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• Lizet Daniela Chambi

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CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

CULTIVOS CELULARES 1.- CULTIVOS CELULARES MICROBIANOS Es un modelo de estudio invitro constituido por células que pueden crecer y mantenerse en suspensión o en monocapa por más de 24 horas en condiciones controladas. Es el proceso de propagar microorganismos de forma artificial creándoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo. Mediante una siembra, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para “fabricar” nuevos microorganismos. Comienzos Desde que comenzó a establecerse la naturaleza microbiana de muchas enfermedades. Se inició un gran interés por el desarrollo de métodos que permitieran propagar y conservar durante largos periodos, a todos aquellos gérmenes causantes de enfermedades con el objetivo de facilitar su estudio morfológico, fisiológico y ecológico. Hoy en día se han desarrollado numerosos métodos para la obtención de cultivos puros y mixtos de muchas especies microbiológicas a. Células microbianas

La célula microbiana es una entidad, aislada de otras células por una membrana celular y que contiene en su interior una variedad de sustancias químicas y de estructuras subcelulares. La membrana celular es una barrera que separa del exterior el interior de la célula. Dentro de la membrana celular se encuentran las diversas estructuras y sustancias que hacen posible las funciones de la célula. Todas las células tienen estructuras claves: el núcleo, donde se almacena la información necesaria para

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES producir más células y el citoplasma, donde está la maquinaria para el desarrollo y funciones de la célula. Todas las células microbianas contienen cierto tipo de componentes químicos complejos: 

Proteínas



Ácidos nucleicos



Lípidos



polisacáridos

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA CÉLULA MICROBIANA: Nutrición: toman sustancias químicas del ambiente, transforman, liberan energía y eliminan productos de desecho. Auto duplicación: son capaces de digerir su propia síntesis. Diferenciación: presentan cambio en su forma o función. Señales químicas: pueden interactuar o comunicarse con otras células. Movimiento: tienen movimiento propio. Evolución: los cambios pueden influir en forma positiva o negativa en la salud general de la célula o del organismo superior Todas las células son similares en tres aspectos: Todas inician su vida con una membrana plasmática, material genético y una región de citoplasma. Membrana plasmática: membrana externa de doble capa, separa el interior de la célula de sus alrededores y selectivamente permite que las sustancias la atraviesen. Material genético: dependiendo de la especie, el ADN ocupa un saco recubierto de membrana (núcleo) en el interior de la célula o solo una región del interior de la célula (nucleoide). Región de citoplasma: región interna organizada donde se llevan a cabo conversiones de energía, síntesis de proteínas, desplazamiento de partes celulares y otras actividades necesarias. b. Medios de Cultivo Un medio de cultivo es un sustrato una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrogeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. CLASIFICACION DE MEDIOS DE CULTIVO: 

Según su estado físico los medios de cultivos se clasifican en sólidos, semisólidos y líquidos.

a) Solidos: contienen agar unos 12-15g/L. son sólidos por debajo de 45ºC. b) Semisólidos: contienen una pequeña cantidad de agar, unos 3g/L. c) Líquidos: no contienen un agente solidificante. 

Según su origen:

a) Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente b) Sintéticos: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles. c) Semisintéticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura. 

Según el uso al que se destinen los medios de cultivo se clasifican en:

a) Medios nutritivos: son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. b) Medios de enriquecimiento: incorporan una serie de factores que resultan indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos que aportan dichos factores. Un ejemplo de este tipo es el Agar Chocolate. c) Medios selectivos: son utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población poli microbiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población poli microbiana específica. Un ejemplo de estos medios es el Caldo Selenito.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES d) Medios inhibidores: cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. Un ejemplo de este tipo de medios es el MacConkey. e) Medios diferenciales: se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), entre otros. f) Medios de identificación: son los destinados a comprobar alguna cualidad especifica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios deben poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. Ejemplos de estos medios es el Agar Kligler y el Simmons. g) Medios de multiplicación: sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios. 

PARA BACTERIAS

Agar nutritivo: El Agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de bacteria. Es muy útil porque permanece solido incluso a relativas altas temperaturas. Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se distinguen mejor las colonias pequeñas. En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente: · 0.5 % Peptona · 0.3 % extracto de carne/extracto de levadura · 1.5 % agar · 0.5% NaCl · Agua destilada · pH casi neutro (6.8) a 25 °C.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Agar sangre: Es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con el agregado de 5% de sangre ovina, también puede usarse sangre humana, para cultivos en una placa de agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos. Agar chocolate: Es un medio de cultivo selectivo que se utiliza para el crecimiento de ciertas bacterias, se parte de un medio de agar sangre el cual se calienta aproximadamente hasta que llega a los 80ºC por 10 minutos hasta que toma la coloración parecida al chocolate. Agar S.S.: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. A partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.  Peptona pancreática de carne 5.00g  Extracto de carne 5.00g  Sales biliares 8.50g  Citrato sódico 10.00g  Tiosulfato ssodico 8.50g  Citrato férrico amomical 1.00g  Lactosa 10.00g  Rojo neutro 25.00mg  Verde brillante 0.33mg  Agar-agra 15,00g

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Agar MacConkey Es un medio de cultivo selectivo y difeencial para bacterias diseñado para aislar selectivamente bacilos Gram negativos y entéricos (encontrados normalmente en el tracto intestinal) y diferenciarlos sobre la base de la fermentación de la lactosa 

PARA HONGOS

AGAR CEREBRO DE CORAZON Medio altamente nutritivo para el cultivo de una gran variedad de microorganismos exigentes. Al añadirle antibióticos, puede utilizarse para el aislamiento y cultivo de hongos. 

