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UNIDAD 1 – Introducción Concepto de bioquímica La bioquímica es una ciencia que estudia la composición química de los seres vivos, especialmente las proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucleicos, además de otras pequeñas moléculas presentes en las células y las reacciones químicas que sufren estos compuestos (metabolismo) que les permiten obtener energía (catabolismo) y generar biomoléculas propias (anabolismo). La bioquímica se basa en el concepto de que todo ser vivo contiene carbono y en general las moléculas biológicas están compuestas principalmente de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. Es la ciencia que estudia la base química de las moléculas que componen las células y los tejidos, que catalizan las reacciones químicas del metabolismo celular como la digestión, la fotosíntesis y la inmunidad, entre otras muchas cosas. Comprende el estudio de las moléculas y reacciones químicas de los seres vivos. Concepto de energía libre Se puede considerar que en los sistemas biológicos la totalidad de las reacciones químicas y el trabajo realizado por ellas ocurren a presión y temperatura constantes. Esto implica que las transformaciones químicas no están asociadas a cambios de volumen o de la temperatura absoluta del sistema. Esto lleva a definir el concepto de energía libre. La cantidad de energía disponible para realizar un trabajo a presión y temperatura constante es denominada Energía Libre de Gibbs (G). Es la fracción de la energía liberada en los procesos bioquímicos capaz de ser utilizada para realizar trabajo, ya que en los organismos vivos en condiciones de presión y temperatura constante, solo una fracción de la energía liberada puede ser utilizada. Energia libre de Gibbs (G): cantidad de energía capaz de realizar trabajo durante una reacción a presión y temperatura constante. [G]= J/mol La variación de la energía libre (∆G) se calcula mediante la diferencia entre la energía libre de los productos y la energía libre de los reactivos de la reacción.

∆ G=G P−G R Entonces:

∆G < 0 la reacción puede realizarse espontáneamente, libera energía (Exergónica) ∆G > 0 la reacción no puede realizarse espontáneamente, consume energía (Endergónica) ∆G = 0 el sistema está en equilibrio. La variación de energía libre depende de cambios en la entalpia y la entropía. Las reacciones que ocurren a P y T constantes, hay dos factores que determinan la ∆G de una reacción y su tendencia a producirse: 



La variación de la energía contenida en los enlaces o entalpia (H) de reactantes y productos. Esta depende de las sustancias consideradas, cuanto más complejas mayor número de enlaces y por lo tanto mayor energía. La variación en el grado de desorden o aleatoriedad del sistema, la entropía (S)

El contenido de energía libre (G), de cualquier sistema cerrado puede definirse en base a tres magnitudes: entalpia (H), que refleja el número y tipo de enlaces; entropía (S); y la temperatura absoluta (T). La definición de energía libre es: G= H – TS. 1

Entalpia Puede definirse como el contenido calórico de una sustancia determinado por su composición química y estructural. H = E + PV, a P constante ∆H = ∆E + P. ∆V y como en los sistemas biológicos el cambio de volumen es pequeño ∆H = ∆E. La entalpia en el sistema internacional se expresa en grados Kelvin (K) Si los productos tienen < E de enlace que los reactivos, la reacción será exotérmica (∆H < 0). Si los productos tienen > E de enlace que los reactivos, la reacción será endotérmica (∆H > 0). Entropía Es una medida de aleatoriedad del sistema. Se expresa en unidades cal/mol.K. Aumenta a medida que en un sistema aumenta el desorden y disminuye cuando se hace más ordenado o estructurado. En la difusión de solutos desde una solución de mayor concentración a otra de menor concentración es dirigido por un aumento de la entropía. La ∆S tiene siempre signo positivo.

∆S tiene signo positivo cuando aumenta la entropía y ∆H tiene signo negativo cuando se libera calor del sistema al entorno. ∆G de un sistema que reacciona espontáneamente es siempre negativo. Si se consideran ambos parámetros (H y S), la variación de energía libre de cualquier reacción puede expresarse como ∆G = ∆H – ∆ (TS) y a T constante ∆G = ∆H – T ∆S Si una reaccion química tiene lugar a temperatura constante, la variación de energía libre, ∆G, viene determinada por la variación de entalpia ∆H, que refleja el tipo y la cantidad de enlaces quimicose interacciones no covalentes que se rompen o forman, y la variación de entropía, ∆S, que describe el grado de desorden del sistema. ∆G = ∆H - T∆S . ∆H es negativa para una reaccion que libera calor y ∆S es positiva para una reaccion que incrementa el desorden del sistema. Un proceso tiende a ocurrir espontáneamente solo si ∆G es negativa (si se libera energía libre durante el proceso). ∆G es una medida de la distancia de un sistema a su posición de equilibrio. Cuando una reaccion ha alcanzado el equilibrio no persiste ninguna fuerza que la induzca a ir en una dirección u otra y no puede realizar trabajo : ∆G = 0 Gibbs demostró que la ∆G (cambio de energía libre real) de una reacción cualquiera es función de la variación de energía libre estándar,

∆ G°

(una constante característica de

cada reacción especifica) y de un término que expresa la concentración inicial de reactivos y productos:

[C ]ci [ D]di ∆ G=∆ G + RTln [ A] ai [B]ib °

(R= cte de los gases / T= temp. absoluta) ° ∆ G =¿ - RTln K eq

. 2

De aquí se deduce que

∆ G°

de una reaccion. Gracias a que modo de determinar

∆ G°

es una manera alternativa a

K eq

K eq

para expresar la dirección

se puede medir experimentalmente, disponemos de un

, la constante termodinámica característica de cada reaccion.

Todas las reacciones químicas tienden a ir en la dirección que da lugar a una disminución de la energía libre del sistema. Reacciones endergonicas y exergonicas En las reacciones que ocurren espontáneamente, los productos tienen menos energía libre que los reactivos, de manera que la reacción libera una cantidad de energía libre que esta disponible para realizar trabajo. Estas reacciones se denominan exergónicas y la disminución de energía libre de reactivos a productos se expresa con un valor negativo. Las reacciones endergónicas, en cambio, requieren un aporte de energía, y sus valores de ∆G son positivos. Solamente una parte de la energía liberada en las reacciones exergónicas se puede utilizar para realizar trabajo. En los sistemas vivos parte de la energía se disipa en forma de calor o se pierde incrementando la entropía. Endergónicas: son aquellas en las cuales la variación de la energía libre es positiva, es decir, reacciones que consumen energía del medio (anabolismo). Exergónicas: son aquellas en las que la variación de energía libre es negativa, es decir, liberan energía al medio (catabolismo). Reversibilidad biológica de las reacciones Los procesos realizados con aumento de entropía, se denominan irreversibles. Los que se realizan sin cambios de entropía, se denominan reversibles. Los procesos reales de nuestro mundo físico son irreversibles. ∆H > 0  Irreversible ∆H = 0  Reversible Reaccion reversible: es aquella que se encuentra prácticamente en equilibrio. Esta catalizada por una enzima con alta actividad, ya que debe estabilizar rápidamente las concentraciones de equilibrio. Cuando los reactivos están en exceso, la reacción se desplaza hacia los productos, hasta alcanzar el equilibrio. Cuando los productos están en exceso ocurre lo contrario. Reaccion irreversible: es aquella que se encuentra lejos del equilibrio. Esta catalizadas por enzimas de baja actividad y ∆G Km) y v = K3 * [ET]. La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto K3 como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción, Vmax = K3 * [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato. 25

Si introducimos Vmax a la ecuación general, obtenemos la expresión conocido como la ecuación de Michaelis-Menten: v = (Vmax*[S])/(Km+ [S] ) Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinetica no es Michaeliana. Esto ocurre con los enzimas alostericos, cuya grafica v frente a [S] no es una hipérbola sino una sigmoide. En la cinetica sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona critica, cercana a la Km se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción. Km y Vmax Las constantes cineticas Km y Vmax permiten la caracterización de las enzimas. La velocidad máxima corresponde al valor máximo al que tiene la curva experimental, y la constante de Michaelis-Menten corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar un medio de la velocidad máxima y proporciona una medida de la afinidad por el enzima sustrato. Determinacion grafica Para determinar gráficamente los valores de Km y Vmax es mas sencillo utilizar la representación doble reciproca (1/Vo frente a 1/[S]o) , ya que es una línea recta. Esta representación recibe el nombre de representación de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cual, la pendiente es Km/Vmax; la absica en el origen es -1/Km ; la ordenada al origen es 1/Vmax. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular gráficamente, los valores de Km y Vmax de una enzima para diversos sustratos.

Reversibilidad de reacción y formación de complejos intermedios Mecanismos de reacción Son los mecanismo mediante los cuales una enzima se una su sustrato. Catalisis basada en la energía de fijación: la energía de fijación es aquella que se libera al formarse interacciones débiles entre la enzima y el sustrato, y proporciona cierto grado de estabilidad a dichas interacciones. Es la principal fuente de energía para la disminución de la energía de activación. Puede ser utilizada para disminuir la entropía del sustrato o para producir cambios conformacionales en la enzima, para permitir la orientación adecuada de sus grupos funcionales. Catalisis acido-base: los grupos R ionizables de los residuos de aminoácidos de la enzima pueden donar

+¿¿ H

al sustrato o aceptar

+¿¿ H

del mismo para formar especies que se

desplazen hacia la formación de producto, en lugar de formar sustrato. Si la catálisis solo 26

utiliza

+¿¿ H

se utilizan

o

+¿¿ H

−¿ OH ¿

presentes en el

H2O

se la llamas catálisis acido-base especifica. Si

cedidos por otros tipos de moléculas se llama catálisis acido-base general.

Catalisis covalente: implica una unión covalente transitoria entre la enzima y el sustrato. Esto altera la ruta de la reacción y solo produce la catálisis si la nueva ruta tiene una energía de activación menor que la catalizada. Por lo general se forma entre un grupo nuclefilico de la enzima y un electrofilico del sustrato. Catalisis por ion metalico: interacciones ionicas entre un metal fijado a la enzima y el sustrato pueden ayudar a orientar al sustrato para que reaccione. Los metales también pueden intervenir en reacciones redox mediante cambios reversibles en el estado de oxidación del ion metalico. Efectos del pH y temperatura Las propiedades de los enzimas derivan del hecho de ser proteínas y de actuar como catalizadores. Cambios en la conformación suelen ir asociados en cambios en la actividad catalítica. En cuanto al efecto del pH sobre la actividad enzimática, los enzimas poseen grupos químicos ionizables (-COOH; -NH2; -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener dsitinta carga. Como la conformación de la proteína depende, en parte, de sus cargas eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la mas adeucada para la actividad catalítica (pH optimo). La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Un ligero cambio puede afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios de pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas mas o menos complejos para mantener estable el pH intracelular, los amortiguadores fisiológicos. Respecto a la temperatura, en general los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas, por cada 10°C de incremento, la velcidad de reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de ciertas temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura optima. Por encima de esa temperatura, el aumento de velocidad de la reacción debido a la temperatura es contrarrestado por la perdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse. Los enizmas son proteínas que actúan en ambientes acuosos y en solución, por tanto por debajo de los 0°C la reacción se paraliza. Las temperaturas mayores a 50°C provocan la desnaturalización. Inhibidores: competitivos, no competitivos y acompetitivos Existen sustancias que pueden impedir que la enzima desarrolle su actividad catalítica, disminuyendo o paralizando la reacción enzimática. A estas sustancias se las denomina inhibidores enzimáticos. Se conocen dos tipos principales de inhibición: la reversible y la irreversible. La primera implica una unión no covalente del inhibidor y por lo tanto siempre puede revertirse. En la inhibición irreversible, el inhibidor se una al enzima de forma covalente y permanente.

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La inhibicion reversible implica la unión no covalente del inhibidor con la enzima, pero difiere en los mecanismos por medio de los cuales reduce la actividad enzimática y en la forma que afecta a la cinetica de la reacción. 

Inhibidor competitivo: sustancia similar en estructura al sustrato, con quien compite por el sitio activo de la enzima. Es capaz de unirse a la enzima libre en el mismo sitio donde se une el sustrato, impidiendo de esta manera su unión. Es decir, sustrato e inhibidor son excluyentes mutuamente. Generalmente el inhibidor competitivo es un análogo no hidrolizable del sustrato, un sustrato alternativo o el mismo producto de la reacción. Como consecuencia la Vmax no se altera, pero hay que poner mas cantidad de sustrato en el medio de reacción para alcnzarla, lo que refleja un aumento de la Km. La eficacia de un inhibidor competitivo depende de su concesntracion respecto a la del sustrato. Si hay un exceso de inhibidor este bloqueara los centros activos de las moléculas de enzima, resultando una inhibición total. No obstante, el proceso es reversible si se procura exceso de sustrato que desplazaría totalmente al inhibidor.



Inhibidor no competitivo: puede combinarse tanto con la enzima libre como con el complejo ES, sin afectar al sitio activo de la enzima. El inhibidor no tiene efecto sobre la unión del sustrato, ya que se une en otro sitio del enzima. El sustrato y el inhibidor se unen al enzima reversiblemente, azarosamente e independientemente a diferentes sitios. Esto significa que el inhibidor se puede unir tanto a la enzima libre como al complejo Es. De igual modo el sustrato S se puede unir a la enzima libre y al complejo EI. Si embargo el complejo ESI es improductivo, no cataliza la formación de producto. De modo que la afinidad por el sustrato no se vera afectada y por lo tanto Km será igual. Mientras que Vmax será menor ya que siempre habrá parte de la enzima formando el complejo ESI improductivo.

28



Inhibidor acompetititvo: reacciona con el enzima en un punto distinto del centro activo, pero solo en el caso de que esta este unida al sustrato formando el complejo ES, de esta forma impide que la enzima desarrolle su actividad catalítica. Se une reversiblemente al complejo ES generando un complejo ESI improductivo. El inhibidor no es capaz de unirse al enzima libre. La consecuencia es que la enzima es mas afin por el sustrato, disminuyendo el Km, sin embargo la Vmax será siempre menor, ya que siempre habrá enzima formando el complejo ESI improductivo. Tanto la Vmax como la Km se alteran en la misma proporción.

