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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

R. NAVARRO B. R. MESTAS

PRACTICA N° 1 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO, MANEJO DE MICROPIPETAS Para al buen desempeño en las prácticas de laboratorio es necesario conocer las recomendaciones fundamentales sobre bioseguridad. De esta manera además de proteger el material de trabajo, se evita la contaminación de quienes manipulan los diferentes reactivos y sustancias; y también se garantiza la no-exposición a agentes peligrosos y la obtención de resultados confiables. En el Laboratorio de Biología Molecular se trabaja con DNA animal, vegetal y de microorganismos y con reactivos químicos potencialmente peligrosos. La mayoría de las siguientes recomendaciones son procedimientos de rutina para el trabajo en el laboratorio. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD Algunos reactivos utilizados en los procedimientos descritos en este manual tienen la característica de ser tóxicos, irritantes, corrosivos, cancerígenos, mutagénicos y neurotóxicos, por lo tanto los estudiantes siempre deberá usar guantes, mascarillas, lentes protectores y mandil para evitar un contacto directo o accidental con ellos. La luz ultravioleta (UV) empleada para la visualización de DNA a 385 nm de longitud de onda con 8W de potencia ocasiona graves daños oculares y epiteliales, por lo tanto, los estudiantes deberán contar con una lámina de policarbonato transparente ubicada entre la lámpara y el punto de observación. Además, deberá usar lentes de protección contra rayos UV del mismo material. El voltaje utilizado para la electroforesis puede generar quemaduras por descarga eléctrica. Aunque la mayoría de cámaras de electroforesis han sido diseñadas para evitar el contacto directo con la electricidad, el operador deberá asegurarse de mantener la fuente poder apagada o desconectada al momento de manipular el equipo. El proceso de ebullición de las proteínas en baño maría a 100ºC deberá realizarse con extremo cuidado para evitar quemaduras. En este sentido, se recomienda utilizar envases de vidrio resistentes a altas temperaturas (por ejemplo: Pyrex) y gradillas flotantes de polipropileno para colocar los viales.

MANEJO DE MUESTRAS Y REACTIVOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR El estudiante deberá usar guantes de látex mientras se encuentre trabajando con DNA y proteínas. Este paso ayudará a evitar la degradación de las biomoléculas por acción de las nucleasas o proteasas presentes en la superficie de las manos. Asimismo, el uso de guantes evitará que el estudiante se exponga ante algún posible riesgo de intoxicación por material infeccioso.

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El material biológico debe ser conservado a bajas temperaturas. El DNA genómico y los productos de amplificación pueden ser almacenados a 4°C, mientras que el DNA plasmídico a –20°C. Las proteínas deben ser conservadas a –80°C o en su defecto a – 20°C. Todas las muestras biológicas deben ser repartidas en alícuotas y en volúmenes pequeños para evitar etapas de descongelamiento o congelamiento drásticos que ocasionarían un eventual deterioro de las moléculas. Debido a la importancia que tiene la medición de volúmenes en los procedimientos de electroforesis, se sugiere que los insumos destinados para tal fin, las micropipetas y puntas de 10, 20, 200 y 1000 ul, viales de 0,5 y 1,5, tubos de 15, 50 y 250 ml y los equipos de laboratorio, cuenten con un certificado que acredite la calidad del producto (Ej.: certificado ISO 9000, ISO 8655, DIN 12650). Se recomienda que las puntas que se insertan en las micropipetas y que tienen contacto directo con las moléculas de DNA sean nuevas y estériles, a fin de evitar una posible contaminación de la muestra con nucleasas. Es importante señalar que es posible trabajar con puntas previamente usadas, siempre y cuando estén libres de restos orgánicos y hayan sido previamente esterilizadas en autoclave (121C a 1,5 psi). Con respecto a la manipulación de las proteínas, no se exige el uso de puntas nuevas pero sí se recomienda esterilizarlas previamente. Se recomienda que los equipos empleados para los procedimientos descritos en este manual cuenten con un certificado de calidad que garantice su precisión y calibración (Ej. ISO9000, ISO 8655, DIN 12650). Los reactivos a usarse durante los procesos de extracción y purificación de ácidos nucleicos y proteínas deben tener grado "molecular" para asegurar el éxito del procedimiento. El uso combinado de reactivos de diferente grado de pureza puede llevar a un fracaso del experimento. LISTA DE SUSTANCIAS PELIGROSAS 1. Acetato de sodio. Ver ácido acético. 2. Ácido acético. Peligroso por inhalación, manejar con guantes y lentes de protección en la campana. 3. Ácido bórico. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. 4. Ácido clorhídrico. Volátil y puede ser fatal en caso de inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Extremadamente destructivo para las mucosas, tracto respiratorio, ojos y piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular con extrema precaución en la campana de extracción. 5. Acrilamida. Potente neurotóxico que se absorbe por la piel (con efecto acumulativo); evitar inhalar el polvo, usar guantes y mascarilla de protección cuando se pesa y preparar las soluciones en campana de extracción. En principio la poliacrilamida no es tóxica pero debe manejarse con precaución, ya que puede contener restos de acrilamida no polimerizada. 6. Ampicilina. Puede ser peligrosa por inhalación, ingestión o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. 7. Azul de bromofenol. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por 2|

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la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. Azul de Coomassie. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. Bis-acrilamida. Ver acrilamida. Bromuro de etidio. Potente mutagénico y tóxico. Evitar respirar el polvo. Utilizar guantes apropiados para pesarlo o trabajar con soluciones que contienen este colorante. Cloroformo. Altamente volátil e irritante para la piel, ojos, mucosas y tracto respiratorio. Carcinógeno y puede dañar hígado y riñones. Evitar respirar sus vapores. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y siempre manipular en la campana de extracción. Dimetilsulfóxido (DMSO). Puede ser peligroso por inhalación y absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en una campana de extracción. El DMSO es combustible. Almacenar en un contenedor bien cerrado. Apartar del calor, chispas y flamas. Etanol. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. Fenol. Extremadamente tóxico, altamente corrosivo y puede causar severas quemaduras. Puede ser peligroso por inhalación, ingestión o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en la campana de extracción. En caso de contacto con la piel, enjuagar con abundante agua y lavar con jabón y agua pero nunca con etanol. Hidróxido de sodio y soluciones que lo contienen. Altamente tóxico y cáustico. Utilizar guantes apropiados, lentes de protección y mascarilla facial. Isopropanol. Irritante y puede ser peligroso por inhalación, ingestión, o absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección. No respirar el vapor. Alejar del calor, chispas y flama. Luz UV y radiación UV. Peligrosa y puede dañar la retina de los ojos. Es mutagénica y carcinogénica. Utilizar pantalla protectora, mascarilla o lentes de protección. N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED). Extremadamente destructivo para tejidos, mucosas y tracto respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalación puede ser fatal. El contacto prolongado puede causar severa irritación y quemaduras. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en campana de extracción. Altamente inflamable, mantener lejos del calor, chispas y flamas. Persulfato de amonio. Extremadamente destructivo para tejidos, mucosas y tracto respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalación puede ser fatal. El contacto prolongado puede causar severa irritación y quemaduras. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en campana de extracción. Poliacrilamida. Ver acrilamida. SYBR Green I. Se encuentra en solución concentrada 10,000X en DMSO, el cual es una sustancia que transporta químicos a través de la piel y otros tejidos. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección. Tris. Puede ser peligroso por inhalación y absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección. Xilen-cianol. Inflamable y narcótico a altas concentraciones. Puede ser peligroso por inhalación y absorción por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de protección y manipular en una campana de extracción. Almacenar en un contenedor bien cerrado. Apartar del calor, chispas y flamas. 3|

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MANEJO DE MICROPIPETAS En biología molecular, la habilidad para medir de manera exacta y reproducible y transferir volúmenes pequeños de líquidos son críticos para obtener resultados útiles. Para los volúmenes menores de 1 ml, el método más común para medir líquidos requiere el uso de un dispositivo conocido como micropipeta. TIPOS DE MICROPIPETAS Los tipos: P1000, P200, y P20. P1000 es útil para volúmenes de 200 hasta 1000 µL P200 es útil para volúmenes de 20 hasta 200 µL. P20 es útil para volúmenes de 0.5 hasta 20 µL.

MANEJO DE LA MICROPIPETA 1. Llenado de la pipeta Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado. Oprimir el émbolo. Cuando el émbolo se presiona sentirá un punto de resistencia. Éste es el primer “alto” o "tope". Si continúa presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al segundo “alto” o "tope". Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una profundidad de 2 a 3 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final. 2.

Expulsión de la muestra Llevar la micropipeta al envase en el cuál quiere añadir el líquido. Se apoya la punta en la pared del recipiente sin evitar la salida de la muestra. Oprima el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la punta. Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones de alta viscosidad. Para solventes orgánicos o para soluciones conteniendo grandes cantidades de proteína (plasma y suero), es difícil sacar todo el líquido de la punta. En estos casos, es mejor pipetear una vez la solución expeliéndola y luego llevando hacia arriba el líquido a medir en un segundo tiempo. Para soluciones de alta viscosidad el llenado y la expulsión deben ser más lentas. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá volúmenes inexactos. La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos.

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Recuerde que el volumen y color que tiene cada una de las micropipetas en su embolo, este le dirá el tipo de punta que debe utilizar, así: a. Micropipetas azules: rango de volumen 100-1000uL, tipo de punta azul b. Micropipetas amarillas: rango de volumen 20-200uL, tipo de punta amarilla c. Micropipetas amarillas: rango de volumen 10-100uL, tipo de punta amarilla d. Micropipetas amarillas: rango de volumen 2-20uL, tipo de punta amarilla e. Micropipetas gris: rango de volumen 1-10uL, tipo de punta transparente f. Micropipetas gris: rango de volumen 0,1-2uL, tipo de punta transparente

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PRACTICA N° 2 EL DNA COMO MATERIAL GENÉTICO Durante más de 50 años muchos investigadores estuvieron interesados en explicar que sustancia era la encargada de transmitir la información genética. Esta sustancia debe ser la responsable del pasaje de los rasgos de padres a hijos. Para que una sustancia cumpla con esta función debe ser: a) lo suficiente estable para almacenar información por largos periodos, b) Capaz de replicarse en forma precisa y c) capaz de cambiar para permitir la evolución. Los últimos 5 a 10 años marcan el inicio del conocimiento público de la biología molecular. Sin embargo, el punto real de inicio ocurrió hace medio siglo cuando James D. Watson y Francis Crick propusieron una estructura para la sal del ácido desoxirribonucleico (DNA). La historia del descubrimiento del DNA –desde su aislamiento como “nucleína” a partir de vendajes manchados, hasta la elucidación de la estructura de doble hélice en 1953- es una historia interesante (Fig. 1).

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Figura 1. Tres líneas de investigación condujeron a descubrir que el DNA es el material hereditario. Hitos selectos en el estudio de la herencia y la naturaleza de los genes, estructura y función del cromosoma, y estructura del DNA desde 384 antes de Cristo hasta 1953.

A inicios de la década de los 1900s, se demostró que los cromosomas eran los transportadores de la información hereditaria. Pero también se sabía que las células eucariotas están compuestas de DNA y de proteína, y la mayoría de científicos inicialmente consideraron que las proteínas eran el material genético. Tres experimentos fueron vitales para el establecimiento del DNA como la molécula responsable de contener la información genética: • El principio transformante de Griffith • Caracterización bioquímica del principio transformante de Griffith realizado por Avery, McCarthy y Mac Leod • Prueba definitiva de que el DNA contiene información genética realizada por Hershey y Chase

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Por lo tanto, los estudiantes deberán revisar los artículos originales correspondientes a estos tres experimentos, los cuales se encuentran libres en la linea: 1. FRED. GRIFFITH (1928). The significance of pneumococcal types. Journ. of Hyg. VOLUME XXVII. 2. OSWALD T. AVERY, COLIN M. MACLEOD AND MACLYN McCARTY (1943). Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The journal of experimental medicine Vol. 79. 3. A. D. HERSHEY AND MARTHA CHASE (1952). Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage. The Journal of General Physiology CUESTIONARIO 1. ¿En qué consistió el experimento realizado por Griffith? 2. ¿A qué denominó Griffith “principio transformante”.? 3. ¿En qué consistió el experimento de Avery y colaboradores para caracterizar el principio transformante de Griffith? 4. ¿A qué conclusión llegaron Avery y colaboradores después de realizar su experimento? 5. ¿En qué consistió el experimento realizado por Hershey y Chase para demostrar que el DNA es el material genético? 6. Mencione algunas razones por las que Hershey y Chase utilizaron un bacteriófago para llevar a cabo su experimento. 7. ¿De qué manera Hershey y Chase comprobaron que las proteínas del fago T2 no pasan a la progenie? 8. Después de haber analizado los artículos originales relacionados con los tres experimentos más importantes en la dilucidación del material genético, ¿usted podría concluir que el DNA es la única molécula que funciona como material genético en los organismos vivos?. ¿Si o no?. Explique porque si o porqué no.

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PRACTICA N° 3 RECUENTO DE CELULAS OBJETIVOS  Determinar el número levaduras a través de conteo celular, haciendo uso de un hemocitómetro de Neubauer. INTRODUCCION Los métodos de determinación de la masa o del número de células que hay en una población, son fundamentales: (a) para cualquier estudio cuantitativo de la cinética de crecimiento de poblaciones celulares, (b) para la estimación precisa de los cambios físicos y químicos de las células y, (c) para la determinación de la cantidad de DNA en cada célula. Existen varias técnicas para lograr esto. Entre las de mas fácil uso están las estimaciones de la masa celular basadas en el peso fresco total (es decir, el peso húmedo) o el peso seco de la muestra y la estimación del número de células a partir de la medición de la turbidez relativa de una suspensión celular. Sin embargo, estos métodos carecen de la precisión requerida para los estudios cuantitativos. Con mayor frecuencia, el número preciso de células presentes en la muestra se determina mediante la observación óptica directa de una alícuota de la suspensión celular obtenida del cultivo mediante “conteo” utilizando la cámara Neubauer o por “citometría de flujo”. Aunque estos dos últimos métodos son mucho mas precisos que lo métodos de determinación del peso o de la turbidez, requieren que todas las células se encuentren separadas y por lo tanto, no pueden aplicarse directamente a los tejidos. En Biología Molecular, el recuento de células es muy importante pues permite determinar el número de células de una muestra de trabajo. La técnica es un conteo celular que se hace en el microscopio y es basada en la técnica en fresco. Para ello, se utiliza la cámara Neubauer (hemocitómetro) (Figura 1).