Cerebro de ternera 7.5g/l



Infusión de corazón de res 10.0g/l



Glucosa 2-0g/l



Mezcla de peptonas 10.0g/l



Di-potasio hidrogeno fosfato 2.5g/l



Sodio cloruro 5.0g/l



Agua 15.0g/l



pH 7.4+- 0,2

AGAR DEXTROSASABORAUD Medio para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras. Agar de Czapek-Dox (Modificado) Medio para el cultivo de hongos y bacterias capaces de utilizar el nitrato de sodio como única fuente de nitrógeno. Agar Maltosa de Sabouraud Medio para el cultivo de hongos filamentosos y levaduras. Agar de Littman con Bilis de Buey Medio selectivo, que suplementado con estreptomicina, se emplea para el aislamiento primario y cultivo de hongos, especialmente dermatofitos.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES m-Medio de Sabouraud Medio para la detección y aislamiento de hongos en muestras, mediante la técnica de filtración por membrana. Peptona Micológica Base nutritiva especialmente diseñada para el cultivo de hongos patógenos y saprófitos. Garantiza un crecimiento característico de hongos patógenos y no patógenos en medios sólidos. Peptona de Soya Base nutritiva obtenida mediante la hidrólisis de la harina de soya con papaína. Se caracteriza por su alto contenido de carbohidratos y vitaminas, por lo que su empleo permite el crecimiento abundante de las bacterias más exigentes y de los hongos. 2.- CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES

a. Células Animales. PARTES DE LA CÉLULA ANIMAL Núcleo: El núcleo de la célula es el centro de control de la misma. En pocas palabras, es el responsable de dictar las instrucciones para el funcionamiento correcto de muchos procesos biológicos. Es un elemento muy importante ya que alberga el ácido desoxirribonucleico (ADN) que contiene la información genética que se va a transmitir cuando se generen otras células.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES El ADN unido a proteínas forma la cromatina, la cual, al condensarse al momento de la división celular, genera unas estructuras semejantes a hilos llamados cromosomas. El núcleo es un orgánulo ya que se encuentra en el citoplasma. Ocupa hasta el 10 por ciento del espacio del interior de la célula y es el componente más grande de la célula. Membrana celular o plasmática: Es una delgada capa que rodea el citoplasma y separa la célula de su entorno. Su principal función es proteger a la célula del exterior y facilitar el intercambio de materiales. Esta membrana cuenta con unos poros o canales de proteínas que comunican el interior con el medio externo, gracias a las cuales ocurre el ingreso de sustancias útiles para la nutrición y la salida de aquellas que son desecho. Es una membrana semipermeable. Su composición se caracteriza por la presencia de una doble capa de fosfolípidos con proteínas incrustadas. Tiene un papel fundamental también en otros procesos importantes como la adhesión celular y la comunicación celular que permite el intercambio de información con otras células o tejidos. La membrana celular utiliza cuatro métodos de transporte: -Ósmosis pasiva y difusión. -Transporte activo. -Endocitosis. -Exocitosis. Finalmente, la membrana celular ayuda a fijar el citoesqueleto por lo que es vital en mantener la forma de la célula y permitirle formar parte de grandes arreglos de células lo que da forma a los tejidos. Citoesqueleto: El citoesqueleto da la forma y mantiene la estructura de la célula y es fundamental en los procesos de endocitosis y división celular. Citoplasma: El citoplasma es todo el material celular con excepción del núcleo, o sea, incluye a todos los orgánulos o partes especializadas de la célula y al citosol, una sustancia incolora y de consistencia semilíquida en la que se encuentran numerosas moléculas y se llevan a cabo las algunas reacciones químicas.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Es en el citoplasma donde la mayoría de las actividades celulares ocurren, incluyendo varias rutas metabólicas como la glucólisis y procesos como la división celular. El citosol es la parte del citoplasma que se encuentra fuera de los organelos delimitados por membranas y equivale aproximadamente al 70% del volumen celular. ORGANELOS: Retículo endoplasmático: Es un sistema de canales y sacos aplanados e interconectados envueltos en una membrana. La elaboración, almacenamiento y transporte de algunas sustancias tiene lugar en este organelo. También otorga soporte interno. Aunque el retículo endoplasmático está presente en la mayoría de las células eucariotas, no se encuentra en los glóbulos rojos ni en los espermatozoides. Existen dos tipos de retículos endoplasmaticos, el liso y el rugoso. Este último tiene esa apariencia porque tiene ribosomas adheridos a su superficie. Sin embargo,éstos ribosomas no son parte estructural del retículo, ya que libremente se adhieren o desprenden de la membrana. Ribosomas: Los ribosomas son los organelos que sintetizan las proteínas vitales para muchos procesos celulares. Son complejas máquinas moleculares que se encuentran en todas las células vivas. Su forma es esférica y están formadas por ARN ribosómico y proteínas. Estos organelos pueden encontrarse en dos formas: libres en el citoplasma o asociados a las membranas del retículo endoplasmático rugoso y realizan su función de elaborar moléculas de proteínas uniendo aminoácidos. Sin embargo, los ribosomas siguen el orden especificado por el ARN mensajero que transfiere el código genético del ADN nuclear para indicar el orden en que los aminoácidos deben ser enlazados. Los ribosomas tienen dos partes, la subunidad menor que se encarga de leer el RNA y la subunidad mayor cuya función es juntar los aminoácidos para crea una cadena péptida. Mitocondrias: Las mitocondrias son las productoras de energía en la célula. La producen por medio del proceso conocido como respiración celular y es donde se elabora el Trifosfato de Adenosina (ATP, por sus siglas en inglés), una molécula que

