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• SsergioArmataMedina

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FUNDAMENTOS DE LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA (PRQ 218)

CULTIVOS CELULARES 1. INTRODUCCIÓN Aunque el papel de los microorganismos en la biotransformación fue reconocido hasta el siglo XIX, los microorganismos han sido utilizados por los seres humanos desde tiempos prehistóricos en los alimentos, bebidas alcohólicas, productos lácteos, textiles, etc. Hoy el uso de microorganismos es aún más generalizado que antes, no sólo se utilizan para los procesos microbianos también para nuevos procesos como la producción de productos farmacéuticos, productos químicos industriales, enzimas, productos químicos agrícolas, aguas residuales tratamientos y tecnologías de ADN recombinante. 2. CULTIVO CELULAR MICROBIANO a. CÉLULAS MICROBIANAS La célula microbiana es una entidad, aislada de otras células por una membrana celular y que contiene en su interior una variedad de sustancias químicas y de estructuras subcelulares. Características generales de la célula microbiana Todas las células son similares en tres aspectos: todas inician su vida con una membrana plasmática, material genético y una región de citoplasma. Membrana plasmática: Membrana externa de doble capa, separa el interior de la célula de sus alrededores y selectivamente permite que las sustancias la atraviesen. Citoplasma: Región interna organizada donde se llevan a cabo conversiones de energía, síntesis de proteínas, desplazamiento de partes celulares y otras actividades necesarias. Material genético: Dependiendo de la especie, el ADN ocupa un saco recubierto de membrana (núcleo) en el interior de la célula o sólo una región del interior de la célula (nucleoide).

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Todas las células microbianas contienen ciertos tipos de componentes químicos complejos que son:  Proteínas  Ácidos nucleicos  Lípidos  Polisacáridos b. MEDIOS DE CULTIVO El crecimiento de la población microbiana en entornos artificiales es llamado cultivo. Una cultura que sólo contiene un tipo de microorganismo es un cultivo puro. Una cultura mixta es aquella que contiene más de un tipo de microorganismo. Los pasos necesarios para la cultivación de microorganismos son: 1. Preparación de un medio de cultivo en el que un microorganismo crecer mejor. 2. Esterilización para eliminar todos los organismos vivos 3. Inocular el microorganismo en el medio preparado. Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energía y elementos químicos para la síntesis de sus constituyentes celulares. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Se pueden clasificar en:  Definidos:Cuando

su

totalmente

2

composición

química

se

conoce

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 Complejos: Cuando no es el caso porque están compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, carne, etc.). 

BACTERIAS

La bacteria es el organismo unicelular más pequeño que existe en la tierra, pertenece al reino mónera, se caracteriza por poseer una célula procariota, en la cual su material genético suele hallarse agrupado en una región nuclear que carece de envoltura o membrana propia.

Medios de cultivo bacterias Un método fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales,para hacer esto, uno debe conocer el material alimenticio y las condiciones físicas requeridas. Materiales de enriquecimiento para las bacterias -

Las fuentes de energía

-

Las fuentes de carbono

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-

Las fuentes de nitrógeno

-

Las fuentes de azufre y fósforo

-

Las fuentes de elementos metálicos

-

Las fuentes de vitaminas

Condiciones físicas: Hay que tener en cuenta tres grandes factores que son:





La temperatura



El ambiente gaseoso



El pH.

HONGOS

Los hongos son plantas carentes de clorofila y por lo tanto son incapaces de sintetizar su propia comida, ellos varían en tamaño a partir de levaduras unicelulares a pluricelulares setas. Entre ellos, las levaduras y los mohos son industrialmente importantes. 3. CULTIVODE CELULAS ANIMALES 3.1 CELULA ANIMAL Las células animales tienen varias características que las diferencian de otras células u organismos, utilizados en la biotecnología; son células de eucariotes superiores, por lo que poseen núcleo y diversos orgánulos, tales como retículo endoplásmico y aparato de Golgi, carecen de pared celular y son más grandes que las levaduras o bacterias, con un diámetro aproximado de entre 10 y 20 µm Ellos están unidos por material intercelular para formar tejidos que se dividen habitualmente en cuatro categorías: 1. El tejido epitelial : Es el tejido formado por una o varias capas de células unidas entre sí, que puestas recubren todas las superficies libres del organismo y constituyen el revestimiento interno de las cavidades, órganos huecos, conductos del cuerpo, así como forman las mucosas y las glándulas.