Figura 1. Cámara de Neubauer

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El hemocitómetro es un portaobjetos especializado en el cual una retícula es grabada con láser. Su construcción permite conocer el volumen de cualquier líquido colocado sobre él y por debajo de su cubreobjetos. La retícula se encuentra compuesta por nueve cuadros de 1 mm2 cada uno (cuadro azul en la figura inferior). Los cuatro cuadros de 1 mm2 localizados en cada esquina poseen a su vez 16 cuadros de 0.0625 mm2. El cuadro central (también de 1 mm2) se encuentra compuesto por 25 cuadros de 0.04 mm2 (en verde). Estos cuadros a su vez se encuentran compuestos por cuadros menores de tan solo 0.0025 mm2 (en negro). Dada la profundidad de la cámara de tan solo 0.1 mm, cada una de estas unidades corresponde a volúmenes fijos conocidos, según se ilustra en la figura 2.

Figura 2. Cuadrícula, dimensión y volumen de la cámara de Neubauer

MATERIAL Y REACTIVOS  Suspensión de células de levadura  Cámara de Neubauer  Micropipetas  Puntas para micropipeta  Pipetas Pasteur  Minicentrífuga  Buffer fosfato de pH 7.4  Hielo PROCEDIMIENTO 1. En un tubo eppendorf, disolver 50 l de suspensión concentrada de células de levadura (Saccharomyces cerevisiae) con 800 l de buffer fosfato. Mezclar, pipeteando 5 veces. 2. Centrifugar por 5 minutos a 5,000 r.p.m. 3. Decantar el sobrenadante por inversión del tubo 4. Resuspender las levaduras en 100 l de buffer fosfato de pH 7.4 5. Mezclar la suspensión, a través de pipeteo suave (por 10 veces), para lograr una completa separación de las células. 6. Coloque el objetivo 20x en el trayecto óptico del microscopio en campo iluminado. 7. Coloque 10 µl de la suspensión celular en cada cámara del hemocitómetro (Figura 3) 8. Coloque el hemocitómetro en el microscopio y localice la retícula grabada (Figura 4). 9. Deje que las células se asienten durante 1-2 minutos y proceda al conteo.

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10. La cuenta celular para cada cuadrante externo (cuadros 4x4, figura 4A; uno de los cuales es ampliado en la figura 4B). deberá oscilar entre 20-50 células, teniendo un total de células para los cuatro cuadrantes 4x4 de 80-200 células. Las células localizadas en los márgenes externos de cada esquina (marcados en rojo) NO deberán ser incluidas en las cuentas. 11. Cuando existe una densidad celular mayor a 50 células por cuadrante 4x4, se procederá al conteo el cuadrante central. Pueden contarse las células de todos los cuadros secundarios, o si se prefiere, los 4 cuados secundarios de las esquinas y el central.

CÁLCULO Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original (aquella de la cual se tomó la alícuota cuando se han utilizado los cuatro cuadros de 4x4 (azules) del hemocitómetro: Concentración = N° de célula contadas ÷ 4 × factor de dilución × 10,000 Para calcular la concentración celular presente en la suspensión celular original (aquella de la cual se tomó la alícuota cuando se han utilizado el cuadro central de 5x5 (verde) del hemocitómetro (Nota: normalmente empleado cuando la cuenta total lograda por el método anterior es superior a 200): Concentración = N° de célula contadas ÷ 100 × factor de dilución × 10,000. Para calcular el total de células presentes en la suspensión original de la cual se tomó la alícuota: Células totales = concentración celular × volumen total de muestra original

CUESTIONARIO 1. Calcule el número de células de levadura que hay en 10 ml de una suspensión, si en el recuento encontramos 50 células por mm2.

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2. En base a los resultados obtenidos en la práctica realice los cálculos para preparar 500 l de una suspensión que contenga 1000 células por ml. 3. Además de la cámara de Neubauer para el recuento de células, diga que otros métodos se pueden utilizar para determinar el número de células de una muestra problema. 4. Describa el procedimiento del método de la citometría de flujo para el conteo de células. BIBLIOGRAFÍA Standard Operating Procedures (SOPs). Conteo celular y evaluación de viabilidad. Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Facultad de Medicina UASLP. 2013.

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PRACTICA N° 4 VIABILIDAD CELULAR

INTRODUCCIÓN La determinación de la viabilidad celular es importante en los ensayos de citotoxicidad. Los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular. La toxicidad en tejidos y células se define como una alteración de las funciones celulares básicas por efectos tóxicos de drogas y compuestos químicos. A través de estímulos las células pierden su equilibrio homeostático, que puede causar su adaptación o sufrir un proceso regresivo o morir (Figura 1). En los últimos años se están empezando a conocer los factores determinantes de la toxicidad en tejidos y células.

Figura 1. Esquema de la supervivencia celular. La célula recibe estímulos nocivos que de ser controlados se adapta, llevando a cabo diversos mecanismos metabólicos o tróficos que le pueden permitir regresar a su condición basal en un proceso homeostático

La supervivencia celular es dependiente de la capacidad del organismo en sustituir las células lesionadas o muertas o reparar los tejidos. A partir de un estímulo o lesión se ejercen respuestas celulares, que son adaptación, degeneración o muerte celular. La adaptación puede tener un carácter fisiológico si el estímulo agresor es moderado. Las adaptaciones patológicas pueden tener mecanismos adaptativos propiciando que la célula module su medio ambiente y se adapte, escapando de las agresiones siendo definido como un cambio morfológico resultante de una lesión no mortal de la célula. Entre las pruebas de citotoxicidad in vitro, se puede analizar el comportamiento de las células en un ambiente controlado, siendo posible evaluar: la inhibición del crecimiento celular; la permeabilidad de membrana, la replicación y la transcripción del ácido

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ribonucleico, la síntesis de proteínas, hormonas y enzimas, el metabolismo energético, la transformación celular, la mutagénesis y la carcinogénesis, entre otros. La citotoxicidad puede ser definida como la capacidad que poseen ciertos compuestos de producir una alteración de las funciones celulares básicas que conlleva a un daño que puede ser detectado. Para la cuantificación de la citotoxicidad es necesaria la implementación de diferentes tipos de ensayos que se encuentran descritos empleando diversos métodos y estrategias para realizarlos. Entre los métodos para cuantificar la citotoxicidad de un compuesto se cuenta con los que miden actividad metabólica celular y por los que se basan en el principio de exclusión celular. Ensayos que miden la actividad metabólica utilizan enzimas Estos métodos para determinar la citotoxicidad de un compuesto incluyen: a) contacto de células vivas en medio de cultivo y expuestas a cantidades conocidas de los compuestos a ser analizados; b) incubación de las células en diferentes intervalos de tiempos; c) un colorante que tenga un estado oxidado, un agente transferidor de electrones, un sustrato para la enzima citoplasmática, un cofactor para la enzima citoplasmática; d) la enzima citoplasmática liberada de las células muertas a través de la cual se determina la citotoxicidad del compuesto a analizar. Un buen ejemplo es la enzima lactato deshidrogenasa la cual es empleada en un ensayo de citotoxicidad de amplio espectro. Esta enzima está presente normalmente en el citoplasma de las células vivas y se libera en el medio de cultivo celular al permeabilizarse la membrana de las células muertas o en vías de hacerlo, que se han visto afectadas por un agente tóxico. Otro método que se basa en la reducción metabólica es a través del uso del bromuro de 3-(4,5-dimetiltizol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa. Es un compuesto coloreado de color azul conocido como formazán, permitiendo determinar la funcionalidad mitocondrial de las células tratadas. Este método ha sido muy utilizado para medir supervivencia y proliferación celular. La cantidad de células vivas es proporcional a la cantidad de formazán producido útil en ensayos de proliferación y citotoxicidad de células eucariotas. Ensayos basados en el principio de exclusión celular Estos utilizan sustancias capaces de atravesar la membrana plasmática y teñir las células. Durante el conteo celular se pueden distinguir las células vivas de aquellas que no lo están, de manera que las células vivas presentan la capacidad de excluir el colorante activamente de sus citoplasmas. Existen descritos en la literatura varios reactivos como por ejemplo Rojo Neutro, Violeta de Genciana, Azul de Metileno y Azul de Tripano. En el caso del rojo neutro es captado por las células, muy específicamente por los lisosomas y endosomas, y en la medida que la célula pierda viabilidad por la acción del compuesto que se analiza se libera al medio el colorante, solamente las células viables son capaces de retener el colorante en su interior. Se mide seguidamente la cantidad de rojo neutro que permanece dentro de la célula. La exclusión del azul de tripán es la prueba más común para la viabilidad celular pero puede ser inadecuada en la identificación de las células muertas. Las células deben ser contadas dentro de 3 – 10 minutos debido a que el número de células teñidas de azul incrementa con el tiempo después de la adición del colorante. El azul de tripán es ampliamente usado para teñir células muertas. En este método, la viabilidad celular debe ser determinada contando las células no teñidas con un microscopio u otros instrumentos.

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Sin embargo, la tinción con azul de tripán no puede ser usada para distinguir entre las células sanas y las células que están vivas pero que han perdido sus funciones celulares. PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO Nº 1. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD MEDIANTE LA PRUEBA DE EXCLUSIÓN DEL AZUL DE TRIPÁN OBJETIVO  Determinar la concentración de células (células/ml), el porcentaje de células vivas y de células muertas, y el número total de células en una suspensión celular. FUNDAMENTO La prueba de exclusión del colorante se usa para determinar el número de células viables presentes en una suspensión celular. Se basa en el principio de que las células vivas poseen membranas celulares intactas que excluye ciertos colorantes, tales como azul de tripán, Eosina, o bromuro de propidio, mientras que las células muertas no. En esta práctica, simplemente se mezcla una suspensión celular con el colorante y luego se examina visualmente para determinar si las células toman o excluyen el colorante. Según este protocolo, una célula viable tendrá un citoplasma claro mientras que una célula no viable tendrá un citoplasma azul. El azul de tripán es un colorante vital. La reactividad del azul de tripán se basa en el hecho de que el cromóforo está cargado negativamente y no interacciona con la célula a menos que la membrana esté dañada. Por ello, todas las células que excluyen el colorante son viables. Debido a que el hemocitómetro tiene un volumen exacto por debajo del cubreobjetos, se puede determinar la concentración (células/ ml) de células vivas y muertas en la cámara. La concentración de la suspensión original de células será la misma que la de la cámara –excepto si se realiza alguna dilución. Las células muertas absorben el colorante, azul de tripán, y aparecen azules bajo el microscopio. Las células vivas excluyen el azul de tripán, y aparecen incoloras. De este modo, se puede calcular el porcentaje de células viables. MATERIALES Microscopio Micropipeta de 1-20 µl Micropipeta de 1-200 µl Hemocitómetro Guantes quirúrgicos Placas estériles de 96 pozos Puntas para pipetas, 10-200 µl Colorante azul de tripán al 0.4% en PBS PROCEDIMIENTO 1. Prepare un hemocitómetro limpio con su cubre-objetos. 2. Anote el volumen de la suspensión celular en mililitros. 15 |

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Mezcle la suspensión celular completamente con una pipeta serológica. Transfiera 100 µl de la suspensión celular en el pozo de una placa de 96 pozos. Añada 100 µl de azul de Tripán al 0.4% (w/v) a la muestra de células. Mezcle, completamente, las células y la solución de azul de Tripán usando una micropipeta, calibrada para 100 l, absorbiendo y eliminando el contenido por cinco veces. Esta es una dilución de 1:2 de las células. Transfiera 20 µl de la mezcla celular a una o a ambas cámaras del hemocitómetro usando una micropipeta. Permita el llenado de la cámara por acción capilar. No llene más ni menos de lo que requiere la cámara. Usando el objetivo de 10X, enfoque sobre las rejillas de la cámara. Cuente las células viables (no azules) y las células no viables (azules) en los cuatro cuadrados de las esquinas de una cámara. Las células que caen sobre las líneas solo serán contadas si están sobre la línea superior y sobre la línea de la mano izquierda de cada cuadrado de las esquinas (Figura 2). Si el número de células en uno de los cuadrados es mucho mayor de 50, tome una nueva muestra de 0.1 ml de la suspensión celular y añada 0.9 ml de azul de tripán. Esta es una dilución de 1:10 de las células. Si el número de células por cuadrado es muy bajo (menor de 5) entonces, la suspensión original deberá ser re-suspendida en un volumen más pequeño.

Figura 2. Diagrama que indica los cuadrantes (A, B, C y D) de la cámara del hemocitómetro en donde se debe contar las células. Diagrama que indica las células que deben ser contadas

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Determine la densidad de células viables de la mezcla original de acuerdo a la siguiente fórmula:

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ó

*Cuando se añade un volumen igual de azul de tripán, siempre se hace una dilución de 2. Diluciones adicionales se realizan cuando el número de células en uno de los cuadrados es mucho mayor de 50.

Ejemplo Célula Viable No viable

N° de células en cada cuadrado 28 30 26 29 1 3 2 0

Total 113 6

Determinar:

28 x 2 x 10,000 = 560,000 = 5.6x105 cells/ml ↑ Dilución hecha en azul de tripán

Células totales = 5.6 x 105 cells/ml x 5 ml = 2.8 x106 cells/ml Nota: células en total de los 5 ml cuando fueron contadas

EXPERIMENTO Nº 2. CONTEO DE CÉLULAS Y DETERMINACIÓN DE LA VIABILIDAD MEDIANTE LA PRUEBA DE EXCLUSIÓN DEL AZUL DE METILENO OBJETIVO  Determinar la presencia de células vivas y muertas en levaduras a través de conteo celular, utilizando una técnica ligeramente modificada.

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FUNDAMENTO La viabilidad es el porcentaje de células vivas que existe en relación al total de células. Su importancia radica en que nos brinda una idea de la eficiencia de la levadura para fermentar. La técnica es un conteo celular que se hace en el microscopio y es basada en la técnica en fresco. Como se utiliza azul de metileno, se trata de una técnica ligeramente modificada, es decir, se emplea colorante. En la industria, se pesa la levadura, los milímetros a utilizar y así se puede brindar un dato porcentual de las células vivas. Allí, este ensayo es una técnica operativa porque emite resultados al instante. Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES). Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se verán azules). MATERIALES Microscopio Micropipeta de 1-20 µl Micropipeta de 1-200 µl Hemocitómetro Guantes quirúrgicos Placas estériles de 96 pozos Puntas para pipetas, 10-200 µl Colorante azul de metileno (Disolver 0.01g de azul de metileno en 10 ml de agua destilada estéril. Agregar 2g de citrato de sodio dihidratado y agitar hasta disolución. Filtrar con papel filtro y llevar el volumen filtrado a 100 ml con agua destilada estéril). PROCEDIMIENTO 1. Transfiera 100 µl de la suspensión celular en el pozo de una placa de 96 pozos. 2. Añada 100 µl de azul de metileno a la muestra de células. 3. Mezcle usando una micropipeta, calibrada para 100 l, absorbiendo y eliminando el contenido por cinco veces. Esta es una dilución de 1:2 de las células. 4. Transfiera 20 µl de la mezcla celular a una o a ambas cámaras del hemocitómetro usando una micropipeta. Permita el llenado de la cámara por acción capilar. No llene más ni menos de lo que requiere la cámara. 5. Usando el objetivo de 10X, enfoque sobre las rejillas de la cámara. Cuente las células viables (no absorben el colorante, se verán transparentes) y las células no viables (absorben el colorante y se verán azules) en los cuatro cuadrados de las esquinas de una cámara (para el recuento seguir el diagrama del experimento 1). 6. Determine el % de viabilidad, número de células/ml y recuento total de células (para realizar los cálculos proceda igual que el experimento anterior). CUESTIONARIO 1. Cuál es el fundamento de la prueba de exclusión del azul de tripán?. 2. Qué problemas presenta el análisis de viabilidad celular utilizando la prueba de exclusión del azul de tripán? 3. Investigue que otros métodos se pueden utilizar para determinar viabilidad celular.