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES constituye la principal fuente de energía usable por la célula para realizar sus funciones. Las mitocondrias sintetizan el ATP a partir de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos. No tienen una estructura definida ya que se deforman fácilmente pero normalmente son alargadas. Aparte de la producción de energía, las mitocondrias están relacionadas con los procesos de comunicación celular, diferenciación celular y la Apoptosis o muerte celular programada, pero también tiene control sobre el ciclo celular y el crecimiento celular. El número de mitocondrias en una célula varía ampliamente. Por ejemplo, los eritrocitos o glóbulos rojos, no contienen mitocondrias pero las células del hígado tienen alrededor de 2,000. Las Mitocondrias tienen varias partes: -Membrana mitocondrial externa. -Membrana mitocondrial interna. -Espacio intermembranoso. -Matriz. -Crestas. b. Medios de Crecimiento En la actualidad, el cultivo de células animales es uno de los sistemas más utilizados en la producción de biofármacos ya que ha demostrado tener ventajas con respecto a la expresión de proteínas recombinantes en bacterias u otros organismos eucariotas, tales como levaduras o cultivos de células vegetales. Sin embargo, su utilidad no es conocida totalmente dentro del ámbito farmacéutico ya que ha sido considerado como un sistema de producción costoso, de bajo rendimiento y difícil de manipular. Por ello, que se presenta de manera general el desarrollo de los cultivos de células animales como sistemas productores de biofármacos y se hace hincapié de sus ventajas y limitantes así como en las aplicaciones actuales y futuras de este sistema dentro de la industria biofarmacéutica. La composición de los medios de cultivo celular influye en la proliferación, morfología y fisiología de las células que se propagan en ellos. Se realizo un medio de cultivo a base de peptona y extracto de levadura grado industrial para adaptar las líneas celulares. El pH es ligeramente alcalino, en un rango de 7.2-7.4 cuyo valor es mantenido constante por un complejo de sistemas tampón, que hacen que cambie muy poco, para asegurar nuestra supervivencia, ya que si la sangre se vuelve ácida, aunque ligeramente, o básica, nos moriríamos.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES TIPOS DE CULTIVO CELULAR Cultivos en Monocapa: El cultivo celular se precisa como la forma de propagar y mantener en condiciones fuera del organismo células de origen animal o vegetal, tratando de que se mantengan sus funciones, propiedades bioquímicas y genéticas. Por diferencias en su habilidad de adherencia a algún material específico, pueden formar monocapa o mantenerse en suspensión, si proceden de órganos crecen en monocapa. Frecuentemente los cultivos en suspensión ocurren con células que son circulantes, y puede referirse a células sanguíneas. El mantenimiento en suspensión tiene como ventaja mayor facilidad de manipulación, debido a que durante el pase de un cultivo al siguiente, la separación del sustrato no requiere la adición de sustancias como la tripsina. Además es posible un mayor escalamiento, debido a que dependen esencialmente de la accesibilidad del medio y de la tensión de los gases pero no de la superficie del recipiente. Como desventajas se enfatiza la necesidad de agregar suplementos, y el hecho de que pueden perderse las interacciones espaciales y de adhesión. Las células para iniciar la proliferación requieren adherirse a la superficie del contenedor para cubrir la superficie de crecimiento o in vitro in vivo 18 confluencia. Cuando son derivadas de un tejido se denominan cultivo primario. Este tipo de células muestran un mejor crecimiento en monocapa. Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, botellas para el cultivo de tejido u otros. El material puede ser plástico o vidrio previamente tratado, en los que para desprender a las células se usan agentes proteolíticos como la tripsina. Cultivos en suspensión: A partir de cultivos primarios se pueden generar líneas celulares caracterizadas por su gran capacidad de multiplicación. Algunas líneas celulares pueden crecer como cultivos estacionarios o en suspensión con un periodo previo de adaptación. Esos también requieren de matrices como protectores a la superficie celular; son fuente de elementos nutricionales balanceados y se localizan en el suero. En ese sistema no es indispensable el anclaje y son de gran utilidad para la producción de proteínas extracelulares. Su ventaja práctica radica en que se reduce el manejo del cultivo, se optimiza el uso de equipos, reactivos y se obtiene un mejor nivel de producción. Cultivos Primarios: Se caracterizan por que provienen directamente de un tejido y conservan la morfología del órgano o tejido de donde provienen además mantienen su número diploide (2n). La mayor similitud a las células que las originaron redunda en una mejor actividad y funcionalidad; se ha descrito que poseen una baja probabilidad

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES de que se transformen en malignos por lo que se pueden usar para la producción de vacunas. Así mismo se ha indicado que pueden contaminarse con agentes adventicios especialmente de tipo viral del tejido original del aislamiento. Líneas Celulares: Son células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de que derivaron y que se han mantenido en cultivos continuos. Pueden ser resultado de una transformación, que se refiere a cambio de un cultivo primario a línea. No todas las líneas son igualmente sensibles al crecimiento de virus, lo que significa que no hay un tipo celular universal. Las líneas celulares pueden derivar de tumores, por transformación con oncogenes, o por tratamiento con carcinogénicos. Una particularidad es que pueden crecer de manera indefinida. Cultivos Tridimensionales: Son el tipo de cultivo que permite mantener la estructura como aparece en el tejido in vivo. Por su disposición permiten estudiar su mantenimiento, proliferación e interacciones con células contiguas, así como el efecto de diferentes sustancias o drogas que sean citotóxicos LAS CÉLULAS ANIMALES Y SU USO EN TRATAMIENTOS MÉDICOS Por qué se pueden implantar células animales? Y esto es posible porque las células animales son muy similares a las células humanas, son bloques vivos que constituyen la mayor parte de los cuerpos de los seres vivos. Sin embargo, todavía queda un largo camino por recorrer para saber si estos tratamientos tendrán efectos secundarios en el ser humano cuando se utilicen en el campo médico. LA IMPLANTACIÓN DE CÉLULAS ANIMALES EN ESPECIES DIFERENTES La ciencia ha dado un paso más. También se busca la integración de las células de un animal en otros animales, una experimentación genética entre animales que ya se ha hecho, y que podría dar lugar a la quimera de un animal híbrido. Para conseguirlo, se puede hacer o bien introduciendo los órganos de un animal en otro, una proposición arriesgada, porque el sistema inmunológico del huésped puede hacer que el órgano sea rechazado, o bien comenzando a nivel embrionario. Los científicos también usaron la tecnología CRISPR para crear embriones de ratón carentes de los genes que causan la formación de órganos. Luego se inyectaron células madre de rata en los embriones de ratón y se implantaron en un sustituto. Debido a que las células de rata todavía contenían los genes para la

