna o filtro en línea

115

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados Precauciones: • No exceder rango de pH de la columna. •

No exceder rango de temperatura de la columna.

•

Nunca guardar la columna con sales o buffer dentro de ella.

• Permitir que la columna se enfrie antes de detener el flujo. 116

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento y Cuidados Mantenimiento y Regeneración: • Tiempo de vida desde 3 hasta 24 meses o de 1000 a 3000 inyecciones. •

El desempeño disminuye con el uso (incremento en la presión y coleo de picos).

• Monitorear presión (¡¡bitacoras!!), probar invertir columna. •

Regenerar la columna con una serie de solventes de débil a fuerte y viceversa en forma gradual. 117

2.4 Columnas – Uso, Mantenimiento, Cuidados y Regeneración SILICA  50 ml de hexano  50 ml de cloruro de    

metileno 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de metileno 25 ml de fase móvil Probar la columna

Consultar siempre folleto del fabricante

118

FASE NORMAL 50 ml de cloroformo 50 ml de cloruro de metileno 50 ml de isopropanol 30 ml de cloruro de metileno 25 ml de fase móvil Probar la columna

2.4 Columna – Regeneración FASE REVERSA  50 ml agua caliente     

( 55 ºC) 50 ml de metanol 50 ml de acetonitrilo 30 ml de THF 25 ml de metanol 25 ml de fase móvil

Consultar siempre folleto del fabricante

119

INTERCAMBIO IÓNICO 50 ml de agua caliente 50 50 25 25 25

(55 ºC) ml de metanol ml de acetonitrilo ml de cloruro de metileno ml de metanol ml de fase móvil

2.4 Columna – Guardacolumna Bomba Guarda Columna Inyector

Columna

Fase móvil

Detector 120

Sistema de datos

2.4 Columna – Horno

Objetivos  Aumentar la solubilidad de la muestra  Disminuir la presión de la columna

 Disminuir la selectividad  Disminuir el tiempo de análisis 121

2.5 Detectores

Uv-vis (λ fija) Indice de Refracción

Uv-vis (Arreglo de diodos)

Fluorescencia 122

ELSD

2.5 Detectores - ProStar 350 Características

Indice de Refracción a) Universal b) Mide el cambio de índice de refracción entre la celda de muestra y la celda de referencia. c) No destructivo de la muestra d) Baja sensibilidad : %w e) No compatible con gradiente 123

f) Sensible a la temperatura ambiente

2.5 Detectores - Indice de Refracción ProStar 350 -Restricciones de Solventes  No recomendados  • Haluros , Formato de Amonio, CCl4 Utilizables abajo del 10% • Acido Bórico, Anhidro Acetico, KOH • Sales de Formato de Amonio, perclorato, HPO42• Sales de bicarbonato, clorato y nitrato Utilizables abajo de 30% • Acido Citrico, NaOH, Sales de Citrato de Amonio, oxalato,  sulfato, H2PO4Utilizables abajo de 50% • Acido Acetico, Acido lactico, Hidrazina,     Nitrato de Amonio, K2CO3, Formato de Sodio 124

2.5 Detectores- Ultravioleta Visible PS-325 Características

Ultravioleta Visible a) Alta sensibilidad b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC. c) No destructivo de la muestra d) Selectivo e) Rango 190-900 nm f) Compatible con gradiente 125

2.5 Detectores-Ultravioleta Visible PS-325 Recomendaciones de Operación

• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos  antes del análisis.  • Configurar longitud de onda y tiempo de  respuesta. • La duración de las lámparas es de aprox 2000  hrs, pero pueden fallar antes o después.

126

2.5 Detectores- Arreglo de Diodos PS-335 Características

a) Sensibilidad similar a UV-VIS b) Mide la absorción de la luz UV o Visible en el eluyente del HPLC. c) No destructivo de la muestra d) Selectivo e) Rango 190-900 nm f) Compatible con gradiente 127

2.5 Detectores- PS-335 Resultados Arreglo de diodos

• Espectro de cada Compuesto,                                 comparación de  Espectros •    Parámetro de Pureza •    Biblioteca de Espectros •    Cromatogramas a diferentes λ

128

.

2.5 Detectores - Arreglo de Diodos PS-335 Recomendaciones de Operación

• Encender la lámpara por lo menos 15 minutos  antes del análisis.  • Configurar longitud de onda y tiempo de  respuesta. • Configurar rango de longitudes de onda para  desarrollo de métodos, y porque sea necesario en  trabajo de rutina. Los archivos son muy grandes. • La duración de las lámparas es de aprox 2000  hrs, pero pueden fallar antes o después. 129

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Características

•

Alta sensibilidad (100 a 1000x)

•

Compatible con gradiente

•

Selectivo: λ excitación, λ emisión

•

Rango de λ s: Ex: 200-850nm y Em:200-900 nm

•

Formación de derivados: columna

Precolumna y Post

• Puede trabajar con la lámpara apagada (Chemiluminescencia, Bioluminescencia) • GLP integradas (horas de la lampara) 130

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 – Lámpara de Xe. • Duración aprox de  500 hrs •    Contiene gas Xe  

presurizado. Manejese  con cuidado. •    La radiación emitida 

es muy intensa.