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2. En el tejido conectivo: Las células siempre están incrustados en una extensa matriz intercelular, que puede ser líquido, semisólido o sólido. 3. Las células musculares: Son generalmente alargados y unidos en láminas o haces de tejido conectivo, los músculos son responsables del mayor movimiento en los animales superiores. 4. Las células nerviosas: Se componen de un cuerpo celular, que contiene el núcleo y una o más extensiones largas y delgadas llamadas fibras. Las células nerviosas son fácilmente estimuladas y pueden transmitir impulsos muy rápidamente. Las células animales de uso más común son: a) Linfositos b) Células epiteliales c) Células de fibroblastos

3.1.1 Características de cultivo de células animales A diferencia de las células eucariotas inferiores (hongos, levaduras) y bacterias, el cultivo de células animales representa retos enormes ya que, entre otras características, las células animales son muy sensibles a estres comúnmente encontrados en biorreactores, presentan requerimientos nutricionales complejos, crecen lentamente y sólo dentro de intervalos estrechos de variables como pH, temperatura y Osmolaridad.

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3.2 MEDIOS DE CRECIMIENTO Las necesidades nutricionales de las células de mamíferos son más estrictas que las de los microorganismos porque, a diferencia de ellos, los animales no metabolizan el nitrógeno inorgánico. Por lo tanto, deben proporcionar muchos aminoácidos y vitaminas. Además, el medio debe ser complementado de 2 a 20% (en volumen) de suero de la sangre de mamíferos. El suero proporciona componentes que aún no han sido identificados, pero han demostrado ser necesarios para la viabilidad del cultivo. 3.3 ANTICUERPOS MONOCLONALES 3.3.1 Producción de anticuerpos Los anticuerpos son moléculas proteicas compuestas de cuatro cadenas, dos ligeras y dos pesadas unidas por puentes di sulfuro, los cuales tienen diversas funciones tales como reconocimiento y neutralización de antígenos, opsonización, presentación de antígenos a células efectoras y activación del sistema de complemento. Los anticuerpos monoclonales son glucoproteínas especializadas que hacen parte del sistema inmune, producidas por las células B- Linfositos, con la capacidad de reconocer moléculas específicas (antígenos). Los anticuerpos monoclonales son herramientas esenciales en el ámbito clínico y biotecnológico, y han probado ser útiles en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunológicas y neoplá-sicas, así como también en el estudio de las interacciones patógenohospedero y la marcación, detección y cuantificación de diversas moléculas. Actualmente, la incorporación de las técnicas de biología molecular e ingeniería genética y proteica han permitido ampliar el horizonte de la generación de anticuerpos monoclonales y sus usos, y se han encontrado técnicas como la hibridación, la quimerización, la humanización y la producción de anticuerpos monoclonales totalmente humanos.

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4. CULTIVO DE CELULAS VEGETALES Con el fin de producir productos metabólicos secundarios de una planta, tejido vegetal exógeno en lugar de una planta entera, puede cultivarse un cultivo en suspensión en una condición aséptica. La justificación técnica para el uso de tejido vegetal se basa en la única toti potencia bioquímica de las células vegetales. El cultivo de células vegetales en lugar de toda la planta para la producción de metabolitos puede proporcionar varias ventajas: 

Las células vegetales se pueden cultivar donde se necesitan sin importar del tiempo y las condiciones geográficas. Como resultado, no hay necesidad de enviar o almacenar materias primas voluminosas.



La calidad del producto y los rendimientos también pueden ser controlados por eliminar los problemas encontrados en el procesamiento de como la calidad de la materia prima, la uniformidad dentro y entre lotes, y daños en el envío y almacenamiento.



Algunos productos metabólicos pueden ser producidos a partir de suspensión cultivo en mayor cantidad que la observada en plantas enteras.

4.1 CÉLULAS VEGETALES La célula vegetal está rodeada por una pared celular, que determina características de la planta. La capa externa de la pared celular se llama centro porque contiene una capa pesada de pectina (una Polygalacturonan) que sirve como el pegamento para sostener firmemente una célula vegetal a una celda adyacente. La capa interna de la pared es la membrana celular; la membrana celular es completamente diferente de la pared celular en forma, composición y función. Considerando que la pared es una estructura gruesa, la membrana citoplasmática es delgada (aproximadamente 75) y flexible. La membrana se compone de proteínas y lípidos, mientras que la pared es carbohidrato en la naturaleza. La pared proporciona soporte, mientras que la membrana regula el movimiento de sustancias dentro y fuera de la célula.

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4.2 TIPOS DE CULTIVOS: Pueden ser: 

Los cultivos de callos son agregados celulares amorfos derivados del crecimiento desorganizado de explantes sobre un nutriente sólido aséptico medio. Los explantes son los órganos pequeños o secciones de tejido.



Los agregados celulares no se corresponden con ningún tejido de la planta entera. El término cultura del callo fue elegido porque se pensó que la proliferación celular era inducida por una lesión del explante durante la escisión. Sin embargo, se ha inducido por los reguladores del crecimiento de las plantas en el nutriente sólido medio.



