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• Jorge Luis Olivar

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Separacion De Fosfolipidos y Determinacion De Colesterol Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Bioquímica Práctica 8 Separación de fosfolípidos por cromatografía en capa fina y determinación de colesterol en yema de huevo

INTRODUCCIÓN Los lípidos son compuestos de origen biológico que se disuelven en compuestos no polares como el cloroformo o el dietil éter y se clasifican en compuestos y simples. Los lípidos compuestos contienen ácidos grasos por lo que son saponificables. Los lípidos simples ó esteroides son derivados del isopreno y no son saponificables. Entre ellos se encuentran el colesterol, hormonas sexuales, ácidos biliares y algunas vitaminas. Son moléculas cíclicas. El colesterol es uno de los esteroides más abundantes y se aísla de la extracción de casi todos los tejidos animales. Se encuentra distribuido ampliamente en el cuerpo humano, pero aún no se conocen todas sus funciones biológicas y es esencial para la vida; sin embargo, no es necesario ingerirlo en los alimentos porque el cuerpo sintetiza la cantidad adecuada. OBJETIVOS * Separar fosfolípidos de la yema de huevo por cromatografía en capa fina. * Comparar las ventajas de dicha técnica con la cromatografía en papel. * Determinar la concentración de colesterol en la yema de huevo por el método de Lieberman-Burchard. Imagen2. Placa con revelador de NINHIDRINA. (Grupos amino) Imagen 1. Placa expuesta con cristales de YODO. (Dobles enlaces) RESULTADOS Tabla 1. Valores de los Rf de fosfolípidos. Frente de la mancha: 5.4 cm | MOLIBDATO | | Recorrido | RF | Mancha 1 | 0.9 | 0.16 | Mancha 2 | 1.3 | 0.24 | Mancha 3 | 2 | 0.37 | Mancha 4 | 3 | 0.55 | Mancha 5 | 3.9 | 0.72 | YODO | Mancha 1 | 2.4 | 0.44 | Mancha 2 | 3.7 | 0.68 | Mancha 3 | 4.7 | 0.87 |

NINHIDRINA | Mancha 1 | 1.5 | 0.27 Mancha 2 | 3.5 | 0.64 BISMUTO | Mancha 1 | 0.7 | 0.13 Mancha 2 | 2 | 0.37 | Mancha 3 | 2.9 | 0.53

| | | |

ESQUEMA DE PLACAS OBTENIDAS Imagen 4. Placa con revelador de BISMUTO. (presencia de colina) Imagen 3. Placa con revelador MOLIBDATO. (Fosfolípidos en general) Cálculos ABS Concentración de colesterol Interpolación: Gallina---67μg ABS (0.300) Pata---47μg ABS(0.212) 20μg---0.25ml 40μg---0.50ml 60μg---0.75ml 80μg---1.0 ml 100μg---1.25 ml 0.082 0.178 0.268 0.369 0.605

Pata Gallina 47μg---5μl 235000μg---25000μl = 235 mg /yema 67μg---5μl 335000μg---25000μl = 335 mg /yema DISCUSIONES Realizamos 4 cromatografías de la misma muestra de huevo porque solo de esta forma identificamos mayor variedad de fosfolípidos presentes en la yema dándose a conocer mediante la aplicación de diferentes tipos de reveladores. La prueba de molibdato presenta el mayor número deinterpretaciones debido a que es una prueba general para fosfolípidos y se visualiza con manchas de color azul; podríamos decir que solo para este experimento nos bastaría aplicar solamente el revelador molibdato porque cubre todas las expectativas; sin embargo, la fosfatidil serina y la fosfatidil colina no se llegan a separar por completo, por lo que se tendrían que realizar otras pruebas para evitar confusiones. Otro punto importante a aclarar es que la mancha que representa a lípidos neutros como el colesterol no presenta el color azul característico de la prueba sino se expresa una tonalidad pálida y amarillenta. La prueba de ninhidrina es específica para fosfolípidos que presenten grupos amino y es positivo con manchas de color violeta solo para fosfatidilserina y fosfatidil-etanol-amina. En cuanto a la prueba de Yodo, éste nos permitió visualizar de color café lípidos con dobles enlaces dando positivo

