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Facultad de Ciencias de la Salud Escuela de Farmacia y Bioquímica

Análisis Instrumental

MATERIAL 13 TEMA: CROMATOGRAFÍA. Generalidades La cromatografía fue inventada por el botánico Ruso Mikhail Tswett en 1906. Él empleó la técnica para separar diversos pigmentos vegetales, como clorofilas y xantofilas, haciendo pasar disoluciones de estas especies a través de columnas de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza) finamente dividido. Tswett utilizó como detector del experimento la simple observación, ya que los compuestos que separó tenían color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, lo cual explica el nombre que eligió para este método: de las palabras griegas chroma, que significa “color” y graphé, que significa “escribir”. 1.

Definición: La cromatografía se define como un procedimiento que permite la

separación, identificación y Cuantificación de los componentes químicos en mezclas complejas. Es una técnica en la cual los componentes de una muestra se distribuyen entre dos fases, una fija o estacionaria y una fase móvil gaseosa o líquida. La fase estacionaria, está fija en un lugar que puede ser una columna o una superficie plana; y la fase móvil, se mueve sobre la fase estacionaria o a través de ella, arrastrando consigo la mezcla de analitos, hasta que estos finalmente emergen por separado de otros solutos que eluyen antes o después. La fase móvil puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. La velocidad de desplazamiento es función del coeficiente de distribución de cada componente entre las dos fases; las sustancias individuales presentan diferentes movilidades a causa de diferencias de adsorción, partición, solubilidad, presión de vapor, tamaño molecular o densidad de carga iónica. En general el soluto es transportado a través del medio de separación por medio de una corriente de disolvente líquido o gaseoso denominado “eluyente”. En la práctica, las separaciones con frecuencia son el resultado de una combinación de efectos de adsorción y de partición. 2.

Clasificación de los métodos Cromatográficos:

Los métodos cromatográficos son de 2 tipos: 2.1. Cromatografía en columna: la fase estacionaria es un sólido finamente dividido sostenido en un tubo estrecho de vidrio o metal y a través de él se fuerza el paso de la fase móvil ya sea por presión o por gravedad (percolación). MSc. William Sagástegui G.

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2.2. Cromatografía plana: la fase estacionaria está sostenida sobre una placa plana de vidrio o en los poros de un papel. Aquí la fase móvil se desplaza a través de la fase estacionaria por capilaridad o por efecto de la gravedad. Los métodos cromatográficos se dividen en tres categorías, según la naturaleza o estado físico de la fase móvil: -

Líquido, hay 5 tipos

-

Gas, hay 2 tipos,

-

Fluido supercrítico. Ver Tabla: 7.1.

Tabla 7.1. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna Clasificación general

Método específico Gas-líquido (GLC)

Cromatografía de gases (CG) Gas-sólido Líquido-líquido reparto

Cromatografía líquida (CL)

Líquido-sólido adsorción Intercambio iónico Exclusión tamaño Afinidad

Fase estacionaria

Líquido adsorbido o Reparto entre gas y unido a una superficie líquido sólida Sólido Adsorción o Líquido adsorbido o Reparto entre unido a una superficie líquidos inmiscibles sólida o Sólido Adsorción

Resina de intercambio iónico por Líquido en los intersticios de un sólido polímero Líquido con grupo específico unido a una superficie sólida

Cromatografía de fluídos supercríticos (SFC) (Fase móvil: fluido supercrítico)

Tipo de equilibrio

Intercambio iónico Reparto/tamizado

Reparto entre líquido superficial y líquido móvil

Especie orgánica unida a Reparto entre fluido una superficie sólida supercrítico y superficie unida

3. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA: Los tipos de cromatografía útiles en el análisis cualitativo y cuantitativo que se emplean en los procedimientos cromatográficos de la USP son: MSc. William Sagástegui G.

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-

Cromatografía en columna,

-

Cromatografía de gases,

-

Cromatografía en papel,

-

Cromatografía en capa delgada (incluida cromatografía en capa delgada de alta resolución) y

-

Cromatografía de líquidos presurizados (comúnmente llamada cromatografía líquida de alta resolución o HPLC). (antes llamada, alta presión).

En cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de la fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas. Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la cromatografía líquida de alta resolución puede ser: 1. Cromatografía de adsorción. La fase fija es un sólido y se utiliza casi exclusivamente sílice (sílica) y en mucha menor medida alúmina. 2. Cromatografía de reparto. En casi todos los casos, como fase estacionaria se utilizan compuestos unidos químicamente a un soporte sólido de sílica. Se la subdivide en cromatografía en fase normal y fase reversa. En la cromatografía en fase normal, la fase fija es polar (como por ejemplo agua o trietilenglicol) y los compuestos menos polares eluyen primero. En la cromatografía en fase reversa, el compuesto unido químicamente es un hidrocarburo alifático y se emplean fases móviles polares. En este caso, las sustancias más polares eluyen primero. 3. Cromatografía iónica. Se utilizan columnas rellenas con resinas de intercambio iónico para separar y determinar iones. 4. Cromatografía de exclusión por tamaño. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros y llevan a cabo un fraccionamiento relacionado con el tamaño molecular. Las moléculas de tamaño mayor son MSc. William Sagástegui G.