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BIBLIOGRAFÍA Standard Operating Procedures (SOPs). Conteo celular y evaluación de viabilidad. Laboratorio de Genómica Viral y Humana. Facultad de Medicina UASLP. 2013.

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PRACTICA N° 5 REPLICACIÓN DEL DNA OBJETIVOS: 1. Identificar algunas características del proceso de replicación del DNA en procariotas 2. Conocer algunas técnicas empleadas para la identificación de tamaño de fragmentos de DNA 3. Analizar y explicar algunas peculiaridades del proceso de replicación del DNA INTRODUCCIÓN El modelo de la doble hélice del DNA descrito por Watson y Crick en 1953, sugirió los posibles modelos acerca del proceso de su replicación. Por ello, entre 1956 y 1960 diversos laboratorios del mundo trabajaron para dilucidar dicho proceso. Así, en 1957 se informó que el proceso de replicación es de tipo semi-conservativo y en 1958, se descubrió la DNA polimerasa de E. coli. En 1972, Okazaki realizó diversos experimentos que le permitieron sugerir que la replicación se lleva a cabo en forma discontinua. Hoy se sabe que una de las hebras del molde se replica en forma discontinua y la otra en forma continua; es decir la replicación del DNA es semi-discontinua (Fig. 1).

Figura 1. Esquema para la operación de las enzimas en una de las horquillas durante la replicación bidireccional de un cromosoma de E. coli o de un plásmido (oriC) que utiliza el origen único del cromosoma de dicha bacteria. La replicación es continua para una hebra (hebra guía) y discontinua para la otra (hebra rezagada).

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Los experimentos que se relatan a continuación permitieron comprobar la sugerencia de Okazaki y deducir que se requiere de un primer de RNA para que se inicie la síntesis de los llamados fragmentos de Okazaki, o que en los primeros momentos de la síntesis del DNA de E. coli, los fragmentos de Okazaki tenían una porción de DNA y otra de RNA. Se trabajó con células de E. coli. Debido a que los fragmentos de Okazaki se producen en los primeros momentos del proceso de replicación, era preciso trabajar en tiempos muy cortos, al inicio del proceso. Además, se tuvo que marcar radiactivamente dichos fragmentos para facilitar su identificación, para lo cual se utilizó Timidina-3H. Hoy se sabe en forma precisa que, en una célula bien nutrida de E. coli, el DNA se sintetiza a una velocidad de 850 nucleótidos por segundo a 37°C, lo cual variar muy ligeramente, según la raza bacteriana usada. El único cromosoma de E. coli tiene un tamaño de 4000 kb, con una longitud de 1.4 mm, y es un DNA circular de doble hebra. Además, se sabe que el proceso de replicación se inicia en un solo sito del cromosoma (OriC) y que a partir de allí el DNA se sintetiza en ambos sentidos y que por lo tanto se forman dos horquillas de replicación (bidireccional). A continuación, se indican (Tabla 1) algunas características importantes del proceso de replicación en E. coli en comparación con lo que ocurre en las células humanas. Tabla 1. Parámetros cuantitativos del proceso de replicación del DNA en E. coli y en células humanas. Característica Número de pb del DNA por célula Tasa de replicación de la horquilla (µm/min) Tasa de replicación de la horquilla (nt/segundo) Número de orígenes de replicación por célula Horas requeridas para completar la replicación del genoma Horas requeridas para una completa división celular

E. coli 3.9 x 30 850 1 0.67 0.33

106

Cél. humanas Aprox. 109 3 60 – 90 103 - 104 8 24

De acuerdo con las características indicadas, se requieren unos 40 minutos para completar la replicación del cromosoma total de E.coli. Considerando esto, en un experimento se decidió determinar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos a los 30 segundos de incubación con timidina-3H y a los 5 minutos después de agregar dicha sustancia marcada. Se trató de utilizar células bacterianas que estaban coordinadas en su ciclo de división celular, de modo que estaban sincronizadas para que inicien su proceso de replicación celular. Para analizar el tamaño de los fragmentos de DNA obtenidos se empleó electroforesis de DNA en agarosa y la ubicación de dichos fragmentos en el gel se detectó por auto-radiografía, pues al estar marcados radiactivamente dichos fragmentos pueden impresionar una placa radiográfica y ocasionar bandas cuyo tamaño en kb puede ser medido. PROCEDIMIENTO 1. Un cultivo de células de E. coli que estaban sincronizadas en su división celular fueron incubadas a 37°C con timidina-3H. A los 30 segundos y a los 5 minutos después del agregado de timidina tritiada, se tomaron alícuotas de células para el aislamiento del DNA. 21 |

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2. El proceso de aislamiento del cromosoma bacteriano consiste en suspenderé las células bacterianas en buffer que contiene sacarosa al 8%, tritón X-100 al 5%, Tris-HCl 50 mM de pH 8.0 y EDTA 50 mM. Se añade lisozima 10 mg/ml y se deja en reposo por 30 segundos. Se calienta por 45 segundos en baño maría hirviente, se enfría y se centrifuga en minicentrífuga por 10 minutos. Se observa un precipitado que es el DNA bacteriano. Con un palillo de dientes se lo recoge y resuspende en un buffer parecido al indicado anteriormente, se agrega isopropanol y se deja 20 minutos a -70°C. Se centrifuga en una minicentrífuga por 10 minutos y en el fondo del tubo tenemos el DNA bacteriano más puro. Se decanta, y resuspende el DNA en Tris-HCl 0.01 M que contiene NaOH 0.1M. La preparación está lista para su examen en una electroforesis en gel de agarosa. 3. Para la electroforesis se usó un gel de agarosa al 0.9%, disuelta en buffer Tris-acetato : EDTA y contenía además NaOH 0.1M. Como marcador de tamaño de los fragmentos de DNA se usó el fago lambda tratado con la enzima de restricción Hind III. Dicho fago tiene 48.6 kb, y cuando es cortado con la enzima Hind III se obtienen fragmentos de 23.6, 9.6, 6.5, 4.3, 2.2, 2.0 y 0.5 kb. En este caso, el fago lambda está marcado radiactivamente y luego de ser cortado con la enzima también se le resuspende en una solución que contenga NaOH 0.1 M.

RESULTADOS A continuación se presentan los resultados obtenidos bajo las condiciones señaladas. La figura muestra el esquema de una autoradiografía, después de la corrida electroforética

Las muestras corridas en la electroforesis son las siguientes:

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Carril 1: Patrón de fragmentos del fago lambda marcado radiactivamente y tratado con Hind III. Carril 2: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H. Carril 3: DNa de E. coli extraído 5 minutos después de incubada con timidina-3H. Carril 4: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H t tratada con fosfodiesterasa de serpiente. Carril 5: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina-3H y tratada con fosfodiesterasa de bazo. Carril 6: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con timidina tritiada y actinomicina D. Carril 7: DNA de E. coli extraído 30 segundos después de incubada con uridina-3H en lugar de timidina tritiada.

CUESTIONARIO 1. En papel semi-logarítmico realizar una gráfica, colocando en el eje Y los tamaños de los fragmentos del patrón fago lambda tratado con Hind III y en el eje X la distancia recorrida por cada fragmento. 2. Utilizando la gráfica, determine el tamaño (en kb) de los fragmentos de DNA que se observan en los carriles 2 – 7. 3. Cuál es la razón de tratar el DNA obtenido en cada paso con NaOH 0.1M. 4. Qué le indica el resultado obtenido en el carril 2. 5. ¿Qué le indica el resultado obtenido en el carril 3? ¿Podría Ud. Sugerir cual fragmento es el que corresponde a la cadena líder? 6. ¿Porque el tratamiento con la fosfodiesterasa del veneno de serpiente no afecta el resultado obtenido? 7. ¿Por qué el tratamiento con fosfodiesterasa de bazo disminuye el tamaño del fragmento más pequeño que se observa en el carril 5 y no el de los más grandes? 8. ¿Con la actinomicina D no se obtienen fragmentos de DNA ¿Qué le indica eso? 9. Uridina-3H, después de 30 segundos solo marca los fragmentos más pequeños, ¿por qué? ¿Qué le indica el hecho de que tales fragmentos se marquen con uridina? 10. Considerando el tamaño del genoma de E. coli (1.4 mm) y la velocidad de replicación en µm/minuto de la Tabla 1, ¿cuánto tiempo demora la replicación total del genoma de E. coli? Haga el cálculo en minutos. 11. Considerando los datos de Tabla 1, la velocidad de replicación de la horquilla (nucleótidos/segundo) y el número de pares de bases (pb) del genoma de E. coli. ¿Cuántos minutos demora la replicación del genoma de E. coli? 12. Si se usara un inhibidor de la DNA girasa, tal como el ácido nalidíxico, ¿Se obtendrá marcación con timidina tritiada? ¿Por qué? Y ¿qué pasará con uridina tritiada?

PROBLEMAS 1. La secuencia de nucleótidos de una cadena de DNA de una doble hélice es 5’GGATTTTTGTCCACAATCA-3’. ¿Cuál es la secuencia de la cadena complementaria? 2. El fragmento de DNA de la Figura 5.1 tiene una doble cadena en cada extremo, pero una cadena sencilla en el centro. Se indica la polaridad de la cadena superior. ¿El fosfato (PO4-) que se muestra en la cadena inferior está en el extremo 5’ o en el 3’ del fragmento al cual está unido?

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Figura 5.1. Fragmento de DNA con un hueco de cadena sencilla en la cadena inferior

3.

Mire cuidadosamente las estructuras de las moléculas que aparecen en la Figura 5-2. A. ¿Qué esperaría que pasara si la dideoxicitidina trifosfato (ddCTP) se añadiera a una reacción de replicación del DNA en exceso por encima de la concentración de deoxicitidina trifosfato (dCTP)?¿Se incorporaría en el DNA? Si así fuera, ¿Qué sucedería después? Razone la respuesta. B. ¿Qué pasaría si se añadiera ddCTP a un 10% de la concentración de dCTP?. C. ¿Qué efectos esperaría si se añadiera dideoxicitidina monofosfato (ddCMP) a la reacción de replicación del DNA en exceso o a un 10% de la concentración de dCTP?

Figura 5-2. Sustratos de replicación potenciales. (A) Dideoxicitidina trifosfato (ddCTP). (B) Dideoxicitidina monofosfato (ddCMP).

4.

¿De qué forma esperaría que afectara la pérdida de la actividad exonucleasa correctora de pruebas 3’ a 5’ de la DNA polimerasa a la fidelidad de la síntesis de DNA en E. coli? ¿De qué forma afectaría su pérdida a la velocidad de síntesis del DNA? Razone su respuesta.

5.

Ha descubierto un nuevo organismo que crece en las profundidades oceánicas en un ambiente hostil de corrientes hidrotermales. Al caracterizar su replicación, descubre para su sorpresa que replica las dos cadenas de forma continuada utilizando dos DNA polimerasas: una que sintetiza el DNA en el sentido 5’ a 3’ habitual y una segunda que sintetiza el DNA en el sentido 3’ a 5’. Ambas polimerasas utilizan los nucleótidos 5’-trifosfato estándar para añadir nucleótidos a las cadenas de DNA en crecimiento. Está sorprendido en encontrar que ambas cadenas de DNA recién sintetizadas estén hechas con el mismo grado elevado de fidelidad que caracteriza la síntesis de DNA en E. coli. A. Describa brevemente los cuatro procesos que contribuyen a la gran fidelidad de la replicación del DNA en E. coli. B. Explique porqué es sorprendente que ambas cadenas de este nuevo organismo se replique con gran fidelidad. C. Sugiera al menos dos vías por las que se puede conseguir esta gran fidelidad. Si necesita inventar enzimas adicionales que realicen funciones específicas, describa sus actividades. 24 |

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6.

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Muchos orígenes de replicación de los embriones tempranos de Drosophila están activos, de manera que se pueden observar varios en una sola electromicrografía, como se muestra en la Figura 5-3.

Figura 5-3. Electromicrografía en la que se muestran cuatro burbujas de replicación en un cromosoma de un embrión temprano de Drosophila.

a.

b.

7.

Identifique las cuatro burbujas de replicación en la Figura 5-3. Indique las localizaciones aproximadas de los orígenes en los que empezó cada burbuja y numere las horquillas de replicación de la 1 a la 8 y de izquierda a derecha. ¿Cuánto cree que tardaran las horquillas 4 y 5 en encontrarse?¿Y las horquillas 7 y 8? La distancia entre nucleótidos en el DNA es de 0.34 nm, y las horquillas de replicación eucariotas se desplazan a una velocidad de unos 50 nucleótidos/segundo. Para este ejercicio no tenga en cuenta los nucleosomas que son evidentes en la Figura 5-3 y considere que el DNA está completamente extendido. Suponiendo que no hay restricciones de tiempo en la replicación del genoma de una célula humana, ¿Cuál sería el número mínimo de orígenes de replicación que se necesitarían?. Si la replicación tuviera que llevarse a cabo en una fase S que durara 8 horas y las horquillas de replicación se desplazaran a una velocidad de 50 nucleótidos/segundo, ¿Cuál sería ahora el número mínimo de orígenes de replicación necesarios para replicar el genoma humano? (Tener en cuenta que el genoma humano consta de un total de 6.4 x 109 nucleótidos en 46 cromosomas.)