En la inhibición irreversible, el inhibidor se une covalentemente a la enzima y la inactiva de manera reversible. Casi todos son sustancias toxicas naturales o sintéticas. Se trata de sustancias que reaccionan con algún grupo funcional importante para la catálisis, bloqueándolo e impidiendo que la enzima desarrolle su actividad. En muchos casos la interacción se produce a través del sitio activo, impidiendo de manera irreversible que el sustrato ocupe su lugar. Activadores Entre los activadores enzimáticos, cabe destacar el del nucleótido adenosina monofosfato cíclico (AMPc), inositol trifosfato (IP3), diacil glicerol, calmodulina, etc. Estos ponen en marcha 29

respuestas rapidas frente a acontecimientos que requieren cambios radicales en el comportamiento de las células. Todos estos cambios están mediados dentro de la celula por activadores enzimáticos denominados segundos mensajeros. Los activadores suelen ser segundos mensajeros que se forman en el interior de la celula en respuesta a un primer mensajero generalmente de carácter hormonal. (Ver Efecto de la modificación covalente sobre la actividad enzimática) Co-factores enzimáticos: metales, coenzimas y grupos prostéticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína mientras que otra necesitan, además, uno o mas componentes no proteicos, llamados cofactores. El

cofactor puede ser un ion metalico como

++¿¿ Fe

++¿ ++¿ , Zn¿ , ++¿ , Mn¿ o bien una molecula organica, Mg ¿

llamda coenzima, auqnue algunos enzimas necesitan ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actua como un sustrato especifico de la enzima (cosustrato; suele ser una molecula organica, coenzima). El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por si misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima. Apoenzima + Grupo prostético = Holoenzima En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima o agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias organicas que , en cantidades minimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células) o molecula derivada de ella. Las coenzimas actúan por lo general como transportadores intermedios de atomos específicos o de electrones. Mecanismos de acción Los enzimas son catalizadores específicos, cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actua sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada sitio activo, comprendida por un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos implicados en el mecanismo de la reacción. Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de reacción. El sitio activo es una región tridimensional de la enzima con una distribución de los grupos única capaz de posibilitar la unión a su sustrato específicos. Dichos grupos del enzima no tienen porque ser necesariamente consecutivos en la secuencia de la proteína y reciben el nombre de centros catalíticos. Para que una reacción ocurra, las moléculas de los reactivos deben chocar con una energía y orientación adecuada. Las enzimas permiten que los sustratos se unan a su centro activo con una orientación optima para que ocurra la reacción y modificar las propiedades químicas del sustrato, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación de nuevos. La acción de los enzimas consiste en la disminución de la energía de activación. 30

Existen dos modelos que intentan explicar la forma en que el sustrato se une al sitio activo:  Modelo llave-cerradura: el sitio activo y el sustrato tiene estrucutras complementarias. Este modelo no considera la reversibilidad de algunas reacciones, ya que en este caso, el sitio activo debería ser complementario también a los productos, y además no explica bien el proceso de inhibición enzimática. Este modelo es valido en muchos casos, pero no siempre es correcto.  Modelo de ajuste inducido: el sitio activo posee una disposición espacial especifica y precisa de ciertos grupos que en presencia del sustrato se adaptan a su estructura.

Indepnedientemente del modelo, una vez formado el complejo enzima sustrato, mediante un mecanismo de distorsion, se activan los enlaces que hay que romper y se aproximan los grupos que hay que enlazar, favoreciendo la formación del producto resultante de la reacción catalizada y quedando la enzima libre para comenzar de nuevo el proceso catalítico. Mecanismos de regulación enzimática Una característica que diferencia las enzimas de los catalizadores químicos convencionales es su capacidad para regular su propia actividad. Una enzima puede ser mas o menos activa gracias a la existencia de distintos niveles de regulación: Nivel de síntesis: que haya mas o menos moléculas de la enzima. Las reacciones enzimáticas del interior de la celula suceden de un modo secuencial, es decir, el producto de una reacción sirve de sustrato para la reacción siguiente. Por esta razón la celula necesita cordinar las diversas secuencias o rutas metabólicas adaptándolas a sus propias necesidades en cada momento. Para que se sinteticen las enzimas de una ruta metabolica, los genes que codifican para las mismas se transcriben dando un ARNm que se traducirá mas tarde en la molecula de proteína correspondiente. Este tipo de regulación supone un control genético sobre los genes que codifican información para cada enzima. Nivel de actividad: que las moléculas de enzima existentes estén mas o menos activas. Puede llevarse a cabo por factores extrínsecos a la enzima como pH, temperatura, [S], [I], o por 31

factores intrínsecos a la propia enzima. En este caso hablamos de enzimas reguladoras, enzimas que por su propia naturaleza tienen mecanismos especiales de regulación. Están especializadas en regularse respondiendo de forma muy sensible a señales externas. En la celula las enzimas operan en grupo, en rutas constituidas por varios pasos enzimáticos. En cada ruta hay al menos una enzima reguladora que determina la velocidad de toda la ruta. La modulación de las enzimas reguladoras ocurre mediante diferentes mecanismos: Modulacion alosterica de la actividad enzimática Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma mas activa porque se une al sustrato con mas afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R ↔ T. Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostericos. Las sustancias que favorecen la forma T y disminuyen la actividad enzimática son los moduladores negativos. Si esto moduladores actúan en lugares distintos del centro activo del enzima se llaman inhibidores alostericos. Por lo general, las grandes rutas metabólicas son controladas por reacciones claves, llamadas reacciones determinantes, que en condiciones intracelulares generalmente son irreversibles. En general dichas reacciones estar reguladas por enzimas alostericos que poseen una serie de características peculiares. Suelen ser proteínas de alto peso molecular, formadas por varias subunidades, cada una de las cuales posee un centro catalítico al que se unen las moléculas de sustrato y otro centro al cual se unen los moduladores del enzima alosterico. Este centro activo distinto del centro catalítico se denomina modulador o efector. En la mayor parte de los casos, el enzima alosterico esta controlada por el primer sustrato y por el producto final; el primer sustrato suele actuar como modulador positivo acelerando la velocidad de la reacción y el ultimo producto de la ruta actua normalemnte como inhibidor de la reacción. De esta manera, la ruta se pondrá en marcha siempre que haya suficiente sustrato y hasta que se produzca el producto necesario. En la medida que el producto final se vaya consumiendo por los procesos que lo requieren, la ruta metabolica seguirá funcionando. Este tipo de control, en el cual el producto final acuta como efector negativo de la ruta, se llama retroinhibicion o feed-back. Efecto de la modificación covalente sobre la actividad enzimática Enzimas interconvertibles, que por actúan modificación covalente reversible, como por ejemplo por fosforilacion/desfosforilacion o modificación redox. Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra mas activa uniéndose covalentemente a un grupo quimico de pequeño tamaños como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al liberar un grupo quimico. En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es mas activa que la no fosforilada. Mientsas que en las vías biosinteticas ocurre lo contrario. Mediante proteínas reguladoras que se unen a la enzima Mediante la eliminación proteolítica de pequeños segmentos peptídicos (irreversible) 32

Enzimas alostericas Funcionan mediante la unión reversible no covalente de compuestos regulatorios llamados moduladores. El modulador puede ser un activador (modulación positiva) o un inhibidor (modulador negativo) y ser el propio sustrato de la reacción (alosterismo homotrópico) o ser otra sustancia (alosterismo heterotrópico). Normalmente se trata de enzimas multimericas y normalmente el sitio activo y el regulatorio se encuentran en distintas subunidades. Fenómenos cooperativos Regulación por modificación química, fosforilacion y defosforilacion Enzimas interconvertibles, que por actúan modificación covalente reversible, como por ejemplo por fosforilacion/desfosforilacion o modificación redox. Otros enzimas pasan de una forma menos activa a otra mas activa uniéndose covalentemente a un grupo quimico de pequeño tamaños como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso, en el que un enzima muy activo se desactiva al liberar un grupo quimico. En las enzimas de las vías degradativas del metabolismo, la forma fosforilada es mas activa que la no fosforilada. Mientsas que en las vías biosinteticas ocurre lo contrario. UNIDAD 4 – Nucleosidos y Nucleotidos Concepto e importancia biológica Los nucleótidos son moléculas orgánicas formadas por tres componentes caracteristicos: una base nitrogenada, una pentos y un fosfato. La molecula sin el grupo fosfato se llama nucleosido.

Las bases nitrogenadas son derivados de dos compuestos parentales, pirimidina y purina. Las bases y las pentosas de los nucleótidos comunes son compuestos heterocíclicos.

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34

Las pentosas son la 2´-desoxi-D-ribosa en los desoxirribonucleotidos prensentes en el ADN y la ribosa en los ribonucleotidos presentes en el ARN. Ambos tipos de pentosas se encuentran en la forma β

La base nitrogenada esta unida covalentemente (por el N-1 en las pirimidinas y el N-9 en las purinas) a través de un enlace N-β-glucosídico con el carbono 1´de la pentosa, y el fosfato esta esterificado con el carbono 5´. El enlace N-β-glucosídico se forma por eliminación de agua (un grupo hidroilo de la pentosa y un hidrogeno de la base), como en la formación de enlaces O-glucosídicos. Tanto el ADN como el ARN contienen dos bases purinicas principales, la adenina (A) y la guanina (G), y dos pirimidinas principales. En ambos, una de las pirimidinas es la citosina (C), pero la segunda no en la misma en los dos, es timina (T) en el ADN, y uraciolo (U) en el ARN. Solo raramente se encuentra timina en el ADN o uracilo en el ADN. Los nucleótidos desempeñas una amplia variedad de funciones en el metabolismo celular. Constituyen la moneda energética en las transacciones metabólicas, son los nexos químicos en los sistemas celulares, en respuesta a hormonas y otros estimulos extracelulares, y son también componentes estructurales de una serie de cofactores enzimáticos e intermediarios metabólicos. Además son las unidades estructurales de los acidos nucleicos; el ADN y el ARN, los depositarios moleculares de la información genética.

Nomenclatura

dAMP

Nombre

Imagen

Desoxiadenilato (desoxiadenosina 5'-monofosfato)

35

dTMP

Desoxitimidilato (desoxitimidina 5'-monofosfato)

dCMP

Desoxicitidilato (desoxicitidina 5'-monofosfato)

dGMP

Desoxiguanilato (desoxiguanosina 5'-monofosfato)

Localizacion celular Funciones Los nucleótidos son las unidades estructurales de los acidos nucleicos y sus propiedades influyen en la estructura tridimensiona de los mismos. Las pirimidinas y purinas son compuestos débilmente básicos, por eso se las llama bases. Las bases presentes en los acidos nucleicos son moléculas altamente conjugadas, por lo que afectan a la estructura, distribución electrónica y absorción de la luz de los mismos. Admas, las bases son hidrofóbicas y relativamente insolubles al agua a pH 7. Las interacciones hidrofóbicas entre las bases tienen gran importancia en la estabilidad de la estructura de los acidos nucleicos. Además de las funciones que les corresponden como subunidades de los acidos nucleicos, los nucleótidos también desempeñan otras funciones en las células: actúan como transportadores de energía, componentes de cofactores enzimáticos y mensajeros químicos. Transportan energía química en las células: pueden presentar uno, dos o tres grupos fosfatos unidos covalentemente al grupo hidroxilo en 5´de la ribosa. Se les conoce como nucleosidos mono-, di- y trifosfato, respectivamente. La hidrolisis de los nucleosidos trifosfato proporciona la energía química para impulsar una veriedad de reacciones celulares. La adenosina 5´trifosfato, el ATP, es, con diferencia, el mas utilizado, aunque el UTP, el GTP y el CTP se emplean en algunas reacciones. Los nucleosidos trifosfato también actúan como precursores activados en la síntesis de ADN y ARN. En enlace entre la ribosa y el fosfato es de tipo ester. Los enlaces α, β, γ son anhídridos de acido fosfórico. 36

La hidrolisis del ATP a menudo juega un importante papel termodinamico en la biosíntesis. Cuando se acopla con una reacción con variación de energía libre positiva, la hidrolisi del ATP desplaza el equilibrio del proceso global en favor de la formación de producto. Componentes de cofactores enzimáticos: muchos cofactores enzimáticos incluyen a la adenosina como parte de su estructura. Su papel tiene relación con la energía de unión entre el enzima y el sustrato (o cofactor), que esta implicada tanto en la catálisis como en la estabilización del complejo enzima-sustrato inicial. (NAD y FAD) Un solo dominio proteico capaz de fijar adenosina puede utilizarse en enzimas diferentes. Este tipo de estructura, denominada plegamiento de unión de nucleótidos, se encuentra en muchos enzimas que unen ATP y cofactores nucleotidicos. Mensajeros: las células responden a su entorno captando señales hormonales y de otro tipo. La interaccion de estas señales (primeros mensajeros) con la supuerficie celular suele dar lugar a la produccion de (segundos mensajeros en el interior de la celulo que provocan cambios adaptativos en el interior celular. Estos segundos mensajeros suelen ser nucleótidos. Nucleotidos mono, di y trifosfato Los nucleótidos pueden tener 1, 2, o 3 grupos fosfatos unidos al C5 del azúcar. De acuerdo a la cantidad de grupos fosfato se los clasifica como nucleótidos mono-, bi- o trifosfato, respectivamente. En los nucleótidos trifosfatos, los enlaces que unen a los grupos fosfato son de alta energía y pueden ser hidrolizados liberando energía para llevar a cabo distintas reacciones. Nucleotidos como transportadores de energía ATP La adenosina trifosfato (abreviado ATP, y también llamada adenosín-5'-trifosfato o trifosfato de adenosina) es una molécula utilizada por todos los organismos vivos para proporcionar energía en las reacciones químicas. También es el precursor de una serie de coenzimas esenciales como el NAD+ o la coenzima A. El ATP es uno de los cuatro monómeros utilizados en la síntesis de ARN celular. Además, es una coenzima de transferencia de grupos fosfato que se enlaza de manera no-covalente a las enzimas quinasas (co-sustrato). El ATP es un nucleótido trifosfato que se compone de adenosina (adenina y ribosa, como β-Dribofuranosa) y tres grupos fosfato. Su fórmula molecular es C10H16N5O13P3. La estructura de la molécula consiste en una base purina (adenina) enlazada al átomo de carbono 1' de un azúcar pentosa. Los tres grupos fosfato se enlazan al átomo de carbono 5' de la pentosa. Los grupos fosforilo, comenzando con el grupo más cercano a la ribosa, se conocen como fosfatos alfa (α), beta (β) y gamma (γ). Debido a la presencia de enlaces ricos en energía (entre los grupos fosfato son los enlaces anhídrido del ácido), esta molécula se utiliza en los seres vivos para proporcionar la energía que se consume en las reacciones químicas. De hecho, la reacción de hidrólisis de la adenosina trifosfato en adenosina difosfato y fosfato es una reacción exergónica donde la variación de entalpía libre estándar es igual a -30,5 kJ/mol El ATP es la principal fuente de energía para la mayoría de las funciones celulares. Esto incluye la síntesis de macromoléculas como el ADN, el ARN y las proteínas. También desempeña un papel fundamental en el transporte de macromoléculas a través de las membranas celulares, es decir, en la exocitosis y endocitosis. También interviene en la señalización intra e intercelular. 37

Nucleotidos como coenzimas Un buen numero de cofactores enzimáticos que llevan a cabo una amplia gama de funciones químicas incluyen la adenosina como parte de su estructura. Es el caso del NAD, FAD y la Coenzima A. La coenzima A, que está formada por un derivado del ADP, el ácido pantoténico, y una cadena corta de etilamina unida a un grupo tiol (-SH), que recibe el nombre de B-mercaptoetilamina (mercapto = azufre). La coenzima A se designa abreviadamente con el término CoA, o bien con el de CoA-SH, para resaltar la importancia que tiene el grupo funcional tiol. Interviene en reacciones enzimáticas implicadas en el metabolismo celular, como transportador de grupos acilo (R-CO-) procedentes de los ácidos orgánicos. Un derivado de la coenzima A, el acetil coenzima A (CH3-CO-S-CoA), tiene una gran importancia en el metabolismo celular. Surge de la unión de la coenzima A con una molécula de ácido acético mediante un enlace tioéster (entre el grupo tiol y el grupo carboxilo del ácido).