para lípidos neutros ( en este caso el colesterol), fosfatidiletanolamina y lecitina. La esfingomielina posee solamente un doble enlace en la primera cadena hidrocarbonada pero dio negativo, probablemente sería por la cantidad de muestra que no es suficiente para ponerlo de manifiesto, además de que sus cadenas con más largas con respecto a los demás. Finalmente, se trabajó con el revelador Bismuto, que nos permitie observar fosfolípidos que presenten colina en su estructura con machas anaranjadas, y encontramos a la isolecitina, esfingomielina y lecitina como lo esperábamos. Analicemos ahora la concentración de colesterol en yema de huevo. Según el Instituto del huevo, se maneja una concentración promedio de 200mg/ unidad de colesterol para loshuevos en general. En otras fuentes se encontró que la concentración es mayor en el huevo de pata que en el de gallina (680mg/unidad y 246mg/unidad respectivamente). Las concentraciones de colesterol que obtuvimos en nuestra gráfica nos dicen lo contrario, ya que obtuvimos mayor concentración en la yema de huevo de gallina, y la diferencia entre las dos muestras es solo de 100 mg/yema. Para justificar un mayor valor en la yema de gallina sugiero que tal vez existió alguna falla a la hora de preparar los tubos para la curva tipo de concentración de colesterol porque se trabajó con cloroformo que se volatiliza muy rápido, y con anhídrido acético que en cualquier momento se pudo hidratar. Otro posible error sería en la preparación de estándar de colesterol. Cabe destacar que a pesar de éste factor, los valores están alrededor del promedio estándar de colesterol (335 mg/yema en huevo de gallina y 235 mg/yema en huevo de pata). CONCLUSIONES * Se separaron fosfolípidos de la yema de huevo de gallina y de pata por el método de cromatografía en placa fina. * Se comparó la estructura de algunos fosfolípidos presentes en la yema de huevo y se diferenciaron entre sí por medio de diferentes reveladores. * Se determinó la concentración de colesterol presente en la yema de huevo y pata por el método de Lieberman-Burchard. * La concentración de colesterol presente en la yema de huevo de gallina es de 335 mg/yema y en la de pata de 235 mg/yema (según nuestros resultados). BIBLIOGRAFÍA * www.institutohuevo.com/ * http://equilibriodinamico.es/?page_id=81 * Graham Solomons, T.W. Química Orgánica. Limusa Wiley, pp 1260 a 1271. (2007 Práctica 8 Separación de fosfolípidos por cromatografía en capa fina y determinación de colesterol en yema de huevo.

Acosta Caudillo Aracely, Galván López Rafael. Sección 4. Grupo: 3IV1. Introducción: Los fosfolípidos son anfipáticos, esto es que son simultáneamente hidrofílicos e hidrofóbicos. La "cabeza" de un fosfolípido es un grupo fosfato cargado negativamente y las dos "colas" son cadenas hidrocarbonadas fuertemente hidrofóbicas. En las membranas celulares juegan un papel muy importante, ya que controlan la transferencia de sustancias hacia el interior o exterior de la célula. Una de las características de los fosfolípidos es que una parte de su estructura es soluble en agua (hidrofílica), mientras que la otra, es soluble en lípidos (hidrofóbica). La parte hidrofílica es en la que se encuentra el aminoalcohol o base nitrogenada. Esta característica estructural hace posible que los fosfolípidos participen en el intercambio de sustancias entre un sistema acuoso y un sistema lipídico, separando y aislando a los dos sistemas, a la vez que los mantiene juntos. En medio acuoso las colas de los fosfolípidos tienden a disponerse en manera tal de formar un ambiente local hidrofóbico. Esto deja a los grupos fosfatos "de cara" al ambiente hidrofílico. Existen tres estructuras que los fosfolípidos pueden formar en razón de naturaleza anfipática. Objetivos: Separar los fosfolípidos de la yema de huevo por medio de cromatografía en capa fina. Comparar las ventajas de esta técnica de separación con la cromatografía en papel. Determinar la concentración de colesterol en la yema de huevo por el método de Lieberman-Burchard. Resultados: Prueba de Molibdato