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES formación de órganos, en las quimeras resultantes crecieron órganos compuestos en gran parte de células de rata. c. Anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son una poderosa herramienta para el diagnóstico de laboratorio y un instrumento cada vez más utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades de los anticuerpos monoclonales y se revisan conceptos relativos a la estructura y funciones de los anticuerpos, así como a la generación de diversidad, activación y maduración de los linfocitos B. Se mencionan las principales técnicas de producción de anticuerpos monoclonales y se enumeran algunas de sus aplicaciones en patología humana. Las células híbridas obtenidas tras el proceso de fusión contienen un número elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas divisiones celulares se irán perdiendo hasta oscilar entre los 70 y los 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas células pierden la capacidad de secreción de anticuerpos o bien funciones básicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonación para evitar el crecimiento de células no productoras que al ser metabólicamente más eficientes acabarían por dominar el cultivo. Los linfocitos B son responsables de la inmunidad humoral. Su función principal es la defensa del huésped contra gérmenes por medio de la secreción de anticuerpos que reconocen las moléculas antigénicas de los patógenos. Para producir anticuerpos monoclonales, primero se extraen células B del bazo de un animal que ha sido expuesto al antígeno. Estas células B son fusionadas en presencia de PEG (polietilenglicol) con células tumorales de mieloma múltiple (un tipo de cáncer) que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusión hace a las membranas celulares más permeables. Estas células fusionadas híbridas, llamadas hibridomas pueden multiplicarse rápida e indefinidamente (ya que son células tumorales después de todo) y pueden producir gran cantidad de anticuerpos. 3.- CULTIVOS DE CÉLULAS VEGETALES. El cultivo de células y de tejidos vegetales consiste en el cultivo de células vegetales aisladas o de fragmentos de tejido vegetal en un medio nutritivo en condiciones asépticas y su posterior regeneración en plantas funcionales. Con frecuencia, puede ocurrir que células vegetales no diferenciadas se desarrollen en plantas funcionales si se cultivan apropiadamente in vitro.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES El cultivo de células y de tejidos vegetales comprende una amplia gama de técnicas de cultivo que permiten regenerar plantas funcionales a partir de tejidos embrionarios, fragmentos de tejidos, callos, células aisladas o protoplastos. La regeneración de plántulas por medio de técnicas de cultivo de tejidos es un requisito fundamental para utilizar la tecnología de la genética molecular en una especie cultivada particular. Desafortunadamente, las especies cultivadas suelen responder de manera distinta a las técnicas de cultivo de células. Dentro del proceso de micropropagación en cultivos in vitro diferenciamos varias fases o etapas: FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades. FASE 1: DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada. FASE 2: INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro. FASE 3: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados. FASE 4: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTOS Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea. FASE 5: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones naturales (in vivo): IN VITRO

IN VIVO

• No realiza fotosíntesis

• Realiza fotosíntesis

• Crecimiento en condiciones controladas • Crecimiento en condiciones de asepsia • Alta humedad relativa

• Crecimiento en condiciones no controladas • Exposición a los patógenos y gérmenes del ambiente • Humedad relativa variable

• Estomas no funcionales

• Estomas funcionales

• Ausencia de pelos radiculares

• Presencia de pelos radiculares

• Ausencia de cera en la cutícula

• Presencia de cera en la cutícula

Para el trasplante, se requiere un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado , para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que se trabaja. Las condiciones del cultivo in vitro , generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia. Las especies vegetales estudiadas han sido: papa, boniato, ajo, frutilla, manzano, ciruelo, duraznero, peral, vid, frambuesa, zarzamora, arándanos, eucaliptos, marcela, especies aromáticas, especies forrajeras y otras. Con este mecanismo se ha buscado armonizar la demanda de plantas por parte de los productores interesados en este nuevo rubro y el interés de laboratorios comerciales y viveristas por ampliar los productos con calidad verificable que son ofrecidos a través de sus procesos de multiplicación de plantas. Las razones que determinan que el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales constituya una tecnología interesante para la producción de plantas y productos naturales de interés, son las siguientes: 1) la producción de plantas de sanidad controlada, lo que permite incrementos en los rendimientos.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES 2) la capacidad de establecer un sistema de producción definido, en relación a las demandas del mercado. 3) el cultivo de especies no domesticadas y/o difíciles de cultivar a campo. 4) la conservación del germoplasma de plantas de interés comercial o en vías de extinción. 5) la producción de compuestos químicos conocidos provenientes de plantas de crecimiento lento o difíciles de obtener por extracción o por síntesis química. 6) la síntesis de nuevos productos químicos expresados únicamente en los cultivos in vitro. 7) la producción de plantas transgénicas resistentes a patógenos, a herbicidas o a estrés abiótico, con mejor calidad nutricional, que actúen como biorreactores en la producción de proteínas, carbohidratos o lípidos.. a. Células vegetales. La célula vegetal es aquella que compone a los miembros del reino Plantae. Es una célula eucariota, con un núcleo diferenciado, membrana y citoplasma al igual que la célula animal. Ambos tipos de células comparten algunas características pero difieren en otras. Específicamente, la célula vegetal cuenta con partes únicas ya que realiza un proceso exclusivo del reino Plantae, la fotosíntesis. No obstante sus diferencias con la célula animal, es importante recordar que todas las células contienen el material genético hereditario que pasa a los descendientes. Los genes en la célula vegetal se encuentran en unas estructuras llamadas cromosomas dentro del núcleo celular. Presentan algunas diferencias: 

Las células vegetales presentan una pared celular celulósica, rígida que evita cambios de forma y posición.



Las células vegetales contienen plastidios, estructuras rodeadas por una membrana, que sintetizan y almacenan alimentos. Los más comunes son los cloroplastos.



Casi todas las células vegetales poseen vacuolas, que tienen la función de transportar y almacenar nutrientes, agua y productos de desecho.