131

2.5 Detectores- Fluorescencia PS-363 - Areas de aplicación Mercado Farmaceutico / Bioquimico

–  Catecholes e  Indoles –  Vitaminas –  Derivados OPA de amino ácidos  –  Derivados FMOC de amino ácidos  –  Marcadores Fluorescentes  Mercado Ambiental – Carbamatos, Glifosatos

– PNAs 132

3.0 Analisis Cuantitativo  Concentración

tr4

133

tr2

tr3

tr1

Area

3.1

Por ciento área

3.2

Área Normalizada

3.3

Estándar Externo

3.4

Estándar Interno

A1

A2

A3

A4

1.

3.0 Analisis Cuantitativo- Por ciento Area Inyectar la Muestra Problema tr4 tr2

Datos

tr3

     A1      A2 tr1

A3 A4 A1

2.

A2

A3

A4

Calcular el % A:

%A = Ai x 100 Σ Ai 134

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento 1.  

Area Normalizada

Preparar una mezcla estándar de concentración conocida

2.

Inyectar la mezcla estándar de calibración

3.

Obtener el cromatograma , así como las áreas: tr4 tr2

tr3

Datos

pico de  referencia

    A  A

1

tr1

A1 135

A2

A3

A4

C1

2

C2

A3

C3

A4

C4

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento Area Normalizada 4.  

Calcular los Factores de respuesta Fr:  

a)

Seleccionar un pico de referencia y asignarle un valor de Fr = 1

b)

Calcular los Fr de los demas Picos:

Fri = A ref x Ci C ref x Ai Fr i = Factor de respuesta del pico de interés A ref = Area del pico de referencia Ci Ai 136

= Concentración del pico de interés = Area del pico de interés

C ref = Concentración del pico de referencia

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento Area Normalizada 5. Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma, asi como sus áreas:

Datos

tr4 tr2

tr3

     A1      A2 A3

tr1

A4 A1

6.  

137

A2

A3

A4

Calcular las concentraciones de cada uno de   los   componentes, en  unidades relativas: %w, %v,   %  mol

3.0 Analisis Cuantitativo- Por Ciento Area Normalizada

%Ci = Ai x Fri   x100           Σ (Ai Fri)

138

Ci =

Concentración del pico de interés en la muestra

Ai =

Área del pico de interés en la muestra

Fri =

Factor de respuesta del pico de interés

1.

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo Preparar una mezcla de estándares de concentración conocida con los componentes de interés

2.

Inyectar la mezcla de estándares

3.

Obtener el cromatograma, así como sus respectivas áreas tr 4

tr2

Datos

    A  A

139

1

C1

2

C2

A3

C3

A4

C4

tr3

tr1

A1

A2

A3

A4

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo 4.

Calcular los factores de respuesta uno de los picos:

de cada

Fri = Ci Ai 5.

140

Inyectar la muestra problema, obtener el cromatograma , así como las áreas:

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Externo tr4 tr2

Datos

tr3

     A1      A2

tr1

A3 A1

6.

A2

A3

A4 A4

Calcular la concentración de cada uno de los componentes:

Ci = Ai Fri

141

Ci =

Concentración del pico de interés en la muestra

Ai =

Área del pico de interés en la muestra

Fri =

Factor de respuesta del pico de interés

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno Requisitos del Estándar Interno

•

Alta pureza

•

Estable químicamente y térmicamente

•

Estructura química semejante a los componentes de interés

•

142

Separado e identificado de los componentes de la muestra

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno 1.

Preparar una mezcla de calibración que contenga los componentes de interés, asi como el componente que servirá como estándar interno

2.

Inyectar la mezcla de calibración, obtener el cromatograma y las áreas tr4 tr2

Datos

    A  A

143

1

C1

2

C2

A3

C3

A4

C4

tr3

Est. Interno tr1

A1

A2

A3

A4

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno 3.

Calcular los Fr tomando como referencia el pico del estándar interno, es decir asignarle un Fr = 1 Fri = Ci X A std int Ai X C std int Fri = Factor de respuesta del pico de interés Ci = Concentración del pico de interes Astd int = Área del estándar interno Ai = Área del pico de interés C std int = Concentración del estándar interno

144

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno 4.

Inyectar la muestra problema y obtener las áreas: tr4 tr2

tr3

Datos

    A  A

1

2

A3

tr1

A4 A1

5.

A2

A3

A4

Calcular la concentración de cada uno de los componentes tomando como referencia el pico del estándar interno 145

C2

3.0 Analisis Cuantitativo- Estandar Interno

Ci= Ai Fri  C std int                    A std int Ci = Concentración del pico de interés Ai = Área del pico de interés Fri = Factor del pico de interés Cstd int = Concentración del estándar interno Astd int = Área del estándar interno

146