Prueba de Yodo

Prueba de Ninhidrina Prueba de Bismuto

Prueba |

| cm frente de disolvente

Molibdato | 4.5 | 5.4 | 0.833 | 3.8 | | 0.703

|

| 3.2 | | 0.592

|

| 1.8 | | 0.333

|

Yodo | 3.4 | 5.4 | 0.629 | 2.8 | | 0.518

|

| 2.0 | | 0.370

|

|1

| | 0.185

|

| 0.5 | | 0.092

|

|

| 1.4 | | 0.259

|

Bismuto

| 3.1 | 5.4 | 0.574

| 2.9 | | 0.537

|

| 1.7 | | 0.277

|

| 0.4 | | 0.074

|

| Rf

|

|

Ninhidrina | 3.75| 5.4 | 0.694 | 2.6 | | 0.481

| cm frente de soluto

|

|

La tabla muestra la relación de frentes obtenidas en cada una de las cromatoplacas de las diferentes puebas que se le realizaron al extracto de fosfolípidos de la yema de huevo. Fosfolìpido | Rf |

| Molidato | Bismutocolina | Ninhidrina(-NH2)

Lifosfatidil colina

| 0.17| +

|+

|-

Esfingomielina

| 0.26| +

|+

|-

|

Fosfatidilcolina

| 0.33| +

|+

|-

|

|-

|+

|

Fosfatidil etanolamina | 0.71| +

|-

|+

Lìpidos neutros | 1.0 | -

|-

|

Fosfatidil serina | 0.33| +

|-

|

|

Esta tabla muestra lo valores de Rf conocidos de algunos fosfolípidos. λ a 640nm λ a 640nm Masa μg Masa μg

Interpolando en la curva tipo obtuvimos que de masa es igual a 98 microgramos así que con esto hacemos una relación para saber cuanto obtuvimos de nuestro filtrado. 98μg----5x10-3ml x----7ml X= 137200μg de colesterol Pasando este valor a mg tenemos un valor de 137.2mg, este valor representa la cantidad de colesterol que hay en media yema, así que tenemos que en una yema completa hay 274.4 mg de colesterol. De datos teóricos se tiene que en una yema de huevo de gallina se encuentran de 210-270 mg de colesterol. Discusión de resultados: De acuerdo a los valores de Rf ya conocidos, las coincidencias encontradas con el experimento realizado en la pràctica nos indican que la yema de huevo tiene fosfatidilcolina y fosfatdiletanolamida, esto nos lo revelo la prueba de molibdato y el bismuto nos revelò la presencia de esfingomielina y la ninhidrina reveló la presencia de esfingomielina, también se tuvo la presencia de lípidos neutros que corrieron con el disolvente. Conclusiones: La cantidad de colesterol contenida en un huevo aproximadamente es de 274.4 mg que es un valor muy acercado al de bibliografía, así mismo pudimos comprobar que la yema de huevo contiene fosfatidilcolina, fosfatdiletanolamida, esfingomielina y esfingomielina. Separación de fosfolipidos por cromatografía en capa fina.Los lípidos son biomoléculas orgánicas insolubles en el agua que pueden extraerse de las células y de los tejidos mediante disolventes no polares, por ejemplo, el

