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• Marisol Pino

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PRACTICA # 3

RESPIRACION Y MADURACION EN LOS PRODUCTOS HORTOFRUTICOLAS INTRODUCCION La respiración consume oxígeno del medio ambiente y sustrato del órgano vegetal. Como consecuencia se producen CO2, agua y energía (tanto química como en forma de calor). Teóricamente, los cambios en cualquiera de estos reactivos o productos se pueden usar como medida de este proceso. En vista de que las reacciones involucradas en la respiración se llevan a cabo en un medio acuoso, la pequeña cantidad de agua producida en relación con el volumen total de agua presente en el tejido no se puede medir exactamente. La producción de energía , ya sea atrapada químicamente o liberada en forma de calor, es también difícil de medir con exactitud. Como consecuencia, la utilización de O2 o la producción de CO2 se usa casi invariablemente para monitorear la respiración: sustrato + O2 è CO2 + H2O + ATP y calor. El estado de desarrollo de una planta o parte de ella puede ejercer un efecto muy pronunciado sobre la velocidad respiratoria y metabólica del tejido vegetal después de la cosecha. Por lo general, las células jóvenes, de crecimiento activo tienden a tener mayor velocidad respiratoria que las células senescentes o más maduras. Sin embargo, se debe considerar que existen también algunos factores que afectan esta relación entre madurez y velocidad respiratoria, por ejemplo la especie, la parte de la planta bajo consideración, y el rango de estados de madurez son a menudo críticos. Por tanto, las generalizaciones sobre el efecto del estado de madurez se deben mantener dentro de límites producto-especie estsrictos, y en algunos casos, inclusive los cultivares son excepciones que se vuelven más numerosas que las reglas. Los efectos de la madurez sobre la respiración son más pronunciados en los frutos climatéricos cuando el rango de estados de madurez bajo estudio incluye los estados preclimatérico, climatérico y postclimatérico. Atendiendo a los cambios en la actividad respiratoria que ocurren en las frutas cosechadas, éstas se pueden clasificar típicamente en dos grupos, climatéricos y no climatéricos durante las etapas finales de la ontogenia del órgano. Los frutos clasificados como climatéricos exhiben una elevación marcada en su actividad respiratoria hacia el final de la fase de maduración. La etapa climatérica representa una transición entre la maduración y la senescencia. Los frutos no climatéricos no exhiben dicha elevación en la actividad respiratoria, sino una disminución progresiva y lenta hasta la senescencia. La velocidad de la actividad respiratoria de un producto almacenado se puede usar como indicadora para ajustar las condiciones de almacenamiento para maximizar la longevidad del producto. Como consecuencia, es a menudo deseable evaluar la respiración de los productos hortofrutícolas en las bodegas comerciales. Dichas evaluaciones se pueden usar también en muchos casos como indicadoras generales de la vida de almacenamiento potencial de los productos. Además, la velocidad de respiración se puede usar para calcular la pérdida de materia seca del producto durante el almacenamiento y la velocidad de absorción de oxígeno por parte del producto del aire y de la bodega. Para evaluar la respiración de un producto existen varias técnicas que se pueden usar para colectar muestras de gases de un producto.

