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• Skiel Rosales

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Bolilla 3 Biotipos reproductivos, características determinantes. Biotipos bovino y porcino. Ciclo estral en especies de interés veterinario. Maduración espermática. Transporte de espermatozoides por el tracto reproductor masculino. La alimentación y su influencia sobre la pubertad y edad del primer servicio: efecto sobre la fertilidad de los animales. Fertilización in vitro: capacitación espermática, Maduración del ovocito y fertilización.

Biotipo

Un biotipo reproductivo comprende un conjunto de características morfológicas, fisiológicas y de comportamiento que dan entidad a un animal o especie (en esta presentación se considerarán los biotipos bovinos, equinos, caprinos - ovinos y porcino).

Patrón reproductivo

Pubertad

bovinos •La hembra bovina es monotoca, poliéstrica continua de ovulación espontánea. •De acuerdo a su estado corporal o en condiciones ambientales muy desfavorables, tiende a convertirse en poliéstrica estacional

La cerda es una hembra politoca poliéstrca. anual de ovulación espontánea

Alrededor de los 11 meses. Rango: 9-18 meses; el inicio está influenciado por la genética y condiciones ambientales externas. Duración 21 (18 – 23) días.

Duración: 18- 24 días, en promedio 19 - 21 días

•Estro: día 0

Estro: 48 - 72 h.

•Metaestro: 1 al 4 (ovulación en el día 1, período de desarrollo de CH )

•Ovulación: alrededor de las 40 h después de comenzado el celo. Mejor momento: 12 h antes de la ovulación. Si se usa semen refrigerado, 12 y 24 h después de observada

Ciclo estral Fases del ciclo estral:

porcino

•Diestro: 5 al 17. CL3 + predominancia de progesterona (P4) •Proestro: 3 días (18 al 20;

regresión del CL)

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Conducta estral 



La señal conductual definitiva de estro es permanecer de pie para ser montada. Los labios vulvares están hinchados y enrojecidos con una descarga delgada, mucosa. En estro se manifiestan atentas e inquietas. Con montas a otras vacas. Comportamiento homosexual.

en celo; 24 y 36 h si se usa semen congelado, asumiendo que se chequea celo 2 veces al día 

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Embrión

Reconocimiento maternal de la gestación

La señal conductual definitiva de estro es permanecer de pie para ser montada por el padrillo. Las cerdas en estro a menudo asumen la posición rígida, llamada reflejo de lordosis, cuando se aplica presión manual en la anca. Los labios vulvares están hinchados y enrojecidos con una descarga delgada, mucosa. La cerda en cautiverio busca al padrillo activamente. Otras señales de estro incluyen: apetito deprimido, inquietud, vigilancia, gruñido

Si la hembra ha quedado preñada, el embrión arriba al útero alrededor del día 3 ó 4 (90 horas) en el estado de mórula.

El embrión en desarrollo hacia el día 15-16 del ciclo dispara una señal antiluteolítica - Interferón Tau - producida en el trofoectodermo embrionario, el cual inhibe la liberación de PGF2a, manteniéndose el CL funcional.

No mantendrá la preñez si la camada es pequeña; los embriones deberían ocupar más del 50% del útero. Los blastocitos en desarrollo pueden señalar su presencia secretando estrógeno

Gestación En promedio, la gestación dura 280 días (278-293), primera ovulación posparto luego de los 30 días, usualmente 45-60 en vacas lecheras, por lo cual tienden a un intervalo inter parto de 12-14 meses

Duración: 114 días (3 meses, 3 semanas y 3 días).