Nucleotidos de nicotinamida y flavina Las piridina-nucleótidos suelen actuar como coenzimas libres. Las más comunes son la nicotinamida-adenina-dinucleótido (NAD), compuesta de la nicotinamida, ribosa, fosfato y AMP, y la nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato (NADP), que además contiene ácido fosfórico esterificado con el OH del carbono 2' del AMP La nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), es una coenzima que se encuentra en todas las células vivas. El compuesto es un dinucleótido, ya que consta de dos nucleótidos unidos a 38

través de sus grupos fosfato con un nucleótido que contiene un anillo adenosina y el otro que contiene nicotinamida.En el metabolismo, el NAD+ participa en las reacciones redox (oxidorreducción), llevando los electrones de una reacción a otra. Su centro activo es la nicotinamida, pudiéndose transformar en NADH o NADPH. La coenzima, por tanto, se encuentra en dos formas en las células: NAD+ y NADH. El NAD+, que es un agente oxidante, acepta electrones de otras moléculas y pasa a ser reducido, formándose NADH, que puede ser utilizado entonces como agente reductor para donar electrones. Estas reacciones de transferencia de electrones son la principal función del NAD+. Sin embargo, también es utilizado en otros procesos celulares, en especial como sustrato de las enzimas que añaden o eliminan grupos químicos de las proteínas, en modificaciones posttraduccionales.

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Los nucleótidos de flavina, que están formados por una base nitrogenada, la flavina, y como pentosa, un derivado de la ribosa, el ribitol, son grupos prostéticos de enzimas de oxidorreducción. La flavina-mononucleótido (FMN) está compuesta por la base flavina, el azúcar ribitol y un grupo fosfato. La FMN puede unirse al AMP para formar la flavina-adeninadinucleótido (FAD), que también es un grupo prostético. Actúan como grupos prostéticos asociados firmemente a proteínas especificas formando falvoproteinas. Los nucleótidos de flavina son: FMN: flavín-mononucleótido. La flavina está unida a un grupo fosfato y FAD: flavín-adenín-dinucleótido, formado por una molécula de FMN unida mediante enlace fosfodiéster a otra de AMP (adenosín monofosfato). Ambos son coenzimas de las deshidrogenasas, enzimas que catalizan las reacciones de oxidación-reducción, y se pueden encontrar tanto en forma oxidada (FAD, FMN) como en forma reducida (FADH2, FMNH2). Para pasar de una forma a otra, captan o ceden hidrógeno oxidando o reduciendo el sustrato.

Nucleotidos cíclicos Algunos nucleótidos actúan como intermediarios de la acción hormonal (mensajeros químicos). Son nucleótidos cíclicos, en los que el ácido ortofosfórico esterifica dos hidroxilos (el 3' y el 5') de la misma ribosa. Los más comunes son la adenosina-3', 5'-monofosfato o AMP cíclico (AMPc y la guanosina-3',5'-monofosfato o GMP cíclico (GMPc).

UNIDAD 5 – Hidratos de Carbono y su metabolismo 40

Los hidratos de carbono son biomoléculas constituidas por C, H y O. Su formula general es

CH (¿¿ 2 O) n , y se definen como poli hidroxi aldehídos o poli hidroxi cetonas. ¿ ALDOSAS (grupo aldheido) OSAS o monosacaridos CETOSAS (grupo cetona)

OSIDOS Unión de monosacáridos por enlace glucosidico

HOLOSID OS Solo glucidos

OLIGOSACARIDOS 2 a 10 monosacaridos POLISACARIDOS Mas de 10 monosacaridos

Aldotriosa (ej, gliceraldehido) Aldotetrosa (ej, eritrosa) Cetotriosa (ej, dihidroxiacetona) Cetotetrosa (eritrulosa) Disacaridos (ej, sacarosa) Trisacaridos (ej, rafinosa) Etc.. HOMOPOLISACARIDOS Se repite un solo monsacarido HETEROPOLISACARIDOS Se repite mas de una clase de monosacaridos

GLUCOCONJUGADOS Tiene glúcidos y moléculas no glucidicas

GLUCOLIPIDOS GLUCOPROTEINAS

Estructuras de monosacáridos, disacáridos y polisacaridos Los monsacaridos están formados por una sola unidad de poli hidroxi aldehído/cetona. Se nombran haciendo referencia al numero de carbonos que poseen, terminado en el sufijo OSA (triosas,tetrosasas,pentosas,etc). No son hidrolizables y a partir de 7C son inestables. Presentan un esqueleto carbonado con grupos alcohol o hidroxilo y son portadores del grupo aldehído (aldosas) o cetónico (cetosas).

41

42

En estos compuestos existe estereoisomeria debido a la existencia de C asimétricos. La disposición del grupo –OH a la derecha en el C asimétrico determina el isómero D, mientras que si esta situado a la izquiera es un isomero L. Cuando un monosacárido tiene varios esteroisomeros, todos los que poseen a la darecha el grupo OH del C mas alejado del grupo carbonilo son de la serie D, y los que lo poseen a la izquierda son de la serie L. Se llama epimeros a los monosacáridos que difieren en la configuración de 1 solo atomo de C. Los monosacáridos pueden formar hemiacetales intramoleculares, las aldosas forman estrucutras conocidas como piranosas y las cetosas forman estructura conocidas como furanosas. Asi, se consituyen los estereoisomeros α y β en torno al C anomerico.

Existen derivados de monosacáridos como: Azucares alcoholes o poli-alcoholes: se obtienen por reducción del frupo carbonilo. Ej. Glicerol, sorbitol, inositol. Azucares acidos: se obtienen por reacciones de oxidación para producir diferentes tipos de acidos y, en el caso de las aldosas, lactonas.   

Se llaman acidos gluconicos (aldonicos) cuando la oxidación se da en el C1 del monosacárido. Se llaman acidos glucuronicos (uronicos) cuando la oxidación se da en el C6 del monosacárido. Se llaman acidos glucanicos (aldanicos) cuando la oxidación se da en los C1 y C6 del monosacárido.

Amino-azucares: son monosacáridos que establecen un enlace con compuestos aminados, constituyendo enlaces N-glucosidicos. Los oligosacáridos contienen de 2-10 unidades de monosacáridos unidos por enlaces O glucosidicos. Los disacáridos son oligosacáridos formados por dos monosacáridos. Son solubles en agua, dulces y cristalizables. Pueden hidrolizarse y ser reductores cuando el carbono anomerico de alguno de sus componentes no esta implicado en el enlace entre los monosacáridos. La capacidad reductora de los glúcidos se debe a que el grupo aldehído o cetona puede oxidarse conduciendo a la formación de un acido. Maltosa: dos moléculas de glucosa unidas por enlace tipo α (1-4). 43

Celobiosa: se obtiene por hidrolisis de la celulosa. Formado por dos moléculas de glucos unidas por enlace β (1-4).

Lactosa: formada por la unión β (1-4) de la β-D-galactorpiranosa (galactosa) y la α-Dglucopiranosa (glucosa).

Sacarosa: es el único disacárido no reductor, ya que los dos carbonos anomericos de la glucosa y fructosa están implicados en el enlace glucosidico (1α,2β).

La rafinosa, estaquiosa y varbascosa son tres oligosacáridos relacionados estructuralmente con la sacarosa, con una, dos y tres glactosas, respectivamente son tri, tetra y pentasacaridos.

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Los oligosacáridos se asocian a numerosas proteínas o lípidos interaccionando con mucha afinidad y especificidad con lectnias del medio extracelular. Estas moléculas complejas están implicadas en el reconocimiento de virus, toxinas, bacterias, etc. Los polisacáridos contienen mas de 10 unidades de monosacáridos unidos por enlaces O glucosidicos, formando cadenas lineales o ramificadas. Tienen peso molecular elevado, no tienen sabor dulce, pueden ser insolubles o formar dispersiones coloidales y no poseen poder reductor. Sus funciones son estructurales (enlace β-glucosidico) y de reserva energética (enlace αglucosidico). En vegetales: Almidon: es un homopolisacarido de reserva. Procede de la polimerización de la glucosa. Se trata de un polímero de glucosa, formado por dos tipos de molecula: amilosa (30%), molecula lineal de glucosas unidas por enlaces α-1,4 que se encuntra enrollada en forma de hélice, y amilopectina (70%), cadena de amilosa con ramificaciones constituidas por enlaces α-1,6.

Celulosa: homopolisacarido lineal formado por la unión de moléculas de de β-glucosa mediante enlaces β-1,4-O-glucosidicos. Por hidrolisis da glucosa. En su estructura se dan multiples puentes de hidrogeno entre los grupos hidroxilo de distintas cadenas yuxtapuestas de glucosa, haciéndolas impenetrables al agua, lo que las hace insolubles en agua, y originando fibras compactas que constituyen la pared celular de las células vegetales.

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Hemicelulosa: es un heteropolisacarido ramificado. Si bien hay variedad de moléculas con estas características, la principal es el xiloglucano, una cadena lineal de (1->4)-β-Dglucopiranosa, a la cual se le unen cadenas laterales cortas con residuos de xilosa, galactosa y fucosa en el carbono 6 de los residuos de glucosa a intervalos regulares. También se la conoce como pentosanas. Pectinas: son heteropolisacaridos complejos, poseen azucares como acidos galacturonicos y glucuronicos, asi como también azucares neturos. Los homogalacturonanos, están formados por un polímero lineal de acido galacturonico unidos por enlaces α(1->4), con residuos de ramnosa unidos por enlaces α(1->2) espaciados de manera regular. Gomas: son heteropolisacaridos muy complejos, siempre heterogéneos y ramificados, con acidos uronicos. Las gomas son productos muy viscosos que cierran las heridas en los arboles. En los extremos se encuentran restos de acido glucuronico. Mucilagos: se consideran constituyentes celulares normales En animales: Glucogeno: polisacárido de reserva, es un homopolisacarido ramificado, constituido por glucosas unidas por enlaces O-glucosidicos α-(1,4), con ramificaciones α-(1-6). Estructuralmente igual a la amilopectina, pero la frecuencia es mayor en el glucoqueno (cada 8-12) que en ella (cada 20-24).

Quitina: es un homopolisacarido lineal, constituido por monómero de N-acetil-glucosamina unidas por enlace O-glucosidico de tipo β, (1-4), por lo que cumple función estructural.

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Acido hialuronico: es un heteropolisacarido lineal, en hélice, con cargas negaticas, que fija mucha agua. Son unidades alternadas de acetilglucosamina y acido glucuronico unidas por enlaces β-(1-4) y β-(1-3).

Además, existen glúcidos asociados a otras moléculas: Heterosidos: son moléculas de un mosacarido o de un pequeño oligosacárido unidas con una o varias moléculas no glucidicas. Peptidoglucanos o mureína: constituyen la pared bacteriana, una estructura rigida que limita la entrada de agua. Proteoglucanos: están formadas por polisacáridos y una pequeña fracción proteica. Glucoproteínas: formadas por una fracción glucidica (5-40%) y una fracción proteica unidas por enlaces covalentes. Glucolipidos: formados por monosacáridos u oligosacáridos unidos a lípidos.

Enlaces glicosidicos O y N El enlace O-glucosidico se forma entre dos –OH de dos azucares, y es clave en la formación de oligosacáridos y polisacáridos. Este puede ser α o β, según la estereoisomeria del primer monosacárido que participa en ese enlace. El enlace N-glucosidico se forma entre un –OH del azúcar y el N de un compuesto aminado, originando aminoazucares. Glicolisis En la glucolisis se degrada una molecula de glucosa en una serie de reacciones catalizadas enzimáticamente, dando dos moléculas del compuesto de 3 carbonos, piruvato. Durante la 47

secuencia de reacciones de la misma, parte de la energía libre cedida por la glucosa se conserva en forma de ATP y NADH. Esto sucede en el citosol. La glucosa se origina de la degradación de polisacáridos, glucógeno en animales y almidon en vegetales; de la degradación de disacáridos y de la gluconeogénesis. La rotura de la glucosa, que tiene seis carbonos, en dos moléculas de piruvato, formado por tres carbonos, tiene lugar en 10 pasos, de los cuales los primero 5 constituyen la fase preparatoria, en la que se da la fosforilacion de glucosa y su conversión en gliceraldehido 3fosfato. 1- Fosforilacion de la glucosa La glucosa se activa mediante la fosforilacion en el C6 dando glucos 6-fosfato; el ATP es el dador de fosforilo. Esta reacción es irreversible, y esta catalizada por la hexoquinasa. La hexoquinada necesita

2+¿ ¿ Mg para su actividad.

Glucosa + ATP  Glucosa-6-fosfato + ADP 2- Conversion de la glucosa 6-fosfato en fructosa 6-fosfato El enzima fosfoglucosa isomerasa cataliza la isomerización reversible de la aldosa a una cetosa. Esta isomerización tiene un carácter critico en la química global de la ruta ya que el reordenamiento de los grupos carbonilo e hidroxilo en C1 y C2 es necesario para los siguientes pasos.

Glucosa-6-fosfato ↔ Fructosa-6-fosfato 3- Fosforilacion de la fructosa 6-fosfato a fructosa 1,6-bifosfato Es la segunda de las reacciones activadoras de la glucolisis, la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1) cataliza la transferencia de un grupo fosforilo desde el ATP. La reacción es prácticamente irreversible en condiciones celulares y es la primera comprometida en la ruta glucolitica. 48

Fructosa-6-fosfato + ATP  Fructosa-1,6-bisfosfato + ADP 4- Rotura de la fructosa 1,6-bifosfato El enzima fructosa 1,6-bifosfato aldolasa, cataliza una condensación aldolica reversible. La fructosa 1,6-bifosfato se rompe dando 2 triosas fosfato diferentes, el gliceraldehido 3-fosfato (aldolasa) y la dihidroxicetona fosfato (cetosa).

Fructosa-1,6-bisfosfato ↔ Dihidroxiacetona-fosfato + Gliceraldehído-3-fosfato 5- Interconversion de las triosas fosfato La dihidroxicetona, se convierte rápida y reversiblemente en gliceraldehido 3-fosfato por la triosa fosfato isomerasa.

Dihidroxiacetona-fosfato ↔ Gliceraldehído-3-fosfato Hasta aquí se se han de invertir dos moléculas de ATP antes de la rotura de la glucosa. El retorno energético tiene lugar en la fase de beneficios, en la que se da la conversión oxidativa del gliceraldehido 3- fosfato en piruvato con formación acoplada de ATP y NADH, 6- Oxidacion del gliceraldehido 3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato Conversión del gliceraldehido 3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerat, catalizada por el gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa. Esta es la primera de las dos reacciones conservadoras de energía de la glucolisis. El grupo aldehído es oxidado a un anhídrido de acido carboxílico con acido fosfórico (acil fosfato). La cantidad de

+¿ NAD¿

en una celulaes muy inferior a la cantidad de 49

glucosa metabolizada en unos minutos. La ruta se detendría si el NADH formado en este paso de la glucolisis no se reoxidara y reciclara continuamente.

NAD+ NADH + Pi

+ H+

Gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa

Gliceraldehído-3-

1,3-

fosfato

Bisfosfoglicerato

+ Pi + NAD+

+ NADH + H+

7- Transferencia de fosforilo desde el 1,3-bifosfoglicerato al ADP El enzima fosfoglicerato quinasa transfiere el grupo fosforilo de alta energía desde el grupo carboxilo del 1,3-bifosfoglicerato al ADP, obteniéndose ATP y 3-fosfoglicerato. La formación de ATP por transferencia del grupo fosforilo a partir de un sustrato como en este caso, se conoce como fosforilacion a nivel de sustrato.