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excluidas y eluyen primero, mientras que las más pequeñas que penetran en los poros son retenidas más tiempo. 4. CONCEPTOS BÁSICOS EN CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: 4.1. Elución: es un proceso en el cual los solutos son arrastrados a través de una fase estacionaria por el movimiento de una fase móvil. 4.2. Eluyente: es un disolvente que se usa para transportar los componentes de una mezcla a través de una fase estacionaria. 4.3. Cromatograma: es una gráfica de alguna función de la concentración de un soluto frente al tiempo de elución o el volumen de elución. Si un detector se coloca en el extremo final de una columna durante la elución y se representa gráficamente su señal en función del tiempo (o del volumen de la fase móvil añadida), se obtiene una serie de picos, diagrama conocido como cromatograma, y es útil para el análisis cualitativo y cuantitativo. La posición de los picos sobre el eje tiempo puede usarse para identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan una medida cuantitativa de la cantidad de cada especie. 4.4. Tiempo de retención tR: es el tiempo transcurrido entre la inyección de una muestra y la aparición de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica. 4.5. Tiempo muerto o tiempo vacío tM : es el tiempo que una especie no retenida tarda en pasar a través de una columna cromatográfica. Todos los componentes pasan algún tiempo muerto en la fase móvil. El analito es retenido porqué pasa un ts en la fase estacionaria. t R = tS + tM

7.1.

4.6. Ensanchamiento de banda y eficiencia de columna: La eficiencia de una columna cromatográfica se ve afectada por el ensanchamiento de banda que se produce cuando los compuestos pasan a través de ella. Cromatografía lineal, Constante de distribución: Todas las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias en el grado en que los solutos se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria. Para la especie de soluto A, el equilibrio implicado se describe con la ecuación: A(móvil)

A (estacionaria)

La constante de equilibrio K de esta reacción se conoce como Constante de distribución MSc. William Sagástegui G.

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(Kc), la cual se define como:

K

( aA) S ( aA) M

7.2

Donde (aA)S es la actividad del soluto A en la fase estacionaria y (aA)M es la actividad del soluto en la fase móvil. A menudo se sustituye cS, la concentración analítica molar del soluto en la fase estacionaria por (aA)S y cM por su concentración analítica molar en la fase móvil (aA)M. Por tanto la ecuación 7.2 se suele escribir como: K

cS cM

7.3

En el caso ideal, la constante de distribución (o razón de partición) es constante en un amplio intervalo de concentraciones de soluto; es decir cS es directamente proporcional a cM. Pero con mayor frecuencia no hay relaciones lineales. La constante de distribución para un soluto en cromatografía es igual a la relación entre su concentración molar en la fase estacionaria y su concentración molar en la fase móvil. Las concentraciones en una columna cromatográfica son por lo general bajas. “La cromatografía quese lleva a cabo bajo condiciones tales que K es constante, se denomina cromatografía lineal”. Aquí se considera solo este tipo de cromatografía. Cromatografía de elución lineal: En la cromatografía de elución, una única porción de la muestra disuelta en la fase móvil se introduce en la parte superior de la columna, después de lo cual los componentes de la muestra se distribuyen entre ambas fases. El agregado de una cantidad adicional de fase móvil (eluyente) hace avanzar columna abajo al disolvente que contiene una parte de la muestra, donde se produce un nuevo proceso de partición entre la fase móvil y las porciones nuevas de la fase estacionaria. Simultáneamente, la partición entre el nuevo disolvente y la fase estacionaria tiene lugar en el sitio de colocación inicial de la muestra. Las continuas adiciones de disolvente desplazan a las moléculas de soluto a lo largo de la columna en una serie de transiciones entre la fase móvil y la fase estacionaria. Debido a que el movimiento del soluto puede tener lugar solo en la fase móvil, la velocidad media a la que migra el soluto, depende de la fracción de tiempo en el que permanece en esa fase. Esta fracción es pequeña para los solutos con relaciones de partición que favorecen la retención en la fase estacionaria y grande para aquellos en los que la retención en la fase móvil es más importante. En condiciones ideales las diferencias resultantes en estas MSc. William Sagástegui G.

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velocidades hacen que los componentes de una mezcla se separen en bandas localizadas a lo largo de la columna. El aislamiento puede lograse entonces haciendo pasar suficiente fase móvil por la columna para hacer que estas distintas bandas sobrepasen el extremo, donde pueden recogerse. Alternativamente, el contenido de la columna puede ser extraído y dividido en porciones que contienen los distintos componentes de la mezcla. El proceso por el cual el soluto es lavado en la columna añadiendo nuevo disolvente se llama elución. Teorías de la elución cromatográfica: Teoría de la velocidad de una columna: La forma gaussiana típica de una banda cromatográfica puede ser atribuida a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las diversas moléculas cuando éstas descienden por la columna. Es importante comprender que las anchuras de las bandas de elución nunca pueden ser más estrechas que la anchura de la zona de inyección. Es instructivo considerar una sola molécula de soluto cuando es sometida a varios miles de transferencias entre las fases estacionaria y móvil durante la elución. El tiempo de residencia entre cualquiera de las fases es muy irregular. La transferencia de una fase a otra requiere de energía, y la molécula debe adquirir esa energía de su entorno. Así, el tiempo de residencia puede ser corto en algunas transferencias y relativamente largo en otras. Recuerde que el movimiento a lo largo de la columna puede producirse solamente mientras la molécula está en la fase móvil. BIBLIOGRAFIA 1. Skoog, D; West, D.; Holler, J.; Cruch, S. fUndamentos de Química Analítica. 8º Edición. Editorial International Thomson Editores S.A. México. 2005. 2. U.S. Pharmacopeia National Formulary (USP NF). USP XIX, XX, XXI, XXII, XXIII. XXVI. Mack Publishing. 2005. 3. “Farmacia Práctica de Remingtón", 19º ed. Ed. Médica Panamericana.UTHEA. 2004. 4. CONNORS, "Curso de Análisis Farmacéutico", REVERTE, Barcelona, 1986.

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