Macho

Semen

a. Volumen del eyaculado: 4 - 8 a. Volumen del eyaculado: ml (raza de carne); 5 – 10 ml (raza 150 – 300 ml (libre de gel). lecheras). Espermatozoides / Espermatozoides / ml: 0,8 a 1.2 x eyaculado: 30 – 60 billones. 108/ml (billón) en razas Espermatozoides / ml: 200 carniceras; 1-2 billón en razas – 300 millones. lecheras. d. Espermatozoides por Total de células en el eyaculado: dosis de IA: 5 billones. 5 – 10 billones (carne); 5-15 billones (leche). d. Eyaculado en una sola fase.

e. Volumen de la dosis: 50 ml. eyaculado en tres fases

Ciclo estral de las diferentes especies

Equino Ciclo estral Duración: 21 – 22 días.

Fases del Ciclo estral Generalmente se divide en dos fases, ya que los cambios no son tan marcados como en otras especies: 

Fase de estro o folicular: de 3 a 7 días. La duración del estro decrece con el progreso de la estación.



Fase de interestro o luteal: de 14 a 16 días.

Fase folicular • Período de receptividad sexual; duración: 5 días (3 a 7), la misma decrece con el progreso de la estación. • Hacia la mitad de la fase se liberan cantidades significativas de FSH como también de pulsos de LH, resultantes de la liberación de GnRH desde el hipotálamo.

Ovulación • Tiene lugar 24 h antes del fin del estro a 24h después del fin del estro. En el día de la ovulación, los pulsos de LH son altos: 1,75 a 2,0 pulsos/h. La amplitud de los pulsos también se incrementan desde ~ 40 ng/ml a cerca de 200 ng/ml. • Alrededor del 15% de las yeguas presenta un estro dividido o bifásico, con 1 o 2 días en el medio sin receptividad sexual, con posterior retorno al celo. • Un 5% presenta celo silente.

Signos del estro    

Tolera la monta Levanta la cola Palpitación vulvar Orina frecuentemente

Fase luteal: • También llamada interestro, se extiende desde fin del estro hasta comienzo del siguiente, con una duración de entre 14 y 16 días. Esta fase se inicia con la ovulación y la consecuente organización del CL; dentro de las 24 a 48 h la yegua cesa de mostrar signos de estro. • Durante la fase luteal de la yegua hay una significativa foliculogénesis. El folículo dominante es de alrededor de 25 mm al momento de la luteólisis. Folículo ovulatorio: 45 a 50 mm.

Ovino y Caprino Ciclo estral duración 

17 días en la oveja (rango 16,5-17,5).



21 días en la cabra

Fase de estro •24 - 36 h en la oveja. •24 - 48 h en la cabra Comportamiento: no muy aparente en la oveja, buscará al macho y puede tener descarga mucosa por la vulva. La cabra se pone inquieta, menea la cola y busca al macho, puede observarse comportamiento homosexual.

•Ovulación: 24 - 27 h después del comienzo del estro.

Anestro estacional •El anestro estacional se caracteriza por pulsos de LH regulares pero de baja frecuencia. Durante este tiempo el sistema generador de pulsos es sensitivo al estradiol (producido por folículos pequeños o intermedios) el cual tiende a mantener muy baja la frecuencia de pulsos de LH. •El ciclo reproductivo en caprinos y ovinos es controlado por secreciones pulsátiles de LH, la cual es inhibida durante las estaciones de días largos (anestro estacional) y esta inhibición tónica se pierde durante las estaciones de días cortos.

Reinicio de la actividad reproductiva •Al comienzo de la estación reproductiva, el hipotálamo se vuelve sensitivo al estradiol y es capaz de producir GnRH, aún en presencia de grandes y sostenidos incrementos de estrógenos desde ovarios más activos. •Se piensa que la presencia del macho, la mejor nutrición y los días cortos, permiten al hipotálamo ser menos sensible al feed-back negativo del estrógeno (efecto macho).

Inseminación 

Oveja: 10-20 h después del comienzo del estro.



Cabra: 12-36 h después del comienzo del estro.

Servicio natural 

1 macho por cada 30 - 40 hembras.