ADP ATP

Fosfoglicerato quinasa

1,3-Bisfosfoglicerato

3-Fosfoglicerato

+ ADP

+ ATP

8- Conversion del 3-fosfoglicerato en 2-fosfoglicerato

50

El enzima fosfoglicerato mutasa cataliza un desplazamiento reversible del grupo fosforilo

2+¿ ¿ Mg

entre C2 y C3 del glicerato. El

es esencial para esta reacción.

Fosfoglicerato mutasa

3-

2-

Fosfoglicerato

Fosfoglicerato

9- Deshidratacion del 2-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato Es la segunda reacción que genera un compuesto con potencial elevado de transferencia de grupo fosforilo (6- la primera). La enolasa promueve la eliminación reversible de una molecula de agua del 2-fosfoglicerato, dando fosfoenolpiruvato (PEP). El mecanismo implica un intermediarion enolico estabilizado por

2+¿ ¿ Mg .

enola sa

2Fosfoglicer ato

Fosfoenolpiruvat o +H2O

10-Transferencia del grupo fosforilo desde el fosfoenolpiruvato al ADP

51

El ultimo paso es la transferencia del grupo fosforilo desde el fosfoenolpiruvato al ADP

catalizada por la piruvato quinasa, que requiere

2+¿ ¿ 2+¿ o Mn ¿ +¿ y tambien Mg . Esta fosforilacion a nivel ¿ K

de sustrato da como producto piruvato, que aparece en primer lugar en su forma enol y a continuación se tautomeriza para dar la ceto que predomina a pH 7.

ADP ATP piruvato quinasa

Fosfoenolpiru

Piruvat

vato

o

Finalmente, el rendimiento neto es de dos moléculas de ATP por molecula de glucosa utilizada. También se conserva energía mediante la formación de dos moléculas de NADH por molecula de glucosa.

52

Las dos moléculas de piruvato formadas por la glucolisis aun contienen la mayor parte de la energía química potencial obtenible de la glucosa, energía que se puede extraer mediante reacciones oxidativas en el ciclo de Krebs y en la fosforilacion oxidativa. La importancia de que los intermediarios entre la glucosa y el piruvato se encuentren fosforilados radica en:  

La membrana plasmática carece de transportadores para los azucares fosforilados, por lo que los intermediarios no pueden abandonar la celula. Los grupos fosforilo son componentes esenciales en la conservación enzimática de la energía metabolica. 53



La fijación de los grupos fosfato a los sitios activos de los enzimas disminyen la energía de activación y aumenta la especificidad de las reacciones enzimáticas.

La mayoría de las células, en condiciones aerobicas oxidan sus nutrientes a

CO2

y

H2O .

La glucolisis es solo la primer etapa de la oxidación completa de la glucosa. La fase aerobica del catabolismo se denomina respiración celuilar, y ocurre en tres etapas: 

Descarboxilacion oxidativa del piruvato a acetil-CoA.



El acetil-CoA ingresa al ciclo de Krebs, donde se oxida a conserva como NADH y



FADH 2 .

Los equivalentes de reducción son oxidados, liberando son transferidos al

CO2 . La energía liberada se

+¿¿ H y electrones. Los electrones

O2 mediante transportadores en la cadena respiratoria, y se forma

ATP mediante la fosforilacion oxidativa. Glucolisis aerobica y anaeróbica El piruvato formado puede continuar siendo metabolizado siguiendo una de tres rutas catabólicas distintas: En condiciones aerobicas, el piruvato se oxida, con perdida de su grupo carboxilo, en forma de

CO2

dando el grupo acetilo del acetil-coenzima A, que es ocidado seguidamente de manera

completa a

CO2

por el ciclo del acido cítrico. Los electrones de estas oxidaciones pasan al

O2 a través de una cadena de transportadores en la mitocondria, formando

H 2 O . La

energía procedente de las reacciones de transferencia electrónica impulsa la síntesis de ATP en la mitcondria. La segunda ruta para el piruvato es su reducción a lactato via fermentación del acido láctico. En condiciones de baja concentración de oxigeno (hipoxia) o anaeróbicas, el NADH no puede ser reocidado a

+¿ NAD¿ , siendo este ultimo el aceptor de electrones imprescindible para la

posterior oxidación del piruvato. En estas condiciones, el piruvato se reduce a lactato y acepta los electrones del NADH, regenerando asi el

+¿ NAD¿

necesario para la continuación de

la glucolisis. En la glucolisis la deshidrogenacion de las dos moléculas de gliceraldehido 3fosfato, reduce 2

+¿ NAD¿

a 2 NADH, como la oxidación de 2 piruvatos a 2 lactato regenera 2

+¿ NAD¿ , el proceso global esta equilibrado. El lactato formado en los musculos puede reciclarse; es transportado hacia el hígado donde se convierte en glucosa. (Lactato deshidrogenasa)

54

La tercera ruta conduce al etanol. El piruvato se convierte, bajo condiciones anaeróbicas o de

CO2 , proceso denominado fermentación etanolica o alcohólica. Primero

hipoxia, en etanol y

se descarboxila a acetaldehído por la piruvato descarboxilasa, luego se reduce a etanol, con NADH producido en la deshidrogenicacion del gliceraldehido 3-fosfato, a través de la alcohol deshidrogenasa.

Además el piruvato tiene también otros destinos anabólicos, ya que puede por ejemplo contribuir en la síntesis de alanina y de acidos grasos. Fermentacion es un termino general que indica degradación anaeróbica de la glucosa u otros nutrientes organicos, para obtener energía en forma de ATP. Balance energético

+¿

Glucosa + 2 ATP + 2 NAD¿ ATP + 2

+ 4 ADP + 2 Pi  2 piruvato + 2 ADP + 2 NADH + 2

+¿¿ H

+4

H2O

Simplificando:

+¿

+¿¿ H

+ 2 ATP + 2

H2O

Las dos moléculas de NADH formadas, son en condicione aerobicas, reaoxidadas a

+¿ NAD¿

Glucosa + 2 NAD¿

+ 2 ADP + 2 Pi  2 piruvato + 2 NADH + 2

por transferencia de sus electrones a la cadena respiratoria. La cadena de transporte electrónico pasa estos electrones a su destino final, el

+¿

2 NAD¿

+2

O2 :

2 NADH + 2

+¿¿ H

+

O2 

H2O

55

La transferencia de electrones desde el NADH al

O2 en la mitocondria aporta la energía

para la biosíntesis de ATP por fosforilacion acoplada a la respiración. En el proceso glucolitico global, se convierte una molecula de glucosa en dos moléculas de piruvato; dos moléculas de ADP y dos de Pi se convierten en dos moléculas de ATP; fianlmente cuatro electrones, en forma de dos iones hidruro, se transfieren desde dos moléculas de gliceraldehido 3-fosfato a dos de

+¿ NAD¿ .

Regulación El flujo de glucosa a través de la ruta glucolitica esta regulado con el objetivo de conseguir niveles casi constantes de ATP, asi como el suministro adecuado de intermediarios glucoliticos que se necesitan para procesos biosinteticos. El ajuste necesario de la velocidad de glucolisis se consigue mediante una compleja influencia reciproca entre el consumo de ATP, regeneración de NADH y regulación alosterica de varios enzimas glucoliticos, entre ellos hexoquinasa, PFK-1 y piruvato quinasa, asi como por fluctuaciones segundo a segundo de la concentración de metabolitos clave que reglejan el equilibrio celular entre la produccion y consumo de ATP. En una escala de tiempo ligeramente mas larga, esta regulada por las hormonas glucagón, adrenalina e insulina, asi como por cambios en la expresión de los genes de varios enzimas glucolitcos. La primera reacción de la ruta que es catalizada por la hexoquinsa, es irreversible metabólicamente, siendo una de las etapas de contron para la glucolisis. El factor regulador es la cantidad de producto (glucosa 6-fosfato), la cual inhibe alostericamente la hexoquinasa. La piruvato quinasa es inhibida alostericamente ante un aumento en la concentración de ATP. También es inhibida por el acetil-CoA y por acidos grasos de cadena larga (combustibles del ciclo de Krebs). La fosfofrutoquinasa-1 (PFK-1) cataliza una reacción irreversible metabólicamente, consumiendo una molecula de ATP, dando como resultado la fosforilacion de un grupo hidroxilo del azúcar sustrato. El ATP es tanto un sustrato de PFK-1 como un inhibidor alosterico de la enzima, mientras que el ADP y AMPO son activadores. Antes de entrar en el ciclo del acido cítrico, los esqueletos carbonados de azucares y acidos grasos deben ser degradados al grupo acetilo del acetilo-CoA, la forma en que el ciclo del acido cítrico acepta la mayor parte del combustible aportado. El piruvato se oxida para dar lucar a acetil-Coa y

CO2

a consecuencia de la acción que

sobre el ejerce una agrupación estructurada de tres enzimas con multiples copias de cada uno de ellos, el complejo de la piruvato deshidrogenasa (PDH), localizado en las mitocondrias de las células eucarióticas y en el citosol de las bacterias. La reacción global catalizada por el complejo de la piruvato deshidrogenasa es una descarboxilacion oxidativa, un proceso de oxidación irreversible en el que el piruvato piere un grupo carboxilo en forma de molecula de

CO2

y los dos carbonos restantes se transforman

en el grupo acetilo del acetil-CoA. El NADH formado en esta reacción libera un ion hidruro a la cadena respiratoria, que transporta los dos electrones hasta el oxifeno o un aceptor de electrones alternativo (en organismos anaeróbicos).

56

La mitocondria es delimitada por una doble membrana, pero solo la membrana interna presenta una barrera para el paso del piruvato. En presencia de

O2 , el piruvato atraviesa la

membrana externa mitocondrial por un canal acuoso formado por una proteína llamada porina. En la membrana interna esta incluida una proteína, la piruvato translocasa, que permite el transporte del piruvato del especio intermembranal a la matriz mitocondiral. Una vez dentro de la mitocontria, el piruvato es convertido en acetil-Coa y

CO2 . El acetil-Coa

será oxidado por las reacciones del ciclo de Krebs. El complejo piruvato deshidrogenasa consiste en tres enzimas: piruvato deshidrogenasa (E1), dihidrolipoamida acetiltransferasa (E2) y dihidrolipoamida deshidrogenada (E3). Estas están ensambladas de forma convalente, de manera que catalizan reacciones sucesivas. El producto formado por una reacción sufre la acción del componente siguiente del sistema. Necesita 5 coenzimas: pirofosfato de tiamina (TPP), FAD, CoA, NAD y lipoato.

E1: cataliza la descarboxilacion del piruvato, produciendo hidroxietil-TPP y a continuación la oxidación del grupo hidroxietilo a gupa acetilo. E2: cataliza la transferencia del grupo acetilo al coenzima A formando acetil-CoA. E3: cataliza la regeneración de la forma disulfuro (oxidada) del lipoato; los electrones pasan primero al FAD y a continuación al

+¿ NAD¿ .

57

El largo brazo de lipoil-lisina bascula los sitios de acción de E1 a E2 y de E2 a E3 (canalización de sustratos).

1- El piruvato reacciona con el TTP unido a E1 y se descarboxila a un derivado hidroxietilico. 2- La E1 cataliza la transferencia de dos electrones y del grupo acetilo del TPP a la forma oxidad del grupo lipoil-lisilo de la E2, formándose el tioester de acetilo del grupo lipoilo reducido. 3- Transacetilacion en la que el grupo –SH del CoA sustituye al grupo –SH de la E2 para obtener acetil-Coa y el grupo lipoilo en su forma mas reducida. 4- La E3 cataliza la transferencia de 2 H de los grupos lipoilo reducidos de E2 al FAD de E3, reestableciendo la forma oxidad del grupo lipoil-lisilo. 5- El

FADH 2 de E3 transfiere un ion hidruro al

+¿ NAD¿ , formando NADH.

Ciclo de Krebs Tambien llamado ciclo del acido cítrico, o ciclo de los acidos tricarboxilicos. Es una via metabolica cíclica en la cual se da un proceso mediante el cual se oxida el acetil-CoA. El mismo ocurre en la matriz mitocondrial (eucariotas). En cada vuelta del ciclo se produce la entreada de un grupo acetilo (dos carbonos) en forma de acetil-CoA y la salida de dos moléculas de

CO2 ; se utiliza una molecula de oxalacetato

para formar citrato y se regenera una molecula de oxalacetato. Cuatro de los ocho pasos de este proceso son oxidaciones en las que la energía de oxidación se conserva, con elevada eficiencia, en forma de los coenzimas reducidos NADH y

FADH 2 .

A pesar del papel central que juega el ciclo del acido cítrico en el metabolismo energético, su función no solo se limita a la conservación de la energía. Los intermediarios de cuatro y cinco carbonos del ciclo actúan de precursores de una amplia gama de productos. 58

El ciclo del acido cítrico es anfibolico, ya que sirve tanto para el catabolismo como para el anabolismo; se pueden extraer intermediaros del ciclo y utilizarlos como material de partida para obtener productos biosinteticos.

59

1- Formacion de citrato Se da la condensación del acetil-CoA con oxalacetato para dar lugar a citrato, catalizada por la citrato sintetasa. El citril-CoA es un intermediario transitorio que se forma en el sitio activo del enzima y que se hidroliza rápidamente a CoA y citrato libres.

2- Formacion de isocitrato via cis-aconitato La enzima aconitasa (aconitato hidratasa) cataliza la transformación reversible del citrato en isocitrato a través de la formación intermedia del cis-aconitato.

60

3- Oxidacion del isocitrato a α-cetoglutarato y

CO2

La isocitrato deshidrogenasa cataliza la descarboxilacion oxidativa del isocitrato, dando lugar a la formación de α-cetoglutarato. Se requiere

+¿ NAD¿

o

+¿ NADP¿ según la enzima, ya que

existen dos formas diferentes de isocitrato deshidrogenasa en todas las células. Existe un interemdiario, el oxalsuccinato.

4- Oxidacion del α-cetoglutarato a succinil-CoA y

CO2

Descarboxilacion oxidativa por la que el α-cetoglutarato se convierte en succinil-CoA y por acción del complejo de la α-cetoglutarato deshidrogenasa; el

+¿ NAD¿

CO2

actua como aceptor

de elctrones y el CoA es el transportador del grupo succinilo. El complejo es muy parecido al complejo de la PDH tanto en estructura como en función.

5- Conversion de succinil-CoA en succinato El succinil-CoA tiene un enlace tioester con una energía libre estándar de hidrolisis altamente negativa. La energía liberada en la rotura de este enlace se utiliza para promover la síntesis de un enlace fosfoanhidrido del GTP o del ATP. En el proceso se forma succinato. La enzima que cataliza esta reacción reversible es la succinil-CoA sintetasa o succínico tioquinasa. La formación de ATP (o GTP) es una fosforilacion a nivel de sustrato.

61

6- Oxidacion del succinato a fumarato El succinato se oxida a fumarato por la flavoproteina succinato deshidrogenas.