Los cultivos de suspensión (o células) consisten en células y agregados celulares, creciendo dispersado en medio líquido. Por lo general, se inician colocando piezas de un cultivo de callos friable en el líquido en movimiento medio. Por consiguiente, los cultivos en suspensión son progresión de la planta al explante, al callo y finalmente a suspensión. El cultivo en suspensión es más adecuado para propagación de las células vegetales que el cultivo del callo, pueden mantenerse y manipularse de forma similar a fermentaciones microbianas sumergidas.



Los cultivos de protoplastos implican el crecimiento de protoplastos en medio líquido. Los protoplastos se pueden preparar mecánicamente o eliminación enzimática de la pared celular. Los protoplastos aislados

Pueden utilizarse: 1) modificar la información genética de las células vegetales 2) para crear híbridos vegetales a través de la fusión de protoplastos 3) a estudiar las infecciones virales de la planta, y así sucesivamente. Otra aplicacion de cultivos de protoplastos es la micropropagación de plantas. Después de las divisiones de protoplastos, las paredes celulares pueden ser

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regenerados para dar lugar a callos y posteriormente a plantas, que proporciona una ruta por la cual las plantas pueden multiplicado. 4.3 MEDIOS DE CULTIVO Aunque los requerimientos nutricionales de diversos cultivos de tejidos varían ampliamente, los medios típicos de cultivo de tejidos vegetales contienen los siguientes componentes: 1) Principales nutrientes: Sales de nitrógeno, potasio, calcio, Fósforo, magnesio y azufre, que son seis elementos para el crecimiento de plantas superiores. 2) Menores nutrientes: Sales de hierro, manganeso, zinc, boro, cobre, molibdeno y cobalto en trazas. 3) Suplementos orgánicos: Pequeña cantidad de vitaminas (mio-inositol, Tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, etc.), aminoácidos (Usualmente omitido, pero a veces usado con ventaja), y otros suplementos indefinidos (carne, malta y extracto de levadura e hidrolizados de proteínas, y así sucesivamente). 4) Reguladores de la planta: Auxinas (generalmente provistos con análogo sintético, ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y Cytokininas (análogo sintético de uso común, kinetina) que regulan el crecimiento y la morfogénesis en tejidos y órganos de las plantas cultura. 5) Fuente de carbohidratos: Usualmente sacarosa para reemplazar el carbono que la planta normalmente se fija de la atmósfera por fotosíntesis, ya que la mayoría del cultivo de células vegetales carece de capacidad fotosintética. 6) Agente solidifícante de semisólido medio: Agar 4.4 PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS Son los compuestos orgánicos sintetizados por las plantas que cumplen funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es letal para el organismo, al

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contrario que los metabolitos primarios. Los metabolitos secundarios intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente; tienen una distribución restringida en el reino de las plantas y algunos solo se encuentran en una especie o grupo, por lo que a menudo son útiles en la Botánica Sistemática. Los metabolitos secundarios se pueden clasificar en tres categorías principales: Alcaloides, aceites esenciales y glucósidos. 5. MEDICION DE CRECIMIENTO DE CELULAR En cualquier sistema biológico, el crecimiento se puede definir como el aumento ordenado de todos los componentes químicos. Crecimiento equilibrado en el que todos los constituyentes celulares (proteínas, ADN, ARN, H2O intracelular) se duplican en un mismo tiempo. Los cultivos sometidos a crecimiento equilibrado mantienen una composición química constante. El crecimiento celular se puede determinar por: 1.-El número de células 2.-La masa celular 3.-La actividad celular 5.1 MEDICIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS Métodos directos Recuento microscópico: El número de células en una población puede ser medido con un microscopio contando las células colocadas en especial cámaras de recuento. Hay dos tipos de cámaras utilizadas para el contando el número de células en muestras líquidas. Técnica común, rápida y barata; para estos recuentos se utilizan cámaras para contar el número de células en muestras liquidas.

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Existen 2 tipos de cámaras: a) Hemocito metro: Cámara plana de vidrio reticulada a 0.1mm., para el uso con

los organismos de 3 µm de diámetro o más grandes.