Perras Etapas que componen el ciclo sexual, en donde por alguna manifestación diferencial (visible o no) se dividen en:

PROESTRO Tiene una duración de entre 4 y 15 días. Va desde que comienza el sangrado hasta que la hembra se deja servir. Se observan perdidas sanguinolentas por la vulva los labios vulvares se agrandan y endurecen. La hembra atrae a los machos debido a la presencia de feromonas.

ESTRO La duración de esta etapa es variable entre 5 y 10 días. Marca la aceptación del macho por parte de la hembra. La vulva se presenta con mayor edema y más blanda, lateraliza la cola y eleva el periné para permitir la copula. La hembra es fértil.

DIESTRO Es el periodo sucesivo al celo y dura de 56 a 58 días en hembras preñadas y de 60 a 100 días en hembras vacías.

ANESTRO La duración es de 2 a 10 meses. Es el periodo en que el endometrio sufre un proceso de reparación, preparándose para el próximo celo.

Gatas Ciclo estral El ciclo estral felino se divide en proestro, estro, diestro, interestro y anestro. El proestro, es el período del ciclo estral cuya duración puede ser tan breve (24 h) que pasa inadvertido o durar 1 a 2 días. Es el momento de actividad folicular (síntesis y secreción de estrógenos), cambios en la citología vaginal y preparación para el apareamiento y preñez. El aumento de las concentraciones séricas de estrógeno se relaciona con el comportamiento afectuoso de la hembra, y las características conductales (fricciones, pisoteo con los miembros posteriores, vocalizaciones y menor hostilidad hacia el macho) presentes en esta etapa del ciclo estral. En este período si bien la hembra atrae al macho, no permite la monta. El estro es el momento en que la hembra acepta el servicio, y la síntesis y concentración sérica de Estrógenos llega a los niveles más altos. La duración promedio de este período es de 6 a 10 días. Debido a las altas concentraciones de estrógeno plasmático, la gata aumenta las vocalizaciones, presenta lordosis, mantiene la cola hacia un lado y acepta la cópula .Este aumento de estrógeno, no solo produce un cambio del comportamiento, sino que también actúa sobre el epitelio vaginal produciendo la cornificación del mismo). En consecuencia, la citología vaginal de la fase folicular (proestro y estro) presentará células superficiales nucleadas y anucleadas. Las células superficiales son grandes, de bordes irregulares, núcleo oval y picnótico o sin núcleo. Una particularidad de las hembras felinas es que la ovulación es inducida por el coito. La estimulación vaginal durante la cópula produce un aumento de las señales neurales hacia la zona Medio ventral del hipotálamo con la consecuente liberación de GnRH. Esta última estimula la liberación de LH. La probabilidad de que ocurra ovulación está directamente relacionada con la amplitud de la Onda de LH, la que a su vez está asociada al número e intervalo entre las cópulas. Se ha informado que muchas cópulas en un breve período de tiempo se correlacionan con mayor probabilidad de ovulación