7- Hidratacion del fumarato a malato La hidratación reversible del fumarato a L-malato esta catalizada por la fumarasa (fumarato hidratasa). El estado

8- Oxidacion del malato a oxalacetato En la utlima reacción, la L-malato deshidrogenasa ligada a NAD cataliza la oxidación de Lmalato a oxalacetato.

Importancia de las enzimas que intervienen y su regulación La regulación se realiza por medio de factores alostericos y por modificaciones covalentes de las enzimas. 62

El flujo de atomos de carbono desde el piruvato hacia el ciclo del acido cítrico y a través de el esta sujeto a una estrecha regulación a dos niveles: la conversión del piruvato en acetil-Coa, el material de partida del ciclo (Complejo piruvato deshidrogenasa) y la entrada de acetil-CoA en el ciclo (Citrato sintasa). El acetil-CoA se produce por vías diferentes a las del complejo de la PDH (oxidación de acidos grasos y de ciertos aminoácidos), por lo que la disponibilidad de intermediarios de estas otras vías es también importante en la regulación del piruvato y del ciclo del acido cítrico. El ciclo esta también regulado a nivel de las reacciones de la isocitrato deshidrogenasa y de la α-cetoglutarato deshidrogenasa. El complejo de la PDH es fuertemente inhibido por el ATP, asi como por el acetil-CoA y el NADH, los productos de la reacción catalizada por el complejo, asi como por acidos grasos. El AMP, CoA y

+¿ NAD¿ , todos los cuales se acumulan cuando fluye demasiado poco acetil-CoA

hacia el ciclo, activan alostericamente el complejo de la PDH. Tambien es inhibida mediante la fosforilacion reversible de un residuo Ser especifico de una de las dos subunidades E1. El complejo de la PDH de plantas, es inhibido por sus porductos (NADH y acetil-CoA). Tambien esta regulada por fosforilacion reversible. Las disponibilidad de los sustratos para la citrato sintasa (acetil-CoA y oxalacetato) limita en ocasiones la velocidad de formación de citrato. El NADH, producto de la oxidación del isocitrato y el α-cetoglutarato, se acumula bajo ciertas condiciones y a elevada concentración ambas reacciones de deshidrogenacion resultan inhibida por la acción de masas. De modo similar, la reacción de la malato deshidrogenasa esta en equilibrio, y cuando la concentración de NADH respecto a

+¿ NAD¿

es alta, la concentración de oxalacetato es baja, lo que

enlentece el primer paso del ciclo. El succinil-CoA inhibe la α-cetoglutarato deshidrogenasa y también la citrato sintasa; el citrato bloquea la citrato sintasa, y el producto final, ATP, inhibe tanto la citrato sintasa como la isocitrato deshidrogenasa. El ADP es un activador alosterico de la citrato sintasa.

63

Balance energético A pesar de que el ciclo del acido cítrico en si genera directamente solo un ATP por vuelta, los cuatro pasos de oxidación en el ciclo, proporcionan un gran flujo de electrones hacia la cadena respiratoria via NADH y

FADH 2 , y de este modo posibilita la formación de un gran

numero de moléculas de ATP durante la fosforilacion oxidativa. La energía liberada se usa para: convertir 1 ADP a 1 ATP; producir 3 NADH y 3 de

+¿ NAD¿

; y reducir 1

Acetil-CoA + 3

a partir

FADH 2 a partir de FAD.

+¿ NAD¿ + FAD + GDP/ADP + Pi +

FADH 2 + GTP/ATP + 2

+¿¿ H

H2O

2

CO2

+ CoA-SH + 3 NADH + 2

+¿¿ H

64

Reacciones anapleroticas Mecanismos especiales para reponer los compuestos intermediarios del ciclo, utilizados en biosíntesis. A medida que los intermediarios del ciclo del acido cítrico son retirados para servir como precursores biosinteticos, son repuestos mediante reacciones anapletoricas. En circunstancias normales, la entrada y salida de intermediarios del ciclo se encuentran en equilibrio dinamico, asi, las concentraciones de los intermediarios permanecen prácticamente constantes. Las reacciones anapleroticas mas comunes, convierten priuvato o fosfoenolpiruvato en oxalacetato o malato, en diversos tejidos y organismos. La reacción mas importante en hígado y riñon de mamíferos es la carboxilacion reversible del piruvato por el

CO2

para

formar oxalacetato, catalizada por la piruvato carboxilasa. Cuando el ciclo carece de oxalacetato o de algún otro intermediario, se carboxila piruvato para producir mas oxalacetato. Esto requiere energía que es aportada por el ATP. La piruvato carboxilasa es un enzima regulador y se encuentra prácticamente inactivo en ausencia de acetil-CoA (modulador alosterico positivo). Siempre que exista acetil-CoA en exceso, se estimula la reacción la piruvato carboxilasa para producir mas oxalacetato.    

Piruvato + HCO3 - + ATP ↔ Oxalacetato + ADP + Pi Fosfoenolpiruvato + CO2 + GDP ↔ Oxalacetato + GTP Fosfoenolpiruvato + HCO3 - ↔ Oxalacetato + Pi 8 Piruvato + HCO3 - + NAD(P)H ↔ Malato + NAD(P)+

Ciclo del glioxilato En muchos organismos no vertebrados, el ciclo del glioxilato sirve como mecanismo para convertir acetato en glúcido. En plantas, ciertos invertebrados y algunos microorganismos, el acetato puede servir como combustible altamente energético y también como fuente de fosfoenolpiruvato para la síntesis de glúcidos. Enzimas del ciclo del glioxilato catalizan la conversión neta de acetato en succinato o en otro intermediario de cuatro atomos de carbono del ciclo del acido cítrico: 2 Acetil-CoA +

+¿ NAD¿ +

H2O

 Succinato + 2 CoA + NADH +

+¿¿ H 65

En el ciclo, el acetil-CoA se condensa con el oxalacetato para formar citrato y el citrato se convierte en isocitrato, al igual que en ciclo del acido cítrico. Pero el siguiente paso consiste en la rotura de isocitrato por la isocitrato liasa, formando succinato y glioxilato. El glioxilato se condensa con una segunda molecula de acetil-CoA para dar malato, catalizada por la malato sintasa. El malato se oxida posteriormente a oxalacetato, el cual puede condensarse con otra molecuala de acetil-CoA para empezar de nuevo el ciclo. Cada vuelta del ciclo consume dos moléculas de acetil-CoA y produce una molecula de succinato. El succinato puede convertirse a través de fumarato y malato en oxalacetato, el cual puede convertirse en fosfoenolpiruvato por la PEP carboxiquinasa, y asi hasta glucosa por la gluconeogénesis.

En plantas, los enzimas de este ciclo se encuentran en orgánulos unidos a membrana denominados glioxisomas, que son peroxisomas especializados. Los enzimas comunes a los dos ciclos tienen dos isozimas, uno especifico de mitocondria y el otro de glioxisomas. Los glioxisomas se desarrollan en semillas ricas en lípidos durante la germinación. Además contienen todos los enzimas necesarios para la degradación de los acidos grasos de los aceites de la semilla. El acetil-CoA formado de la degradación de lípidos se convierte a succinato por este ciclo, y el succinato se exporta a la mitocondria, donde los enzimas del ciclo del acido cítrico lo transforman en malato. Un isozima citosolico de la malato deshidrogenasa oxida malato a oxalacetato, un precursor de la gluconeogenes. Asi la semilla en germinación puede convertir el carbono de los lípidos almacenados en glucosa. El esqueleto carbonado del oxalacetato del ciclo del acido cítrico (mitocondria) es transportado al glioxisoma en forma de aspartato, y este se reconvierte en oxalacetato. El succinato producido regresa a la mitocondria donde vuelve a entrar al ciclo del acido cítrico.

66

El isocitrato es un intermediario crucial, en el punto de ramificación entre los dos ciclos. La isocitrato deshidrogenasa se encuentra regulada mediante modificación covalente: una proteína especifica la fosforila con lo que se inactiva. Esta inactivación desvia el isocitrato hacia el ciclo del glioxilato. Una fosfoproteína fosfatasa elimina el grupo fosforilo de la isocitrato deshidrogenasa, reactivando el enzima y enviando mas isocitrato al ciclo del acido cítrico. La fosfoproteína que activa la isocitrato deshidrogenasa esta estimulada por intermediarios del ciclo del acido cítrico y de la glucolisis, y por indicadores de un reducido aporte energético celular. Los mismos metabolitos inhiben la actividad de la proteína quinasa del polipéptido bifuncional. De esta manera la acumulación de intermediarios de las vías centrales de generación de energía, que indican una reducción energética, dan como resultado la activación de la isocitrato deshidrogenasa. Cuando disminuye la concentración de estos reguladores, lo que indica un flujo suficiente a través del ciclo del acido cítrico generador de energía, la isocitrato deshidrogenasa es inactivada por la proteína quinasa. Los mismos intermediarios son inhibidores alostericos de la isocitraro liasa. Cuadno el metabolismo productor de energía es lo suficientemente rápido como para mantener las concentraciones de intermediarios a un nivel bajo, la isocitrato deshidrogenasa se inactiva, desaparece la inhibición de la isocitrato liasa, y el isocitrato fluye hacia el ciclo del glioxilato, para ser utilizado en la biosíntesis de glúcidos, aminoácidos y otros componentes celulares.

67

Gluconeogénesis, regulación Encaragada sintetizar glucosa a partir de precursores no glucidicos, se convierte piruvato y compuestos relacionados de tres y cuatro carbonos en glucosa. Los precursores importantes de la glucosa en enimales son compuestos de tres carbonos como el lactato, piruvato y glicerol, asi como ciertos aminoácidos. La gluconeogénesis y la glucolisis no son rutas idénticas que ocurren en direcciones opuestas, auqnue conparten varios pasoso; 7 de las 10 reacciones son la inversa de las reacciones glucoliticas. Hay tres que son prácticamente irreversibles y no pueden utilizarse en la gluconeogénesis: la conversión de la glucosa en glucosa 6-fosfato (hexoquinasa), la fosforilacion de la fructosa 6-fosfato a fructosa 1,6-bifosfato (fosforutoquinasa-1) y la conversión de fosfoenolpiruvato en piruvato (piruvato quinasa). En la gluconeogénesis, los tres pasos irreversibles se “rodean” mediante un conjunto diferente de enzimas que catalizan reacciones que son suficientemente exergonicas para ser egectivamente irreversibles en la dirección de la síntesis de glucosa. Como la glucolisis, tiene lugar mayoritariamente en el citosol, por lo que necesitan una regulación reciproca y coordinada, esta se logra a través de controles ejercidos sobre los pasos enzimáticos específicos propios de cada una. El primer rodeo es la conversión de piruvato en fosfoenol piruvato (PEP). La fosforilacion del piruvato se consigue mediante una secuencia de reacciones de rodeo, que en eucariotas requiere tanto enzimas del citosol como de la mitocondria. En primer lugar se transporta el piruvato desde el citosol a la mitocondira o se genera dentro de la mitocondira a partir de 68

alanina por transaminacion en la que se transfiere el grupo α-amino de la alanina a un αcetoacido carboxílico. A continuación, la piruvato carboxilasa (requiere biotina) convierte el piruvato en oxalacetato. Piruvato + HCO3 - + ATP ↔ Oxalacetato + ADP + Pi La piruvato carboxilasa es el primer enzima regulador en la ruta de la gluconeogénesis que requiere acetil-CoA como efector postivo. La reacción de la piruvato carboxilasa puede reponer intermediarios del ciclo del acido cítrico. Debido a que la membrana mitocondrial no tiene transportador de oxalacetato, antes de ser exportado al citosol, el oxalacetado debe ser reducido a malato mediante la malato deshidrogenasa mitocondiral a expensas de NADH

+¿

Oxalacetato + NADH + H ¿

+¿ NAD¿

 L-malato +

El malato abandona la mitocondria via un transportador especifico de la membrana mitocondrial interna y en el citosol el malato se reoxida a oxalacetato con produccion de NADH citosolico: Malato +

+¿ NAD¿

 Oxalacetato + NADH +

+¿¿ H

El oxalacetato se convierte entonces en PEP por la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa. Esta reacción dependiente de

+¿ Mg¿

Oxalacetato + GTP  PEP +

requiere GTP como dador de fosfato:

CO2

+ GDP

La reacción es reversible; la formación de un compuesto de alta energía (PEP) se compensa con la hidrolisis de otro (GTP). La ecuación global: Piruvato + ATP + GTP + HCO3 - ↔ PEP + ADP + GDP + Pi +

CO2

Debido a que el NADH citosolico se consume durante la gluconeogénesis, la biosíntesis de glucosa no puede tener lugar a menos que se suministre NADH. El transporte de malato desde la mitcondria hasta el citosol y su reconversión allí en oxalacetato tiene el efecto de transportar equivalentes de reducción en forma de NADH al citosol, en donde son escaso. Esta ruta desde el pirubato al PEP proporciona, por lo tanto, un equilibrio importante entre el NADH producido y el NADH consumido en el citosol durante la gluconeogénesis. Cuadno el lactato es el prcursor gluconeogenico predomina un segundo rodeo del piruvato a PEP. La conversión del lactato en piruvato en el citosol de los hepatocitos produce NADH, por lo que la exportación de equivaletnes reductores desde la mitocondria ya no es necesaria. Una vez transportado el piruvato producido por la reacción de la lactato deshidrogenasa a la mitocondria, se convierte en oxalacetato por acción de la piruvato carboxilasa. No obstante este oxalacetato se convierte directamente en PEP por la PEP carboxiquinasa. A continuación el PEP se transporta fuera de la mitocondria para continuar en la ruta gluconeogenica. Lactato +

+¿ NAD¿

 Piruvato + NADH +

+¿¿ H

(lactato deshidrogenasa)

69

La segunda reacción, la generación de la fructosa 6-fosfato a partir de la fructosa 1,6-bifosfato esta catalizada por la fructosa 1,6-bifosfato (FBPasa-1), enzima dependiente de

+¿ Mg¿ , que

promueve la hidrolisis prácticamente irreversible del fosfato en C1. Fructosa 1,6-bifosfato + bifosfatasa +

H2O

 Fructosa 6-fosfato + Pi

(fructosa 1,6-

+¿ Mg¿ )

El tercer rodeo es la reacción final de la gluconeogénesis, la desfoforilacion de la glucosa 6fosfato para dar glucosa. La reacción catalizada por la glucosa 6-fosfatasa no requiere la síntesis de ATP, sino que es una simple hidrolisis de un ester fosfato. Glucosa 6-fosfato + fosfatasa +

H2O

 Glucosa + Pi

(glucosa 6-

+¿ Mg¿ )

Esta enzima se encuentra en el retículo endoplasmatico de los hepatocitos y de las células renales y epitelalies del intestino delgado, pero no en otros tejidos. Si otros tejidos la tuvieran, la actividad de la enzima hidrolizaria la glucosa 6-fosfato, que es necesaria para la glucolisis. La glucosa generada es enviada a otros tejidos, a través del torrente circulatorio. La suma de reacciones es:

+¿

2 Piruvato + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 2 H ¿ Pi + 2

+4

H2O

 Glucosa + 4 ADP + 2 GDP + 6

+¿ NAD¿

La gluconeogénesis es energéticamente cara, pero es esencial. Gran parte del alto costo de energía es necesario para asegurar que la gluconeogénesis sea irreversible. La ruta biosintetica de la glucosa antes descrita permite la síntesis neta de glucosa no solo desde el piruvato, sino también de los intermediarios de cuatro, cinco y seis carbonos del ciclo del acido cítrico. Citrato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato y malato son todos ellos intermediarios del ciclo del acido cítrico que se pueden oxidar dando oxalacetato. Algunos atomos de carbono, o todos, de la mayoría de los aminoácidos procedentes de las proteínas se convierten en ultimo termino en piruvato o en intermediarios del ciclo del acido cítrico. La glucolisis y la gluconeogénesis están reguladas de forma reciproca. El primer punto de control determina el destino del piruvato en la mitocondria, pudiendo convertirse en acetilCoA por el complejo de la piruvato deshidrogenasa para alimentar el ciclo de Krebs o en oxalacetato (piruvato carboxilasa) para iniciar la gluconeogénesis. El acetil-CoA es un modulador alosterico positivo de la piruvato carboxilasa y negatico del complejo de la piruvato deshidrogenasa. Cuando están satisfechas las demandas energéticas, la fosforilacion oxidativa se hace mas lenta y la acumulación de NADH inhibe el ciclo de Krebs, con lo que se acumula acetil-CoA, estiulando gluconeogénesis. El segundo punto de control es la reacción catalizada por la fructosa 1,6-bifosfatasa, que es inhibida por el AMP, mientras que la correspondiente enzima glucolitica, la fosfofurtoquinasa-1, es estimulada por el AMP y ADP pero es inhibida por el citrato y el ATP. Con lo cual, cuando hay suficiente concentración de acetil-CoA o citrato o de ATP, la gluconeogénesis esta favorecida. 70

Vías de las pentosas fosfato La glucosa 6-fosfato tiene, otros destinos catabólicos que conducen a productos especializados necesarios para la celula. La oxidación de la glucosa 6-fosfato a pentosas fosfato por la ruta de las pentosas fosato (del fosfogluconato o de las hexosas monofosfato), es un caso de especial importancia en algunos tejidos. En esta ruta oxidativa el

+¿ NADP ¿ es

el aceptor electrónico, dando NADPH. Las células en rápida dividion, utilizan la pentosa ribosa 5-fosfato para producir RNA, DNA y coenzimas como ATP, NADH,

FADH 2 y coenzima A. En

otros tejidos el producto esencial de esta ruta es el NADPH, necesario para la biosíntesis reductora o para contrarestar los efectos de los radicales oxigenados. Fase oxidativa: la primera reacción es la oxidación de la glucosa 6-fosfato por la glucosa 6fosfato deshidrogenasa (G6PD), para formar 6-fosfoglucono-δ-lactona. El

+¿ NADP ¿ es el

aceptor electrónico. La lactona se hidroliza dando el acido libre 6-fosfogluconato por una lactonasa especifica, y en el paso siguiente el 6-fosfogluconato se oxida y descarboxila por la 6-fosfogluconato deshidrogenasa formando la cetopentosa ribulosa 5-fosfato; la reacción genera una segunda molecula de NADPH. Esta ribulosa 5-fosfato es importante en la regulación de la glucolisis y de la gluconeogénesis. La fosfopentosa isomerasa convierte la ribulosa 5-fosfato en su isómero aldosa ribosa 5-fosfato. En algunos tejidos la ruta acaba en este punto. El resultado es la produccion de NADPH, un reductor para las reacciones biosinteticas, y ribosa 5-fosfato, precursor de la biosíntesis de nucleótidos. Glucosa 6-fosfato + 2

+¿ NADP ¿ +

H2O

 Ribosa 5-fosfato +

CO2

+ 2 NADPH + 2

+¿¿ H Fase no oxidativa: en los tejidos que se requiere NADPH, las pentosas fosfato producidas en la fase oxidativa de la ruta se reciclan a glucosa 6-fosfato. En primer lugar la ribulosa 5-fosfato se epimeriza a xilulosa 5-fosfato. A continuación en una serie de reordenamientos de los esqueletos carbonados, seis azucares fosfato de cinco carbonos se convierten en cinco azucares de sis carbonos, permitiendo la oxidación continua de glucosa 6-fosfato con produccion de NADH. El reciclado continuo conduce en ultimo termino a la conversión de glucosa 6-fosfato en seis

CO2 .

Las transcetolasa cataliza la transferencia de un fragmento de dos carbonos desde un dador cetosa a un aceptor aldosa. Transfiere C1 y C2 de la xilulosa 5-fosfato a la ribosa 5-fosfato, formando el producto de siete carbonos sedoheptulosa 7-fosfato. El fragmento restante es el gliceraldehido 3-fosfato. La transaldolasa se encarga de catalizar una reacción en la que se elimina un fragmento de tres carbonos de la sedoheptulosa 7-fosfato y se condensa con el gliceraldehido 3-fosfato, formando fructosa 6-fosfato y la tetrosa eritrosa 4-fosfato. A continuación la transcetolasa vuelva a acutar, formando fructosa 6-fosfato y gliceraldehido 3-fosfato a partir de la eritrosa 4-fosfato y la xilulosa 5-fosfato. Dos moléculas de gliceraldehido 3-fosfato obtenido por dos repeticiones de estar reacciones pueden convertirse en una molecula de de fructosa 1,6-bifosfato, y luego la FBPasa-1 y la 71

fosfohexosa isomerasa convierten la fructosa 1,6-bifosfato en glucosa 6-fosfato. En conjunto seis pentosas fosfato se han convertido en cinco hexosas fosfato. Todos los enzimas de la ruta están localizados en el citosol, al igual que los de la glucolisis y la mayoría de los de la gluconeogénesis. Estas tres rutas están conectadas a través de varios intermediarios y enzimas compartidos. El gliceraldehido 3-fosfato formado por la acción de la transcetolasa se convierte rápidamente en dihidroxicetona fosfato por acción del enzima triosa fosfato isomerasa, y estas dos triosas se pueden unir gracias a la intervención de la aldolasa que sucede en la gluconegenesis, formando furcotsa 1,6-bifosfato. De modo alternativo, las triosas fosfato, pueden oxidarse a piruvato mediante reacciones glucoliticas. El destino de las triosas viene determinado por las necesidades relativas de la celula respecto a pentosas fosfato, NADPH y ATP. El que la glucosa 6-fosfato entre en la glucolisis o en la ruta de las pentosas fosfato depende de las necesidades de la celula y de la concentración de

+¿ NADP ¿ en el citosol. Sin este

aceptor, no puede producirse la primera reacción de la ruta. Cuando una celula esta convirtiendo rápidamente NADPH en

+¿ NADP ¿ , aumenta el nivel de

+¿ NADP ¿ lo que

estimula alostericamente a la G6PD, incrementa de este modo el flujo de glucosa 6-fosfato a través de la ruta de las pentosas fosfato. Cuando disminuye la demanda de NADPH, disminuye el nivel de

+¿ , ¿ NADP

la ruta de las pentosas fosfato se hace mas lenta y, en su

lugar, la glucosa 6-fosfato se utiliza como combustible para la glucolisis. Biosíntesis y degradación de oligosacáridos y polisacáridos Las principales formas de almacenamiento de la glucosa son el glucógeno en los vertebrados y el almidon en las plantas. En los vertebrados es la misma glucosa la que se transporta por la sangre, mientras que la forma de transporte en las plantas es la sacarosa. La síntesis de glúcidos en las células animales utiliza siempre precursores que tienen, al menos, tres carbonos, todos ellos a un nivel de oxidación inferior al del carbono del

CO2 .

En cambio, las plantas y microorganismos fotosintéticos pueden formar glúcidos a partir de

CO2

y

H 2 O , reduciendo el

CO2

a expensas de la energía y el poder reductor

suministrados por el ATP y el NADPH generados en las reacciones dependientes de la luz de la fotosíntesis. Las plantas verdes poseen una maquinaria enzimática que cataliza la conversión de

CO2 en

compuestos organicos sencillos (reducidos), proceso que se denomina asimilación de

CO2 .

La primera fase es la reacción de fijación de carbono, donde se da la condensación del

CO2

con un aceptor de cinco carbosos, la ribulosa 1,5-bifosfato, formando dos moléculas de

3-fosfoglicerato. En la segunda fase el 3-fosfoglicerato se reduce a triosas fosfato. En conjunto, se fijan tres moléculas de

CO2

para formar seis moléculas de gliceraldehido 3-

fosfato en equilibrio con la dihidroxicetona fosfato. En la tercera fase se utilizan cinco de las seis moléculas de gliceraldehido 3-fosfato en la regeneración de tres moléculas del material inicial ribulosa 1,5-bifosfato. La sexta molecula de triosa fosfato, el producto neto de la fotosíntesis, puede ser utilizada para formar hexosas que sirven como combustible y como 72

material para producir sacarosa para el transporte a tejidos no fotosintéticos o almidon para almacenamiento. En distintos organismos el exceso de glucosa se convierte en formas poliméricas para su almacenamiento: glucógeno en los vertebrados y muchos microorganismos y almidon en las plantas. En los vertebrados el glucógeno se encuentra principalmente en el hígado y en el musculo esquelético. El glucógeno del musulo se encuentra allí para proporcionar una fuente de energía rápida para el metabolismo tanto aerobico como anaeróbico; el glucógeno hepático sirve como almacen de glucosa para otros tejidos cuando no esta disponible glucosa en la dieta. Las ramas exteriores del glucógeno entran en la ruta glucolitica a través de la acción de tres enzimas: glucógeno fosforilasa, enzima desramificador del glucógeno y fosfoglucomutasa. La glucógeno fosforilasa caraliza la reacción en la que un enlace glucosidico (α1->4) que une dos residuos en un extremo no reductor del glucógeno sufre un ataque por el Pi, eliminando el residuo glucosa terminal en forma de α-D-glucosa 1-fosfato. La glucógeno fosforilasa actua repetitivamente sobre los extremos no reductores de las ramas de glucógeno hasta que alcanza un punto que se halla a cuatro residuos de glucosa de un punto ramificado (α1->6) en donde se detiene su acción. La oligo (α1->6) a (α1->4) glucanotransferasa, cataliza dos reacciones sucesivas que transfieren ramificaciones. Una vez transferidas las ramificaciones y se ha hidrolizado el residuo glucosilo en 6-6, la glucógeno fosforilasa continua su actividad. UNIDAD 6 – Oxidaciones Biológicas Sistemas redox biológicos Las reacciones de oxido-reduccion implican la perdida de electrones por una especie química, que es asi oxidada, y la ganancia de electrones por otra, que es reducida. Este flujo de electrones es respondable, directa o indirectamente, de todo trabajo realizado por los organismos vivos. En los organismos no fotosintéticos, la fuente de electrones son compuestos reducidos (alimentos); en los fotosintéticos, el dador de electrones inicial es una especie química excitada por absorción de luz. En el caso de la glucosa como fuente de electrones, por ejemplo, a medida que la misma se oxida enzimáticamente, los electrones liberados fluyen espontáneamente a través de una serie de transportadores de electrones intermedios a otra especie química, tal como el Este flujo de electrones es exergonico, por el

O2 .

O2 tiene una afinidad por los electrones

mayor que la que tienen los transportadores de electrones intermedios. Las oxidorreducciones se pueden describir en forma de semirreacciones considerando las dos mitades de una reacción en forma separada. La molecula dadora de electrones en una reacción de oxidación-reduccion se denomina agente reductor o reductor; la molecula aceptora es el agente oxidante u oxidante. Un agente determinado, funciona como un par reductor-oxidante conjugado (par redox): Dador de electrones (reductor) ↔

−¿¿ e

+ Aceptor de electrones (oxidante)

Los electrones se transfieren de una molecula a otra de cuatro formas: 

Directamente como electrones. 73



En forma de atomos de hidrogeno.



En forma de ion hidruro (: H ¿ , que tiene dos electrones.



A través de una combinación directa con el oxigeno.

−¿

Se denomina equivalente de reducción para designar un equivalente de electrones que participa en una reacción redox. o

El potencial de reducción estándar, ( E ¿ , es una medida de la afinidad relativa hacia los electrones. Oxidasas, oxigenasas y oxidorreductasas

−¿

Las oxidorreductasas son enzimas que catalizan la transferencia de electrones ( H ¿ o H), desde una molecula donante (se oxida) a otra aceptora (se reduce). Las oxidasas son un tipo de oxidorreductasa donde el y se reduce a

O2 actua como aceptor de electrones

H2O o H2O2 .

Las oxigenasas son enzimas que catalizan la transferencia de un atomo de O hacia un sustrato. Dicho atomo proviene del

O2 , el atomo restatnte se reduce a

H2O .

Transporte de electrones asociados a la membrana mitocondria interna La mayoría de los transportadores de electrones de la cadena respiratoria mitocondrial son proteínas integrales de membrana con grupos prostéticos capaces de aceptar y donar uno o dos electrones. Cada componente de la cadena acepta electrones del transportador y los transfiere al siguiente en una secuencia especifica. Puede ser la transferencia de un electron, de un atomo de hidrogeno o un ion hidruro. Además de deshidrogenasas dependientes de NAD y las flavoproteinas, hay otros gurpos transportadores de electrones en la cadena respiratoria: ubiquinonas, cuproproteinas, quinonas, citocromos y ferrosulfoproteinas. Deshidrogenasas dependientes de nucleótidos de nicotinamida, flavoproteínas y cuproproteínas Las deshidrogenasas son enzimas que catalizan reacciones redox de un sustrato por sustracción o adicion de un

−¿¿ H , empleando coenzimas que actúan como aceptores o

dadores de electrones o protones. Coenzimas: 

+¿ NAD¿ /NADH  Dinucleotido nicotinamida y adenina (catabolismo)



+¿ NADP ¿ /NADPH  Nicotinamida adenina dinucleotido fosfato (anabolismo)

74

Flavoproteinas: enzimas que catalizan reacciones redox utilizando como cofactores

+¿ FAD¿

o

FMN. Participan en la transferencia de uno o dos electrones. Algunas presentan iones inorgánicos.

