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PREPARACION DE EXTENDIDOS Y COLORACIONES DIFERENCIALES Moreno Luis Miguel1, Polanco C. Alejandro2, Ramirez R. Nayibe3 Escuela Ingeniería de Alimentos, Universidad del Valle 16 Diciembre 2015

RESUMEN Se emplearon los diferentes métodos de coloración para distinguir de cada bacteria su reacción frente a estas tinciones, para la E.Coli y la E.Aureus se usó la técnica de tinción de Gram identificando en estas que son gram negativas y gram positivas respectivamente, a la B.Cereus se le identifico su espora mediante la coloración necesaria posteriormente mencionada, a la Proteus su motilidad, aunque no fue posible su observación debido a que la bacteria se murió o y finalmente a la Klebsiella se le identifico su capsula por el método de Anthony. Debido al pequeño tamaño de los microrganismos se dispuso de un microscopio óptico para que le campo fuese más claro y poder identificar y observar estas bacterias. Todos los resultados, a excepción de la prueba de motilidad, fueron los esperados. Palabras claves Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae, capsula, espora, tinción de Gram, coloración, Abstract Different staining methods were used to distinguish from each bacterium their reaction to these dyes, for E.Coli and E.Aureus the Gram staining technique used in identifying these are gram negative and gram positive respectively, the B. cereus spore was identified by his later mentioned necessary coloration, the Proteus motility, although his remark was not possible because the bacteria eventually died to Klebsiella his capsule was identified by the method of Anthony. Due to the small size of the microorganisms were available for light microscopy field will be clearer and to identify and observe these bacteria. All results, except for the motility test, were as expected. Keywords Escherichia Coli, Estafilococos Aureus, Bacillus Cereus, Proteus, Klebsiella Pneumoniae, capsule, spore, Gram stain, coloration.

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INTRODUCCIÓN Las bacterias se caracterizan por ser microorganismos unicelulares que no poseen membrana nuclear, en las cuales el material nuclear está organizado en una tira continua, a veces circular, contenido en el citoplasma y presentan una actividad metabólica. Existen bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. (Evelyn, 2005). Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. (Tortora et al, 2007). La coloración de gram permite separar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivos y Gram negativos, basados en que si retienen o no el colorante primario (cristal violeta), luego del proceso de decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición de agentes decolorantes como el alcohol, aparecen como azul oscuro o violeta y se designan como Gram positivos: aquellos que pierden e cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario, la safranina, aparecen como rojos y se designan como Gram negativos. (Gerard et al, 2005). OBJETIVOS 

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Aprender las técnicas de preparación del frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el estudio macroscópico de cultivos bacterianos, para poder así dar pauta a la identificación de las principales formas bacterianas y comprender la importancia de las tinciones y su adecuado uso. Identificar las técnicas de coloración más comunes utilizadas para identificar morfología y estructuras de bacterias.

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METODOS Tabla 1 resultados observados de la tinción de gram de las bacterias E. Coli y E.Aureus Escherichia Coli

Estafilococos Aureus

FOTO Ilustración 1 Coloración de la E. Coli.

DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO

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Ilustración 2 Coloración de la E. Aureus

Miden alrededor de 0.5u Son circulares y cortas Elevación Convexas Borde liso No forman esporas

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Miden alrededor de 0.5 a 1u Se distingue un patrón con forma de racimo de uvas Borde ondulado Elevación convexa

COLORACIÓN DE La bacteria se tiño de color rosado La bacteria se tiño de color LA BACTERIA morado TEÑIDA REACCIÓN A LA Según el color rosado la bacteria es Gram positivo COLORACIÓN DE gram negativo GRAM Tabla 2 resultados observados de la bacteria Bacillus Cereus Bacillus Cereus

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FOTO

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Ilustración 3 Coloración de Bacillus Cereus.

DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO

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Redondeados Forman cadenas Son gram positivos presentan color verde en la parte externa (2) Presencia de color verde en la parte interna(endoesporas)(1)

Tabla 3 resultados observados de la prueba de motilidad de la bacteria Proteus PROTEUS

FOTO

Ilustración 4 Prueba de motilidad de Proteus.