En ausencia de apareamiento u ovulación espontánea comienza la etapa llamada interestro, la cual es definida como la etapa que le sigue a un estro y precede al estro siguiente. La duración de este período varía de 8 a 10 días promedio. Mediante citología vaginal puede observarse un predominio de Células intermedias, células superficiales en menor proporción y ocasionalmente pueden visualizarse neutrófilos. Las células intermedias son más pequeñas que las células superficiales, con contornos celulares regulares y núcleo redondo u oval, el cual puede estar picnótico (Prats, 1992). Se denomina diestro a la fase en la cual existe un cuerpo lúteo funcional con la consiguiente secreción de progesterona. Si ocurre ovulación pero los ovocito no son fertilizados, los folículos se luteinizan y se forman cuerpos lúteos que secretan progesterona. La fase luteal es más corta que la gestación, y se denomina pseudogestación. En esta etapa, la concentración de progesterona sérica llega a niveles de más altos. La vida media de los cuerpos lúteos es de 25 a 35 días y al final de esta fase un período breve de interestro precede al siguiente estro, siempre y cuando las gatas estén en etapa reproductiva .En consecuencia la duración del período de pseudogestación es aproximadamente de 40 días. En esta fase la citología vaginal presenta las mismas características que la citología de interestro. Tanto en caninos como en felinos la síntesis de progesterona por parte del cuerpo lúteo es necesaria Durante toda la gestación, de esta manera las concentraciones séricas de esta hormona se mantienen estables en valores de 15 a 30 ng/ml, hasta aproximadamente el día 60, momento en que la concentración de progesterona disminuye abruptamente, coincidiendo con el día del parto. A diferencia de los cuerpos lúteos de la pseudogestación, los cuerpos lúteos de la gestación pueden mantenerse más allá de 25 días gracias a factores luteotróficos específicos como los de la pituitaria. El anestro es el período caracterizado por la ausencia de ciclos estrales. Esta fase ocurre cuando disminuyen las horas luz con el consiguiente aumento de melatonina y prolactina. Las concentraciones séricas de melatonina y prolactina son sincrónicas, se elevan durante los períodos de oscuridad y disminuyen durante los períodos de gran intensidad lumínica. Por lo tanto, el anestro felino se caracteriza por niveles elevados de prolactina y melatonina, y niveles basales de estrógeno y progesterona. En esta etapa, la citología vaginal presenta contenido mucoso, predominio de células Stornelli. Particularidades fisiológicas de la reproducción en felinos.

Pubertad Adquisición de la habilidad para lograr una reproducción exitosa. Etapa a partir de la cual un animal produce gametos fértiles y comienza a manifestar comportamiento reproductivo

Pubertad en la Hembra   

Edad al primer estro (celo): comportamiento reproductivo. Puede no haber ovulación. Edad a la primera ovulación: palpación rectal, ecografía. Puede no haber estro. Edad a la cual la hembra puede soportar una preñez: umbral metabólico.

Pubertad en el Macho •Edad cuando el comportamiento trata de ser expresado: monta y erección, sin producción de espermatozoides •Edad a la primera eyaculación: fluido seminal •Edad cuando aparecen los primeros espermatozoides en el eyaculado •Edad cuando aparecen los primeros espermatozoides en la orina: ocurrencia de la espermatogénesis. •Edad cuando el eyaculado contiene un número umbral de espermatozoides: 10 o 15 %.

Factores afectan el inicio de la pubertad Hormonales •Cambio en el hipotálamo a la sensibilidad de los esteroides • Aumento de amplitud y frecuencia en la secreción de GnRH

Ambientales •Temporada durante la cual nacen y se desarrollan •Fotoperiodo •Planos nutricionales •Estrés

Sociales •Presencia o ausencia del sexo opuesto •Numero de hembras alojadas juntas •Exposición al macho

Genéticas •Especie •Raza

Factores nutricionales que influyen en el inicio de la pubertad Cambio en la disposición de uso de la energía. Cierto grado de “adiposidad” es necesario para el inicio de la pubertad •La prioridad durante las primeras semanas de vida es el crecimiento y desarrollo. •Al aumentar el consumo energético, aumenta también la masa corporal. •Se produce un cambio en el gasto metabólico, comienza a “sobrar” energía y las funciones no vitales se desarrollan. •Ese “excedente” de energía es convertida en grasa, el hipotálamo reconoce el incremento de ácidos grasos y glucosa en sangre y se inicia el proceso de la pubertad. •El inicio de los pulsos de alta frecuencia de la GnRH está bajo la influencia de los niveles sanguíneos de glucosa y ácidos grasos libres.

La leptina y la reproducción 

Esta es la hormona responsable del control del apetito, cuando aumenta el nivel de grasa en el organismo, la leptina actúa sobre el hipotálamo para disminuir el apetito y aumentar el metabolismo basal.

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La leptina también tiene un rol importante en la reproducción, actuando a diferentes niveles del eje hipotálamo – hipófisis – gónada.

