• Author / Uploaded
• JeffersonPalacios

Citation preview

Deber 2: Producción de proteína recombinante con estrategia de clonación virtual (25%) En grupo elijan una proteína y un plásmido en el expresarán y luego purificarán aquella proteína Deberá encontrar sitios de restricción adecuados en el plásmido de su elección (disponibles en Edmodo o cualquier otro plásmido disponible comercialmente) y los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados en el cDNA que codifica su proteína, de modo que pueda ligar su secuencia de ADN en el plásmido elegido. En primer lugar tendrá que encontrar la secuencia de ADN que codifica su proteína de elección (usar la base de datos NCBI). Utilizará programas informáticos disponibles públicamente para identificar sitios de enzimas de restricción adecuados y diseñará un plásmido recombinante para la expresión (en bacterias, o levaduras, o plantas, o células de mamífero) de la proteína elegida producto de la clonación de la secuencia de ADN. Puede utilizar estrategias de tecnología de ADN recombinante para lograr este objetivo; por ejemplo el uso de PCR (reacción en cadena de polimerasa) para introducir sitios de clonación adecuados donde no existen. Se evaluará el mapa del plásmido, con sitios de restricción relevantes, mostrando la secuencia de ADN clonado y la secuencia promotora relevante. También debe incluir la secuencia completa de nucleótidos de la secuencia de cDNA que codifica la proteína elegida y describir las enzimas que utilizaron en la construcción del plásmido recombinante. También debe describir un protocolo de purificación para la proteína expresada haciendo uso del manual “The recombinant protein handbook” (disponible en Edmodo).. Consulte la información disponible en Edmodo, referencias externas y la hoja de evaluación para esta tarea. Estudiantes por grupo: Máximo 5 Fecha de entrega: Viernes,30 de Noviembre del 2018 11:30 Forma de entrega: Digital Cantidad de hojas: Máximo 7 hojas (fuente 12 en texto general y menor fuente en figuras y notas) + hoja de calificación. Webs de ayuda para su trabajo: http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore http://nc2.neb.com/NEBcutter2/index.php https://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Subir con el documento Word: -

El archivo (.gb) de la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína El archivo (.gb) de la secuencia de nucleótidos codificadora del plásmido El archivo (.gb) del plásmido recombinante.

Grupo(Apellidos):

Proteína: Directrices para deber “Estrategia de clonación”

Tarea Figura/diagrama que muestre la secuencia de DNA (nucleótidos) de la proteína de su elección y el cDNA (nucleótidos) de la proteína de su elección. Figura con descripción Mapa con los sitios de enzimas de restricción en la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que ha elegido Mapa del plásmido seleccionado de acuerdo al huésped donde se lo pretende utilizar (usar referencias). El mapa muestra los sitios de restricción específicos para la clonación y los sitios relevantes para expresión Lista de enzimas empleadas para la digestión del plásmido, de la secuencia que codifica la proteína y para insertar la secuencia de ADN en el plásmido. Use referencias que soporten la selección de enzimas. Muestra la secuencia del forward y reverse primer con extremos 5’ y 3’ Mapa del plásmido recombinante detallado con los sitios de restricción relevantes, la localización del ADN de interés. Mencione los elementos importantes para la expresión y purificación de su proteína. Describe el procedimiento para realizar la clonación en laboratorio empleando viñetas. Use referencias  Paso 1:  Paso 2: ….. Describe el protocolo de purificación de la proteína expresada. Explique en máximo 10 líneas porque se selecciona la estrategia de purificación. (Use referencias que soportan la elección y explicación). Sección de referencias contiene la lista de páginas web. Softwares, papers empleados y otras referencias. Mantener formato consistente con APA

Valor /2 /3

/2 /4

/4

/4

/3.5

/2.5

Máximo 7 páginas A4 (tamaño de fuente 12). Total /25 Observaciones:

Procedimiento para clonación

1. Descargue el programa Serial Cloner 2.6 (http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html) e instálelo en su 2.

3.

4.

5.

6.

7. 8.

PC o en su defecto puede emplear otro programa alternativo para manipular la información genética. Realice una búsqueda en el NCBI del gen que desea clonar y emplee la secuencia del gen en el Serial Cloner. Dentro de esta secuencia identifique cual es la secuencia codificadora de la proteína (CDS) (“FIND” y “ORF” pueden ser de ayuda para ello). Una vez encontrada la secuencia, genere otro archivo y guárdelo con el formato (.gb). Genere el mapa de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína que ha elegido y considere los sitios de enzimas de restricción presentes en esta región. Realice una búsqueda en el NCBI o en la página del proveedor de la secuencia de nucleótidos del plásmido a emplear para la clonación y emplee esta secuencia en el Serial Cloner. Guarde esta secuencia en su computadora o USB. Genere un mapa con los sitios de enzimas de restricción y sitios relevantes para expresión que va a emplear para construir su plásmido recombinante. Realizar el PCR: Continúe con la creación de primers para emplear en la futura reacción de PCR. Forward primer: Puede seleccionar unas bases de inicio de la secuencia de nucleótidos codificadora de la proteína (CDS) y copiar y con ellas crear su primer adicionando bases adicionales al inicio del primer y la secuencia de enzima de restricción. Forward Primer (FP)= 5’ Extra bases + Enzima de restricción + Secuencia idéntica al CDS 3’ Reverse Primer (RV)= 5’ Extra bases + Enzima de restricción + Secuencia reversa y complementaria al CDS 3’ Las bases extras se colocan para mantener el Open Reading Frame adecuado para la producción de la proteína y además dar estabilidad para la complementariedad del primer. La secuencia que contenga la enzima de restricción es la que se pretende emplear para la digestión del plásmido. Para realizar el PCR, abra una ventana desde la barra superior del software opción de “PCR”; una ventana emergerá donde se colocarán los primers. En: “Oligo tail not identical to the target sequence”  extra bases y enzima de restricción “Segment identical to the target sequence”  FP Secuencia idéntica de inicio del CDS, RP Secuencia reversa y complementaria del final del CDS Otra alternativa para crear los primers sin la secuencia de enzima de restricción es usar de la Barra de herramientas “Edit” y “Use as PCR Reverse Primer” o “Use as PCR Forward Primer” En la “Opción Select the target Sequence” seleccione la secuencia de CDS (guardado en el paso 2) y corra el PCR. Una nueva ventana emergerá con el producto del PCR, guarde este archivo. De la barra de herramientas seleccione “Construct”. En la ventana que emerge seleccione en “Fragment 1” cargue el archivo del plásmido (guardado en el paso 3). Encuentre las enzimas a emplearse para digestión y de un click en la enzima de restricción del extremo 5’ del PCR y doble click en la enzima de restricción del extremo 3’ del PCR. En la sección “Fragment 2” cargue el archivo guardado en el paso 4 (producto de PCR). Encuentre las enzimas a emplearse para digestión y de un click en la enzima de restricción del extremo 5’ del PCR y doble click en la enzima de restricción del extremo 3’ del PCR. Y pulse “Ligate” Una nueva ventana aparecerá con su plásmido recombinante, guarde este archivo. Use “Find” para generar una lista de los posibles ORFs. Seleccione el ORF donde se encuentre su insert. En “features” y “+” puede cambiar editar información, color y designar a este ORF como su “CDS”. Confirme que el CDS sea la secuencia de aminoácidos de su proteína usando “Show Selection information and translation”. Genere el gráfico del plásmido recombinante. Felicitaciones! Ha realizado su primera clonación virtual!