Las células vegetales complejas, carecen de ciertos organelos, como los centriolos y los lisosomas.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES PARTES DE LA CÉLULA VEGETAL

Este tipo de células tiene una estructura con varios orgánulos iguales o semejantes a otras células eucariotas y otros completamente exclusivos como son: Núcleo: Es el centro de control de la célula y contiene la información genética en forma de ADN (Acido desoxirribonucleico). En todas las células de los miembros de una misma especie se halla el mismo número de cromosomas. Membrana nuclear: La membrana o envoltura nuclear, es una delgada capa de lípidos con orificios que consienten el acceso y la salida de material del núcleo de la célula y que separa al núcleo del citoplasma. Membrana plasmática o celular: Es también una capa externa pero en este caso envuelve a toda la célula. En su composición predominan los lípidos y las proteínas y su superficie exhibe unos diminutos poros necesarios para los procesos de intercambio de sustancias entre la célula y el exterior. El Citoesqueleto: Es una importante estructura que le da soporte y forma a la célula y mantiene a los orgánulos en su lugar. Es fundamental en el crecimiento, movimiento y

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES reproducción de la célula, así como en el intercambio de sustancias con el exterior. Pared celular: Es una capa o estructura rígida compuesta principalmente de celulosa y cuya función es proteger a la membrana plasmática y dar rigidez y forma a la célula. Adicionalmente, cuenta con unos conductos llamados plasmodesmos que permiten la comunicación con otras células. Tiene tres partes fundamentales: -Pared primaria. -Pared secundaria. -Laminilla media. Citoplasma: Es la materia dentro de la membrana plasmática exceptuando al núcleo y que contiene, al citosol y a los orgánulos de la célula. Está revestida por una delgada película. Para entenderlo mejor, es todo lo que se encuentra entre la membrana plasmática y el núcleo. ORGÁNULOS: Retículo endoplasmático: Se define como un sistema de membranas semejantes a sacos que rodean el núcleo, gracias a las cuales se realiza el transporte de sustancias dentro de la célula y también participan en la síntesis de proteínas y lípidos . Existen dos tipos el retículo endoplasmático liso y el rugoso . Aparato de Golgi: Se trata de un conjunto de sacos de forma aplanada y dispuestos de forma apilada, que se encarga de enviar sustancias a través de la membrana plasmática. Ribosomas: Son los sitios donde se realiza la síntesis de proteínas. Se componen de proteínas y ARN ribosómicos. Vacuola: Las células vegetales maduras tienen una vacuola de considerable tamaño que contiene líquidos. Es un orgánulo grande rodeado por una membrana llamada tonoplasto o membrana vacuolar. Gracias a las vacuolas los tejidos de las plantas permanecen rígidos.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Mitocondrias: Son el centro energético de la célula. Estos orgánulos están envueltos en dos membranas y normalmente se observan unas crestas en la membrana interna. En las mitocondrias se realiza la respiración celular por medio de la cual se produce ATP (Trifosfato de adenosina). Plastos: Producen y almacenan importantes elementos para el proceso de la fotosíntesis, la síntesis de lípidos y de aminoácidos. Existen dos tipos de plastos, los primarios y los secundarios. Los primeros se encuentran en la mayoría de las plantas mientras que los secundarios son exclusivos del plancton. Leucoplastos. Almacenan sustancias incoloras, pero permiten la conversión de la glucosa. Cromoplastos. Estos plastos son responsables de los maravillosos colores que tienen muchas frutas o flores. Cloroplastos. Son orgánulos característicos de la célula vegetal pues en ellos tiene lugar el proceso de la fotosíntesis. Contienen una sustancia de color verde o pigmento que recibe el nombre de clorofila y que confiere a las plantas su distintiva coloración verde. Los cloroplastos convierten la energía lumínica proveniente del sol en energía química. IMPORTANCIA DE LA CÉLULA VEGETAL Sin lugar a dudas la fotosíntesis, el proceso responsable de la transformación de la energía solar en materia orgánica es la piedra angular de la vida en la Tierra. Para lograr esto, la fotosíntesis crea moléculas de ATP y NADPH, las primeras donde queda almacenada la energía química creada. En general, también el núcleo de las células vegetales contiene el material hereditario que pasa de generación en generación. Al mismo tiempo, son el punto donde se llevan a cabo las imprescindibles funciones bioquímicas que sintetizan moléculas esenciales. A diferencia de la célula animal, la vegetal posee una pared celular que aporta rigidez y protección a la membrana plasmática. Sin embargo, esta pared no es exclusiva de la célula vegetal, ya que otras células eucariotas también la tienen. Los cloroplastos y las vacuolas son también inherentes a las células de cualquier tipo de planta que realiza la fotosíntesis. Este orgánulo es el responsable de la

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES tonalidad verde de las plantas y de la transformación de la materia inorgánica en materia orgánica a partir de la energía del Sol. Es un elemento importantísimo en la naturaleza ya que desprende el oxígeno vital que los seres vivos respiran. b. Tipos de cultivo de tejidos vegetales. La producción de plantas y de metabolitos puede realizarse mediante cultivos de tejidos vegetales diferenciados o indiferenciados. 

Cultivos diferenciados: Los métodos de regeneración de plantas por cultivo in vitro incluyen la embriogénesis somática y la organogénesis.