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CROMATOGRAFIA DE GASES La cromatografía es un método de separación físico, en el cual se distribuyen las substancias entre la fase estacionaria de relleno de la columna separadora y la fase del gas portador circulante (fase móvil). En cromatografía de gases existen: La cromatografía entre fase “gaseosa y sólida” , en la cual se emplean, como fase estacionaria, carbón activo, tamices moleculares, silica gel y óxido de aluminio. Este tipo de cromatografía de gases se emplea para la separación de hidrocarburos. Sin embargo, no es muy buena la reproducibilidad y simetría de las bandas o picos. La cromatografía entre fases de gas y líquido es mucho más importante, y con ella se realiza la mayor parte de los trabajos analíticos. En este tipo de cromatografía la fase estacionaria consite en un soporte sólido, por ejemplo Kieselgur, que está impregnado con un líquido , por ejemplo glicol polipropilénico. En este líquido se disuelven las muestras introducidas y evaporadas y de esta disolución son desplazadas, más o menos rápidamente por el gas portador. Este proceso se repite contínuamente hasta que la substancia sale de la columna separadora del cromatógrafo de gases y el detector emite la señal correspondiente. El principio de funcionamiento del cromatógrafo de gases es el siguiente: El gas portador fluye de un tanque a presión por una válvula reductora, extrangulada por un regulador volumétrico de gas, al bloque de inyección, y de ahí a la columna separadora y al detector. El paso puede regularse exactamente. Luego se regula la temperatura del bloque, conducciones y columnas separadoras. Debe transcurrir un tiempo determinado, por lo general de 1 a 2 horas, hasta que todo el sistema se encuentre en equilibrio y el análisis pueda empezar. Dicho estado se reconoce por la línea horizontal uniforme que escribe el registrador, el cual, ajustado a alta sensibilidad, debe trazar una línea recta. Luego se inyecta la muestra, con una jeringa de 1mL a lo sumo, y a través de una membrana de goma de silicona, en el bloque de inyección. La muestra se evapora y llega a la columna separadora, en la cual, impulsada por la corriente del gas portador, permanece, según su coeficiente de distribución, más o menos tiempo. Al final de la columna las substancias separadas llegan al detector. Este mide una característica física o química de la substancia, por ejemplo, en nuestro caso, de conductividad térmica, y traslada los valores al registrador. Los valores quedan registrados en papel y la gráfica resultante constituye el cromatograma (Fig. 1). La sensibilidad del registrador se regula de acuerdo con la cantidad de substancias presentes. Dado que a menudo esto sólo puede comprobarse después de finalizar un análisis, se debe realizar un segundo y tercer cromatograma. Detector de Conductividad Térmica.- Controla la conductividad de los gases salientes. Esta varía cuando una substancia de la fase gaseosa es desplazada por otra, o cuando el gas soporte arrastra consigo una substancia de la columna. Se pueden utilizar como elementos de medición los termistores o resistencias de semiconductores o bien filamentos de tungsteno. Otros detectores que se usan en cromatografía de gases son: ionización de la flama, contenido de fósforo y contenido de nitrógeno. En cromatografía de gases se distinguen dos tipos de columna: la columna de relleno y la columna capilar. La columna de relleno contiene una fase sólida, consistente por lo general en un material de soporte inorgánico. Dicho material de soporte está cargado con un 0.5% al 30% de fase estacionaria. Estas columnas miden generalmente 2-6m de longitud con un diámetro de 3-4mm. El otro tipo de columna es la columna capilar. Estas columnas miden de 25 a 100 m de longitud, con un diámetro interior de 0.25 mm. No contienen ningún tipo de material de soporte en forma sólida, sino que el líquido de separación está adherido a la pared de la columna a manera de película fina. Las columnas están enrolladas en espiral alrededor de un núcleo y se fabrican de metal de cobre en algunos casos. El gas portador debe ser inerte y puede ser nitrógeno, argón o helio. La temperatura se ajusta al principio del proceso de separación y puede permanecer igual durante el análisis, entonces se dice _________________________________________________________________________________________ Laboratorio de Fisiología y Tecnología Poscosecha de Frutas y Hortalizas Universidad Autónoma Metropolitana

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que las condiciones del análisis son isotérmicas. En otros casos se pueden variar las condiciones de temperatura del análisis en cualquier número de grados por unidad de tiempo y se reporta el programa de temperaturas utilizado en forma de gradientes de temperatura. Así también se puede aumentar naturalmente la temperatura a voluntad para la elución de substancias de difícil evaporación.

