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UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS ESPE DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

Nombre: Miguel Tupiza Profesor: Ing. Francisco Flores PhD Fecha: Sangolquí, 21 de Noviembre del 2018

NRC: 3825 Asignatura: Bioinformática PRÁCTICA N°: 5

1. TEMA: Análisis y diseño de primers para la trasfección del gen LacZ del plásmido pTZ18U en el plásmido pFL260 2. OBJETIVOS Diseñar primers para clonación de un amplicón en un vector plasmídico.

3. INTRODUCCIÓN: El diseño minucioso de primers es uno de los aspectos más trascendentales de la PCR. Primers mal diseñados pueden amplificar otros fragmentos de ADN diferentes a los buscados (amplificación inespecífica) (Attwood T.K., 2012). En el diseño de los mismos algunas reglas se han demostrado como útiles, por ejemplo: A – Cada primer individual debe contar con una longitud de 18-24 bases, es decir una longitud pequeña. B – Se recomienda que de G:C (Guanina:Citosina) este entre 40 y 60 %. C –La temperatura de fusión “Tm” debe ser cercano, dentro de los 5 °C, en ambos primers. D – Se estableció que la secuencias deben iniciarse y terminarse con 1 o 2 bases púricas, en los primers individuales.

4. METODOLOGÍA Se realizo el PCR y la ligación en al programa Serial Cloner, primer se busco en la base de datos las secuencias de el dador de la secuencia y el aceptor de la secuencia, posteriormente ambas secuencias se cargaron en el programa en la secuencia dadora se realizo el diseño de primers foward y reverse y la inserción del gen LacZ se realizó desde la secuencia aceptora. El análisis de la termodinámica se relizo en el programa Oligo Analyzer.

5. RESULTADOS Busco la secuencia en lavase de datos NCBI Sequence pTZ18U

Cargo la secuencia Sequence pTZ18U

Cargo la secuencia Sequence 1= pFL260

Cargo la secuanci De sequence=PTZ18U=2860

Secuencia 2 receptora señalo los dos sitios de restricción Nota a qui identifico que el sitio de restricción de la enzima NCOL esto pro enzima del sitio de restricción de la enzima EAGL lo cual quiere decir que Ncol está en el sitio 5’ y la Eagl está en 3’

Para el primer foward Secuencia 1 dadora realizo la pcr Voy a la base de datos del NCBI y busco la secuencia pTZ18U pongo en el gen LacZ y copio de la parte superior 17 nucleótidos del gen LACZ que servirán como parte del primers

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/L37352.1 Después voy a secuence dadora en Run PCR en sequence identical to the target sequence

Posteriormente completo en secuencia dadora Run PCR en oligo tail not identical to the target sequence Escribo el sitio de la enzima de restricción NCOL (ccatgg ) Nota el sitio de restricción está presente en la secuencia donde voy a cortar y en la secuencia donde voy a insertar

Posteriormente escribo cualquier nucleótidos a lado de la secuencia del sitio de restricción de la enzima NCOL (ccatgg ) escribi attg Nota complete hasta 27 por que 27 es lo que me pidió el profe

Para el reverse Voy a la base de datos del NCBI y busco la secuencia pTZ18U pongo en el gen LacZ y copio de la parte inferior 17 nucleótidos del gen LACZ que servirán como parte del primers a esta secuencia está en 5’-3’ así que hay que invertir a 3’-5’ ccaaaaa acttgattag

gattagttcaaaaaacc despues debemos sacar la cadena que hibrida ctaatcaagttttttgg copio esta secuencia y pego en el primer revers aumento la secuancia de la enzima de restricción Eagl cggccg y aumento las 27 nt umentando cualquier nucleotidos ttaa

Run pcr y luego arrastro en el lugar de seuence 1 después señalo la secuencia y elijo otra vez los sitios de restricción

Selecciono con shif y pongo grafic map y ya esta

Por último pongo grafic map se puede observar la parte insertada

Los primers realizados fueron Foward: attgccatgg atgaccatgattacgaa Reverse: ttaacggccg ctaatcaagttttttgg Mapa de restricción

Información termodinámica de los primers forward y reverse Para la obtención de la información (https://www.idtdna.com/calc/analyzer).

termodinámica

Primer forward: 5`- attgccatgg atgaccatgattacgaa - 3` Homodímero con menor delta G

se

utilizó

la

página

web

Oligo

Analyzer

Heterodímero con menor delta G

Hairpin con el menor delta G

Temperatura de melting: 58.7°C

Primer reverse: 5`-tgcttacggccgctaatcaagtttttt- 3` Homodímero con menor delta G

Hetedímero con menor delta G

Hairpin con el menor delta G

Temperatura de melting: 59.5 °C

Especificidad de los primers diseñados Información termodinámica de los primers forward y reverse Homodímero con menor delta G Heterodímero con menor delta G Hairpin con el menor delta G Temperatura de melting de cada primer 6. Discusión Secuancial Cloner es un elemento bioinformático para recombinación genética (Zou,2015)Se realizó la inserción del genoma en el programa Sequencial clonel la ventaja de este sofware es que te permite visualizar la inserción del genoma a demás de ser sofware libre, lo complicado fue el entender la interfase ya que había que realizar pasos poco convencionales. 7. CONCLUSIONES:  Se logro diseñar los primers para lograr realizar la PCR.  Se analizo la termodinámica de los primers para ver su viabilidad para ser utilizados.

8. REFERENCIAS: 9. 

Attwood T.K., G. A.-E.-R. (2012). «Concepts, Historical Milestones and the Central Place of Bioinformatics in Modern Biology: A European Perspective». Bioinformatics - Trends and Methodologies. InTech.



Zou, D., Ma, L., Yu, J., & Zhang, Z. (2015). . «Biological databases for human research». Genomics, Proteomics & Bioinformatics. doi:doi:10.1016/j.gpb.2015.01.006