+¿ H2 FAD¿ /FAD

 

FMN/FMN H 2

 Flavina-adenina dinucleotido

 Flavin mononucleotido

Las cuproproteinas son transportadores de iones

−¿¿ R

donde dicha transferencia esta medida por

2+¿ . Cu¿

Ferrosulfoproteínas Las proteínas ferro-sulfuradas, transfieren un

−¿¿ e

y que contienen hierro pero no en forma

de grupo hemo, sino en asociación con atomos de azufre inorgánico, o con atomos de S de residuos de Cys de la misma proteína. Estos centros Fe-S pueden ser estructuras sencillas con un atomo de Fe coordinado a 4 residuos de Cys o con 2 o 4 atomos de Fe. Participa en la transferencia de un electron (en las que se transfieren solo uno), en la que se oxida o reduce uno de los atomos de hierro. Quinonas Son transportadores de electrones en cadenas de transferencia de electrones asociadas a membranas. La ubiquinona (coenzima Q) es una bezoquinona liposoluble que contiene una larga cadena lateral isoprenoide. Es pequeña e hidrofóbica por eso puede difundir libremente a través de la membrana mitocondiral y puede hacer de lanzadera de equivalentes de reducción, entre otros transportadores electrónicos de la membrana pero menos moviles. Puede aceptar un electron, transformándose en el radical semiquinona (Q H

o

) o dos

electrones, formando ubiquinol ( QH 2 ). Tambien puede actuar como unión entre un dador de dos electrones y un aceptor de un electron. Citocromos Son proteínas transferidoras de un electron que contienen hierro como grupo prostético hemo. Se encunetra en la membrana mitocondrial interna, en la membrana de los tilacoides de los cloroblastos y en la membrana plasmática de bacterias. Existen tres calses de citocromos que se distinguen es su espectro de absorción de la luz, se los llama a, b y c. En los grupos hemos de cit a, b y c, los anillos conjugados son similares pero son distintas las cadenas laterales. Los grupo hemo de los citocromos a y b están unidos fuertemente, pero de manera no covalente, a sus proteínas respectivas. Los grupos hemo de los citocromos c están unidos covalentemente a traces de residuos Cys a la proteína. Los citocromos a y b, y algunos c, son proteínas intergrales de membrana a excepción del citocromo c de la mitocondria, que es una proteína soluble que se asocia mediante interacciones electrostáticas con la parte exterior de la membrana mitocondrial interna. 75

Radicales libres Sistema de catalasa, peroxidasa y superoxido dismutasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición de 2

H 2 O2

en

La peroxidas catalizan reacciones bisustrato utilizando el

H 2 O2

 Donante oxidado +

H 2 O2

H2O −¿¿

Es una importante defensa antioxidante en células expuestas al

−¿¿ O2 

H2O .

como oxidante.

La superoxido-dismutasa catalizan la dismutacion del superóxido ( O2

2

O2 y

H 2 O+O2

 2

Donante +

H 2 O2

) en

O2 y

H 2 O2 .

O2 .

H 2 O2

La cadena respiratoria mitocondrial Es un conjunto de compuestos proteínicos de la membrana mitocondrial interna, que funciona como acarreadores de electrones, transfiriéndolos desde las coenzimas hasta el aceptor terminal, el

O2 (en metabolismos aerobicos) y al fluir los electrones a través del

compuesto, los

+¿¿ H

son translocados a través de la membrana mitocondrial interna al

espacio intermebranal, generando un gradiente de

+¿¿ H ] que se cataliza nuevamente a ¿

través de la proteína ATPsintasa, permitiendo de este modo impulsar la síntesis de ATP. Los sustratos son el NADH,

FADH 2 ,

+¿¿ H

,

O2 , ADP y Pi y los productos ATP,

H2O ,

+¿ NAD¿ , FAD. En la membrana mitocondiral interna existen cuatro complejos proteicos y de cofactores que participan en la transferencia de electrones, la cual es unidireccional, desde los transportadores de menor potencial de reducción a los de mayor. 

Complejo I: NADH a ubiquinona = Complejo NADH deshidrogenasa

Es un complejo de flavoproteina que conteien mas de 25 cadenas polipeptidicas. Esta incrustado en su totalidad en la membrana mitocondrial interna y esta orientado de manera que su sitio de fijación de NADH mire hacia la matriz para poder interaccionar con el NADH producido por cualquiera de las deshidrogenasas de la matriz. El complejo tiene siete centros de Fe-S de al menos dos tipos diferentes. Reaccion global: NADH +

+¿¿ H

+ Uq 

+¿ NAD¿

+ Uq H 2 76

La ubiquinona oxidad acepta un ion hidruro desde el NADH y un

+¿¿ H

desde el

H2O

disolvente de la matriz. La ubiquinona acepta de a un electron a la vez pasando por un intermediario semiquinona (UqH) antes de reducirse totalmente (Uq H 2 ). En la primera etapa de transferencia de electrones a través del complejo I el NADH + transfieren dos electrones al grupo prostético FMN, el cual se reduce a

+¿¿ H

FMN H 2 . El FMN

puede aceptar dos electrones a la vez y donarlos al agente oxidante, pero de a un electron a la vez, convirtiendo el flujo de electrones a etapas de un electron, que caracteriza al resto de la cadena. El

FMN H 2 transfiere los electrones de a uno por vez a un grupo Fe-S y estos se tranfieren a

la ubiquinona, la que se reduce primero a semiquinona y finalmente a ubiquinol. Este difunde en la membrana desde el Complejo I al Complejo III en donde se oxida a ubiquinona liberando 4

+¿¿ H . La tranferencia de elctrones desde el Complejo I a la ubiquinona y al Complejo II va

acompañado de la transferencia de 4

+¿¿ H

de la matriz al espacio intermembrana, por cada

par de electrones. 

Complejo II: Succinato a ubiquinona = Succinato deshidrogenasa

Es la única enzima del ciclo de Krebs ligado a la membrana, contiene dos tipos de gurpo prostéticos (FAD y Fe-S) y al menos 4 proteinas distintas. Una de ellas tiene un FAD unido covalentemente y un centro Fe-S con 4 atomos de Fe. También hay una segunda proteína ferrosulfurada. El succinato realiza la transferencia de dos electrones al FAD, oxidándose a fumarato. El

FAD H 2 realiza la transferencia de un electron hacia los grupos Fe-S y a continuación estos los transfieren a la ubiquinona de a un electron por vez, hasta que la ubiquinona se reduce totalmente y los transporta hasta el complejo III. El complejo no contribuye al bombeo de protones, pero sirve para introducir electrones. Otros sustratos de las deshidrogenasas mitocondriales también pasan electrones a la cadena respiratoria a nivel de la ubiquinona pero no mediante el complejo II: La primera enzima de la β-oxidacion, acil-CoA deshidrogenasa, transfiere electrones desde el sustrato acil-CoA hacia el FAD de la deshidrogenasa, esta los transfiere a la flavoproteina transferidora de electrones (ETFP), de la que pasan via ETFP-ubiquinona oxidorreductasa a la ubiquinona. El glicerol 3-fosfato (degradación de triglicéridos) cede electrones a la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa (flavoproteina) ubicada en la cara externa de la mebrana mitocondrial interna, y esta los transfiere a la ubiquinona. 

Complejo III: Citocromos bc1 = Uq-Citocromo c oxidorreductasa

77

Contiene los citocromos

b560

y

b566 , citocromo c1, una proteína ferrosulfurada y otras 6

subunidades proteicas. Todas están dispuestas asimétricamente en la membrana mitocondrial interna. El citocromo b abarca la membrana y el citocromo c1, como la proteína ferrosulfurada, se encuentra en la cara externa. La conmutación entre la ubiquinona transportadora de dos electrones y los transportadores de un electron (citocromos

b560

y

b566 , c y c1) se consigue mediante las reacciones del

ciclo Q: El ubiquinol difunde a la cara citosolica de la membrana y se produce una dismutacion: transfiere un electron a la proteína Fe-S (reduce al citocromo c1 y el electron continua hacia debajo de la cadena) y libera 2

+¿¿ H

al citosol. El ubiquinol se oxida a semiquinona. El flujo

de electrones es dirigido desde la semiquinona hacia los citocromos

b566

y de este a

b560 ,

quedando la semiquinona totalmente oxidada (ubiquinona). Para que haya reducción de ubiquinona del lado de la matriz, se necesita que esta se haya difundido a través de la membrana. El

b560

reducido dona un electron a la ubiquinona en la cara matricial para

formar semiquinona. Para completar el ciclo Q, se necesita una segunda molecula de ubiquinol que repita el proceso, para convertir la semiquinona del lado de la matriz a ubiquinol (reduciendo c1, otros 2

+¿¿ H , otra quinona y

b560 , consumiendo 2 +¿¿ ). H

El resultado neto es la oxidación de dos moléculas de ubiquinol y la formación de una molecula de ubiquinol. Los dos electrones del complejo III son donados al citocromo c (uno por vez), una pequeña proteína de la membrana periférica que se mueve a lo largo de la fase citosolica intermembranal y acarrea los elecrones al complejo IV. El ubiquinol y la ubiquinona son solubles en la bicapa lipídica, se mueven entre las caras citosolicas y matrical de la membrana. La semiquinona se encuenra en dos depósitos separados, cerca de la fase acuosa de cada lado de la membrana. 

Complejo IV: Citocromo c oxidasa

Es el ultimo complejo de la cadena. Contiene citocromos a y a 2 (conteien grupos hemo

3+¿ Fe¿ ). También contiene dos iones cobre

Cu a Cub ¿ ¿ y

que alternan entre estados cúprico

y cuproso al participar en la transferencia de electrones al oxigeno. Llevan a cabo la reducción de 4 electrones del oxigeno sin generar intermediarios incompletamente reducidos como

H 2 O2

El

Cua

u

−¿ OH ¿

ya que son especies muy reactivas y dañarían a la celula.

2+¿

2+¿

( Cu ¿ y el citocromo a ( Fe¿ ) forman un centro redox bimetálico que puede

aceptar dos electrones y

Cu b y el citocromo

a3

contituyen un segundo centro redox

bimetálico. Los electrones se trasladan desde el citocromo c a en equilibrio redox, y a continuación donan los electrones a

Cu a o citocromo a, que están

Cub

o citocromo

a3

(también 78

en equilibrio) los que a su vez ceden los electrones al oxigeno de a un electron (bombea 2

+¿¿ H ). Se necesitan cuatro electrones (2 NADH) para reducir una molecula de oxigeno. Los cuatro

+¿¿ H

utilizados en la reducción del oxigeno a dos moléculas de agua son tomados de la

matriz. En cnsecuencia el complejo contribuye de dos formas a formar el gradiente de protones: a través del bombeo de

+¿¿ H

y consumiendo iones (4

+¿¿ H ) de la matriz que

reaccionan con el oxigeno y forman agua. La transfeencia de electrones al oxigeno es muy exergonica. Reaccion global: ½

O2 + 2

+¿¿ H +2

−¿¿ e



H2O

Inhibidores Son compuestos que bloquean la transferencia de electrones, porque tienen potencial redox mas electropositivo que los componentes de la membrana. Los electrones no llegan al oxigeno y este no se reduce a agua. C I : inhiben la transferencia de electrones desde un centro Fe-S a la ubiquinona. Ej.Rotenona, Amital, Pericidina A. C II: Ej. Malonato C III: bloquea la transferencia desde el citocromo b al citocromo c1. Ej. Antimicina A. C IV: inhiben a la citocromo oxidaca (cit a y a3). Ej. Cianuro, monóxido de carbono. Fosforilacion oxidativa Esta acoplada a la transferencia de electrones porque la energida liberada en esta reacción muy exergonica se canaliza a una segunda reacción endergonica que es la condensación de ADP y Pi (fosforilacion. El complejo V o la ATP sintasa es un complejo enzimático de la membrana mitocondrial

+¿

interna que sintetiza ATP ( no contribuye al gradiente en la [ H ¿ ], sino que lo consume). Esta formado por dos componentes o factores migratorios:

F1 : consta de 5 subunidades

α 3 , β 3 , γ, δ, ε. Contiene varios sitios para la fijación de ATP

y ADP, incluido el sitio catalítico para la síntesis de ATP. Es un complejo de proteínas periféricas de la membrana, que se mantinen unidas a la misma por su interaccion con

Fo .

Fo : complejo de proteínas intergrales de membrana constituido por 4 polipeptidos distintos que forman el canal transmembranal a través del cual los protones pueden atravesar la membrana. Es la porción de ATP sintasa que tiene sensibilidad a la oligomicina un importatne inhibidor de este complejo enzimático.

79

El complejo completo, asi como

F1

aislado, pueden hidrolizar el ATP a ADP y Pi, pero su

función biológica es sintetizar ATP mediante la condensación de ADP + Pi. Un gradiente de protones acopla el flujo de electrones y la fosforilacion. Según el modelo quimiosmotico, la transferencia de electrones a lo largo de la cadena va acompañada del bombeo de protones a través de la membrana mitocondrial interna al espacio intermembranal, lo que da como resultado una diferencia transmembranal en la [

+¿¿ H ] y por lo tanto una variación de pH, la matriz se ve alcalinizada respecto al espacio intermembranal.

+¿

La energía electroquímica viculada a la [ H ¿ ] y separación de cargas es la fuerza proton motriz, que se utiliza para impulasar la síntesis de ATP catalizada por el

F1

a medida que

los protones fluyen pasivamente de nuevo a la matriz a través de los poros de protones formados por el

Fo .

El modelo de cambio por fijación considera que la ATP sintasa sufre un cambio conformacional debido al gradiente de protones que la atraviesan. Tiene tres estados conformacionales posibles y 3 sitios de fijación de sustrato:   

Conformacion T: fijación fuerte, catalíticamente activo. Conformación L: fijación débil, catalíticamente inactivo. Conformacion O: fijación muy débil, abierta, con baja afinidad hacia el sustrato.

Al principio de un ciclo catalítico, el sitio T esta ocupado por el ATP ya formado, mientras que el ADP se une débilmente al sitio L. la fuerza proton motriz que hace que, por un flujo de protones a través del canal

Fo , se produzca un cambio conformacional cooperativo en el

que el sitio T se convierte en el sitio O del que se disocia el ATP, el sitio L se convierte en el sitio T en el que el ADP y Pi se condensan rápidamente formando ATP y el sitio O se transforma en un sitio L al que se une débilmente ADP y Pi. Asi, la energía química del gradiente de protones se transforma en energía mecánica que se almacena como energía química en los enlaces fosfato del ATP Reaccion de la transferencia de elctrones: +

NADH +

+¿¿ H

+½

O2 + 2

−¿¿ e



+¿ NAD¿

H2O

Reaccion de la fosforilacion oxidativa: Reaccion global: ATP +

+¿ NAD¿

+4

3 ADP + 3 Pi  3 ATP + 3 NADH +

+¿¿ H

H2O

+ 3 ADP + 3 Pi + ½

O2

3

H2O

Estequiometria 80

Índice P/O Indica la relación entre el numero de moles de ATP por cada mol de atomos de oxigeno consumidos, o moles de Pi consumidos en la reacción ADP + Pi  ATP, por cada mol de atomos de oxigeno consumidos en la reacción ½

O2 + 2

+¿¿ H +2

−¿¿ e



H2O .