BIBLIOGRAFIA 1. Alberts B., Johnson A., Lewis J. Raff M., Roberts K., Walter P. (2002) Molecular Biology of the Cell. Garland Science. 2. Brown T.A. (2008) Genomas. Ed. Panamericana 3. Devlin T.M. (2005). Biochemnistry 4. Lewin, B. (2008) Genes IX. Jones and Bartlet Publishers. 5. Nelson D.L. and Cox, M.M. (2009) Lehninger Principles of Biochemistry. Ed. Woth Publishers

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PRACTICA Nº 6 EXTRACCIÓN DE DNA INTRODUCCIÓN Uno de los procedimientos básicos en biología molecular es la purificación y extracción de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso para posteriores análisis. Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA. En general, todos tienen el mismo principio; es decir, empiezan con una forma de lisis celular seguido por una remoción de proteínas y por último la obtención de DNA de alta pureza por precipitación etanólica. Las variaciones que presentan los diferentes métodos dependen del tipo de célula con la que se trabaja. En muchos casos, la liberación de DNA puede ser fácil, cuando se trabaja con virus y con algunas bacterias como Mycoplasma y E. coli; sin embargo, resulta más complicada con ciertos organismos como el Mycobacterium tuberculosis, debido a sus características particulares de la membrana celular. PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN COLECTA DE LA MUESTRA La colecta de la muestra y su manejo adecuados son indispensables para una extracción del ADN exitosa. En la tabla 1 se dan algunas recomendaciones importantes sobre la colecta y el manejo de tejidos vegetales y animales. Tabla 1. Recomendaciones sobre la colecta y manejo de algunos tejidos de plantas y animales ORGANISMO

Plantas

Animales

COLECTA EN CAMPO/ TRANSPORTE DE LA MUESTRA En el caso de tejido foliar, se recomienda colectar tejido joven pues contiene más células por unidad de peso que el tejido viejo y posee menos polisacáridos y polifenoles que dificultan la extracción. Una vez colectado, el tejido debe congelarse inmediatamente en nitrógeno líquido para evitar la formación de cristales y que se sinteticen metabolitos secundarios después de la abscisión. Si el tejido es obtenido de invernaderos o cultivo in vitro, no es necesario congelar el material, se puede hacer la extracción directamente. Tejido Cortar el tejido en pedazos pequeños (aproximadamente 0.5 x

ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA PREVIO A LA EXTRACCIÓN

Almacenar el tejido a -80 °C y evitar ciclos de congelación y descongelación antes de proceder con la extracción. Se recomienda congelar varios paquetes pequeños de la misma muestra con la cantidad de material que será procesada. Alternativamente, el tejido puede ser lioflizado y almacenado a temperatura ambiente entre 15 y 25 °C, aunque esta alternativa no es viable para suculentas.

Las muestras deben almacenarse de acuerdo al método de colecta utilizado, en etanol a 4 °C o si fue congelado con

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MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 0.5 cm o menores) para facilitar su maceración posterior. El tejido se puede deshidratar con etanol al 70 % (aunque esta opción puede degradar el ADN o acarrear contaminantes) o bien, congelarse con nitrógeno líquido. Para transportar la muestra es recomendable utilizar un buffer especializado que inactive las endonucleasas, por ejemplo, el RNAlater (Ambion®). Otra opción es homogenizar el tejido en buffer de lisis que contenga sales de guanidina o ß-mercaptoetanol que inhiben DNasas y RNasas. Sangre Utilizar agujas de calibre apropia do, respetar la relación muestra/ anticoagulante y homogeneizar correctamente la muestra para evitar la hemólisis y/o coagulación, y la contaminación bacteriana. Una vez obtenida la muestra es importante evitar movimientos bruscos durante el transporte.

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nitrógeno líquido a -80 °C

Las muestras pueden mantener se por unos días a 4 ºC después de su colecta. Si se congela la muestra a -20 °C, debe descongelarse a temperatura ambiente y procesarse en su totalidad pues una vez descongelada, inicia la hemólisis, por ello es aconsejable hacer alícuotas.

HOMOGENIZACIÓN DEL TEJIDO La homogenización, mecánica o química, consiste en romper las uniones entre las células para facilitar la interacción con las soluciones de lisis que ayudan a liberar el material genético 1. Homogeneización Mecánica Nitrógeno líquido. Este procedimiento consiste en macerar la muestra con nitrógeno líquido, en un mortero de porcelana, hasta obtener un polvo muy fino. El nitrógeno líquido, congela de inmediato la muestra y evita que se formen cristales en el interior de la célula que rompen la estructura celular e inicie el proceso de degradación. Este procedimiento, se puede utilizar en tejido fresco o congelado, por ejemplo semillas, plántulas, tejidos fibrosos o viscosos y hongos. Es importante considerar que, si la muestra ya está congelada, se deberá disgregar con nitrógeno líquido para evitar la degradación del DNA por acción de las DNasas. Pistilos u homogeneizadores. Los pistilos disgregan la muestra mediante fricción con la pared del tubo que contiene la muestra, adicionalmente se puede utilizar algún material abrasivo como vidrio pulverizado o resinas. El proceso se realiza manualmente, con pistilos plásticos o con ayuda de dispositivos electrónicos, conocidos como homogenizadores. Es recomendable adicionar un poco del buffer de lisis antes de iniciar, estas soluciones desnaturalizan a las proteínas y mantienen estable al DNA. Cuando se utilizan dispositivos es necesario colocar el tubo sobre una cama de hielo, lo cual evita que el DNA se fragmente por el calor que genera la fricción. El uso de pistilos u homogenizadores se recomienda en general para muestras pequeñas y tejidos blandos, aunque también se usa para tejidos no fibrosos como hojas jóvenes o flores. No es recomendable utilizar este método con tejidos congelados, porque las células del interior del tejido se descongelan antes de entrar en contacto con la solución de lisis y el DNA se 27 |

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fragmenta por acción de las DNasas. En este caso se recomienda que el tejido se disgregue en presencia de nitrógeno líquido. Alternativamente se pueden utilizar el buffers comerciales como RNALater® ICE (Ambion®). La muestra se sumerge en el reactivo y se mantiene a -20°C toda la noche, posteriormente se puede descongelar la muestra y macerar sin requerir nitrógeno líquido 2.

Homogeneización química En la homogenización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en solución a altas temperaturas en presencia de detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso pueden perforar la membrana celular. La disgregación química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas de tejidos frescos o sangre. En tejidos fibrosos es recomendable cortar en fragmentos pequeños para favorecer su disgregación. Antes de iniciar la homogeneización es necesario contar con información sobre la cantidad apropiada de tejido que debe utilizarse pues una disgregación rápida y completa es esencial para asegurar la obtención de DNA y evitar su degradación. Si se excede la cantidad recomendada se puede sobresaturar el sistema, con lo que se afecta el rendimiento y aumentan las impurezas del extracto, de manera que es aconsejable realizar experimentos preliminares con distintas cantidades de material inicial para determinar cuál es la cantidad apropiada, en particular en los sistemas de extracción tradicionales. Por ejemplo, en el caso de tejido vegetal, el material liofilizado contiene mayor cantidad de células, por lo que se recomienda utilizar solo el 50% de peso fresco. Si el tejido contiene una alta cantidad de polisacáridos o polifenoles, se inicia con el 25% del peso. Sin embargo, si la especie tiene un genoma pequeño es posible incrementar la cantidad hasta un 50%. En el caso de tejido animal, aunque el peso o la cantidad inicial sea la misma el rendimiento puede variar significativamente entre tejidos. En la tabla 2 se muestra la cantidad de tejido recomendada y el rendimiento esperado cuando la extracción se lleva a cabo utilizando combos de extracción comercial. Tabla 2. Tipo de tejido, cantidad de muestra y rendimiento esperado de ADN, usando combo de extracción comercial MATERIAL Células de E. coli Células HeLa Células 293F Sangre de humano Cola de ratón Cerebro de ratón Hígado de ratón Baso de ratón Espinaca Arabidopsis thaliana Alfalfa Girasol Hongo Soya Trigo Maíz Jitomate

CANTIDAD

RENDIMIENTO DE DNA (μg)

2 x 109 5 x 106 5 x 106 200 ul 1 a 1.2 cm 25 mg 25 mg 10 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg

10-30 20-40 15-30 3-10 5-25 10-30 10-30 10-40 2.0 - 2.5 1.8 - 3.1 2.1 - 3.0 1.6 - 4.0 1.1 - 1.4 0.3 - 2.0 9.2 - 14.6 4.4 - 6.6 1.0 - 2.3

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LISIS CELULAR Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. Entre los métodos de lisis celular más utilizados están: a) Detergentes. Los detergentes aniónicos se utilizan básicamente para extraer DNA de parásitos, células en cultivo y tejido, siendo el dodecil sulfato de amonio (SDS), Nonidet-P40 (NP40) y sarkosil unos de los más usados para la ruptura de la membrana celular. b) Enzimas. Se utilizan especialmente para la extracción de DNA bacteriano total o plasmídico, siendo la lisozima la enzima de elección. La lisozima actúa desestabilizando la pared celular de bacterias Gram negativas, ya que rompe las uniones glucosídicas entre los polisacáridos N-acetilglucosamina (NAG) y el ácido Nacetilmurámico (NAM). c) Agentes desnaturalizantes. Se utilizan para extraer DNA de diferentes tipos celulares y tejidos, siendo el cloruro de guanidina uno de los más empleados. ELIMINACIÓN DE PROTEINAS Se lleva a cabo mediante el uso de enzimas proteolíticas tales como la proteinasa K. Algunos protocolos de extracción realizan la lisis con detergentes como el SDS en presencia de proteinasa K en un solo paso. Adicionalmente, la digestión se acompaña del uso de la sal disódica del ácido etilén-diamino-tetra-acético (EDTA) para inhibir la acción de las DNAasas. Alternativamente, para organismos ricos en glicoproteínas como las micobacterias y tripanosomas, entre otros, luego de la digestión se realiza un tratamiento con el detergente catiónico bromuro de hexadecil-trimetil-amonio (CETAB) en presencia de NaCl 0.7 M, con la finalidad de eliminar las glicoproteínas y obtener un DNA más puro. La desproteinización también se lleva a cabo con solventes orgánicos tales como el fenol y el cloroformo, los cuales tienen la propiedad de desnaturalizar las proteínas. El fenol debe ser bidestilado, equilibrado y protegido contra la oxidación mediante la adición de 8-hidroxiquinolina. Por su parte, al cloroformo se le adiciona alcohol isoamílico en proporción 24:1 volumen a volumen, con el fin de prevenir espuma y facilitar la separación de las fases acuosas y orgánicas. Estos solventes se utilizan en una relación de 1:1 (v:v) de la muestra que se pretende limpiar, quedando las proteínas desnaturalizadas en la interfase y el DNA en la fase acuosa. ELIMINACION DE RNA Se realiza mediante la digestión de RNA con RNAasas como la ribonucleasa A de páncreas bovino. Este paso en algunos protocolos se lleva a cabo después de la extracción de DNA. CONCENTRACION DEL DNA Se logra mediante precipitación con etanol en presencia de cationes monovalentes a concentraciones de 0.1 a 0.5 M. El etanol en la presencia de estos cationes induce un cambio estructural en el DNA que causa la agregación y precipitación del mismo. Adicionalmente, con este tratamiento se remueven los residuos de fenol y cloroformo del

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paso anterior. Entre las sales más utilizadas se encuentran el acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio y cloruro de litio.

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EXTRACCIÓN DE DNA GENÓMICO DE Saccharomyces cerevisiae OBJETIVO  Familiarizar a los estudiantes con protocolos estándares de extracción de DNA MATERIALES Y REACTIVOS  Medio de cultivo YPD: Extracto de levadura 1% (p/v); peptona 2% (p/v); glucosa 2% (p/v).  Solución SZB (pH 5): Sorbitol 1M; citrato de sódio 100mM; EDTA 0.1 M; βglucoronidasa 50 unidades, 2-mercaptoetanol 100mM.  Solución TE: Tris-HCl 50 mM, EDTA 20 mM (pH 7,4)  SDS al 10%  Acetato de potasio 5M (pH 4,8)  Isopropanol  Etanol al 70% PROCEDIMIENTO 1. Los cultivos de las levaduras se dejan crecer durante 16 horas en agitación (120 rpm) o hasta obtener más de 100 millones de células/ml a 28 ºC, en 5 ml de YPED. 2. Las células se colectan por centrifugación a 8000 rpm durante 5 min en un tubo de microcentrífuga. 3. Las células se resuspenden en 0,5 ml de una solución de SZB. La suspensión se incuba en baño maría a 37 ºC durante 60 min, agitando periódicamente. Centrifugar a 8000 rpm por 10 min. 4. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de solución TE. Adicionar, 50µl de SDS al 10% e incubar en baño María a 65 ºC por 30 min. 5. Adicionar 0,2 ml de acetato de potasio 5M (pH 4,8), mezclar (mínimo 30 seg.), y llevar a baño de hielo por 30 min. 6. Centrifugar a 14000 rpm por 5 min y transferir el sobrenadante a un tubo limpio. 7. Centrifugar de nuevo por 5 min para eliminar impurezas y trasvasar el sobrenadante a otro tubo. 8. Adicionar 0,2 ml de acetato de amonio 5 M y 1 ml de isopropanol (conservado a -20 ºC). Incubar a temperatura ambiente por 10 min agitando suavemente el tubo. Centrifugar a 14000 rpm por 10 min, descartar el sobrenadante. 9. Al precipitado añadir 0,5 ml de etanol al 70% (conservado a -20 ºC), centrifugar a 14000 rpm por 5 min, descartar el sobrenadante. Dejar secar el precipitado a temperatura ambiente. 10. Resuspender el DNA en 50 µl de TE. Incubar por 5 min en baño maría a 100º C, y dejar enfriar a temperatura ambiente. 11. Almacenar a -20 ºC hasta su uso posterior. BIBLIOGRAFIA David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988 Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

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Esteban Osorio-Cadavid, Mauricio Ramírez, William Andrés López, Luz Adriana Mambuscay. Estandarización de un protocolo sencillo para la extracción de DNA genómico de levaduras. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XI. 2009.

