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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA GENÉTICA MICROBIANA

“AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE DNA CROMOSÓMICO”

Álvarez Lagunes Jorge Eliseo Arias Gamarra Citlali Yolotzin

Equipo 1 Sección 1

Biol. Sergio Mora Ramírez Q.B.P. Octavio Gómez Guzmán Q.B.P. Francisco Español Español M. en C. Verónica Pérez Enríquez

Grupo: 5QV1

07- Septiembre- 2017

INTRODUCCIÓN El DNA es biopolímero de desoxirribonucleótidos. Tales unidades monoméricas se componen de un grupo fosfato, desoxirribosa y una base nitrogenada que puede ser púrica (adenina o guanina) o pirimidínica (citosina o timina). Las purinas y pirimidinas son heterociclos que contienen nitrógeno, estructuras cíclicas que contienen, además de carbono, otros (hetero) átomos, como nitrógeno. La naturaleza planar de las purinas y las pirimidinas facilita su asociación estrecha, o “apilamiento”, que estabiliza el DNA bicatenario. Los dobles enlaces conjugados de derivados de purina y pirimidina absorben luz ultravioleta. Si bien los espectros son dependientes del pH, a pH de 7.0 todos los nucleótidos comunes absorben luz a una longitud de onda cercana a 260 nm. De este modo, la concentración de nucleótidos y ácidos nucleicos suele expresarse en términos de “absorbancia a 260 nm”. El grupo 5′-fosforilo de un mononucleótido puede esterificar un segundo grupo 3hidroxilo, lo que forma un fosfodiéster. La unión de desoxirribonucleótidos por enlaces fosfodiéster para formas cadenas sencillas es la estructura primaria. La estructura secundaria del DNA se debe a la unión de dos cadenas complementarias mediante puentes de hidrógeno y el apilamiento de bases que contribuye a su estabilidad por fuerzas de Van der Waals. La complementariedad de bases fue descrita por Watson y Crick, en la cual, la guanina se une a la citosina por tres puentes de hidrógeno y la timina con la adenina por solo dos puentes de hidrógeno. Cuando una doble cadena se separa, perdiendo los puentes de hidrógeno y el apilamiento de bases, se dice que se desnaturaliza. Con la desnaturalización del DNA se manifiesta un incremento de la absorbancia de 260 nm, enfecto denominado hipercrómico. También ocurre el efecto hipercrómico residual cuando aun una cadena sencilla, al ser hidrolizada, aumenta su absorbancia de 260 nm. La desnaturalización o fusión del DNA puede ocurrir por efecto del pH y principalmente por aumento de la temperatura. Cada DNA de un organismo, tiene un punto de fusión (Tm) característico que representa la temperatura a la cual el 50% del DNA dúplex, se encuentra como cadena sencilla. La representación gráfica de absorbancia a 260 nm contra temperatura es una curva de desnaturalización, es sigmoidea. Resalta que un DNA no sufre cambios (efecto hipercrómico) importantes hasta los 75 °C aprox. y posteriormente ocurre un cambio abrupto de absorbancia. Ese cambio es un aumento de alrededor de 35% de la absorbancia en un intervalo de temperatura corto de alrededor de 4 °C. El DNA se puede renaturalizar si se enfría de forma lenta. La disminución gradual de la energía cinética favorece el apareamiento correcto de las bases de cadenas complementarias.

OBJETIVOS 



Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de una cepa de Escherichia coli W3350, establecer el espectro de absorción, así como el grado pureza y concentración por diferentes métodos del DNA obtenido. Emplear un programa bioinformático para determinar el efecto del %G-C, la secuencia y longitud del DNA sobre la Tm del mismo.

FUNDAMENTO El propósito del aislamiento del DNA es separarlo de todos los componentes de la célula, manteniendo la estructura del DNA, facilitando el aislamiento y previniendo la modificación química del DNA por componentes liberados durante el rompimiento celular. Todos los métodos de aislamiento incluyen cuatro pasos esenciales: rompimiento de la célula, remoción de proteínas y RNA, concentrar y determinar la pureza y concentración de DNA. Los dos obstáculos más comunes para obtención de DNA son las fuerzas hidrodinámicas y la degradación por DNAsas no específicas. Durante el método se usan diferentes reactivos con el fin de cumplir con los cuatro pasos mencionados anteriormente. (Tabla 2). Paso

Preparación del medio para el rompimiento celular

Rompimiento celular

Reactivo

Uso El TRIS es un buffer que tiene una gran capacidad de regulatoria a pH entre 7.6 y 9.0. El EDTA es un agente quelante que secuestra los iones Mg++ necesarios como cofactor para la actividad de las DNAsas esto resulta en la Tris/EDTA (50/20 mM) Se usa dos veces, la primera es para remover el caldo y todos los componentes del mismo, donde se encontraban suspendidas las células, la segunda adición se realiza con el fin de mantener un pH estable para la adición de la RNAsa. Enzima degradadora de RNA, requiere ser activada y agregada antes de la lisis celular, RNAsa 10mg/mL para que lleve a cabo sus funciones desde el momento en que se lisan las primeras células. Enzima que rompe los enlaces β 1-4 de la Lisozima 50mg/mL peptidoglicana. Los detergentes ayudan a inhibir DNAsas SDS al 10% como a la lisis celular por la formación de

