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TIROSINASA I- II-III Determinación de la actividad enzimática Determinación de la actividad de tirosinasa al variar la concentración del sustrato, PH y temperatura optima de la tirosinasa Determinación de la constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima

Por:

Jaidy Moreno Mosquera CC. 1128396793 Cindy Paternina Pitalúa C.C. 1017178584

Informe de laboratorio de Bioquímica

Profesor: Edwin Patiño

UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES BIOLOGÍA MEDELLÍN

31 de marzo 2011

CALCULOS Y RESULTADOS Tabla 1.

T (min)/Tubo 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

1

2

0.095 0.099 0.110 0.129 0.150 0.172 0.191 0.209 0.230 0.249

3

4

Absorbancia 0.250 0,265 0.257 0,271 0.305 0,403 0.362 0,415 0.413 0,519 0.461 0,528 0.507 0,534 0.549 0,541 0.588 0,535 0.619 0,527

0.168 0.174 0.209 0.253 0.296 0.335 0.378 0.417 0.451 0.483

5

6

0.368 0.370 0.444 0.524 0.596 0.653 0.679 0.685 0.685 0.685

0,412 0,426 0,514 0,587 0,605 0,624 0,628 0,628 0,628 0,619

Gráfica 1.1

Absorbancia vs Tiempo 0.3

Absorbancia

0.25 0.2 0.15 Tubo 1 0.1 0.05 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Tiempo (min)

3.5

4

4.5

5

5.5

Absorbancia vs Tiempo 0.6 Absorbancia

0.5 0.4 0.3 0.2

Tubo 2

0.1 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

Tiempo (min)

Gráfica 1.3

Absorbancia vs Tiempo 0.7 0.6

Absorbancia

0.5 0.4 0.3

Tubo 3

0.2 0.1 0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Tiempo (min)

3.5

4

4.5

5

5.5

Absorbancia vs tiempo

0.6 0.5 0.4

Series1

0.3 0.2 0.1 0 0

1

2

3

4

5

6

Absorbancia vs Tiempo Absorbancia

0.8 0.6 0.4 0.2

Tubo 5

0 0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

Tiempo (min)

0.7 0.6 0.5 0.4 Series1

0.3 0.2 0.1 0 0

1

2

3

4

5

6

CALCULOS 

Tubo 1: (

)( (



)

Tubo 2: (

)( (



)

)( (

)

)( (

) )

Tubo 5: (

)( (



)

Tubo 4: (



)

Tubo 3: (



)

) )

Tubo 6: (

)( (

) )

Tabla 2.

Tubo 1 2 3 4 5 6

[S]f 0,003 0,006 0,009 0,012 0,015 0,018

vi 0,043 0,082 0,099 0,113 0,129 0,037

1/[S] 333,333 166,666 111,111 83,333 66,666 55,555

Gráfica: Velocidad inicial vs concentración.

0.14 0.12 0.1 0.08 Series1

0.06 0.04 0.02 0 0

0.005

0.01

0.015

0.02

1/vi 23,255 12,195 10,101 8,849 7,751 2,027

Gráfica 2.2. Gráfica de Lineweaver-Burk

25 y = 0.0649x + 1.8691 20

15 Series1 Linear (Series1)

10

5

0 0

100

200

300

400

( )

TIROSINASA III DETERMINACION DEL PH ÓPTIMO DE LA TIROSINASA

Tubo PH ABSORBANCIA

1 3.0 0.114

2 4.5 0.131

3 6.0 0.268

4 7.2 0.239

5 10 0.253

4 55ºC 0.400

5 94ºC 0.163

0.8 0.7 0.6 0.5 Series1

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

2

4

6

8

10

12

DETERMINACION DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA Tubo temperatura absorbancia

1 4ºC 0.440

2 25ºC 0.459

3 37ºC 0.421

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25

Series1

0.2 0.15 0.1 0.05 0 0

20

40

60

80

100

ANÁLISIS Y DISCUSIONES En la práctica realizada se trató de analizar la cinética de la enzima tirosinasa, variando la concentración de sustrato y observando el cambio en la velocidad. La velocidad inicial de las reacciones se halló mediante el cálculo de las pendientes de las curvas para cada uno de los tubos en las gráficas de Absorbancia vs tiempo. Para hallar las pendientes se tomaron los puntos que mejor representaban el segmento con comportamiento lineal de la curva. Las curvas de la Absorbancia vs tiempo del producto formado describen claramente la cinética de la reacción. La primera región, donde la curva es constante, pues no hay un cambio significativo de la Absorbancia, describe el estado pre-estacionario de la reacción durante el cual no se ha saturado toda la enzima, no se ha estabilizado la concentración del complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente inicia la formación de producto durante el cual la curva tiene un comportamiento prácticamente lineal hasta que llega a un punto donde la concentración del producto formado empieza a estabilizarse, manteniéndose constante, los sitios activos de la enzima ya están saturados o ya no hay mas sustrato para convertir en producto. Debido a que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de una sustancia, las graficas realizadas de absorbancia vs tiempo presentan el mismo comportamiento de una grafica concentración vs tiempo. Teóricamente se calculó la velocidad máxima ( ) y el Km para la tirosinasa mediante la recta de regresión de la gráfica de Lineweaver-Burk (Gráfica 2.2) arrojando valores de 0.00891 M/s para la velocidad máxima y de 0.0347 M para el Km. El valor de la velocidad máxima teórica, mucho mayor que la velocidad para las concentraciones de sustrato usadas, no se alcanzó con las concentraciones de sustrato usadas. En cambio el valor del Km si se encuentra entre los valores de las concentraciones utilizadas en los tubos. Este valor de Km considerablemente grande para la tirosinasa en comparación

con otras enzimas, podría estar indicando que es poco afín al sustrato L-Metildopa. de sustrato a la cual se ha alcanzado la mitad de la velocidad máxima. En la determinación de PH óptimo para la enzima tirosinasa observamos que el rango de PH donde trabaja mejor la enzima va de 5 – 7 evidenciando en este intervalo una mejor actividad enzimática, según los valores de absorbancia obtenidos y donde se observó que el ph óptimo (intensidad máxima de la actividad enzimática donde todo las moléculas del sustrato se convierte en producto) fue de 6.0 mostrando en este una mayor densidad óptica; Por encima o por debajo del rango hay alteraciones en los estados de ionización de los residuos de aminoácidos que forman la enzima alterando la carga neta y por lo tanto alterando su estructura 3D y como consecuencia hay menos afinidad de la enzima por su sustrato o evita que se forme el complejo ES. En el caso de temperatura también existe también un rango donde la catálisis enzimática es favorable este hecho se debe a que en general, la velocidad de la reacción se incrementa con la temperatura hasta que un punto máximo es alcanzado. Este incremento se debe a que aumenta el número de moléculas ricas en energía que pueden pasar la barrera energética de estado de transición, para formar a los productos. Por encima de este rango hay perdida de la actividad enzimática como resultado de la desnaturalización de la enzima perdida de la estructura 3D. Y por debajo causa una desactivación temporal de la enzima y por lo tanto disminuye la velocidad de la reacción. Para el caso de la tirosinasa observamos que no hay pérdida completa de la actividad enzimática en el rango de temperatura en que evaluamos a la enzima pero si hubo una disminución de la velocidad a ambos lados de la temperatura óptima (T. ambiente).