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EXTRACCIÓN DE DNA DE SANGRE MATERIALES Y REACTIVOS  Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de  sangre total (5 ml por mesa)  Tubos Falcón de 15 ml y Eppendorf estériles de 1.5 ml  Micropipetas  Puntas estériles  Vortex  Centrifuga con rotor para tubos de 15 m y Microcentrifuga para viales de 1.5 ml  Guantes  Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 ml): 0.83 g de Cloruro de Amonio, 0.1 g de Bicarbonato de Potasio, 0.2 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0, 80 ml de agua destilada estéril. Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenización completa. Completar a 100 ml con agua destilada estéril. Autoclavar. Almacenar a 4ºC.  Buffer de lisis celular (100 ml): 5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0, 20 ml de SDS 10% 60 ml de agua destilada estéril. Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un Erlenmeyer hasta homogenización completa. Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estéril. No Autoclavar. Almacenar a temperatura ambiente  Solución precipitante de proteínas (50 ml): 38,54 g de Acetato de Amonio, 10 ml de agua destilada estéril. Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización. Puede requerir calentamiento ligero. Completar a 50 ml con agua destilada estéril. Autoclavar. Almacenar a 4ºC.  Solución de rehidratación 10 ml: TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM). Preparar TRIS 1 M pH 8.0 100ml (PM 121.1g), EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml. A partir de estos hacer la mezcla TE y diluciones correspondientes

PROCEDIMIENTO 1. En un tubo de 15 ml, medir 8 ml de Buffer de lisis de glóbulos rojos y sobre este adicionar con una pipeta de Pasteur 2 ml de sangre total. Con la misma pipeta mezclar muy bien y con mucha suavidad hasta lograr una completa homogenización. 2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a temperatura ambiente. 3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos. Descartar el sobrenadante y conservar el precipitado. 4. Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el precipitado en el líquido residual. 5. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces, hasta homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura ambiente. (En este paso se puede suspender el procedimiento, incluso hasta el día siguiente, dejando los tubos a 4ºC). 6. Adicionar 800 µl de solución precipitante de proteínas. Mezclar fuerte, hasta observar grumos de las proteínas precipitadas. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos. 7. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 ml que contenga 2,4 ml de isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al menos unos 5 minutos. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el DNA. 8. Envolver el DNA en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol al 70% frío, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500 µl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a 10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 µl etanol al 70% 33 |

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BIBLIOGRAFIA David, L.G. Dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 Perbal, B. A practical guide to molecular cloning. 2nd edition John Wiley 6 Sons, 1988 Sambrook, J. et al. 1989 Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd edition, Col Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

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PRACTICA Nº 7 EXTRACCIÓN DE DNA VEGETAL El DNA vegetal es más difícil de obtener de una forma que sea luego clonable o digerible, que el proporcionado por células animales, debido principalmente a la presencia de metabolitos secundarios y polisacáridos, los cuales interfieren con el procedimiento de extracción y se co-purifican con el DNA. Algunos de estos problemas se pueden superar usando hojas sin expandir. Los tejidos de plantas son robustos y por ello requieren pre-tratamientos intensivos, tales como largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno líquido con polvo de albúmina seguida por extracción con el tampón CTAB, etc. El método aquí descrito proporciona cantidades relativamente puras de DNA genómico, que se puede usar como molde de amplificación con fines de figer printing molecular (RAPDs, microsatélites u otras metodologías) (Griffin y Griffin, 1994). MATERIALES Y REACTIVOS 1. Buffer de maceración: 10 ml de Tris-HCl 1 M pH 7.4, 2.5 ml de EDTA 0.5 M, 2.5 ml de SDS al 10%, 2.5 ml de NaCl. Agregar agua bidestilada hasta completar 50 ml. 2. NaCl 5 M 3. Cloroformo 4. Alcohol isopropìlico 5. Etanol absoluto 6. Buffer TE (Tris-HCl 50 mM pH 8.0, EDTA 1mM). PROCEDIMIENTO 1. Colocar hojas de quinua (0.15 g) con 400 l de buffer de maceración en un tubo de microcentrífuga nuevo. Homogenizar hasta que se muestre de color verde intenso. Centrifugar a 14,400 rpm por 1 minuto. 2. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregar un volumen de cloroformo y mezclar por inversión. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 5 minutos en la microcentrífuga. 3. Trasvasar 300 l del sobrenadante y precipitar con 1 volumen de NaCl 5 M con uno de los siguientes alcoholes: Alcohol isopropílico 1 volumen; etanol absoluto 2 volúmenes. 4. Dejar en reposo, a temperatura ambiente, por 5 minutos, luego sedimentar en la microcentrífuga a velocidad máxima por 5 minutos. 5. Dejar secando a temperatura ambiente. Resuspender en 100 l de agua libre de nucleasas, o en buffer TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM). El producto final es de 20 ng/ml de DNA aproximadamente. 6. Esquematice lo realizado

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EXTRACCIÓN DE DNA VEGETAL Método Collins et al. (1987)  Agregar 400 µl del tampón de lisis (0,08 M NaCl, 0,16 M sucrosa, 0,06 M EDTA, 0,5% SDS, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,6) a la muestra. Homogenizar en un vial de 1,5ml.  Incubar a 64°C durante 30 minutos.  Transferir 56 µl de acetato de potasio 8 M para la precipitación de proteínas.  Incubar durante 60 minutos a -20°C.  Centrifugar a 3.500 rpm durante 15 min, el sobrenadante pasarlo a un tubo nuevo.  Adicionar 100 µl de etanol al 100%.  Centrifugar a 3.500 rpm durante 15 min.  Descartar el sobrenadante.  Al precipitado adicionar 100 µl de etanol al 75%, el producto final se seca y se resuspende en 100 µl de agua ultrapura.  El producto final se trata con un µl de RNAasa (Fermentas®) a 37°C durante 60 min. Finalmente la muestra se almacena a -20°C. BIBLIOGRAFÍA 1. Alberts, B Johnson, A. Lewis,J, Raff, M. Roberts, K and Walter, P (2002) Molecular Biology of The Cell. G.S. Fourth Edition. Garland Science. 2. Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda Yadi Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.

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PRÁCTICA N° 8 CUANTIFICACIÓN DE DNA FUNDAMENTO La concentración de DNA se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz ultravioleta (UV) a una longitud de onda de 260 nm, debido a que las base púricas y pirimidínicas del DNA tienen la propiedad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. Es importante tener en cuenta que, dado el emparejamiento de sus bases (puentes de hidrógeno), el DNA bicatenario absorbe menos que el monocatenario. La determinación de la pureza del DNA se establece mediante la relación de las lecturas de las absorbancias a 260 y 280 nm. Es así como una unidad (u) de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 g/ml de DNA de doble cadena, a 40 g/ml de RNA y DNA de cadena simple, y a 20 g/ml de oligonucleótidos. Las preparaciones puras de DNA y RNA tienen una relación de DO 260/280 nm de 1.8 a 2.0. Valores inferiores a 1.8, se consideran como DNA contaminado con proteína y fenol. Además, también se puede estimar la concentración de DNA utilizando colorantes como la difenilamina. Cuando se trata DNA con difenilamina en condiciones ácidas, se forma un compuesto azul que tiene su máxima absorción a 595 nm. Esta reacción la dan las desoxipentosas y no es específica para DNA. En solución ácida, la cadena lineal de una desoxipentosa se convierte a la forma -hidroxilevulinoaldehido altamente reactiva y que reacciona con difenilamina para dar un complejo azul. En el DNA solamente reacciona la desoxirribosa del nucleótido de purina, así que el valor obtenido representa la mitad del total de desoxirribosa presente. PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES 1. Solución de DNA de las prácticas anteriores 2. Amortiguador salino (NaCl 0.15 mol/l; citrato de sodio 0.015 mol/l, pH 7). 3. Reactivo de difenilamina (disuelva 10 g de difenilamina pura en 1 litro de ácido acético glacial y agregue 25 ml de ácido sulfúrico concentrado. Esta solución debe prepararse en el momento de usar). 4. Baño de agua hirviendo EXPERIMENTO 1. Cuantificación de DNA por el método espectrofotométrico 1. Diluir el DNA en agua destilada en un volumen final de 1 ml para el macrométodo y 100 l para el micrométodo. La cantidad de DNA tomada dependerá de la intensidad de la banda observada en el gel de agarosa. 2. Utilizar agua destilada como blanco y realizar las mediciones a 260 y 280 nm, utilizando celdas de cuarzo. 3. Determinar la concentración teniendo en cuenta la dilución del DNA. Por ejemplo, para un DNA diluido 1/100 en un volumen final de 1 ml y una lectura de 0.050 a 260 nm, se tiene que 0.050 (DO) x 50 g/ml x 100 (factor de dilución) = 250 g/ml = 0.25 g/l = 250 ng/l. EXPERIMENTO 2. Cuantificación de DNA por el método colorimétrico 37 |

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Tome 2 ml de solución de ácido nucleico (que contenga aproximadamente 10 mg de ácido nucleico en 50 ml de amortiguador salino) y agregue 4 ml de reactivo de difenilamina. Caliente en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos, enfríe y lea la extinción a 595 nm. Use un blanco de agua destilada. RESULTADOS 1. Anote sus resultados y determine la concentración de DNA para cada uno de los métodos utilizados. 2. Esquematice lo realizado. BIBLIOGRAFIA Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. Eds. 1995. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc., Chichester, NY, Brisbane, Toronto, Singapore.

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PRÁCTICA N° 9 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS EN GELES DE AGAROSA OBJETIVO  Separar e identificar diferentes fragmentos de ácidos nucleicos usando electroforesis en geles de agarosa INTRODUCCION La concentración e integridad del DNA extraído, así como el tamaño de distintos fragmentos de DNA (por ejemplo, productos de PCR) pueden ser verificadas mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. La electroforesis consiste en la separación de moléculas (proteínas, isoenzimas, ácidos nucleicos) a través de una matriz tamponada (agarosa, acrilamida, almidón). La matriz funciona como un filtro, separando las moléculas en un campo eléctrico, de acuerdo al tamaño y la carga neta que poseen. En el caso de los ácidos nucleicos, el grupo fosfato es el responsable por la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo que los fragmentos migren hacia el polo positivo (ánodo) durante la electroforesis. La resolución y velocidad de separación de fragmentos de DNA por electroforesis son reguladas a través de la concentración de agarosa (o acrilamida) en el gel y el voltaje aplicado durante la electroforesis. La agarosa funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente hacia el ánodo que aquellos de mayor tamaño. Al aumentar la concentración de agarosa se dificulta el movimiento de los fragmentos a lo largo del gel, permitiendo obtener una mayor resolución en los fragmentos de menor longitud. El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de migración de los fragmentos en el gel. Los ácidos nucleídos separados en geles de agarosa pueden visualizarse mediante tinción con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su integridad y estimar su concentración mediante un análisis comparativo con patrones de concentración conocida. Los colorantes fluorescentes actúan mediante inserción entre las pares de bases que conforman el ácido nucleico. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la visualización de DNA y RNA. Sin embargo, éste es un reactivo altamente tóxico, con propiedades mutagénicas, por lo que debe ser manejado con extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I, Vista Green y Syto60, desarrollados específicamente para reducir los riesgos potenciales de mutagénesis. La técnica para la cuantificación de DNA consiste simplemente en la utilización de una secuencia de concentraciones de solución patrón de DNA con la que se comparan muestras de DNA de concentración desconocida. El cálculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta según la fluorescencia. Debe evitarse la exposición prolongada a la luz ultravioleta, incluso con máscara de protección. La estimación de las concentraciones de DNA puede realizarse sobre una fotografía digital del gel tomada bajo luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imágenes.

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La concentración de agarosa y el voltaje con los que se debe trabajar depende del tamaño del segmento de DNA que se quiera visualizar. Los segmentos de gran tamaño, el del DNA total (proveniente de una extracción de DNA), deben trabajarse con concentraciones del 0.8% y a voltajes de 60V para evitar la fragmentación del mismo. Los segmentos de 1,500 pb en adelante con geles al 1%, los segmentos de 500 pb a 1,500 pb en geles 1,5% o 2% y los pequeños segmentos de de 100 pb a 500 pb (los microsatélites por ejemplo) en geles al 4% o 6%. Para estos el voltaje puede variar de 20v a 120v de pendiendo de la velocidad a la que quiera que migre el DNA, a voltajes elevados más rápido corren las muestras. La pureza de la agarosa y de la solución tampón (TAE o TBE) puede variar según la finalidad del ensayo. Es posible reutilizar una solución de agarosa cuando el fin es utilizarla sólo para visualización de algún producto de PCR. No se debe reutilizar cuando se va a cuantificar DNA ni a extraer bandas a partir del gel. Para reutilizar la solución de agarosa se recomienda guardar el gel en un envase con tapa, esto evita la evaporación y la entrada de polvo. En caso dado de que se evapore algo de la solución se puede completar el volumen con solución tampón limpia. PARTE EXPERIMENTAL MATERIALES Y REACTIVOS 1. Muestra obtenida en la Práctica 6 y 7. 2. Marcador de peso molecular. 3. Cámara de electroforesis y accesorios requeridos: soporte, peines, tabla niveladora, burbuja niveladora, etc. 4. Solución amortiguadora de Tris-Boratos-EDTA (TBE). La solución se prepara 10X y se utiliza 1X. Para preparar 500 ml de una solución 10X TBE mezclar: 54 g de Tris Base (PM= 121.14 g/mol), 27.5 g de ácido bórico (H3BO3) (PM= 61.83 g/mol), 20 ml de EDTA sódico (0.5 M, pH 8.0), llevar a 500 ml con agua destilada y autoclavar. 5. Gel de agarosa al 1% en TBE con bromuro de etidio. Precaución: el bromuro de etidio es un agente mutagénico, utilice guantes para manipular cualquier material o solución que contenga este químico. 6. Amortiguador de muestra con azul de bromofenol. 7. Tubos de 1.5 ml. 8. Beaker o erlenmeyer de 125 ml. 9. Micropipeta de 20 μl con sus respectivas puntas. 10. Lámpara de UV. Precaución: la luz ultravioleta puede dañar sus ojos. NUNCA observe un gel bajo la luz ultravioleta sin el uso de anteojos que filtren dicha luz. 11. Guantes. PROCEDIMIENTO 1. Ubicar la zona de electroforesis y tener cuidado con los materiales, evitar manipular objetos ajenos al área. 2. Preparar Buffer TBE al 1X Preparación del gel de agarosa al 1% 3. Pesar 400 mg de agarosa en polvo. 4. Montar los soportes y materiales adecuados para preparar el gel procurando nivelar la superficie, verificar que no existan fugas y colocar los peines adecuados.

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Depositar la agarosa en el matraz de 250 ml y agregar 40 ml del Buffer TBE 1X. Calentar la agarosa en el horno de microondas por 1 min o hasta que se disuelva perfectamente.

NOTA: Manejar con extremo cuidado el matraz y evitar respirar los vapores del contenido. 6.

7.

Enfriar un poco sin que se solidifique la agarosa y agregar una gota de bromuro de etidio* (manipular el reactivo lo menos posible y evitar derrames o mancharse). Mezclar perfectamente hasta homogeneizar y verter el contenido en el molde. Esperar a que solidifique (aproximadamente 20 min) y colocar el gel en la cámara de electroforesis de tal forma que los pozos principales queden del lado correspondiente al polo negativo (color negro). Llenar la cámara hasta la marca indicada con TBE 1X y con precaución retirar los peines.

Preparación de las muestras 8. En un papel parafilm, colocar 3 µL del buffer de carga para 10 µL de muestra. Mezclar la muestra con el buffer y vaciar en un pozo del gel (dejar libre el primer pozo para el marcador de peso molecular) para cada una de las muestras. 9. Concluido el proceso, tapar la cámara de electroforesis haciendo coincidir los polos: positivo con positivo y negativo con negativo. Conectar la cámara a la fuente de poder y programar la corrida a 90 volts constantes durante 20-30 min. Visualización de resultados 10. Sacar el gel de la cámara de electroforesis 11. Examine el gel bajo la lámpara de luz ultravioleta para determinar la posición de las bandas en el gel. 12. Tomar la foto del gel.

BIBLIOGRAFÍA 1. BioRad. Manual de instrucciones de la cámara mini sub cell para electroforesis en geles de agarosa. 2. Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda Yadi Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.

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PRÁCTICA N° 10 SINTESIS DE RNA DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS a) Espliceosoma b) Exón c) Exosoma d) Factor general de transcripción e) Holoenzima de la RNA polimerasa f) Intrón g) Maduración del RNA por corte y empalme h) RNA mensajero i) Promotor j) RNA polimerasa k) RNA ribosómico l) RNA nuclear pequeño m) Transcripción

PROBLEMAS 1. Una RNA polimerasa está transcribiendo un segmento de DNA que contiene la secuencia 5’-GTAACGGATG-3’ 3’-CATTGCCTAC-5’ Si la polimerasa transcribe esta secuencia de izquierda a derecha, ¿cuál será la secuencia del RNA? ¿Cuál sería la secuencia de RNA si la polimerasa se moviera de derecha a izquierda? 2.

