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REACCIONES QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS CHEMICAL REACTIONS OF AMINO ACIDS Wilson Javier Martínez (Facultad de ciencias agropecuarias, Ing. Agronómica, UPTC, estudiante, cód.: 201520669, [email protected]) Camilo Rojas Cuta (Facultad de ciencias básicas, Lic. Biología, UPTC, estudiante, cód.: 201322329, [email protected]) RESUMEN En esta práctica se realizó una de las técnicas más sencillas para identificación de aminoácidos que fue la combinación de la cromatografía en capa fina con la reacción de la ninhidrina, con la cual se pueden identificar los aminoácidos por la tinción color morado o magenta que se presenta en ellos, excepto con la prolina, la cual, da un tono amarillo al reaccionar con la ninhidrina debido a que no produce amonio al reaccionar con ella, lo que indica que los demás aminoácidos si presentaron esta reacción. En la segunda parte, en el desarrollo de la práctica se realizaron diferentes ensayos (ninhidrina, Adamkiewis, Xantoproteico, reacción de los Tiogrupos) con el objetivo de identificar aminoácidos presentes en muestras conocidas como la que preparamos de Tecoma Stan al 15%, también de Albumina de huevo, gelatina, triptófano y formaldehido; debido a la especificidad de cada una de estas pruebas y a las características estructurales de cada aminoácido se consiguió reconocer la presencia o ausencia de ellos en las muestras analizadas.

PALABRAS CLAVE: Ninhidrina, Adamkiewis, Xantoproteico, reacción de los Tiogrupos, Acetona, Prueba calorimétrica, cromatografía.

ABSTRACT In practice one of the simplest techniques for identification of amino acids was the combination of thin layer chromatography with ninhydrin reaction, with which one can identify the amino acids by the colored stain purple or magenta presented performed in them, except proline, which gives a yellow tone to react with ninhydrin because not produce ammonium react with it, indicating that the other amino acids if this reaction presented. In the second part, in developing practical different tests (ninhydrin Adamkiewis, xanthoproteic, reaction Tiogrupos) were performed in order to identify amino acids in samples known as the one we prepared Tecoma Stan 15%, also egg albumen, gelatin, tryptophan and formaldehyde; due to the specificity of each of these tests and structural characteristics of each amino acid was achieved recognize the presence or absence of them in the samples analyzed.

KEYWORDS: Ninhydrin Adamkiewis, xanthoproteic, reaction Tiogrupos, Acetone, calorimeter testing, chromatography.

1. INTRODUCCION Los aminoácidos que constituyen alas proteínas, son substancias que tienen como característica general el hecho de poseer un carboxilo libre y un grupo amino, situado en el carbono alfa con respecto al carboxilo. En todos los aminoácidos alfa que forman a las proteínas, el grupo amino alfa es un grupoprimario, es decir que no tiene sustituyentes. La única excepción ocurre con la prolina, que es un aminoácido, ya que su grupo es secundario. Los aminoácidos difieren entre sí únicamente por las características del resto de su molécula o cadena lateral (R), de manera que su fórmula general es:

Imagen 1: Composición de un aminoácido. Image 1: Composition of an amino acid. Las propiedades de cada aminoácido dependen tanto de su grupo carboxílico como de su grupo amino alfa, y de su cadena lateral (R). En un polímero lineal de aminoácidos o poli péptido,

de todos los grupos carboxilo alfa y amino de los aminoácidos que intervienen, solo quedan libres un grupo amino alfa, el grupo terminal y un grupo carboxilo alfa, el grupo carboxilo terminal. Así pues, en una proteína las cadenas laterales de los aminoácidos que la constituyen, son las que influyen de manera directa en las propiedades de cada zona a lo largo de la cadena polipeptídica y, en consecuencia, determinan también en gran medida su comportamiento. Una de las propiedades más importantes de las cadenas laterales de los aminoácidos, es su capacidad de interacción con los solventes acuosos o con los reactivos que permiten su identificación, es decir su grado de polaridad o no polaridad. 2. OBJETIVOS Realizar pruebas calorimétricas que permiten el reconocimiento de aminoácidos. Familiarizarse con las técnicas de cromatografía en papel filtro. Separar varios aminoácidos por cromatografía. 3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL  Parte I Tomamos un papel filtro, lo doblamos en cuatro partes, señalamos el punto medio y un punto de referencia en cada cuadrante que se formó en el papel, en cada uno de esos puntos, con ayuda de un capilar, colocamos una pequeña muestra de (Prolina, Solución al 15% de Tecoma Stans, albumina de huevo y Felilalanina) respectivamente; luego impregnamos el papel con Acetona y luego lo secamos por medio de calor hasta que reaccionara y se identificara la presencia o ausencia de aminoácidos. (Colores morado o fucsia).  Parte II Reacción con la Nihidrina

Imagen 2: Estructura química de la Nihidrina Image 2: Chemical structure of ninhydrin