 Embriogénesis somática: Los embriones que no resultan de la fusión de gametos se definen como embriones somáticos, asexuales o adventicios. Son estructuras bipolares con un eje radical-apical, no poseen conexión vascular con el tejido materno y son capaces de crecer y formar plantas normales. La embriogénesis somática se puede obtener directamente a partir de células aisladas o utilizando callos. Si bien implícitamente todas las células vegetales tienen la información genética para formar una planta completa y funcional, se usan comúnmente cotiledones e hipocótilos para producir embriones somáticos. Generalmente se utilizan medios con altas concentraciones de sales, de sacarosa o de manitol y se necesita la presencia de una auxina para la iniciación del callo embriogénico, habitualmente 2,4-D. Como la maduración y la germinación de los embriones no ocurren en presencia de esta auxina, se usa en bajas concentraciones para permitir el desarrollo debe remover o usarla en bajas concentraciones para permitir el desarrollo. Además, tanto la inducción de la embriogénesis somática como el desarrollo de los estados subsiguientes dependen de la presencia de nitrógeno reducido. La maduración comienza después que el embrión completa el proceso de histodiferenciación, el crecimiento por mitosis se detiene y la célula comienza a expandirse y a acumular sustancias de reserva. En esta etapa no es necesaria la adición de reguladores de crecimiento en el medio de cultivo, aunque en algunas especies se recomienda el uso de citocininas y en otras la adición de ABA.  Organogénesis: La organogénesis consiste en la formación de un primordio unipolar a partir de una yema y el desarrollo de ese primordio en brotes vegetativos que luego enraizan vía la formación y proliferación de meristemas radicales. Los brotes pueden formarse directamente del explanto (organogénesis directa) o indirectamente a partir de callos. La organogénesis se desarrolla por inoculación de tejido meristemático estéril (yemas axilares o adventicias) en un medio suplementado con niveles óptimos de sales, de compuestos orgánicos y de reguladores de crecimiento. La calidad y cantidad de los componentes del medio dependerá de la especie y del explanto

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES que se quiera cultivar in vitro dado que la inducción de un tipo específico de órgano involucra señales aún poco conocidas. La micropropagación es la tecnología más difundida de propagación masiva de plantas vía organogénesis. Consiste en un conjunto de procedimientos asépticos de cultivo de órganos, tejidos o células que permitan la producción de poblaciones de plántulas idénticas a la planta original de la que se derivan. Los cultivos diferenciados son más estables genéticamente que los cultivos indiferenciados. A su vez, los cultivos de yemas axilares que provienen de meristemas preexistentes presentan menores índices de variación genética que el cultivo de yemas adventicias que se originan de novo a partir de tejidos somáticos con desarrollo directo o indirecto a través de la formación de callos.  CULTIVOS INDIFERENCIADOS: Los cultivos vegetales indiferenciados se obtienen a partir de órganos o tejidos organizados cultivados en un medio nutritivo apropiado (sólido o líquido) que desdiferencian ante la presencia de auxinas exógenas. En medio sólido se obtienen masas celulares más o menos compactas que constituyen los callos, mientras que en medio líquido se logran las suspensiones celulares formadas por células libres o agregadas. Los cultivos de células vegetales indiferenciadas pueden exhibir una gran variedad estructural, genética y metabólica con respecto a la planta madre.  Tipos celulares presentes en los cultivos in vitro indiferenciados En los cultivos indiferenciados se encuentran células con gran variedad de tamaños y formas, de citoplasma denso, con vacuolas pequeñas y con alto potencial morfogénico que se pueden homologar a las células meristemáticas de las plantas. También se observan células alargadas y células muy grandes con una gran vacuola central y bajo. Sin embargo, debido a que las células en suspensión se dividen en forma asincrónica, los tipos celulares descritos pueden no corresponder a tipos celulares diferentes sino a distintos estadios dentro del ciclo de crecimiento. La adición de pectinasas, la reducción de la concentración de calcio y el aumento de la velocidad de agitación permite reducir la agregación. c. Medios de cultivo. Componentes inorgánicos del medio de cultivo Los medios de cultivo están constituidos por componentes inorgánicos, los cuales son suministrados en cantidades relativamente grandes (macronutrientes) y otros añadidos en menor cantidad (micronutrientes). Dentro de los macronutrientes, se encuentran iones de nitrógeno (N), potasio (K), calcio (Ca), fósforo (P), magnesio (Mg) y azufre (S).

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES El nitrógeno se adiciona al medio de cultivo en forma de nitrato o iones amonio, o la combinación de ambos iones, el sulfato de magnesio (Mg SO 4 7H2O) satisface tanto el requerimiento de magnesio como el de azufre, el fósforo puede adicionarse en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O ó KH2PO4, el potasio es un catión que se agrega en forma de KCl, KNO3, ó KH2PO4, el calcio se adiciona con Ca Cl2.2H2O, Ca(NO3)2.4H2O o la forma anhidra de cualquier sal y el cloro se presenta en forma de KCl ó CaCl2. Los requerimientos de nitrógeno son generalmente provistos por una mezcla de nitrato y amonio en concentraciones variables entre 3 y 50 mM. Los micronutrientes, que son añadidos a los medios de cultivo son hierro (Fe), níquel (Ni), cloro (Cl), manganeso (Mn), cinc (Zn), boro (B), cobre (Cu), y molíbdeno (Mo). Estos elementos junto con el carbono (el C), oxígeno (O) e hidrógeno (H) constituyen los 17 elementos esenciales. Estos micronutrientes aunque son requeridos en menor cantidad son necesarios para una adecuada actividad metabólica de las células vegetales. El Fe y el Mn son esenciales para la síntesis de clorofila y la función de los cloroplastos. El Fe es requerido para la formación de precursores de la clorofila y es un componente de los citocromos, ferredoxina y legohemoglobina, esta última es esencial en la fijación de nitrógeno por las plantas leguminosas se agrega al medio de cultivo en una concentración de 0,01 a 0,15 mM. El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso fotosintético. Los elementos Cu y Zn son requeridos para la oxidación e hidroxilación de compuestos fenólicos. El Zn está relacionado con la síntesis de triptófano, precursor del ácido indolacético (AIA) y ejerce control sobre las ribonucleasas lo que permite mantener la síntesis proteica en caso de estrés ambiental (medio de cultivo). El Cu, además es un componente de la Plastocianina que es esencial en el funcionamiento del transporte electrónico de la fotosíntesis y es activador de otras enzimas como la oxidasa del ácido ascórbico (Vitamina C), tirosinasa, lacasa, fenolasa y citocromoxidasa, esta última forma parte de la cadena de transporte electrónico del proceso respiratorio. El Mo forma parte de las nitratorreductasas de las plantas y nitrogenasas en leguminosas y bacterias fijadoras de nitrógeno. El boro (B) es necesario para el mantenimiento de la actividad meristemática, está involucrado en la síntesis de bases nitrogenadas. Luego el Fe es añadido en forma de quelato cuyas moléculas son capaces de retener un ión de un metal con varias uniones químicas formando un anillo complejo (un quelato) como el EDTA (ácido etilendinitrotetraacético), que utilizado en bajas concentraciones estimula el crecimiento al hacer disponible en bajas cantidades este elemento. La concentración necesaria de fosfato indicada en los diferentes medios de cultivo varía entre 0,1 y 1,5 mM. Generalmente se agrega calcio en mayores concentraciones que en los medios microbianos, variando entre 1 y 3 mM.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES En general el boro, el manganeso, el iodo y el zinc se utilizan en concentraciones variables entre 1 y 100 mM, mientras que el resto de los micronutrientes se agregan en valores inferiores a 0,1 mM. El medio de cultivo más utilizado es la formulación de las sales Murashige y Skoog el cual fue desarrollado inicialmente para el crecimiento de callos de tabaco y en la actualidad se emplea como medio de cultivo basal para un grupo importantes de plantas de interés para la alimentación y con fines ornamentales. Sales minerales del medio de cultivo de Murashige y Skoog: Ingredientes