¿Cuáles son las funciones de los factores generales de transcripción en la transcripción mediada por la RNA polimerasa, y porqué se denominan “generales”?

3.

Los intrones con automaduración utilizan dos estrategias para llevar a cabo el corte y empalme. Los intrones del grupo I unen un nucleótido de G del medio y lo activan para atacar el enlace fosfodiéster que une el intrón al nucleótido terminal del exón anterior (Fig. 1A). Los intrones del grupo II activan un nucleótido particularmente reactivo de A dentro de la secuencia intrónica y lo utiliza para atacar el enlace fosfodiéster que une el intrón con el nucleótido con el nucleótido terminal del exón anterior (Fig. 1B). Para ambos tipos de intrones, el paso siguiente une los dos exones y libera el extremo 3’del intrón. ¿Cuáles son las estructuras de los intrones escindidos en cada caso? ¿Qué mecanismo se asemeja más a la maduración de los pre-mRNA catalizada por el espliceosoma?

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Figura 1. Paso inicial en la automaduración. (A) Reacción catalizada por un intrón autocatalítico del grupo I. (B) reacción catalizada por un intrón autocatalítico del grupo II.

4.

La purificación de un factor de transcripción de un ensayo rápido que impida que sea inactivado antes de que la fracción que lo contiene sea identificada. Un avance técnico clave fue el uso de un promotor unido a una secuencia de 400 nucleótidos de DNA que carecía de nucleótido C. Cuando se omite el GTP en la mezcla de ensayo (pero se incluye CTP, UTP, y ATP), el único transcrito largo de RNA se fabrica a partir de esta secuencia de DNA, dado que todos los otros transcritos se terminan cuando se requiere una G. Esta estrategia permite realizar un ensayo rápido de transcripción específica simplemente midiendo la incorporación de un nucleótido radiactivo en el transcrito largo. Para probar esta idea, se construyeron dos plásmidos que llevan la secuencia sintética: uno con un promotor de un adenovirus (pML1) y el otro sin promotor (pC1) (Fig. 2A). Cada plásmido se mezcló con RNA polimerasa II pura, factores de transcripción, UTP, ATP y 32P-CTP. Además, se añadieron varias combinaciones de GTP (que termina la transcripción cuando se incorpora una G). Los productos se midieron por electroforesis en gel mostrándose los resultados en la fig. 2B. A. ¿Por qué está ausente el transcrito de 400 nucleótidos del carril 4 pero presente en los carriles 2, 6 y 8? B. ¿Puede adivinar la fuente de la síntesis en el carril 3 cuando se ha utilizado el plásmido sin promotor pC1? C. ¿Por qué hay un transcrito de 400 nucleótidos en el carril 5 pero no en el carril 7?

Figura 2. Caracterización de la transcripción utilizando un molde sin nucleótido C. (A) Estructuras de los plásmidos del ensayo. (B) Resultados de los ensayos de transcripción bajo diferentes condiciones. Todas las reacciones contienen RNA polimerasa II, factores de transcripción, UTP, ATP y 32P-CTP. Los otros componentes se numeran encima de cada carril, C representa el plásmido pC1; ML representa el plásmido pML1.

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5. La subunidad mayor de la RNA polimerasa II de levaduras posee un CTD (dominio Cterminal) que comprende 27 repeticiones casi perfectas de la secuencia YSPTSPS. Si se reemplaza el gen normal de la RNA polimerasa II por uno que codifica un CTD con sólo 11 repeticiones, las células son viables a 30C pero son incapaces de crecer a 12C. Esta sensibilidad al frío permite seleccionar los mutantes reversos haciéndolos crecer a 12C. Se demostró que algunas de estas reversiones eran mutaciones dominantes en genes previamente desconocidos como Srb2. Los extractos obtenidos de levaduras que carecen del gen Srb2 no pueden transcribir moldes de DNA añadidos al extracto, pero pueden activarse para la transcripción al añadir la proteína Srb2. Para comprobar el papel de la proteína Srb2 en la transcripción, se incubaron DNA plasmídicos con secuencias libres de G, cortas o largas, localizadas a continuación del promotor (Fig. 3A) en presencia o ausencia de una cantidad limitante de Srb2 recombinante [y sin añadir nucleótidos trifosfato (NTP) de modo que no se podía comenzar la transcripción]. Las reacciones se mezclaron y la transcripción se inicio a diferentes tiempos al añadir una mezcla de los cuatro NTP que incluía 32P-CTP (Fig. 3B). Después de una breve incubación (de modo que la transcripción no tuviese tiempo de reiniciarse), los productos se separaron por electroforesis en gel. Fuera cual fuese el molde que se preincubaba con Srb2, ese era el único molde que se transcribía (Fig.3C). Por el contrario, si se mezclaba un exceso de Srb2 con un molde durante la preincubación, se observaba transcripción a partir de ambos moldes una vez mezclados. A. ¿Mostró Srb2 preferencia por alguno de los moldes cuando la preincubación se llevaba a cabo con los moldes individuales o con la mezcla (Fig. 3C, carriles 1 a 3)? B. ¿Indican los resultados que Srb2 actúa esquiométricamente o catalíticamente? ¿Por qué? C. ¿Forma parte Srb2 del complejo de preiniciación o actúa una vez se ha iniciado la transcripción? ¿Cómo puede decirlo? D. ¿Qué ocurre durante la preincubación que favorece tanto la transcripción a partir del molde añadido durante la preincubación? E. ¿Indican estos resultados que Srb2 se une al CTD de la RNA polimerasa II?

Figura. 3. Experimentos para comprobar la función de Srb2 en la transcripción. (A) Moldes libres de G cortos (C) y largos (L). (B) Diseño experimental. (C) Resultados experimentales. Los transcritos a partir de los moldes C y L se visualizaron mediante autorradiografía. 44 |

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La secuencia AAUAAA ubicada justo a 5’ del sitio de poliadenilación es una señal crítica para la poliadenilación, como se ha verificado de muchas maneras. Una confirmación elegante utilizó una modificación química para interferir con las interacciones proteicas específicas. Las moléculas de RNA que contenían la secuencia señal se marcaron radiactivamente en un extremo y luego se trataron con dietilpirocarbonato, que puede modificar los nucleótidos A y G haciendo que el RNA sea sensible a la rotura mediante un tratamiento con anilinas. Las condiciones experimentales empleadas fueron tales que las moléculas de RNA contenían aproximadamente una modificación cada una. En ese momento se trataron con anilina. Las series de fragmentos resultantes tienen longitudes que corresponden a posiciones de A o G en el RNA (Fig. 2, carril 1). Para definir los nucleótidos A y G críticos, los RNA modificados, pero aún intactos, se incubaron con un extremo capaz de cortar y poliadenilar. Los RNA fueron luego divididos entre aquellos que habían adquirido la cola de poli-A (poli-A+) y aquellos que no (poli-A-). Estas dos fracciones fueron tratadas con anilina y los fragmentos, analizados por electroforesis en gel (Fig. 4, carriles 2 y 3). En una segunda reacción se añadió EDTA al extracto junto con los RNA modificados; esto no afecta a la escisión del RNA pero impide la adición de la cola de poli-A. Estos RNA escindidos fueron aislados, tratados con anilina y examinados por electroforesis (carril4). A. ¿En qué extremo se marcan las moléculas de RNA? B. Explica por qué las bandas correspondientes a la señal AAUAAA (corchete en Fig.4) se pierde en el RNA poli-A+ y en el RNA escindido. C. Explique por qué la banda de la flecha (el nucleótido normal donde se añade la cola de poli-A) falta en el RNA poli-A+ pero está presente en RNA escindido. D. ¿Qué nucleótidos A y G son importantes para la escisión, y qué nucleótidos A y G son importantes para la adición de la cola de poli-A? E. ¿Qué información adicional podría obtenerse marcando las moléculas de RNA en el otro extremo?

Figura 4. Análisis autorradiográfico de los experimentos para definir las purinas importantes en la escisión y poliadenilación del RNA. La secuencia del RNA precursor se muestra a la izquierda con el extremo 5’ abajo y el extremo 3’ arriba. Todos los RNA fueron modificados mediante reacción con el dietilpirocarbonato. El RNA no tratado con el extracto (no tratado) se muestra en el carril 1. El RNA tratado con el extracto pero sin poliadenilar (poli-A-) se muestra en el carril 2. El RNA poliadenilado (poli-A+) en el extracto se muestar en el carril 3. El RNA que fue escindido pero no poliadenilado (escindido) se muestra en el carril 4. Los fragmentos más cortos de RNA corren más rápido; es decir, migran hacia la parte inferior del gel durante la electroforesis.

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PRACTICA N° 11 SINTESIS DE PROTEINAS DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS a) Traducción b) Aminoacil-tRNA sintetasa c) Anticodón d) Código genético e) Codón f) Factor de iniciación eucariota (eIF) g) Pauta de lectura (marco de lectura) h) Proteosoma i) Ribosoma j) Ribozima k) RNA ribosómico l) RNA de transferencia m) RNA de transferencia iniciador PROBLEMAS 1. Para la siguiente secuencia de RNA, indique los aminoácidos codificados en las tres pautas de lectura. Si le dijesen que este segmento de RNA estaba en medio de un mRNA que codificaba una proteína grande, ¿cómo sabría cuál es la pauta de lectura utilizada? ¿Por qué? AGUCUAGGCACUGA 2. Una mutación de un gen bacteriano genera un codón de paro UGA en medio del mRNA que codifica para una determinada proteína. Una segunda mutación en la célula lleva a un cambio de un solo nucleótido en un tRNA que permite la traducción correcta de la proteína; es decir, la segunda mutación “suprime” el defecto causado por la primera. El tRNA alterado traduce el codón UGA como triptófano. ¿Qué cambio de nucleótido ha ocurrido probablemente en la molécula de tRNA mutante? ¿Qué consecuencias tendría la presencia de este tRNA mutante en la traducción de los genes normales de esta célula? 3. El factor de elongación EF-Tu introduce dos cortas demoras entre el apareamiento entre el apareamiento de bases codón-anticodón y la formación del enlace peptídico. Estas demoras aumentan la precisión de la síntesis proteica. Describa estas demoras y explique de qué manera mejoran la fidelidad de la traducción. 4. El peso molecular promedio de las proteínas codificadas por el genoma humano es de aproximadamente 50,000 daltons. Algunas proteínas son mucho mayores que este promedio. Por ejemplo, la proteína llamada titina, fabricada en las células musculares, tiene un peso molecular de 3’000,000 daltons. A. Calcule cuánto tiempo tardará una célula muscular en traducir el mRNA de una proteína promedio y el mRNA de la titina. El peso molecular promedio de un aminoácido es de unos 110 daltons. Considere que la velocidad de traducción es de dos aminoácidos por segundo. B. Si los nucleótidos de la región codificante de un mRNA constituyen el 5% del total de los que son transcritos, ¿cuánto tardará una célula muscular en transcribir el gen 46 |

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR de una proteína promedio comparado con el gen de la titina? velocidad de transcripción es de 20 nucleótidos por segundo.

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Suponer que la

5. Muchos de los errores de la síntesis proteica ocurren porque las tRNA sintetasas tienen dificultades para discriminar entre aminoácidos parecidos. Por ejemplo, la isoleucil-tRNA sintetasa (IleRS) normalmente activa isoleucina. IleRS + Ile + ATP  IleRs(Ile-AMP) + PPi Con una frecuencia de 1 cada 180 activaciones correctas, la IleRS activa erróneamente una valina IleRS + Val + ATP  IleRs(Val-AMP) + PPi La síntesis de proteínas es más precisa de lo que esta frecuencia sugiere, ya que la sintetasa es capaz de editar la mayoría de sus errores, en una reacción que requiere la presencia del tRNAIle. IleRs(Val-AMP) + tRNAIle  IleRs + Val + AMP + tRNAIle EDICION El tRNAIle, por supuesto, también es necesario para la correcta aminoacilación (carga) de la isoleucina para dar el Ile-tRNAIle. IleRs(Ile-AMP) + tRNAIle  Ile-tRNAIle + IleRs + AMP + CARGA ¿Se requieren las mismas regiones del tRNAIle para la carga de la isoleucina que para la edición de la valina? Una aproximación a esta pregunta consiste en introducir cambios en el tRNAIle para determinar si las dos actividades se ven afectadas de la misma forma. En lugar de cambiar la secuencia nucleótido a nucleótido, se hicieron cambios de bloques de secuencia, utilizando como donante el tRNAVal. El tRNAVal por sí mismo no estimula la carga de isoleucina ni la edición de la valina por parte de la IleRS. Sin embargo, el cambio de su anticodón de 5’-CAU a 5’-GAU le permite ser cargado bastante eficientemente por la IleRS. Se construyeron diversos tRNA quiméricos mediante la combinación de partes del tRNAIle y del tRNAVal. Se analizó la capacidad de cada quimera de estimular la carga de isoleucina y la edición de valina, como se muestra en la Fig.1. A. ¿Qué mínimo debe ser insertado en el tRNAVal para permitir la carga de la isoleucina por parte de la IleRS? B. ¿Qué mínimo debe ser insertado en el tRNAVal para permitir la edición de la valina por parte de la IleRS? C. ¿Reconoce la IleRS las mismas características del tRNAIle cuando cataliza la carga de la isoleucina que cuando procesa la edición de la valina? Explique su respuesta.

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Figura 1. Regiones del tRNAIle responsables de la carga y la edición. (A) tRNAIle y tRNAVal. (B) Carga de la isoleucina y edición de la valina. Bajo los resultados de carga de la isoleucina (barras negras) y de edición de la valina (barras grises) se muestran los tRNA quiméricos compuestos de fracciones del tRNA Val (negro) y tRNAIle (gris).

6. Ha aislado un antibiótico, llamado edeína, de un cultivo bacteriano. La edeína inhibe la síntesis proteica, pero no tienen ningún efecto sobre la síntesis del DNA ni del RNA. Cuando se añade a un lisado de reticulocitos, la edeína detiene la síntesis proteica después de un largo periodo de latencia (Fig. 2). Por el contrario, la cicloheximida detiene la síntesis proteica inmediatamente. El análisis del lisado inhibido por edeína mediante una centrifugación en gradiente de densidad demostró que no quedaba ningún polirribosoma en el momento en el que se había detenido la síntesis proteica. En su lugar, todo el mRNA de la globina se acumulaba en un pico anormal de 40S, que contenía cantidades equimolares de la subunidad menor del ribosoma y del tRNA iniciador. A. ¿Qué paso de la síntesis proteica inhibe la edeína? B. ¿Por qué hay un periodo de latencia entre la adición de la edeína y el cese de la síntesis proteica? ¿Qué determina la extensión de este periodo de latencia? C. ¿Esperaría que los polirribosomas desaparecieran si añade cicloheximida a la vez que la edeína?