Todas la aminas primarias (y por lo tanto también los alfa-aminoácidos) reaccionan con la nihidrina en presencia de calor dando dióxido de carbono, amoniaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. En cuatro tubos de ensayo, añadimos un vol de 0,5 de (Albumina de huevo, una solución de aminoácidos, sacarosa y el extracto de las hojas de Tecoma Stans al 15%) respectivamente; a cada tubo de ensayo le agregamos 0,5ml de Hihidrina, agitamos calentamos a baño de maría y esperamos la coloración en cada tuvo. Reacción de Adamkiewics En cuatro tubos de ensayo, añadimos un vol de 2ml de (Albumina de huevo, gelatina, triptófano y la solución al 15% de Tecoma Stans) respectivamente; luego añadimos 1ml de Ácido sulfúrico; agitamos con cuidado, calentamos a baño de baria y esperamos la reacción. Reacción Xantoproteica

Imagen 3: Estructura química de la Fenilalanina Image 3: Chemical structure of Phenylalanine

En 4 tubos de ensayo agregamos 1ml de (Albumina de huevo, fenilalanina, sacarosa y el extracto de la planta al 15%) respectivamente, después adicionamos 0,5ml de Ácido nítrico concentrado a cada tubo; agitamos, calentamos en baño de maría y esperamos la reacción. Reacción de los Tiogrupos

Imagen 4: Estructura química de la Cisteina Image 4: Chemical structure of Cysteine

En cuatro tubos de ensayo agregamos un volumen de 1ml de (Albumina de huevo, Cisteina, Hidroxido de potasio y el extracto de la planta al 15%) respectivamente, a cada tubo de ensayo le agregamos 3 gotas de acetato de plomo, agitamos, calentamos en baño de maría y esperamos la reacción. 4. RESULTADOS Y ANALISIS  Parte I

Imagen 5: Montaje identificación de aminoácidos por cromatografía. Image 5: Mounting amino acid identification by chromatography.

NIHIDRINA: La ninhidrina reacciona específicamente con el grupo de a-amino de los aminoácidos, ya sean libres o bien unidos mediante enlaces peptídicos. La ninhidrina a Ph entre 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los grupos de a-amino libreando amonio, el cual se condensa con la ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina formando un compuesto coloreado que varía de azul a violeta púrpura. [1] La primera reacción que se hizo evidente fue en la Fenilalanina y posteriormente en la albumina de huevo, dando una tonalidad fucsia indicando la presencia de aminoácidos, como se ve en las imágenes anteriores. En el caso de la prolina, no se manifestó con un color purpura, ya que su grupo es secundario y reacciono dando un color amarillo. En la solución de Tecoma Stans al 15% n o tuvimos ningún tipo de reacción, eso pudo deberse a que la solución la habíamos preparado varios días atrás y a pesar de que estaba en refrigeración pudo haberse dañando o pasado; en este caso por sugerencia de la docente, tendremos que hacer de nuevo la solución y realizar el mismo proceso, solo para esta sustancia.

CALCULO DEL Rf

CALCULOS DE Rf. (Cuantitativo)

El Rf que es la distancia recorrida por el soluto, desde un punto de partida, dividido por la distancia recorrida por el frente del solvente; se calcula de la siguiente manera: Se deben tomar dos medida, la primera es de el punto de referencia inicial (en nuestro caso el papel es circular punto centro) al punto donde colocamos la muestra con el capilar (fase acuosa o estacionaria; la segunda medida se toma desde donde se colocó la muestra estacionaria con el capilar, hasta donde se desplazó o se identifica la mancha fucsia. Podemos determinarlo Mediante la formula

RF=

Distancia Distancia del solvente .

menor a 1. Ecuación 1: Cuantificación del Rf Equation 1: quantification of Rf

Siempre

Rf (prolina)= (2cm)/(3,8cm) Rf (prolina)= 0,52 Rf(fenilalanina)= (1,8cm)/(4,8cm) Rf(fenilalanina)= 0,375 Rf(Extracto)= (1,9cm)/(5cm) Rf(Extracto)= 0,38 Rf(A. huevo)= (1,8cm)/(3,9cm) Rf(A. huevo)= 0,46  PARTE II  Reacción con la ninhidrina Los grupos amino libres de los aminoácidos, de los péptidos y las proteínas reaccionan con la ninhidrina a un pH entre 4 y 8, para dar un compuesto de intenso color azul púrpura. La prueba también es positiva con aminas primarias y amoníaco pero sin desprendimiento de CO2. Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina dan un color amarillo en lugar del color púrpura con la ninhidrina. [2] El amoniaco reacciona con otra molécula de nihidrina formando un compuesto azul casi violeta denominado PURPURA DE RUTHEMMANS

Imagen 6: Ejemplo de cómo calcular el Rf Figure 6: Example of how to calculate the Rf

Imagen 8: Ensayo con Nihidrina. Figure 8: Test with ninhydrin.