Cámara cuenta

glóbulos.

b) Cámara de recuento de Petroff-Hausser: Cámara de recuento, para uso principalmente con bacterias. 5.2 MEDICIÓN DE LA MASA CELULAR 5.2.1 Peso seco de la célula: Se puede medir directamente mediante la adopción de una alícuota de la suspensión celular y centrifugando la misma. Después se desecha el sobrenadante, las células se lavan a fondo con agua destilada para eliminar toda la materia soluble. La suspensión se vuelve a centrifugar y las células sedimentadas se secan en un horno y se pesa. Consiste en dejar secar volúmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta que alcancen un volumen constante. Esta técnica sólo se puede utilizar con suspensiones de células densas, y las células se deben lavarse completamente libre de toda materia extraña. 5.2.2 Turbidez: La masa celular se puede medir ópticamente mediante la determinación la cantidad de luz dispersada por una suspensión de células. La técnica se basa en el hecho de que las partículas pequeñas dispersan la luz proporcionalmente, dentro de ciertos límites, a su concentración. La capacidad de absorción se define como el logaritmo de la relación de la intensidad de luz que incide sobre la suspensión (o) a la transmitida por la suspensión (I): Io

A = log I p

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Una curva de calibración se puede obtener mediante la medición de la absorbancia de las muestras con concentración de células conocida. Las mediciones se hacen generalmente a una longitud de onda de 600 - 700 nm. 5.3 MÉTODOS INDIRECTOS Los métodos indirectos para la medición de la masa de células se basan en la estequiometria general para el crecimiento y formación de producto, que puede escribirse en la forma general: C-fuente + N-fuente fosfato + O2 masa celular + producto + H20 + CO2 + calor El cambio de la masa celular se puede monitorizar indirectamente por el: Consumo de nutrientes: Es necesario elegir un nutriente que es no susceptibles de ser utilizados para sintetizar un producto metabólico. Fosfato, sulfato, o magnesio puede ser buenos candidatos. Formación de producto: Es importante comprobar que el producto formado se asocia el crecimiento. Componentes de la célula: Los componentes de la célula de macromolecular tales como proteínas, ARN, y ADN se puede medir en lugar de la masa celular. Sin embargo, es necesario tener cuidado porque la proporción de estos materiales en una célula pueden cambiar con el tiempo el cultivo no se somete a un crecimiento equilibrado Evolución del calor: la medición del calor de la fermentación puede está relacionado indirectamente con el crecimiento celular. El calor de combustión de organismos es bastante constante con un valor típico de 5 kcal / g. la cantidad de calor desprendido depende de la eficiencia del carbono utilización de la energía. Viscosidad: El crecimiento de micelio o la formación de polisacáridos aumentan la viscosidad del caldo de fermentación. Por lo tanto, la medición de la viscosidad del caldo es útil en muchas fermentaciones comerciales..

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6. INMOVILIZACION CELULAR El termino inmovilización de células se refiere a células físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio, reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización las células pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos procesos químicos. Bajo esta perspectiva, la inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los métodos de inmovilización juegan un papel fundamental en la selección de protocolos de inmovilización. Es por ello que por medio de la inmovilización es posible no solo controlar la ubicación de las células sino también modificar sus propiedades selectivamente. 6.1 METODOS DE INMOVILIZACION DE CELULAS: Los métodos de inmovilización son: a) Adhesión Es el término utilizado para cualquier forma de inmovilización en la que las células forman una unión a la superficie de un soporte sólido, ya sea de forma natural (adsorción y la adherencia) o como resultado del tratamiento de la superficie de las células y el material de soporte (unión covalente). Adhesión Natural (adsorción) de las células a las superficies es un fenómeno generalizado y proporciona un método simple y suave para la inmovilización de las células. b) Atrapamiento El atrapamiento de las células individuales y su ventaja de crecimiento natural a la colonización del material de soporte. El atrapamiento dentro de la estructura preformada podría ocurrir a nivel microscópico usando partículas micro porosas tales como cerámica, vidrio sinterizado, o gel de sílice o a nivel macro a través de la utilización de partículas con poros relativamente grandes, tales como malla de acero inoxidable o de partículas de soporte de biomasa espuma reticulada.

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El atrapamiento de las células dentro de las estructuras porosas que se forman in situ alrededor de las células se consigue mediante la mezcla de las células microbianas, en la forma de una suspensión o pasta, con un compuesto adecuado, que luego se gelifica o polimeriza para formar la estructura porosa que contiene las células. c) Agregación La agregación y floculación de las células microbianas resultantes en la formación de flóculos grandes es un fenómeno natural que se puede observar en muchos tipos de microorganismos en alguna etapa de su ciclo de vida. Los polímeros en la superficie celular y sustancias poliméricas extracelulares son factores importantes en el desarrollo natural de flóculos microbianos y su integridad. d) Contención: (contención detrás de una barrera) Las células pueden ser inmovilizadas en micro cápsulas que tienen una membrana permanente o no permanente semipermeable. La ventaja de las técnicas de encapsulación es la gran área superficial para el contacto de sustrato y células. La membrana semipermeable también pasa selectivamente los componentes sólo bajo

peso

molecular.

7. BIBLIOGRAFIA -

Dutta - Fundamentals of Biochemical Engineering

-

https://prezi.com/qcojujkyfj8d/medios-de-cultivo-para-hongos/

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http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/09/tipos-yfunciones-de-los-medios-de.html

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