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La leptina es un factor necesario pero no suficiente para el inicio de la pubertad.

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La leptina es la señal más temprana de comienzo de la pubertad, contribuyendo a la activación del eje hipotálamo – hipófisis – gónadal.

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Además de la leptina , los altos niveles de glucosa y de ácidos grasos en sangre constituyen los factores en la alimentación que desensibilizan el hipotálamo con las gonotrophinas

Nutrición sobre la edad de servicio •Al destete puede hacerse la proyección a fin de determinar el AMD necesario para alcanzar el peso de entore a determinada edad

•DESTETE = 160 Kg. 15 meses 22 meses 27 meses

240 días 450 días 600 días

•ENTORE = 280 Kg. 0,500 g/día 0,270 g/día 0,200 g/día

PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES Las técnicas para producir embriones, mediante la maduración de ovocitos y su posterior fertilización in vitro, ofrece la posibilidad de obtener embriones a bajo costo para ser utilizados con fines de estudio o con propósitos comerciales. Los embriones se producen a partir de óvulos recuperados de ovarios provenientes de animales faenados o por aspiración folicular en vacas vivas Luego de una maduración in vitro, serán fecundados con espermatozoides. La fertilización in vitro puede realizarse por cocultivo de los espermatozoides con los ovocitos maduros o inyectando el espermatozoide en el espacio perivitelino (ICSI). Los embriones obtenidos son cultivados en estufas en condiciones atmosféricas especiales durante 7-8 días. Finalizado este periodo los embriones están en condiciones de ser transferidos a una receptora o criopreservados en termos de nitrógeno líquido para posterior transferencia. ALGUNAS VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES BOVINOS. Ventajas:    

Evaluación eficiente de la capacidad fertilizante de espermatozoides y ovocitos. Difusión del uso de semen valioso y escaso. – Prolongación de la vida reproductiva de animales genéticamente valiosos, inmaduros o muy viejos. Creación de bancos de gametos provenientes de animales seleccionados por excelencia productiva y/o adaptabilidad

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Determinación y selección del sexo de embriones. Control de enfermedades de la esfera reproductiva. Aplicación de la transferencia de embriones en especies exóticas y en peligro de extinción. Permite obtener descendientes de hembras de elevada calidad genética que deban ser sacrificadas por padecer enfermedades, infertilidad, por su avanzada edad o durante los programas de erradicación de enfermedades infecciosas (tuberculosis, brucelosis, leucosis). Permite el aprovechamiento de animales con determinadas formas de infertilidad: machos oligospermias severas, hembras con alteraciones estructurales o funcionales del tracto genital.

Desventajas. 

Bajo rendimiento, el porcentaje de ovocitos capaces de transformarse en embriones transferibles se encuentra estancado entre el 30 y 40%.  Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo.  Reducción del potencial de desarrollo pre y postimplantacional, ocasionando bajos porcentajes de gestación (30 a 40%).  Existe una escasa resistencia a la Criopreservación, dificultando su conservación a largo plazo.

Fertilización in vitro Fecundación de los ovocitos. Consiste en incubar los óvulos madurados (producto de la maduración in vitro) con espermatozoides vivos y móviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de selección y capacitación espermática que nos permitirá a su vez deshacernos de componentes del plasma seminal, crioprotectores y espermatozoides muertos o con escasa vitalidad. La capacitación espermática generalmente se logra exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y cafeína, entre otras. Estas sustancias logran estimular el proceso de capacitación del espermatozoide que lo prepara para interaccionar y fecundar el óvulo. Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es la fecundación, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados en un medio suplementado con fuentes energéticas (piruvato, lactato) y albúmina sérica en un ambiente controlado por estufas de cultivo por un tiempo comprendido entre 5- 24 hs dependiendo del protocolo, la concentración de espermatozoides y la calidad del semen utilizado. Habitualmente una dosis inseminante es de 1-6 millones de espermatozoides por ml de medio de fecundación dependiendo del protocolo utilizado. Para la fertilización in vitro se utilizan las masas celulares pluripotentes, lo cual son, los embriones de aprox 7 días, previos a la implantación. Estos blastocitos cuentan con una masa celular interna que es el embrión y una capa externa llamada trofoblasto que será la placenta. Una vez extraído este ovocito pluripotentes, se llevan a cultivo para pasar del estadio inmaduro al maduro para que completen la meiosis II.