Como se observa en la figura, los resultados obtenidos en este ensayo, concuerdan con los teóricos y arrojaron los siguientes resultados:

Imagen 7: Rf en el laboratorio Figure 7: Rf laboratory

Extracto: (--) Negativo para nihidrina, probablemente por lo mencionado respecto a la solución.

Sisteina: (+++) Positivo para nihidrina, violeta fuerte

mientras que la gelatina, aunque también hirvió, no tuvo gran cambio a simple vista. En todas las soluciones, hubo una reacción exotérmica.

Albumina de huevo: (++) Positiva para Nihidrina, violeta que se evidenciaba a contra luz.

Alumina de huevo: (+) nos arrojó positivo para Triptófano, color amarillo

Sacarosa: (--) Negativo para nihidrina, no presento ningún cambio en su coloración.

Extracto de T. Stans: (++) positivo para Triptófano, color naranja claro.



Reacción de Adamkiewics

Es una reacción colorimétrica cuantitativa para detectar proteínas basada en que el triptófano de las mismas forma un complejo coloreado como el ácido glióxico, dando un color naranja/amarillo. El grupo indolo del aminoácido Triptófano se condensa con el ácido glioxilico del reactivo, formando compuestos coloreados. El agregado de una pequeña cantidad de ácido sulfúrico, aumenta la sensibilidad de la reacción.

Imagen 9: Ensayo Reaccion de Adamkiewics Figure 9: Reaction test Adamkiewics

En este ensayo pudimos observar reacciones muy interesantes; al adicionar el Ácido sulfúrico en cada uno de los tubos de ensayo, la Albumina de huevo, casi de inmediato comenzó a hacer efervescencia y lleno completamente el tubo de ensayo con espuma hasta rebosarlo. Por otro lado, el extracto de Tecoma Stans al igual que el Triptófano comenzó a hervir y presentaron un cambio de coloración evidente;

Triptófano: (++++) Positivo para Triptófano, nos presentó un color naranja intenso, casi rojizo. Gelatina: (--) Negativo para triptófano, no tuvo ningún cambio en su coloración.  Reacción Xantoproteica Los aminoácidos, que contienen un núcleo aromático forman nitro derivados de color amarillo cuando se calientan con ácido nítrico concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja intenso en medio alcalino. La fenilalanina, la tirosina y en cierto grado el Triptófano, así como todas las proteínas que los contienen, dan positiva la prueba. Se evidenció que inicialmente la coloración fue la esperada para dicha prueba y de igual forma para la confirmación con el NaOH. [3] Los resultados de añadir ácido nítrico a las muestras de albúmina de huevo, fenol y triptófano solo dio positiva en la albúmina de huevo, Por lo tanto concluimos que hay presencia de proteínas solubles en la solución esto hace que se torna la solución de un color amarillo oscuro.

muestra a una hidrolisis alcalina con hidróxido de sodio según la siguiente ecuación:

De esta manera el sulfuro de sodio se encuentra libre para reaccionar con el acetato de plomo del reactivo de Courtone.

[5]

Ilustración 1 reacción xantoproteica Ilustración 1 xanthoproteic reaction



Reacción de los Tiogrupos

5. CONCLUSIONES Realizamos la separación de aminoácidos mediante la cromatografía; es de las técnicas más simples, nos permitió observar la reacción producida por medio de la ninhidrina, que permite identificar aminoácidos, ya que la reacción de los aminoácidos con ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los mismos observándose así una coloración morada o magenta. Calculamos el Rf de cada muestra con ayuda de la técnica de la cromatografía en aminoácidos. Indicamos la presencia de proteínas en diferentes muestras, del mismo modo identificamos algunos de los aminoácidos presentes en ellas por medio de las reacciones que ocurrieron en cada caso de acuerdo al radical o al grupo que caracteriza al aminoácido. 6. REFERENCIAS

Imagen 10: Prueba de Tiogrupos Figure 10: Test Tiogrupos

El S de un grupo tiol de un aminoácido más acetato de plomo, produce precipitado negro (PbS2). Esta reacción dará positiva con aquellos aminoácidos que presentan azufre en su estructura, como son la cistina, la cisteína, y la metionina. La reacción consiste en someter la

[1]http://bioquimicatm2.blogspot.com.co/2015/0 2/aminoacidos-y-proteinas_3.html [2]http://angelabioqumica.blogspot.com.co/2011 /09/objetivos-1.html [3]https://es.scribd.com/doc/27312502/INFORM E-LABORATORIO-RECONOCIMIENTO-DEAMINOACIDOS-EN-ALIMENTOS [5]https://es.scribd.com/doc/42093275/Aminoaci dos-Peptidos-y-Proteinas

[6] Campbell Mary K & Farrell ShawnO. (2003). Bioquímica Cuarta Edición.México: editorial THOMSON.

[7] Guías suministradas por la docente