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Figura 2 Efecto de los inhibidores edeína y cicloheximida sobre la síntesis de proteínas en lisados de reticulocitos.

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PRÁCTICA N°12 CONTROL DE LA EXPRESION GENICA DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS a) Control traduccional b) Control transcripcional c) Proteína represora de genes d) Operón e) Operador f) Proteína represora de genes g) Represor triptófano h) Región del control del gen i) Impronta genómica j) Metilación del DNA k) RNA de interferencia PROBLEMAS 1. En principio, una célula eucariota puede regular la expresión génica en cualquier etapa de la vía que lleva del DNA a la proteína activa (Fig. 7-2) A. Sitúa los puntos de control enumerados a continuación en los sitios adecuados del esquema de la Fig. 7-2. 1. Control de la degradación del mRNA 2. Control de la actividad proteica 3. Control del procesamiento del mRNA 4. Control del transporte y localización del mRNA 5. Control transcripcional 6. Control traduccional B. ¿Qué tipos de control de la lista anterior es poco probable que se utilicen en bacterias? 2. Defina control negativo y control positivo en términos de cómo funcionan las formas

activas de las proteínas reguladoras de genes. Explique de qué forma un ligando “inductor” activa un gen que está controlado negativamente. ¿De qué forma activa un ligando inductor a un gen que está controlado positivamente? Explique como un ligando “inhibidor” inactiva un gen que está controlado negativamente y de qué forma inactiva un gen está controlado positivamente. 3. Las células bacterianas pueden adquirir el aminoácido triptófano de su entorno o, si el

aporte externo es insuficiente, pueden sintetizar triptófano a partir de pequeñas moléculas de la célula. El represor del triptófano inhibe la transcripción de los genes del operador de triptófano, el cual codifica las enzimas de la biosíntesis del triptófano. Cuando se ha unido al triptófano, el represor del triptófano se une a un sitio específico del promotor en el operón. A. ¿Por qué la unión al operón dependiente de triptófano es una propiedad útil para el represor del triptófano? B. ¿Qué pasará con la regulación de las enzimas de la biosíntesis del triptófano en las células que expresan una forma mutante del represor del triptófano que (i) no puede unirse al DNA o que (ii) se une al DNA incluso cuando no hay triptófano unido? C. ¿Qué pasaría en las situaciones (i) y (ii) si la célula produjera la forma de represor del triptófano normal a partir de una segunda copia del gen no mutada? 49 |

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4. Se ha descubierto varios mecanismos distintos para la localización del mRNA. Todos

requieren señales específicas del propio mRNA, por lo general en su región no traducida 3’ (UTR). Resuma brevemente tres mecanismos mediante los cuales los mRNA celulares podrían situarse en su localización dentro de la célula. 5. En nematodos, la elección entre espermatogénesis y oogénesis en la línea germinal

hermafrodita depende de la regulación traduccional de los genes Tra2 y Fem3, como muestra la Fig. 7-52. Cuando se expresan, Tra2 induce a oogénesis y Fem3 induce la espermatogénesis. La traducción del mRNA de cada gen se regula mediante la unión de proteínas a elementos presentes en sus regiones 3’ no traducidas. En cada caso, el mRNA unido a proteína, aunque es estable, no se traduce de manera eficiente y tiene una cola de poli-A corta. En cada caso, el mRNA en su forma no unida es activo traduccionalmente y tiene una cola de poli-A larga. ¿Cómo cree que afectan las longitudes de las colas de poli-A a la eficiencia de la traducción de estos mRNA?

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PRÁCTICA 13 ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DE SECUENCIAS El primer paso para secuenciar el DNA involucra extraerlo de las células que lo contienen. Hay muchos métodos que pueden usarse para extraer DNA (convencionales o comerciales). Después de que el DNA ha sido aislado, el segundo paso es amplificar por PCR los fragmentos de DNA (ej. genes) deseados. El siguiente paso antes de secuenciar, es la purificación de los fragmentos de DNA. Este paso es muy importante para propósitos de validación de la secuencia. Los fragmentos de DNA obtenidos son enviados a secuenciar en una plataforma de genómica. Existen en todo el mundo, laboratorios o empresas comerciales dedicados al servicio de secuenciación automática que permiten reducir los costos de este proceso cuando se hace a pequeña escala (ej. equipos y reactivos especializados costosos). Además, estas plataformas tienen una alta experiencia en las diferentes técnicas, lo que les permite ofrecer un soporte de garantía para encontrar una solución a cualquier dificultad. El único punto crítico para la confiabilidad de los resultados es la calidad del DNA o fragmento de DNA a enviar. Por eso es muy importante seguir los requisitos en materia de calidad y cantidad de las muestras. Las muestras de DNA son secuenciadas con la técnica de Sanger (Sanger et al., 1977). Esta técnica se basa en la habilidad que tienen las polimerasas de introducir tanto deoxinucleótidos como dideoxinucléotidos a una cadena de DNA en crecimiento. Utilizando la técnica en sistemas automatizados de tecnología capilar y de fluorescencia, se puede detectar de manera diferencial cada uno de los dideoxinucleótidos que se adicionan al final de un fragmento en la polimerización, los cuales son separados de otros fragmentos de diferente tamaño, por medio de una electroforesis capilar y a través de un software, se descifra la secuencia de un fragmento de DNA. Existen otras técnicas de secuenciación como la técnica de pirosecuenciación que se basa en la detección de la señal luminosa generada por una reacción quimioluminiscente, en la cual se utiliza como sustrato el pirofosfato que se libera como resultado de la incorporación de un nucleótido a la cadena de DNA naciente (Shendure et al., 2004). La técnica más reciente es la secuenciación con chip semiconductor (Ion Torrent Semiconductor Sequencing; Perkel, 2011). Este método es basado en la capacidad de detectar un ion de hidrógeno [H+], proveniente de la polimerización de la cadena complementaria a un DNA patrón, los dNTP´s son incorporados durante un ciclo de secuenciación, permitiendo la formación del enlace fosfodiéster y una posterior liberación de PPi e H+. Esta polimerización se lleva a cabo en conjunto de pocillos, colocados sobre un sensor de efecto de campo sensible a iones, utilizados en las mediciones de pH en soluciones, por lo que cuando cambia la concentración de iones, cambia por consecuencia la corriente del transmisor y genera una señal eléctrica detectada en el chip. A diferencia de otras técnicas de secuenciación, ésta no utiliza un sistema óptico de detección. Después del proceso de secuenciación, la plataforma de genómica envía los resultados en archivos electrónicos que contienen el electroferograma y toda la información del análisis. La última etapa para la identificación molecular es el análisis de 51 |

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secuencia de DNA con métodos bioinformáticos. El análisis de la secuencia de DNA, es el descubrimiento de similitudes funcionales y estructurales, y las diferencias entre múltiples secuencias biológicas. Esto puede hacerse comparando las nuevas (desconocidas) con las bien estudiadas y registradas (conocidas) secuencias. Este análisis incluye la búsqueda en la base de datos de secuencias, la alineación de secuencias, el descubrimiento de patrones, la reconstrucción de las relaciones evolutivas, la formación y la comparación del genoma. Los científicos han encontrado que dos secuencias similares poseen el mismo papel funcional. La comparación se puede hacer desde aspectos de comportamiento bioquímico o de acuerdo a la estructura de la proteína. Si dos secuencias de diferentes organismos son similares, se dice que son secuencias homólogas. Para el análisis de secuencias, se utiliza el siguiente protocolo: Corrección y ensamble de las secuencias de DNA El primer paso del análisis es la corrección manual de las secuencias y posteriormente el ensamble de las secuencias de un mismo fragmento en contig (ej. superposición de las secuencias sentido, anti sentido e internas). Este paso se puede efectuar con el programa libre “BioEdit”, que se puede descargar en la página: http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html. Búsqueda de secuencias registradas El segundo paso es comparar la secuencia nucleotídica obtenida con otras secuencias depositadas en bancos públicos (ej. GenBank®) de genes. Una vez hecha la comparación, se importan las secuencias registradas con mayor similitud o adecuadas para hacer el análisis bioinformático. Este paso es crucial para tener una buena identificación de los organismos bajo estudio y establecer las correctas relaciones de filogenia o evolutivas. Alineación de secuencias de DNA En este paso, se comparan las secuencias mediante la búsqueda de patrones de caracteres comunes y el establecimiento de los residuos de correspondencia entre las secuencias relacionadas. El alineamiento de pares de secuencias es fundamental en la búsqueda de similitudes dentro de la base de datos y el alineamiento de secuencias múltiples. Un concepto importante en el análisis de la secuencia es la homología de secuencia. Cuando dos secuencias son descendientes de un origen evolutivo común, se dice que tienen una relación homóloga u homología. Un término relacionado, pero diferente es la similitud de secuencias (estos términos suelen utilizarse indistintamente de manera errónea). Este paso se efectúa con el programa libre MEGA 5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, http://www.megasoftware.net/index.php) Análisis flogenético La finalidad de los análisis filogenéticos es estimar una relación de parentesco (árbol filogenético) que muestre la historia evolutiva del grupo taxonómico de estudio. Es decir, el objetivo final es obtener un árbol filogenético que sea reflejo del proceso evolutivo donde las entidades biológicas son el resultado de la descendencia con modificación entre especies ancestrales y descendientes. Existen diferentes métodos utilizados en estudios de sistemática filogenética [Máxima Parsimonia (MP), Máxima Verosimilitud (MV) e Inferencia Bayesiana (IB), entre otros] que deben ser propiamente seleccionados en dependencia de los objetivos de las diferentes investigaciones. Estos análisis son realizados con el programa MEGA 5, por ejemplo, el algoritmo Neighbor-Joining (NJ) es utilizado para la identificar las secuencias que tengan la menor distancia genética.

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Mientras, el modelo MV es utilizado para establecer la historia evolutiva de un grupo taxonómico estudiado, ya que es un método estadístico basado en modelos de evolución molecular, donde se toma en cuenta conocimiento a priori acerca de los caracteres, especialmente cuando son caracteres moleculares (secuencias de nucleótidos de DNA). La bioinformática, al igual que todas las ciencias que son base en la investigación científica, provee grandes volúmenes de información que requiere de técnicas computacionales avanzadas para permitir hacer un procesamiento en tiempo real. Muchas de estas técnicas se enmarcan dentro de temas de investigación y desarrollo informático que tienen que ver con el almacenamiento y procesamiento de datos, entre las cuales podemos mencionar las bases de datos y algunas técnicas de inteligencia artificial, entre otras. Por lo anterior, estos análisis que estaban restringidos a los centros de investigación que tenían importantes recursos a nivel bioinformático, son ahora accesibles para cualquier centro. La disponibilidad de herramientas en línea, permite incluso al biólogo molecular principiante, obtener una cantidad considerable de información útil a partir de los bancos de datos de nucleótidos, y así realizar casi cualquier análisis vía servidor. El sitio “phylogeny.fr” (http://www.phylogeny.fr/version2_cgi/index.cgi) está diseñado principalmente para los biólogos que no tienen experiencia en la filogenia. Este sitio tiene un cuadro en el que puede “pegar” secuencias en diferentes formatos y disponer de una cuenta de correo electrónico. Después, simplemente hacer clic en el botón “Ejecutar” y al finalizar el usuario recibirá los resultados de su análisis en su correo electrónico. Mientras, el sitio “CIPRES” (Cyber Infrastructure for Phylogenetic RESearch; http://www.phylo.org/portal2/login!input.action) es una plataforma que permite reconstrucciones filogenéticas a gran escala (cientos de miles de secuencias) para los especialistas en filogenia.

PROCEDIMIENTO Utilizando las herramientas bioinformáticas propuestas realice el análisis filogenético de la siguiente secuencia: TGTACAAAAAAGTTGGTTAAAATCCAAATTATTTTCTGAAGGTAACATTTCTCTGTGAC TGAAGAAAAAGGGGGATGATTAAAAAATAAGAATACAGACCATCTTGTTACTGAAGAA TTATAATTACTTTTATTTCCAGGAAATGGGACTTAATGTATAATTATTTATATAGGCAAT TTAAAAAAAATAGTTTTTGTATATAACAAAATGAAAAAAAAAACCCTTTTCAGTAGAAAA ATTAAAAGGGTCCCTTGTTAATACTGATTTTGACCTCCAAATGGATTAAATTCTCTTTC ATAAAACAATTTTAACTATTAGAAACCCTGTCCTTCCCTGAGCGACCCTTTCAGAACTA GGAAGTTTGCCATTTTGGATTTTATTAAGGACCATGTGACTCAAAGTATTATAATAATA ATAAAGTTGGAAGGGACCTTGAAGGTCATCGAGTCCAAACCCCCTGCTCAGGCAGGA AACCCTATATCATTTCAGACAAATGGCTGTCCAGTCTCTTTCTTAAAAACTTCCAGTGA TGGAGCTTTTCTCTGTCTCTTAGATTCAAATGGAATATGTGGGNTCTTCCTTGTTCAGG TATTTTCCTTCAGTCTCACTTACCAAG BIBLIOGRAFÍA Adrien Gallou, Alba Priscilia Suaste Dzul, María Guadalupe Serna Domínguez, Gilda Yadi Andrade Michel (2015) Manual de prácticas del Laboratorio de Biología Molecular. Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria. SENASICA.

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Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences 74: 5463-5467. Shendure, J., Mitra, R.D., Varma, C. y Church, G.M. 2004. Advanced sequencing technologies: Methods and goals. Nature Reviews Genetics 5: 335-344.