cloroformo, el éter o el benceno. Existen diferentes familias o clases de lípidos, pero las propiedades distintivas de ellos derivan de la naturaleza de la cadena hidrocarbonada de la porción principal de su estructura. Los lípidos desempeñan diversas funciones biológicas importantes: * Como componentes estructurales de la membrana * Como formas de transporte y almacenamiento del combustibles catabólicos * Como cubierta protectora sobre la superficie de muchos organismos Los lípidos se han clasificado en simples y complejos. Los lípidos simples no contienen ácidos grasos por lo que nos son saponificables y se dividen en terpenos, prostaglandinas y esteroides. El colesterol es el esterol más común y es un compuesto clave en la síntesis de ácidos biliares, hormonas sexuales, hormonas corticosuprarrenales y vitamina D. se encuentra en los tejidos corporales y en el plasma sanguíneo de los vertebrados. Se presenta en altas concentraciones en el hígado, médula espinal, páncreas y cerebro. Análisis de la técnica En la obtención de fosfolípidos de la yema de huevo: El cloroformo-metanol separa las proteínaspresentes en la yema del huevo de los lípidos y carbohidratos que contiene este, el hielo se utiliza debido a que el solvente utilizado es muy volátil y el hielo ayuda a que no se volatilice. El KCl utilizado es un lavado que se realiza para eliminar aminoácidos y péptidos. Se deja reposar para separar en dos fases la fase acuosa queda arriba y en esta fase se van algunos péptidos y aminoácidos que persistieran en la mezcla, la fase organica contiene los fosfolípidos de la yema de huevo. Objetivo: * Separar los fosfolípidos de la yema de huevo por medio de cromatografía en capa fina. Resultados RF a la relación existente entre la distancia recorrida por el compuesto y la recorrida por el disolvente en el mismo tiempo, es decir: RF= (distancia recorrida por el compuesto)/(distancia recorrida por el disolvente) Tabla de rf de yema de huevo de gallina | | Molibdato | Yodo | Ninhidrina | Bismuto | Lípidos neutros | Rf =0.65.1 =0.11 | Rf =0.85.4 =0.14 | ----- | ----- | Fosfatidil-etanol-aminaFEA | Rf =1.25.1 =0.23 | Rf =1.95.4 =0.35 | Rf =25.5 =0.36 | ----- | Fosfatidil Serina | Rf =1.95.1 =0.37 | Rf =2.15.4 =0.38 | Rf =3.95.5 =0.70 | ----- | Fosfatidil Colina | Rf =2.85.1 =0.54 | Rf =2.75.4 =0.5 | ------ | Rf =0.75.4 =0.12 |

Esfingomielina | Rf =3.85.1 =0.74 | Rf =3.75.4 =0.68 | ----- | Rf =1.55.4 =0.27| Lisofosfatidil Colina | Rf =4.35.1 =0.84 | Rf =55.4 =0.92 | ----- | Rf =2.35.4 =0.42 | Tabla de rf de yema de huevo de pata | | Molibdato | Yodo | Ninhidrina | Bismuto | Lípidos neutros | Rf =0.55.2 =0.09 | Rf =0.65.4 =0.14 | ----- | ----- | Fosfatidil-etanol-aminaFEA | Rf =1.95.2 =0.36 | Rf =15.4 =0.35 | Rf =2.15.5 =0.38 | ----- | Fosfatidil Serina | Rf =2.15.2 =0.40 | Rf =1.75.4 =0.38 | Rf =3.65.5 =0.65 | ----- | Fosfatidil Colina | Rf =2.75.2 =0.51 | Rf =2.75.4 =0.5 | ------ | Rf =0.75.6 =0.125 | Esfingomielina | Rf =3.25.2 =0.59 | Rf =3.75.4 =0.68 | ----- | Rf =1.75.6 =0.30 | Lisofosfatidil Colina | Rf =45.2 =0.76 | Rf =4.85.4 =0.92 | ----- | Rf =2.95.6 =0.51 | Resultados Referencia * LEHNINGER. PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA /Michael M. Cox, David L. Nelson/ EdicionesOmega /1264 páginas Discusión de resultados: Por la cromatografía de la yema realizamos diferentes pruebas para determinar algunas características de los fosfolípidos separados como: Prueba de molibdato: El reactivo reacciona con el grupo fosfato por lo que esta prueba identifica a los fosfolípidos en general por lo que todas las manchas en la placa dieron positivas solo la de los lípidos neutros no. Prueba de bismuto: esta prueba identifica fosfolípidos que contienen en su estructura colina y los tiñe de color amarillo-naranja