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= Cilindro de gas 7 = Salida de la columna = Aguja de inyección 8 = Amplificador Fig. 1. Esquema de un cromatógrafo de gases con registrador. Tomado =deEntrada de Columna 9 =de Brazo inscriptor Günther (1973). Métodos Modernos Análisis Químico de Carnes = Columna 10 = Registrador y Productos Cárnicos. = Termostato 11 = Cromatograma = Detector

OBJETIVOS El estudiante se familiarizará con los instrumentos para evaluar la actividad respiratoria de los órganos vegetales. El estudiante determinará la actividad respiratoria de dos productos hortofrutícolas en varios estados de madurez e identificará los cambios del patrón respiratorio con los cambios bioquímicos (°Brix, acidez, color) entre frutos climatéricos y no climatéricos.

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MATERIAL • Contenedores grandes de vidrio o acrílico. Pueden utilizarse desecadores adaptados con tapones de hule para tomar muestras del espacio de cabeza (pueden ser frascos grandes de mayonesa cuya tapa sea perforada y se le coloquen 1 a 2 tapones de hule). • Jeringas desechables de 1 mL (tuberculina) (al menos 2 por equipo) • Agujas desechables de 21X32mm (1 ¼) (al menos 3 por equipo) • 1 tubo de ensayo o frasco vial de 100-125mL • 50 mL de solución saturada de NaCl • CO2 de concentración conocida en la solución saturada de NaCl

• Material biológico: 1 Kg. de jitomates, plátanos, fresas, naranjas, limones, manzanas, mangos, duraznos, uvas, guayabas, toronjas (en diferentes estados de madurez). • Cromatógrafo de gases con celda detectora de conductividad térmica.

METODO 1.- Colóque 1Kg de material biológico en un contenedor grande de vidrio o acrílico con aditamentos adaptados para tomar una muestra gaseosa del espacio de cabeza en el momento en que son colocados los productos en el contenedor y expongalos al aire durante un mínimo de 1 hora. Colóque la manguera de entrada de la parte superior del contenedor en la fuente de aire y ajuste el flujo de aire a 450-500 mL/min en el caso de los frutos climatéricos y a 300400 mL/min en el caso de los frutos no climatéricos. Tome la primera muestra de gases de la atmósfera en donde se encuentran los frutos antes de abrir la llave del aire y después de estabilizar el cromatógrafo de la siguiente manera: 2.- Abra la llave del gas acarreador del cromatógrafo. 3.- Encienda el control principal del cromatógrafo, espere 20-30 minutos a que el gas corra por el cromatógrafo y se estabilice en él. 4.- Encienda el detector. 5.- Encienda el integrador. 6.- Espere a obtener la línea base en el integrador (1-2 horas). 7.- Extraiga 1 mL de gas del espacio de cabeza del vial que contiene la concentración conocida de CO2. NOTA: Los pasos 2 a 8 ya se habrán realizado por parte de los instructores, por practicidad, para evitar pérdida de tiempo de sesión de laboratorio. 8.- Inyéctelo en el cromatógrafo. Simultáneamente a esta operación marque una línea vertical en la carta. Este será el punto de inyección. Empiece también en ese momento un conteo mediante un cronómetro para determinar el tiempo de retención del CO 2 . Detenga el cronómetro en cuanto vea salir el primer pico en el integrador. De esta manera se obtiene el factor de respuesta (FR) de su estándar para calibrar el aparato y _________________________________________________________________________________________ Laboratorio de Fisiología y Tecnología Poscosecha de Frutas y Hortalizas Universidad Autónoma Metropolitana