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PRÁCTICA N° 14 DISEÑO DE INICIADORES O “PRIMERS” INTRODUCCION Los iniciadores o “primers” son secuencias de 18 a 30 nucleótidos que hibridan con el DNA molde y flanquean la región que uno desea amplificar. OBJETIVOS  Manejar los criterios básicos para el diseño de “primers” específicos y degenerados.  Diseñar “primers” específicos y degenerados para amplificar una secuencia génica.  Utilizar herramientas bioinformáticas para el diseño de “primers”. DISEÑO DE “PRIMERS” ESPECÍFICOS Para el diseño de estos oligonucleótidos se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: 1. Los primers deberían ser específicos para la secuencia a ser amplificada y pueden tener una longitud de 18 a 30 bases. Los primers se deben probar contra la base datos. 2. Los primers deberán formar duplex estables a la temperatura de hibridación, 3. Se debe evitar la complementariedad entre el “primer forward” (primer 1) y el “reverse” (primer 2) y los productos de la amplificción, 4. Los primers “forward” y “reverse” deben tener una Tm (temperatura de fusión) similar. 5. El contenido de G + C debe ser de aproximadamente 50% 6. G o C en el extremo 3’ 7. Se debe evitar corridas de A y/o T 8. Evitar secuencias que permitan la formación de horquillas DISEÑO DE “PRMERS” DEGENERADOS Aunque la mayoría de las PCR se realizan con iniciadores específicos, cuando se desea amplificar un gen en base a las regiones mas conservadas de una familia de proteínas se debe diseñar iniciadores degenerados. Para el diseño de este tipo de iniciadores se debe tener en cuenta la degeneración del código genético, por lo que los iniciadores que nos permitan amplificar una secuencia particular de aminoácidos también debería ser degenerada de tal manera que codifique todas las posibles permutaciones. En este sentido un “primer” diseñado según la secuencia de 6 aminoácidos cuyos codones presentan 64 permutaciones, puede potencialmente reconocer 64 diferentes secuencias nucleotídicas de as cuales solamente una de ellas se hibridará con la secuencia blanco. Si dos de estos “primers” se usa en una reacción de PCR, entonces hay 64 x 64 o 4096 posibles permutaciones. En vista que los productos de PCR se amplifican exponencialmente, puede darse el hecho de que si usamos “primers” altamente degenerados, solamente muy pocos de ellos pueden reconocer el gen blanco. Por ello se recomienda usar “primers” no muy degenerados. El adecuado diseño de iniciadores degenerados es fundamental para un clonamiento exitoso de un gen a partir de su secuencia proteica. Por ejemplo, uno de los “primers” degenerados a partir de la secuencia aminoacídica Leu-Ile-Gli-Glu, sería: 55 |

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a. De acuerdo al alfabeto de la Tabla 1, la secuencia del “primer” sería 5´-YTH-ATHGGN-GAR-3´. b. Seguidamente se debe calcular el número de permutaciones de la secuencia: ((2 x 4) x 3 x 4 x 2) = 192 permutaciones. El extremo 3´ del “primer” debería presentar la mayor cantidad de las permutaciones de la secuencia aminoacídica, ya que la Taq polimerasa no puede realizar la reacción de síntesis a partir de un “mismatch” que esté en el extremo 3´. c. La degenerancia del “primer” se puede reducir incorporando en la secuencia inosina, ya que este nucleótido sintético puede generar enlaces de hidrógeno con las 4 bases nitrogenadas. Para nuestra secuencia, el resultado sería 5´-YTH-ATH-GGI- GAR-3´ y que presentaría sólo 48 permutaciones. Sin embargo, el uso de la inosina reduce la temperatura de hibridación y por esta razón se puede obtener una elevada amplificación de productos inespecíficos. d. Finalmente, los nucelótios del extremo 3´ preferentemente deben ser G o C y no N, I o T, ya que la timidina (y la inosina) no pueden hibridar específicamente. Se prefieren las guanosinas y citidinas ya que estas bases se enlazan mediante 3 puentes de hidrógeno y por lo tanto son mas fuertes que el par A-T. Tabla 1. Alfabeto de nucleótidos degenerados que se usa para el diseño de iniciadores degenerados.

Letra A G R K S B H N C T Y M W D V I

Especificaciones Adenosina Guanosina puRina (A o G) Keto (G o T) Strong (G o C) Not A (G, C o T) Not G (A, C o T) ANy (A, G, C o T) Citidina Timidina pYrimidina (C o T) aMino (A o C) Weak (A o T) Not C (A, G o T) Not T (A, C o G) Inopina

EJERCICIOS 1. Utilizando el programa primer3 diseñe el par de iniciadores específicos que le permitan amplificar las siguientes secuencias génicas: a) GATGCTGCTTATTGAATATTGCCCTGAAGGAGGCAGAGATGGGTGGTCTGGA GAACTGGGTGGGCAATACCCCCCTGTGTGAGTTGCGGCGTCTGTCGCCCCA TGCGGGGGTGCGGATTTTCGGAAAGCTGGAGGGGAACAACCCCGCCGGTT CGGTCAAGGATCGCCCGCCTTGAACATGATTCGTCGGGCGCTGGAGCGGGG CACCATCACCCCCGCTACACGTCTGATCGAACCGACCAGCGGGAATACGGG CATCCGCCCTGGCCATGGCGGCATCGGTACGCGGATTGTCCATGACGCTGA TCATGCCAGACAATATGAGCATCGAAAGGCGCCAGGTGATGCGTGCCTACG GAGAAGGAGTGCTCGCGGGCATCTCTTCGGGCGGAGCGCTGGCGGCGGCG 56 |

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ATACGGGTGGCGCAGCATCTGGAGGTTGGCGTGATCGTCGTCATCATCTGC GATCGGGGTGACCGCTACCTCTCTACCGGGCGTTTTTCCGGCCTGACGCAAT GATGCAAGGGGCGCAGCAGGGTCTTGCCGA b) ATGAGTGTAGGAACCAGGATACAGGATGTGCTCCTCCTTTTCGGGGAATTGC GCAACGCGCCATACGCACCGGCGGTTTTTGCCACCAGCTTCGGGGCGGAAG ATATGGTGCTCACGGACCTGATTGCGAAACATGCGCCCTGGATAGAGATATT CACCCTCGATACCGGTCGTTTACCGGAGGAAACCTACCGGCTGATGCAGGA AACCCGGGGGCA..............................CGCGCGCCATCTCCCCCGGCCAGGATA TCCGCGCGGGTCGTTGGTGGTGGGAGAATCCGGCCACCAGAGAGTGCGGC CTGCATGTCATTGACGGCAAACTGGTCCGCGCCAAGCCAGTAACACCACAA AAAACTTCAGGACAAATATGATGCATACTACAGCCGAAAAACATGTTC c) ATGAATACGCTCGAAGCCGAATCCCTCGGAATCCTGCGCGAAGCCGTAGCC GAGGCGCGCAAGCCGGTGATGCTGTATTCCATCGGCAAGGATTCCTCGGTA ATGCTGCACCTGGCGCGCAAGGCCTTTGCGCCGGGTCCGCTGCCCTTTCCG TTGCTGCATGTGGACAC............................GGCTGCTATCCCCTCACCGCCGCT GTCGAAAGCGATGCCGATACCCTGGAGGCGGTGATCGCCGAAACCCTGGC CGCACGCAGCTCCGAGCGCGCCGGGCGGCTGATCGACCATGACAGCTCCG GCTCCATGGAACGCAAGAAGCAGGAGGGCTATTTCTGATGAACGGTCGCTT GCGTT 

Acceda a la implementación de Primer3 en el White Head Institute, en la siguiente dirección: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi. Le aparecerá la siguiente ventana

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Pegue la secuencia en el campo de texto en la parte superior de la página de primer3, como se muestra a continuación. Presione el botón “Pick Primers” y espere unos segundos.

 Debe encontrarse ahora en la página de resultados de primer3:

 Regrese a la página inicial de primer3 con el botón de regreso de su navegador e ingrese la secuencia correspondiente a su primer, por ejemplo GTTCCGGAATTCGCGCGCG, en el cuadro de texto justo debajo de la opción de escogencia del primer izquierdo, como se muestra a continuación. Presione “pick primer” y observará que región de su secuencia se amplificará.

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 Pero ... ¿es esto todo lo concerniente al diseño de primers? No!, por supuesto que no, aún es posible realizar algunos otros análisis. Por ejemplo mediante mFold2 podemos visualizar el tipo de estructura secundaria susceptible de ser formada por nuestros primers. Este tipo de visualización puede resultarnos de ayuda a la hora de corregir ciertos parámetros. Visite la siguiente dirección: http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfoldsimple.html o alternativamente: http://mfold.burnet.edu.au/dna_form. En cualquiera de los dos casos se encontrará con un formulario donde podrá ingresar la secuencia del primer a analizar. Deberá ingresar una cuenta de correo electrónico válida, donde los resultados le serán enviados. 2. Diseñe los “primers” degenerados a partir de las siguientes aminoacídicas correspondientes al extremo N-terminal de unas proteínas: a) EAAWWA b) VFFDKDQ c) DDLESNR BIBLIOGRAFÍA 1. Alberts, B Johnson, A. Lewis,J, Raff, M. Roberts, K and Walter, P (2002) Molecular Biology of The Cell. G.S. Fourth Edition. Garland Science 2. Sheeler (1993) Biología Celular, estructura bioquímica y función. Ed. Limusa. México.

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PRÁCTICA N° 15 COMUNICACIÓN CELULAR DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS a) AMP cíclico b) Cascada de señalización c) Dominio de homología con la plecstrina (PH) d) Dominio SH2 e) Factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) f) GMP cíclico g) Grb2 h) Molécula señal extracelular i) Proteínas amplificadoras j) Proteínas de anclaje k) Proteínas integradoras l) Proteínas moduladoras

m) n) o) p) q) r) s) t) u) v) w)

Proteínas de transmisión Proteínas de armazón Proteínas transductoras Proteína de señalización intracelular Proteína G Receptor Receptor acoplado a proteína G Receptor quinasa con secuencias repetidas ricas en leucina (LRR) Receptor serina /treonina quinasa Receptor tirosina quinasa Vía de señalización

PROBLEMAS 1. ¿A qué se debe que células distintas puedan responder de manera diferente a la misma molécula señalizadora, incluso cuando estas células tienen los mismos receptores? 2. Un incremento en la concentración de cGMP en las células de la musculatura lisa del pene causa una relajación de los vasos sanguíneos y desencadena una erección. Explique de que forma la molécula señal NO (óxido nítrico) y el fármaco viagra producen un aumento en el cGMP. 3. Considere una vía de señalización que se produce a través de tres proteínas quinasa, las cuales se activan secuencialmente por fosforilación. En caso, las quinasas están unidas formando un complejo señalizador mediante una proteína de armazón; en el otro caso, las quinasa difunden libremente (Fig. 15-2). Analice las propiedades de ambos tipos de organización en términos de amplificación de la señal, velocidad y potencial de entrecruzamiento entre las vías de señalización.

Figura 15-2. Una cascada de proteínas quinasa organizada por una proteína de armazón o compuesta por componentes que difunden libremente. 60 |

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4. Si la señalización apareció como una solución a las demandas de la pluricelularidad, ¿cómo explican entonces los mecanismos tan similares de señalización que utilizan los animales y el hongo unicelular Saccharomyces cerevisiae? 5. La maduración del fruto es un proceso complicado de desarrollo, diferenciación y muerte (excepto para las semillas). El proceso se desencadena por cantidades mínimas del gas etileno. Normalmente, el etileno es producido por los propios frutos a través de una vía bioquímica, cuya etapa limitante está controlada por la ACC sintasa, la cual convierte la S-adenosilmetionina en un compuesto de ciclopropano que es el precursor inmediato del etileno. El etileno inicia un programa de expresión génica secuencial que incluye la producción de varias nuevas enzimas, incluyendo la poligalacturonasa, que probablemente contribuye a debilitar la pared celular. La compañía en la que trabaja, Agribucks, está intentando obtener tomates mutantes que no pueden sintetizar su propio etileno. Este fruto podría estar más tiempo en la parra y desarrollar su sabor mientras aún permanece verde y firme. Se podrían transportar en este estado robusto de inmadurez y exponerse al etileno justo antes de su llegada al mercado. Esta estrategia debería permitir que se vendieran en su mejor momento y el proceso no implicaría la adición de aditivos artificiales de ningún tipo. Decide utilizar una aproximación antisentido, que funciona especialmente bien en plantas. Pone el cDNA de la ACC sintasa en un vector de expresión de plantas de manera que el gen se transcriba al revés, lo introduce en la célula de tomate y regenera la planta por completo. Con total seguridad, la producción de etileno se inhibe en un 99.5% en estas tomateras transgénicas y su fruto no alcanza la maduración. Pero cuando se ponen en presencia de una pequeña cantidad de etileno, se convierten en preciosos y sabrosos tomates rojos maduros en 2 semanas. ¿De qué manera supone que la transcripción del gen del la ACC sintasa en sentido reverso bloque la producción del etileno? 6. La proteína Ras funciona como un interruptor molecular que se activa gracias a un factor intercambiador de nucleótidos de guanina (GEF) que le permite unirse al GTP. Una proteína activadora de GTPasa (GAP) inactiva el interruptor al estimular a Ras para que hidrolice su GTP unido a GDP de una manera mucho más rápida que en su ausencia. Así, Ras actúa como un interruptor de la luz que una persona lo enciende y otra lo apaga. En una línea celular que carece de la GAP específica de Ras, ¿qué anormalidades en la actividad de Ras, si es que hay alguna, esperaría encontrar en ausencia de señales extracelulares? ¿Y en su presencia?

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PRÁCTICA 16 CÁNCER DEFINA LOS SIGUIENTES TÉRMINOS a) Carcinoma b) Carcinógeno c) Leucemia d) Linfoma e) Metástasis f) Progresión tumoral g) Sarcoma h) Gen Rb i) Gen supresor de tumores

j) k) l) m) n) o) p) q)

Oncogén Protooncogén Retinoblastoma Proteína Rb Virus tumoral Cáncer colono-rectal p53 Promotor tumoral

PROBLEMAS 1. Ahora que la secuenciación del DNA es tan barata, fácil y rápida, su tutor ha construido un consorcio de investigadores que persigue el ambicioso objetivo de rastrear todas las mutaciones de un conjunto de tumores humanos. Ha decidido centrarse en el cáncer de mama y en el cáncer colono-rectal puesto que son responsables del 14% de las muertes por cáncer. Para cada uno de los 11 cánceres de mama y de los 11 cánceres colono-rectales, diseña cebadores para amplificar 120,839 exones en 14,661 transcritos de 13,023 genes. Como controles, amplifica las mismas regiones a partir de muestras de DNA tomadas de dos individuos normales. Secuencia los productos de PCR y utiliza un software analítico para comparar las 456 Mb de la secuencia tumoral con la secuencia del genoma humano publicada. Queda estupefacto al encontrar 816,986 mutaciones puntuales. Este dato representa más de 37,000 mutaciones por tumor. Seguramente no puede ser cierto. Después de pensar en ello un buen rato, se da cuenta de que el ordenador produce a veces errores al nombrar las bases. Al analizar la causa del error, inspecciona visualmente cada lectura secuenciada y encuentra que puede excluir 353,738 cambios; el número se reduce así a 463,248 mutaciones, o alrededor de 21,000 mutaciones por tumor. Todavía demasiadas A. ¿Puede sugerir al menos otras tres fuentes de mutaciones aparentes que en realidad no contribuyen al desarrollo del tumor? B. Después de aplicar diferentes criterios para filtrar cambios de secuencia irrelevantes, encuentra un total de 1,307 mutaciones en los 22 cánceres colonorectales y de mama, o aproximadamente 59 mutaciones por tumor. ¿Cómo podría decidir cuáles de estos cambios de secuencia se corresponden con mutaciones relacionadas con el cáncer y cuáles es probable que sean mutaciones “pasajeras” producidas en genes que no tienen relación con el cáncer (pero encontradas en los tumores por que sean producido en las mismas células con mutaciones verdaderamente cancerosas)? C. ¿Detectará su exhaustiva estrategia de secuenciación todos los posibles cambios genéticos que afectan a los genes diana de las células cancerosas?

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