P/O = N° moles P / N° moles atomos de O NADH +

+¿¿ H



FADH 2  FAD

+¿ NAD¿

- - > P/O= 2,5/3

- - > P/O= 1,5/2

Control respiratorio La fosforilacion oxidativa esta regulad por las necesidades energéticas de la celula. El consumo de oxigeno (tasa respiratoria) en la mitocondria esta limitado por la disponibilidad de ADP como sustrato para la fosforilacion. Dicha dependencia se denomia “control por aceptor”. Otra medida realcionada con ella es la razón de la acción de masas del sistema ATP-ADP: [ATP] / [ADP] [Pi]. Cuando aumentan las necesidades energéticas de la celula, se produce un aumento de la degradación de ATP a ADP y Pi, por lo que disminuye el valor del cociente, por el contrario cuando hay una alta concentración de ATP, el cociente es elevado. Con mas ADP disponible para la fosforilacion oxidativa, aumenta la velocidad de respiración, lo que da lugar a la regulación de ATP. Esto continua hasta que la razón de acción de masa vuelva a su valor elevado normal, punto en el que la respiración se hace mas lenta. Desacoplantes e inhibidores Los desacoplantes son compuestos que inhiben la fosforilacion del ADP, sin afectar el transporte electrónico. Hacen que los protones ingresen a la matriz pero por un lugar distinto de la ATP sintasa, debido a que son acidos liposolubles y pueden difundir fácilmente a través de la membrana mitocontrial. Ej. Valinomicina; 2,4 dinitrofenol; proteína desacopladora (termogenina). Inhibición de la ATP sintasa: Oligomicina, Venturicidina. Dicitrohexilcarboamida inhibe el flujo de protones a través de

Fo

y

cF o . 81

Mecanismo Transporte del ATP, ADP y Pi a través de la membrana mitocondrial interna La fuerza proton motriz no solo suministra energía para la síntesis de ATP, sino también para el transporte activo a través de la membrana mitocondrial interna, la cual al ser impermeable a las especies cargadas necesita de transportadores específicos que lleven ADP y Pi a la matriz mitocondrial y ATP al citosol, donde se consume la mayor parte de el. Uno de estos sistemas es la nucleótido adenina translocasa, que abarca la membrana interna y lleva a cabo una reacción de intercambio entre el ATP de la mitocondria y el ADP citosolico (ingresan 3 cargas negativas y salen 4 negativas). Este co-transporte antiparalelo esta favorecido por el gradiente de protones porque la matriz es elctricamente negatica respecto al exterior. Este sistema es inhibido por el atractilosico, un glusido toxiso producido por una especie de cardo. Un segundo sistema de transporte a través de la membrana es la fosfato translocasa, que

−¿

¿

promueve el cotransporte paralelo de un H 2 PO 4

y un

+¿¿ H

al interior de la matriz. Este

sistema también es favorecido por la fuerza proton motriz, porque en la matriz la concentración de protones es muy baja lo que favorece el movimiento de protones a favor del gradiente de concentración. Los sitemas de lanzadera permiten oxidar aerobicamente al NADH citosolico. La NADH deshidrogenasa de la membrana mitocondrial interna (en células de animales) solo puede aceptar electrones del ANDH de la matriz mitocondrial, dado que la membrana interna no es permeable. Existen sistemas especiales de lanzadadera que transportan equivalente de reducción desde el NADH citosolico, al interior de la mitocondria mediante una ruta indirecta. Lanzadera malato-aspartato: funciona en el hígado, corazón y riñones. Los equivalentes de reducción del NADH citosolico se transfieren en primer lugar al oxalacetato citosolico, obteniéndose malato por acción de la malato deshidrogenasa. El malato pasa a través de la membrana interna a la matriz mitocondrial via el sistema de transporte malato-αcetoglutarato. Dentro de la matriz los equivalentes pasan por acción de la malato deshidrogenasa al

+¿ NAD¿

de la matriz formando NADH, el cual puede pasar los electrones

directamente a la cadena respiratoria (Complejo I). el paso de estos dos electrones al oxigeno genera 3 moleculas de ATP. El oxalacetato citosolico se regenera por transaminacion, como también los transportadores de membrana para empezar el ciclo. Lanzadera del glicerol 3-fosfato: funciona en el musculo esquelético y en el cerebro. La dihidroxiacetona fosfato del citosol acepta dos equivalentes de reducción del NADH citosolico en una reacción catalizada por la glicerol 3-fosfato deshidogenasa citosolica. Asi el sustrato se reduce a glicerol 3-fosfato, el cual presenta una isoenzima (glicerol 3-fosfato mitocondrial) ligada a la membrana y localizada en la cara exterior, la cual transfiere los equivalentes de reducción desde el glicerol 3-fosfato hasta la ubiquinona. Este sistema no requiere de transportadores de membrana y difiere del primer sistema de lanzadera en que transfiere los equivalentes de reducción al complejo III, y genera 1,5 mol de ATP por cada mol de NADH citosolico oxidado. Las mitocondrias de las plantas superiores tienen una NADH deshidrogenasa (Complejo I) orientada hacia el exterior, que puede transferir electrones directamente desde el NADH citosolico a la cadena respiratoria. 82

Factores acoplantes Son proteínas solubles que restauran el acoplamiento entre la oxidación y la fosforilacion. UNIDAD 7 – Fotosintesis

UNIDAD 8 – Metabolismo de compuestos nitrogenados Nitrogenasas Son enzimas que catalizan la ruptura del nitrógeno molecular y su combinación con H para formar amonio, del cual deriva la síntesis de aminoácidos y otros compuestos nitrogenados. Nitrificacion, denitrificacion La nitrificación es un proceso de oxidación del amoniaco a nitrito y finalmente a nitrato por el cual las bacterias del suelo obtienen energía. Las plantas y muchas bacterias pueden incorporar el nitrito y el nitrato y reucirlo hasta amoniaco para la síntesis de aminoácidos. La desnitrificacion es el proceso por el cual algunas bacterias, en condiciones anaeróbicas, convierten el nitrato en nitrógeno molecular, manteniendo un equilibrio entre el nitrógeno fijado y el nitrógeno atmosférico. Estas bacterias utilizan el nitrato en lugar del oxigeno como aceptor final de electrones en una serie de reacciones que generan un gradiente de protones transmembrana que se utiliza para la síntesis de ATP. Asimilación del nitrato Las plantas asimilan el nitrógeno en forma de nitrato y lo convierten en amonio. El nitrato es reducido a nitrito en el citosol de las células radicales y mesofilas por la nitrato reductasa. El nitrito es reducido a amonio en los plastidios por la nitrito reductasa. Esta enzima utiliza a la

Fd¿ como dador de electrones.

El nitrógeno reducido a amonio se incorpora primero a los aminoácidos y luego a otras biomoléculas nitrogenadas. Dos aminoácidos, glutamato y glutamina constituyen el punto de entreda del nitrógeno. La via mas importante para la incorporación de amonio en el glutamato requeiere dos reacciones: Glutamato +

+¿ NH ¿4

+ ATP  Glutamina + ADP

Metabolismo general de aminoácidos Glutamato deshidrogenasa Glutamato y glutamina Transaminacion y decarboxilacion Desaminacion oxidativa y no oxidativa Excresion de nitrógeno Ciclo de la Urea 83

Derivados de aminoácidos alifáticos y aromáticos Ruta del shiquimato Oxidacion de aminoácidos y produccion y eliminación de urea La función es formar intermediarios que entran al ciclo de Krebs y que de ahí pueden oxidarse completamente a dióxido de carbono y agua para generar energía o se pueden desviar hacia la gluconeogénesis o cetogenesis. Esto ocurre en el citosol y matriz mitocondiral del hígado, musculo, tracto intestinal (animales vertebrados). El sustrato son aminoácidos que pueden provenir de proteínas de la dieta, de la decradacion normal de proneinas celulares o en la diabetes mellitus no tratada. Respecto a los productos y su destino podemos mencionar: 

α-cetoacidos: todos pueden oxidarse via el ciclo de Krebs o Acetil-CoA (isoleucina, leucina y triptófano)  Cetogenesis o Acetoacetil-CoA (leucina, lisina, fenilalanina, triptófano y tirosina)  Cetogenesis o Piruvato (alanina, cisteína, glicina, serina y triptófano)  Cetogenesis (via acetil-CoA) o Gluconeogenesis o Oxalacetato (asparagina y aspartato)  Gluconeogenesis o Fumarato (fenilalanina y tirosina)  Gluconeogenesis o Succinil-CoA (isoleucina, metionina, treonina y valina)  Gluconeogenesis o α-cetoglutarato (glutamato, arginina, glutamina, histidina y prolina)  Gluconeogenesis  Amonio: puede ser utilizada para la síntesis de aminoácidos, nucleótidos y otros compuestos nitrogenados, y su exceso es eliminado como urea en los animales vertebrados. En el caso de los peces, es eliminado como amonio y las aves y reptiles en forma de acido urico. Procesos: Desaminacion no oxidativa: es una reacción de transaminacion en la que un grupo amino se transfiere de un aminoácido al α-cetoglutarato, formando glutamato y dejando un αcetoacido. Esta reacción esta catalizada por una enzimana aminotransferasa (Transaminasa) que posee un grupo prostético, el poridoxalfosfato (PLP) que es el encargado de transportar los grupo amino. Esta enzima actua con el mecanismo ping-pong, en el que el primer sustrato ha de abandonar el sitio activo antes de que se pueda unir el segundo sustrato. Asi, el aminoácido entrante se une al sitio activo, cede su grupo amino al PLP y sale en forma de αcetoacido. A continuación se une el α-cetoacido entrante, acepta el grupo amino del PLP y sale en forma de aminoácido. Ocurre en el citosol de las células hepáticas. Desaminacion oxidativa: reacción en la que el glutamato (que ha sido transportado desde el citosol a la matriz mitocondiral) es transformado a α-cetoglutarato y amonio. Esta catalizada por la glutamato deshidrogenasa que requiere

+¿ NAD¿

o

+¿ NADP ¿ , y esta formada por seis

subunidades iguales. Su inhibidor alosterico es el GTP, y su activador el ADP. El exceso de amonio generado en la mayor parte de los tejidos se combina con el glutamato dando glutamina, la responsable de transladar el amonio toxico por la sangre hasta la matriz mitocondrial de las células hepáticas. La reacción esta catalizada por la glutamina sintetasa, requiere ATP y ocure en dos pasos: Primero, el L-glutamato y el ATP forman ADP y un intermedio y-glutamil fosfat. Luego, en un segundo paso, el intermedio reacciona con el amonio produciendo glutamina y Pi. 84

Allí en el hígado, la glutamina lo libera para que ingrese al ciclo de la urea. En los musculos, el amonio en exceso se transfiere generalmente desde el L-glutamato al piruvato dando alanina, la cual lleva el amonio al hígado. Primero en el musculo: Segundo en el citosol de células hepáticas: El piruvato via gluconeogénesis forma glucosa y vuelve a los musculos. Parte del L-glutamato se transporta a la matriz mitocondrial y libera el amonio. Ciclo de la urea Su función es la síntesis de la urea, y el mismo ocurre en la matriz mitocondrial y citosol de las células hepáticas. Utiliza como sustrato amonio, que proviene de la oxidación de aminoácidos producida en hígado, otros tejidos y el tracto intestinal, y el segundo es aportado por el aspartato;

−¿ HCO ¿3

producido en la respiración mitocondrial; ATP y agua. De esta forma

se genera urea, que a través de la sangre pasa a los riñones y es escretada por orina; ADP, Pi, AMP e

+¿¿ H .

1- El amonio se utiliza junto con el 23-

45-

−¿ ¿ HCO 3

para producir carbamoil fosfato. Esta reacción

es dependiente de ATP y es catalizada por la carbamoil fosfato sintetasa I. El carbamoil fosfato reacciona con la ornitina dando citrulina y liberando Pi. La citrulina es liberada al citosol. Se introduce un segundo amonio que proviene del aspartato (generado en la matriz por transaminacion y transportado al citosol). Se produce una condensación entre el aspartato y la citrulina que forma argininosuccinato. Esta reacción esta catalizada por la argininosuccinato sintetasa, requiere ATP y tiene lugar a través de un intermedio citruilil-AMPSe corta el argininosuccinato por la argininosuccinato liasa para formar arginina libre y fumarato. Se hidroliza la arginina por la arginasa dando urea y ornitina. La ornitina es transportada a la mitocondria para iniciar otra vuelta del ciclo de la urea.

Reaccion global: Los ciclos de la urea y del acido cítrico están conectados El fumarato producido en el citosol por la argininosuccinato liasa del ciclo de la urea entre al ciclo del acido cítrico en la mitocondria convirtiéndose a través de varios pasos en oxalacetato. Este acepta un grupo amino del glutamato por transaminacion y el aspartato asi formado abandona a la mitocondria cediendo su grupo amino al ciclo de la urea en la reacción de la arginino succinato sintetasa. El otro producto de esta transaminacion es el αcetoglutarato que es otro intermediario del ciclo de Krebs. Regulacion Carbamoil fosfato sintetasa I: es activada alostericamente por el N-acetilglutamato, que se sintetiza a partir del acetil-CoA y glutamato. La N-acetil glutamato sintetasa es a su vez activada por la arginina, intermediario del ciclo de la urea que se acumula cuando la produccion de urea es demasiado lenta para porder acomodar todo en amoniaco que se produce en el catabolismo de los aminoácidos. 85

Ciclo del nitrógeno El nitrógeno abunda en la atmosfera, pero el utilizable biológicamente es escaso. Fijación: el nitrógeno molecula es reducido a amoniaco o amonio por algunas bacterias (cianobacterias del suelo o del agua y bacterias del suelo) Ej. Azotobacter, rizobium, etc. Como el triple enlace del nitrógeno es muy estable, se necesita una elevada energía de activación para fijarlo, la cual es proporcionada por la unión e hidrolisis del ATP. Asdfkjñasjdfhlñshlfajsdkfasasdflfdsa de la nitrogenasa, presente en las bacterias fijadoras. Este tiene dos componentes claves: Dinitrogenasa reductasa (DNR): dimero formado por x subunidades iguales. Tiene un cetro

Fe4 - S 4

(que puede ser oxidado y reducido por un electron) y dos sitios de unión a ATP.

Dinitrogenasa (DN): tetrámero de dos copias de dos subunidades distintas. Posee cuatro cetro

Fe4 - S 4

y un cofactor Fe-Mo.

La fijación es realizada por la forma reducida de la DN en un proceso que requiere ocho electrones: seis para reducir una molecula de nitrógeno y dos para formar hidrogeno como parte obligada del mecanismo de reacción. Los electrones son cedidos por el piruvato a la DN via ferredoxina-DNR. El ATP se une a la DNR aumentando su potencial de reducción, y permitiendo de esta manera ceder los electrones a la DN. Por cada electron cedido por la DNR a la DN se hidrolizan dos ATP. La DN utilizada los electrones para reducir el nitrógeno molécular a dos moléculas de amoniaco. El complejo de la nitrogenasa se inactiva en presencia de oxigeno, las bacterias fijadoras poseen distintos mecanismos para evitar el oxigeno:    

Algunas solo existen en forma anaeróbica. Azotobacter: desacoplan el transporte de electrones de la síntesis de de ATP, de manera que el oxigeno se consuma tan deprisa como entra a la celula. Cianobacterias: tienen células especializadas para la fijación con paredes celulares gruesas que impiden la entrada de oxigeno. Rizhobium: se encuentran estableciendo una asociación simbiótica con las raíces de leguminosas, para evitar el oxigeno, se rodean de una proteína llamada leghemoglobina, generada por la planta (parte proteica) y la batería (grupo hemo) que captura el oxigeno.

Nitrificación: es la oxidación biológica del amonio, primero a nitrito, y luego a nitrato, llevada a cabo por las bacterias nitrificantes del suelo. Nitrosomas y nitrococus, oxidan amoniaco a nitrito: Nitrobacter, oxidan nitrito a nitrato: El amoniaco y el nitrato actúan como dadores de electrones en una cadena de transporte acoplada a la síntesis de ATP en dichas bacterias. Desnitrificacion: es el proceso que realizan las bacterias desnitrificantes, como las pseudomonas, en condiciones anaerobias y que consiste en la reducción del nitrato a 86

nitrógeno molecular a partir de sustratos organicos o inorgánicos como fuentes de energía. El nitrato actua como aceptor

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