Tris/EDTA (10/1 mM)

NaCl 5M

Fenol saturado

Remoción de RNA y proteínas Cloroformo: Alcohol isoamílico (24:1)

Isopropanol frío Concentración del DNA Etanol frío al 70% Determinación de conc. Y pureza RESULTADOS

Agua destilada estéril o Tris/EDTA

micelas mixtas, ya que se insertan micelas del detergente a la membrana fosfolipídica, una vez que la lisozima ha roto los enlaces dichos. El medio interno de la célula contiene muchos metabolitos secundarios e iones, por lo que su función es regular al liberarse estos de la célula, además de brindar el volumen necesario para que la concentración de NaCl disminuya a 0.5 aproximadamente. Al adicionarla su concentración disminuye a 0.5M, aproximadamente, la cual es suficiente para mantener fuerza iónica del medio y con esto la rigidez del DNA, a su vez puede solubilizar a los detergentes, de esta manera cuando se retire el Tris/EDTA, los detergentes también se retiraran. Este penetra al centro hidrófobo de las proteínas, cambiando su conformación y haciéndolas más solubles en fenol que en agua, aunque el DNA tiene una parte hidrofóbica esta no interacciona tan fuertemente con el fenol. El cloroformo es un solvente orgánico que funciona de manera similar al fenol, sin embargo al ser totalmente inmiscible en agua, este requiere de un agente emulsificador, el cuál es el alcohol isoamílico, de esta manera al agitar, las proteínas con grupos no polares expuestos quedan en la fase fenólica, la interfase mantiene moléculas medianamente polares. De la misma manera remueve las trazas de fenol. Precipita al DNA por fenómeno de desolvatación, además de disminuir la energía cinética de las moléculas al estar frío, a la vez remueve aminoácidos, nucleótidos y componentes de bajo peso molecular Funciona de manera similar al isopropanol, pero este además remueve sales y restos de isopropanol que pudieran quedar. Con esto tendremos como resultado una solución de DNA aislado, útil para leer en el espectrofotómetro.

Tabla 1. Resultados de absorbancia, pureza y concentración obtenidos. Las lecturas de absorbancia fueron obtenidas con 𝐴𝑒 nanodrop, la concentración uno se calculó ocupando la formula 𝐶 = , la concentración 2 se calculó considerando que una 22,500

unidad de absorbancia de DNA de doble cadena equivale a 50µg/ml de DNA de doble cadena; la concentración 3 corresponde a la obtenida por Nanodrop.

Equipo 1 2 3 4 5 6

Abs (260nm) 1.43 2.881 0.345 1.115 1.181 1.533

Abs (280nm) 0.757 1.493 0.208 0.347 0.664 0.768

Pureza 1.89 1.924 1.658 1.84 1.77 1.95

Conc. 1 (µg/mL) 63.5 128 15.33 49.5 52.48 68.13

Conc. 2 (µg/mL) 71.5 144.05 17.25 55.75 59.05 76.6

Conc. 3 (µg/mL) 71.5 144 17.2 70.2 59 76.6

Fig. 1 Espectro de absorción del DNA aislado

DISCUSIÓN En esta práctica se siguió el protocolo descrito en el fundamento (veáse tabla 1) para aislar DNA de Escherichia coli. El cual se caracterizó por espectrofotometría midiendo las absorbancias a 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 y 300 nanómetros (veáse tabla 2). El DNA aislado tuvo una pureza de 1.89, esta es una relación para evaluar la pureza del DNA frente a la contaminación con proteínas, particularmente de aminoácidos aromáticos. El valor obtenido es lo suficientemente alto para considerarse apto para posteriores análisis. En caso de haberse obtenido una pureza menor, se precisa de un lavado con cloroformo-alcohol isoamílico 24:1 y volver a precipitar con etanol al 70%