Cantidad en mg L-1)

NH4NO3

66 000

K NO3

76 000

Mg SO4.7H2O

14 800

KH2 PO4

6 800

Fe SO4.7H2O

1390

Na2 EDTA.2H2O 1865 CaCl2.2H2O

15172

H3BO3

6200

Mn SO4.H2O

16900

Zn SO4.7H2O

8600

Na2 MoO4.2 H2O 240 Cu SO4.5H2O

25

Co Cl2.6H2O

25

KI

83

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Componentes orgánicos del medio de cultivo Dentro de los componentes orgánicos del medio de cultivo se encuentran: Carbohidratos La nutrición que es desarrollada en las condiciones in vitro a partir en los diferentes órganos y tejidos son ampliamente heterótrofos con respecto al carbono debido a la ausencia o insuficiencia de asimilación clorofílica, por lo cual resulta indispensable añadir azúcares a los medios de cultivo como fuente de energía y reguladores osmóticos. La sacarosa es el azúcar empleado universalmente. Le siguen en importancia glucosa, maltosa, rafinosa, fructosa y galactosa entre otros. La sacarosa, en concentraciones del 2 al 4 % (p/v), constituye la fuente más utilizada. Otros azúcares capaces de sostener el crecimiento o incrementar la producción de metabolitos son glucosa, fructosa, trehalosa, maltosa y lactosa. Vitaminas Si bien las plantas son autótrofas, puede ser necesario añadir al medio de cultivo algunas vitaminas hasta que los cultivos prosperen. Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalíticas en el metabolismo y son requeridas en pequeñas cantidades. Las vitaminas más empleadas son: 

Tiamina (vitamina B1): se añade como hidrocloruro de tiamina y constituye una vitamina esencial para el crecimiento de células vegetales. Es un coenzima de la descarboxilación de los cetoácidos piruvato y œcetoglutarato y es esencial para el crecimiento radical pues interviene en la síntesis de citocininas.



Ácido Nicotínico: forma parte de las coenzimas NAD y NADP que intervienen en la transferencia de hidrógeno, además de ser precursor el triptófano y por tanto tiene un efecto sinérgico con el AIA en la producción de raíces y ejerce acción inhibitoria en el desarrollo de yemas axilares.



Piridoxina (Vitamina B6): Es añadida como hidrocloruro de Piridoxina (Piridoxina-HCl). Participa como coenzima en el metabolismo de los aminoácidos, entre ellos el triptófano, precursor de AIA y ácido nicotínico, además de favorecer la formación de raíces.



Myo-inositol: No es propiamente una vitamina, sino un azúcar-alcohol. Tiene un efecto sobre la proliferación de tejidos y sobre la activación de la organogénesis.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES 

Ácido ascórbico y ácido cítrico: Son añadidos a los medios de cultivo en ocasiones no como vitaminas sino como antioxidantes para evitar el oscurecimiento de determinados tejidos.

Aminoácidos y extractos naturales En general, si los aminoácidos corresponden a la forma D son inhibidores, mientras que en la forma L tienen acción benéfica. Los aminoácidos favorecen la proliferación de callos y la organogénesis. Los efectos obtenidos mediante el aporte de aminoácidos parecen muy variables según la especie y el tipo de morfogénesis estudiada. Dentro de ellos se encuentran la glutamina, L-arginina, L-cisteína entre otros. Los extractos naturales estimulantes son numerosos productos de composición variable y no bien definida. Dentro de ellos se encuentran extracto de levadura, hidrolizado de caseína, peptona y agua de coco (más utilizado) entre otros. Agentes gelificantes El agar se ha convertido en el material de soporte más ampliamente usado, pues provee el medio de un excelente gel húmedo que sirve como soporte al explante. También es utilizado el gelrite o fitagel. Agua Es de vital importancia la calidad del agua empleada para realizar los medios de cultivo la cual debe ser destilada. Siempre que se realicen trabajos con cultivo de tejidos y células in vitro el agua a usar debe tener la mayor calidad posible (desionizada), debiendo estar entre 0.5 a 2 mS/ cms. Reguladores del crecimiento vegetal Los reguladores del crecimiento vegetal se agrupan en cinco categorías: auxinas, citokininas, giberelinas ácido abscísico y etileno. Además de estas sustancias naturales de la planta existen otros productos que pueden utilizarse como reguladores del crecimiento para el cultivo in vitro. Los reguladores de crecimiento son componentes exclusivos de los medios de cultivos vegetales. El pH inicial de los medios de cultivo se regula, en general, entre pH 5,5 y 6,0, dado que afecta tanto el crecimiento como la producción. Principales reguladores del crecimiento empleados en cultivo de tejidos. AUXINAS 