DESCRIPCIÓN DE LO OBSERVADO

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Circulares y cortos Borde ondulado y elevación convexa No se distinguieron los flagelos

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN Coloración de Gram

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Las bacterias gram positiva y las gram negativas presentan una gran diferencia en su pared celular, las paredes de las gram positivas están conformadas principalmente por peptidoglicano, la cual se cree que es la responsable de retener el cristal violeta de la tinción de gram debido a su gruesa capa, aunque estas células también presentan una gran cantidad de ácido teicoico (polisacáridos que se unen al ácido N-acetilmurámico o a los lípidos de la membrana plasmática.) este acido tiene una función de estabilizar la pared celular. Además los ácidos teicoicos tienen un rol en la virulencia de estos microorganismos, porque actúan como antígenos de superficie que se unen a receptores específicos en las células del huésped. (Prescott et al, 1999). Por otro lado la pared celular de la gram negativa está constituida de tres zonas, la membrana plasmática, el espacio periplásmico que incluye una fina capa de peptidoglicano y la membrana externa. Esta última, exclusiva de las bacterias gram negativas, es una bicapa lipídica que difiere de otras membranas por su capa externa, que está constituida por una molécula anfipática. Una de las funciones más importantes de la membrana externa es servir como barrera protectora. Evita o disminuye la entrada de sales biliares, antibióticos y otras sustancias tóxicas que podrían destruir o lesionar la bacteria. La membrana externa es más permeable que la plasmática y permite el pasaje de pequeñas moléculas como glucosa y otros monosacáridos. (Prescott et al, 1999). Una vez clara la composición de las paredes celulares de las dos bacterias analizadas (Escherichia Coli, Estafilococos Aureus) y de acuerdo a los resultados presentados en la tabla 1. Es posible que la diferencia entre las bacterias gram positivas y negativa se deba a su estructura conformada en la pared celular, el peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece actuar como barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta. Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se retiene el complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las bacterias gram negativas (Escherichia Coli) es muy fina, con menos enlaces y con poros de mayor tamaño. Además, es posible que le tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. (Prescott et al, 1999). Por estos motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias gram negativas Coloración de capsula (Método de Anthony) Para realizar el método de Anthony nos dieron la bacteria ( Klebseilla pneumoniae): este método nos dio positivo ya que se pudieron observar dos tonalidades, primero se ve un aro incoloro alrededor de la bacteria la cual está de un tono morado, se puede diferenciar la capsula ya que esta no permite la adhesión de partículas, por lo que la bacteria está rodeada de esta escritura que le ayuda a protegerse de la fagocitosis y la acumulación de alimento entre otras funciones. La capsula puede englobar más de una bacteria, pero en la Klebseilla pneumoniae solo rodea una elemento 5

bacteriano el cual es visible en la figura n o 3; la composición química de la capsula es de glucídica la cual está conformada habitualmente de polisacáridos complejos, formadnos por una mezcla de monosacáridos y ácido urónicos a los cuales se le asocian en ocasiones azúcares aminados y acetilados. Contienen gran cantidad de agua (hasta el 90%). Los azúcares más habituales que constituyen los polisacáridos son la D-galactosa, D-glucosa y D-manosa. (Pumarola, Rodriguez, Garcia y Piedrola 1999).

CAPSULA

BACTERIA

Ilustración 4 Observación de la capsula bacteriana (Klebsiella Pneumoniae) por método Anthony

Coloración de esporas Algunas bacterias Gram positivas forman estructuras inactivas de gran resistencia denominadas esporas o endoespora, se desarrollan dentro de las bacterias de los géneros bacillus y clustridum entre otros. Estas estructuras son resistentes a situaciones vitales estresantes como el calor, la desecación, la radiación ultravioleta, los ácidos y los desinfectantes químicos. Las esporas son impermeables a la mayoría de los colorantes, se observan como áreas incoloras dentro de las células coloreadas. Existen además coloraciones especiales para teñir las esporas, como el verde malaquita al 5% utilizado en la bacteria Bacillus Cereus. La situación de la espora en la célula madre o esporangio, es característica para una especie bacteriana determinada, siendo esto importante para la identificación de la bacteria. Para esto se Dentro de una célula vegetativa se produce una espora única, que se diferencia de la célula madre en su morfología y composición, en el aumento de la resistencia a los ambientes adversos y en la ausencia de actividad metabólica evidente. El proceso incluye la formación de numerosas cubiertas y la captación de calcio con síntesis de ácido dipicolínico. Al final de la esporulación queda una partícula deshidratada que contiene ADN genómico. Ese 6

ADN se vuelve resistente a la desecación, al calor extremo, a la radiación y al ataque por la mayoría de las enzimas y agentes químicos. De acuerdo a lo mencionado anteriormente se pudo observar utilizando el microscopio en la bacteria Bacillus Cereus, confirmando con los datos registrados en la Tabla 2.