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comparar sus muestras problema con aquélla concentración conocida de CO2. 9.- Espere a obtener de nuevo la línea base en el integrador. 10.- Extraiga 1 mL de gas del espacio de cabeza del contenedor con los frutos (acabado de cerrar) e inyéctelo al cromatógrafo como en el paso 7. 11.- Espere 1 hora a que los frutos del contenedor respiren dentro de él como se indicó en el paso #1. 12.- Cierre la llave de la fuente de aire en donde están respirando los frutos, una por una, colóque pinzas en cada manguera de salida del contenedor. Transporte el contenedor al lugar donde se encuentra el cromatógrafo. 13.- Extraiga 1 mL de gas del espacio de cabeza del contenedor en donde están respirando sus frutos después de bombear 3 veces el aire con la jeringa. Se recomienda empezar por los frutos no climatéricos y después por los frutos climatéricos empezando por los más verdes (sazones), los más senescentes, y por último los intermedios maduros. 14.- Inyéctelo en el puerto B de inyección del cromatógrafo. Empiece inmediatamente a tomar el tiempo que transcurre a partir de la inyección hasta que obtenga el pico que representa al CO2 . Escriba una línea en el momento de la inyección en el integrador. Una vez que obtenga el pico anóte con lápiz su identificación, i.e., estándar de CO2 , muestra de plátano sazón I, etc. 15.- Espere hasta obtener una nueva línea base para proceder con la inyección de la siguiente muestra. Repita esta última operación por triplicado para cada muestra. 16.- Integre el área bajo la curva de cada pico y compárela con la del estándar. Registre sus datos en % de CO2 por kilogramo de fruta. 17.- Grafique una curva de grado de madurez

CALCULOS PARA LA DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD RESPIRATORIA DE LOS PRODUCTOS HORTOFRUTICOLAS El estándar utilizado para calibrar el cromatógrafo de gases tiene una concentración de CO 2 conocida en porcentaje. Con el objeto de hacer los resultados obtenidos comparables con los de la literatura el porcentaje de CO 2 se transforma en mL de CO 2 \Kg\hr de la siguiente manera: ∆CO2 = concentración de CO2 en el tiempo 2 - concentración de CO2 en el tiempo 1 (∆ %CO2 X 10) (volúmen del espacio libre del contenedor en litros)\ (peso fresco del producto en Kg) (tiempo que estuvo cerrado el contenedor en horas) = mL de CO2 \Kg\hr para un sistema cerrado, ó: (∆%CO2 X 10) (velocidad de flujo del aire en mL\min X 60\ 1000)\ (peso fresco del producto en Kg) = mL de CO2\Kg\hr para un sistema abierto. Los mililitros de CO2 se convierten normalmente en miligramos para eliminar el efecto de la temperatura sobre el volumen de gas de manera que se pueden realizar comparaciones directas; para lo cual se debe usar una corrección por temperatura. Una mol de gas es igual a 22.4L a 0°C a 1 atmósfera, por lo tanto, su volumen (V 1), a la temperatura del producto, se puede calcular con la siguiente ecuación: _________________________________________________________________________________________ Laboratorio de Fisiología y Tecnología Poscosecha de Frutas y Hortalizas Universidad Autónoma Metropolitana

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V1 22.4 (1+ la temperatura del producto en °C\ 273°Kelvin) Por ejemplo, el volumen de 1 mol de CO 2 a 25°C es igual a 24.45L. El volumen de gas por gramo se calcula dividiendo su volumen correcto por el peso molecular del gas (CO 2 =44), i.e. 24.45L\44=0.556 L\g ó 556mL\1000 mg (el volumen de CO2 a 25°C dividido por su peso molecular). Posteriormente se puede calcular el peso del gas de la muestra de respiración mediante la siguiente ecuación: 556mL\1000mg = mL determinados de la muestra\X Peso del gas de la muestra de respiración en mg: X = mL determinados de la muestra \ 0.556 Tabla de Correcciones para las temperaturas más comúnmente usadas: 0°C = 509 5°C = 518 10°C= 528 15°C= 537 20°C= 546 25°C= 556 30°C= 565

mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg mL CO2\ 1000mg

Tomado de Kays (1991). Postharvest Physiology of Perishable Plant Products.

REPORTE El reporte se elaborará a manera de artículo científico: Título Resultados Discusión Conclusiones Literatura Citada

BIBLIOGRAFIA Burton, W.G. 1982. Post-Harvest Physiology of Food Crops. Edit. Longman, U.S.A. Günther, H.O. 1973. Métodos Modernos de Análisis Químico de Carnes y Productos Cárnicos. Ed Acribia, España. pp56-77. Kays, S.J. 1991. Postharvest Physiology of Perishable Plant Products. Ed. AVI, U.S.A. pp75-95.

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