ANA: Ac. naftalenacético



2,4 D: Ac. 2,4 diclorofenoxiacético



Picloram

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES 

Dicamba

CITOKININAS 

BAP: 6 - bencilaminopurina



KINETINA: 6 - furfurilaminopurina



Z: Zeatina

GIBERELINAS 

GA3: Ac. giberélico



GA1, GA4, GA7: (giberelinas)

ETILENO ACIDO ABSCISICO POLIAMINAS 

Putrescina



Espermidina



Espermina

BRASINOESTEROIDES 

Análogos Biobras 6



Biobras 16

OLIGOSACARINAS 

Pectimorf: oligogalacturónido DPS (12-14)

Estos nutrientes deben estar en una concentración tal que permita el adecuado crecimiento celular. Muchas células vegetales son sensibles a los niveles de fosfatos en el medio. Habitualmente, los fosfatos son almacenados en la vacuola y adquiridos desde allí para el crecimiento, mientras que la síntesis de metabolitos comienza al agotarse el fosfato vacuolar. d. Producción de metabolitos secundarios. Algunas células vegetales producen metabolitos secundarios importantes en las interacciones de la planta con el medio ambiente (protección frente a depredadores, patógenos o estrés ambiental) o que están relacionadas con la maquinaria reproductiva de la planta (atracción de insectos para la promoción de la polinización). Muchos de estos productos secundarios tienen uso en la industria farmacéutica y en la producción de tests de diagnóstico, de fragancias, de aditivos alimentarios y de biocidas en general.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Metabolitos secundarios producidos por cultivos in vitro de celulas vegetales:

4. MEDICION DEL CRECIMIENTO CELULAR: Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. En este punto nos vamos a referir al crecimiento microbiano a escala de poblaciones comenzaremos con algunos métodos habituales de medir ese crecimiento. 

Aumento de masa del cultivo



Aumento de numero de células

Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado o equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES 1.-MEDIDA DE MASA CELULAR Esta técnica es utilizada para medir el peso de las bacterias, es un método muy utilizado a que si la población aumenta de masa celular. 1.1.- MÉTODOS DIRECTOS En estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas. 1) Determinación del peso húmedo: se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.  Se tara un tubo de centrifuga  Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante,  Se determina el peso del sedimento La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. 2) Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105ºC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo. El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad relativa alta.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES 3) Determinación del nitrógeno total: “técnica de micro-Kjeldahl.” Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una muestra con relación al compuesto que se quiera determinar. Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el nitrógeno proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret, Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la Digestión de Kjeldahl. 4) Determinación de un componente característico: Es una técnica que determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico (generalmente ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.) 1.2.- MÉTODOS INDIRECTOS 1) Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos. 2) Métodos turbidimétricos (ópticos). Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión). b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro. a. Medición del número de celulas: Consiste en insertar a las células en una cámara para hacer el proceso de tinción, lo que permite determinar el número de microorganismos que se han desarrollado en la dilución de la muestra en el volumen de la cámara con las cuales se puede identificar el número de células muertas y vivas para predecir cuál será la cantidad de células crecientes en un tiempo definido. MÉTODOS DIRECTOS 1) Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas: La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

2) Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). b. Métodos Indirectos 1) Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original. 2) Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro

Se de las se

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro. 5. INMOVILIZACIÓN CELULAR La inmovilización celular puede ser definida como la ubicación física de células en un espacio o región específica, de forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una actividad catalítica deseada. El termino inmovilización de células se refiere a células físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida en el espacio reteniendo sus propiedades y actividades catalíticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilización tanto las células como las enzimas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser utilizadas repetida y continuamente en diversos procesos químicos. Por razones técnicas y económicas la mayoría de los procesos químicos llevados a cabo por células requieren su reutilización o el continuo uso de biocatalizadores durante largos periodos de tiempo. Bajo esta perspectiva, la inmovilización debería ser definida como una técnica capaz de reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y células. Por lo tanto, la sencillez y el bajo costo de los métodos de inmovilización juegan un papel fundamental en la selección de protocolos de inmovilización. Es por ello que por medio de la inmovilización es posible no solo controlar la ubicación de las células sino también modificar sus propiedades selectivamente. Entre las principales ventajas que presentan los sistemas biotecnológicos que utilizan células inmovilizadas se encuentra su facilidad para el manejo de una mayor densidad celular comparado con los procesos tradicionales, un mejor control en sistemas continuos y la posible recuperación de la biomasa para su posterior reutilización. En general, los materiales para inmovilizar células deben cumplir importantes requisitos como: ser grado alimenticio (según sea el caso), bajo costo, disponibilidad, no degradables y aptos para condiciones de pH y temperatura bajas. Los métodos de inmovilización de células más usados son la auto floculación, la adsorción sobre soportes y la incorporación de levaduras en matrices sólidas. La inmovilización de microorganismo en soportes naturales o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. La inmovilización también puede proporcionar condiciones favorables a la diferenciación celular y la comunicación de célula a célula, alentando así la producción de altos rendimientos de metabolitos secundarios. La inmovilización puede proteger las células y de esta manera disminuir los problemas relacionada con las fuerzas de cizallamiento.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES Tabla 1: Métodos de inmovilización celular Método

Materiales

Fijación a una superficie

Astillas de madera, colágeno, micro vehículos, intercambio iónico a una superficie resinas, óxidos metálicos

Atrapamiento dentro de matrices Cordierita, poro de vidrio, acrilamida, porosas alginato, matrices porosas de Colágeno, K-carragenina. Detrás de una barrera de contención

Polilisina contención, etilcelulosa, emulsión, barrera sintética

Auto agregación

Sedimentos miceliales, témpanos microbianos, polielectrolitos, agentes de reticulación

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS. La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a un soporte. Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: 1. El aumento de la estabilidad de la enzima. 2. La posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. 3. La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen en la Figura 1. Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza. Figura 1: tanque agitado.

CAPITULO 7. CULTIVOS CELULARES

Las desventajas del Proceso de Inmovilización Son: 1. La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo. 2. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte. 3. Siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la movilización. 4. El biocatalizador es más caro que la enzima nativa.