Prueba de motilidad De acuerdo a los resultados de la tabla 3, Los flagelos son filamentos proteicos, helicoidales, delgados y rígidos, de longitud y diámetro uniforme, responsables de la movilidad de la bacteria. Los flagelos son tan delgados que no pueden observarse directamente con un microscopio de campo claro, deben teñirse con técnicas especiales para aumentar su grosor. (Schaechter et al, 1993). Esta puede ser una de las razones por las cuales no se distinguieron los flagelos en la prueba de motilidad. Los flagelos no son necesarios para la vida bacteriana. Su síntesis está regulada por las necesidades nutricionales o el estado energético y ocurre por la adición de monómeros de flagelina al extremo distal de los flagelos en crecimiento. La síntesis del filamento es un ejemplo excelente de auto ensamblaje, es decir que la información necesaria para construir el filamento está en la propia estructura de la subunidad de flagelina; no colaboran enzimas especiales u otros factores. (Schaechter et al, 1993). ANEXOS CUESTIONARIO 1

¿Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetales por qué? Rta// Las esporas son más difíciles de colorear que las células vegetales ya que estas son impermeables a la mayoría de los colorantes habituales y se identifica como una zona clara, redondeada u ovalada, que contrasta con el resto de la bacteria que aparece coloreada existente, no obstante, medios de tinción especiales que permiten reconocerlos.

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¿En su preparación se observaron esporas libres y en el interior de la células vegetativas. Como puede incrementarse el contenido del material capsular? Rta// Las células vegetativas de las bacterias formadoras de endosporas comienzan el proceso de esporulación en el momento en que el nutriente esencial, como el carbono o el nitrógeno se toma escaso o inaccesible. En el primer estadio identificable de la esporulación se forma un nuevo cromosoma bacteriano, que es separado junto con una pequeña fracción de citoplasma mediante una invaginación 7

de la membrana plasmática denominada tabique de la espora. Más tarde el tabique de la espora se convierte en una membrana de doble capa que rodea al cromosoma y al citoplasma. Esta estructura se localiza íntegramente en el interior de la célula progenitora y se denomina preespora. Entre ambas capas de la membrana se depositan capas espesas de peptidoglucano. Más tarde se forma una capa gruesa de proteínas alrededor de la membrana externa llamada cubierta de la espora; esta capa es responsable de la resistencia de las endosporas a numerosas sustancias químicas agresivas. La degradación de la célula original determina la liberación de la endospora. 3

¿Los frotis de bacterias encapsulada no se lavan con agua ni se calientan. Porque? Rta// los frotis bacterianos encapsulados no se lavan ni se calientan ya que la tinción de la capsula es más difícil que otros tipos de procedimientos de tinción porque los materiales capsulares son sensibles al calor, hidrosolubles y pueden desprenderse o eliminarse durante los procesos rigurosos de lavado y la fijación. (Tortora, 2007) Para localizar el lugar de la célula donde se encuentran estos componentes se utilizan Métodos Citoquímicos, consistentes en utilizar medios que pongan de manifiesto un compuesto concreto en el interior celular.

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¿Cómo se correlaciona la presencia de capsula de virulencia de una bacteria patógena? Rta// Patogenidad y virulencia bacteriana: La adhesión, colonización y penetración Agresinas, Mecanismos de defensa del huésped. Inmunidad Humoral y celular. La patogenicidad es la capacidad de un microorganismo de producir enfermedad. La aparición de la enfermedad depende en gran parte de las defensas inmunológicas del huésped. La virulencia se refiere al grado de patogenicidad. Una determinada cepa bacteriana puede ser virulenta o altamente virulenta. El grado de virulencia se relaciona con el número de organismos requeridos para producir la enfermedad o el tiempo en que tarda en manifestarse ésta. La patogenicidad microbiana puede expresarse sólo cuando se produce la enfermedad en el huésped. Por el contrario, la resistencia del huésped a una enfermedad infecciosa, se advierte sólo como una respuesta a la presencia del microorganismo.

CONCLUSIÓN 

Para una correcta visualización de la motilidad de la bacteria Proteus se deben tener cuidados estrictos para poder observarla, de lo contrario como sucedió en el laboratorio no pudo ser posible su movimiento en el microscopio. 8

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Dependiendo de la composición de la membrana de la bacteria, de si tiene mucho o poco peptidoglucano, se puede dar que sea gram negativa o gram positiva. Por medio de la tinción con verde de malaquita, el cual requirió del calor para la penetración; se pudo observar las endosporas aunque la estructura de la batería fuera muy pequeña.

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Por medio de la tinción de cápsula se pudo observar y verificar la estructura de la bacteria y su forma.

BIBLIOGRAFÍA      

Prescott, Harley, Klein. Microbiología. Mc Graw-Hill Interamericana de España. 4ª ed. 1999. Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Microbiología. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. Ed Panamericana. 2ª ed. Buenos Aires 1993. Pumarola, A. (1987). Microbiología y parasitología médica. Evelyn Rodríguez Cavallini, Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio 2005. Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introducción a la Microbiología. Ed. Médica Panamericana. Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. Introducción a la microbiología, 2005.

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