Maduración de ovocitos. “La maduración ovocitaria es un fenómeno complejo, durante el cual el ovocito progresa desde el estadio de profase de MI hasta el de MII (maduración nuclear). El ovocito completa la meiosis en respuesta al pico ovulatorio de LH, o bien, cuando es retirado del folículo para llevar a cabo la maduración in vitro. Un periodo de 24h de cultivo es necesario para que el ovocito bovino complete la maduración nuclear, es decir, alcance el estadio de MII, en el que permanece hasta el momento en que es fertilizado, que es cuando completa la meiosis y se forma los pronúcleos. Además de la maduración nuclear, también es importante que exista una maduración citoplasmática ya que prepara al ovocito para soportar la fertilización y aportar los nutrientes requeridos para el desarrollo embrionario temprano. Cuando los ovocitos son aspirados desde los folículos terciarios reanudan espontáneamente la

meiosis y al ser cultivados in vitro continúan con los procesos de maduración. De este modo la composición de los medios y el ambiente controlado por estufas de cultivo, deben brindar un ambiente adecuado para que la maduración ocurra en 21-24hs de un modo similar a lo que sucede in vivo. Las condiciones utilizadas en la mayoría de los laboratorios para lograr este ambiente, involucra el uso de medios de cultivo tales como el TCM-199 suplementado con hormonas (LH, FSH, estradiol, etc.), antioxidantes (glutatión, cisteamina, cistina), factores de crecimiento y macromoléculas ( suero, albumina), en una atmósfera de 5% CO2 a 38,5°C y humedad a saturación.

A)- De animales que se envían a faena. Miles de animales de alta genética van al matadero por Año y esta genética podría ser recuperada por esta técnica b)- De hembras castradas. Por cada vaca castrada o que va a matadero (2 ovarios Recuperados) se pueden obtener entre 15 a 20 óvulos, lo que permitirá obtener de 4 a 6 Embriones para transferir C)- De hembras vivas. Por punción ovárica transvaginal (ultrasonografía y bomba de Vacío). La cantidad de será inferior que la obtenida de ovarios de matadero o castración (5 a 10 vs 15 a 20). Pero resulta más eficiente para producir embriones que la Superovulación, en un determinado período

Principales eventos moleculares vinculados a la capacitación espermática. _ Eliminación de los Factores decapacitantes: se añadieron en epidídimo o durante la eyaculación e inhiben la unión a la Zona Pelúcida. _ Extracción del colesterol de la Membrana plasmática y redistribución de proteinas, lípidos y azucares. _ Ingreso de Ca++ y HCO3 al citosol _ Aumento de fosforilación de residuos de tirosina de las proteínas citosólicas: marcador de capacitación. _ Translocación de proteínas a la zona ecuatorial _ Aumento del metabolismo y movilidad espermáticos: Hiperactivación ELIMINACION DE FACTORES DECAPACTANTES Epididimarios: Plasma Seminal y/o Secreciones Epididimaria La membrana plasmática del espermatozoide epididimario contiene un complemento de moléculas superficiales (proteínas y carbohidratos). Eyaculados: Durante la eyaculación, estos complementos se cubren con proteínas seminales, que las enmascaran. Capacitados: Cuando el esperma es expuesto a las condiciones ambientales del tracto genital femenino, está cubierta de proteínas seminales son removidas junto con algunas moléculas de superficie, tornándose el espermatozoide capaz de ligarse al ovocito.