En el espectro de absorción (veáse fig. 1) se obtuvo un pico máximo a 260 nm, que corresponde a la molécula de DNA, descartando la posibilidad de RNA ya que se utilizó RNAsa en el proceso de aislamiento y los ribonucleótidos remanentes fueron descartados al decantar el sobrenadante de los lavados con etanol al 70%. Otro índice de pureza es Abs260/Abs270 para determinar contaminación por fenol, ya que, este tiene un pico de absorbancia máximo a 270 nm. Las preparaciones de ácidos nucleicos sin contaminación fenólica presentan este índice de alrededor de 1.2 En nuestro caso este índice es de 1.28 La absorción de luz UV a una longitud de onda de 230 nm significa que lamuestra está contaminada con iones péptidos, compuestos aromáticos u otras sutancias. Para muestras puras de ácidos nucléicos el índice 260/230 se espera en el rango 2.0-2.2; muestras con un índice menor indican la presencia de contamintantes que absorben a 230 nm, como EDTA, carbohidratos y fenol. Nuestra lectura de 230 nm fue cero; pudiendo deberse a que el blanco estuviera contaminado con alguna de las sutancias que absorben a 230 nm como el EDTA y carbohidratos. La concentración determinada por el equipo Nanodrop fue de 71.5 µg/ml, la misma calculada con la relación que establece que una unidad de absorbancia es igual a 50 µg/ml. También se calculó la concentración con la formula (Abs 260)/(22500/b) dando el valor de 63.55 µg/ml, donde b es el paso de luz por la celda utilizada en un espectrofotómetro convencional. La razón por la cual, las lecturas de absorbancia del Nanodrop son mayores a 2 (como si la transmitancia fuese menor al 0%) se debe a que este aparato no utiliza celdas y la alícuota utilizada es del oreden de 1 a 3 µL dejando un minúsculo paso de luz que se refleja en la ecuación como una disminución del denominador y aumento neto de la absorbancia. En cuanto al rendimiento, Surzycki menciona que, de un título de entre 2 y 4x10 10 de Escherichia coli, se pueden obtener de 200 a 300 µg/ml. Si nuestro cultivo en caldo Luria se encontraba al menos en fase estacionaria, tenemos que nuestro rendimiento es bajo y se pudo deber a fallas en la precipitación del DNA debido una insuficiente agitación o incluso a una pérdida parcial del pellet de DNA. Influencia de los parámetros longitud, secuencia y porcentaje de guanina-citosina sobre la desnaturalización de desoxirribonucleótido determinada por el software DNAMAN Influencia del contenido GC AAAAACCCCCTTTTTGGGGGAAAAACCCCCTTTTTGGGGG 50%GC Thermo 83.2 °C

%GC 67.9 °C

GC+AT 120 °C

AAAAATTTTTCCCCCCCCCCGGGGGGGGGGAAAAACCCCC 62.5% GC Thermo 88.5 °C

%GC 73.0 °C

GC+AT 130 °C

GGGGGGGGGGCCCCCCCCCCGGGGGCCCCCAAAAACCCCC 83.5% GC Thermo 97.5 °C

%GC 83.3 °C

GC+AT 150 °C

Influencia de la variación en la secuencia AAAAAAAAAAGGGGGGGGGGTTTTTTTTTTCCCCCCCCCC Thermo 83.4 °C

%GC 67.9 °C

GC+AT 120 °C

AAAAAGGGGGTTTTTCCCCCAAAAAGGGGGTTTTTCCCCC Thermo 82.8 °C

%GC 67.9 °C

GC+AT 120 °C

AGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGTC Thermo 75.2 °C

%GC 67.9 °C

GC+AT 120 °C

Influencia de la longitud de la secuencia AGTCAAGTCAAGTCA Thermo 35.6°C

%GC 43.0 °C

GC+AT 42.0 °C

AGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCA Thermo 65.7 °C

%GC 59.6 °C

GC+AT 84.0 °C

AGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAAGTCAA GTCA Thermo 81.8

%GC 68.0

GC+AT 168.0

El aumento en el contenido de guanina-citosina aumenta los tres valores de Tm dados por DNAMAN. El contenido de pares de bases guanina y citosina es determinante en la temperatura de fusión porque estas bases pueden formar tres puentes de hidrógeno resultando más fuertes que solo dos puentes que se forman entre adenina-timina. De hecho al graficar el porcentaje de guanina-citosina contra la Tm de diversos microorganismos se obtiene un comportamiento lineal que brinda una ecuación para relacionar Tm y %GC (Tm=69.3+0.41(%GC) La modificación de la secuencia, cuando la longitud y porcentaje GC son constantes, solo afecta al valor de Tm thermo. Esperamos que la Tm, en general sea modificada por la secuencia. En los oligonucleótidos diseñados se manifiesta que conforme se intercalan más pares G-C con pares A-T la Tm thermo disminuye. Una razón para explicar lo anterior es el efecto cooperativo en la desnaturalización; En el primer oligonucleótido hay segmentos largos de GC en el segundo y tercer oligo se intercalaron pares A-T, en este último parece fácil que los pares GC se separen teniendo de vecinos a dos pares de bases A-T Por último, el aumento de la longitud de los oligonucleótidos incrementa los tres valores de Tm. Si no se conociera la estructura de un oligonucleótido sería más útil, entonces, valerse del valor thermo dado por el software DNAMAN. CONCLUSIONES      

El DNA cromosómico de E. coli aislado es útil para trabajar, por su pureza de 1.89 y su concentración de 71.5 µg/mL. El DNA aislado es casi libre de proteínas. La combinación de los métodos de Marmur y Kyrbi con fenol y cloroformo-alcohol isoamílico, es efectiva en la extracción de DNA El DNA cromosómico de E. coli aislado presenta un espectro de absorción característico para DNA. El nanodrop es útil para determinar concentraciones de DNA que son pequeñas. Los factores longitud, secuencia y %GC son determinantes en la Tm de oligonucleótidos

REFERENCIAS Surzycki, S. “Basic Techniques in Molecular Biology”. Springer Science & Business. 2000. Pp. 1-25 Nelson D, Cox M.. (2009). Principios de bioquímica Quinta edición. Barcelona, España: Ediciones Omega.