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PRÁCTICA NO. 5

EXTRACCIÓN DE UN A ENZIMA Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EQUIPO 3 De los Santos Cortés Jhonatan Durán Luján Diana Victoria Monroy Ponce Edgar Palestina López María Fernanda

INTRODUCCIÓN En éste experimento visualizaremos y demostraremos la activas que realizan las enzimas fuera del organismo a partir de un proceso de hidrólisis de la sacarosa, así como realizaremos la comprobación acerca de la cantidad de producto en dependencia del tiempo de reacción entre enzima-sustrato transcurrido. Además identificaremos la producción de amilasa como producto de la hidrólisis del almidón. Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: pero transcurre a una velocidad muy baja. En la actividad enzimática, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Debido a que las enzimas son extremadamente selectivas con sus sustratos y su velocidad crece solo con algunas reacciones, el conjunto de enzimas sintetizadas en una célula determina el tipo de metabolismo que tendrá cada célula. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación de una reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reacción, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente reacción no catalizada. Durante el metabolismo de la sacarosa, ésta se convierte en glucosa y fructosa. La glucosa y la fructosa se transforman hasta alcohol etílico y CO 2 a través de varias reacciones. Esta serie de transformaciones se realizan mediante la acción de enzimas que actúan como catalizadores. En el metabolismo de las levaduras la sacarosa se convierte en glucosa y fructuosa. Como la sacarosa no es azúcar reductor, podemos detectar la actividad de la sacarosa por transformación de azúcares reductores.

OBJETIVOS 1-. Demuestra la actividad enzimática fuera del organismo a partir de los productos de la hidrolisis de la sacarosa. 2-. Comprueba que la cantidad del producto depende del tiempo de reacción enzima-sustrato transcurrido. 3-. Identifica la producción de amilasa como producto de la hidrolisis del almidón. PROBLEMA BIOLÓGICO ¿Afectará la concentración del sustrato y la temperatura a la actividad enzimática? HIPÓTESIS Al saber que la sacarosa es la enzima especifica de la sacarosa, se intentará evidenciar que la misma puede degradarse al romper los enlaces beta-gucosidico en sus productos finales glucosa y fructuosa por ello mismo se demostrará la activad enzimática.

DESARROLLO EXPERIMENTAL PARTE 1 EXTRACCION DE UNA ENZIMA A) Se suspendieron 0.5 g de levadura seca en 5mL de acetona fría. Esto mata a las células pero no destruye la enzima. Se dejó reposar la suspensión de la levadura en acetona por 20 a 30 minutos. Decantamos la acetona para secar la preparación de levadura sobre el papel absorbente. Suspendimos el polvo acetónico de levadura, en la solución amortiguadora. Agitamos durante 15 minutos Imagen 1 Levadura con acetona. (Foto de: Dos Santos J.) así recuperamos el sobrante que contiene la enzima.

B)

En 8 tiras de glucocitina, se hicieron 2 filas con 4 tiras respectivamente. En dos recipientes de reloj uno marcado con agua y otro con sacarosa, se les agregó 0.5 mL de la enzima obtenida anteriormente. Imagen 2Vidrios de reloj con sus respectivas sustancias. (Foto de: Dos Santos J.)

Utilizando un palillo diferente para cada solución se removió hasta que quedó una mezcla homogénea y procedimos a medir la cantidad de azúcar que se ha formado con las tiras de glucocitina. Al paso del tiempo la cantidad de azúcar aumenta, haciendo que los colores cambien de tono.

Imagen 3Tiras indicadoras, con enzima, sin enzima y muestra. (Foto de: Dos Santos J.)

En un tubo de ensaye agregamos 2mL de solución glucosa, agregando 10 gotas de reactivo de Benedict. Se calentó el tubo a baño María durante 5 minutos. Observamos si cambió de color, se repitió el procedimiento de la solución de la carosa.

Imagen 4Calentamiento a baño maría de un tubo de ensaye con reactivo de Benedict. (Foto de: Dos Santos J.)

En otro par de tubos de ensaye colocamos 2 mL de solución de extracto enzimático de levaduras y al segundo 2 mL de agua destilada, agitando por 15 minutos.

Pasando los 15 minutos, en ambos agregamos 10 gotas de reactivo Benedict, se calentaron a baño María durante 5 minutos observando el cambio de color que se pudo generar en alguno de los tubos. SUSTANCIA Imagen 5Tubos con presencia de cambio deSaliva color. (Foto de: Dos Santos J.) Trigo Avena Soya PARTE 2 ACCION ENZIMATICA DE Alfalfa GERMINADOS VEGETALES A) Posteriormente en la segunda parte de la práctica, machacamos 5 gramos de diferentes germinados en un mortero con 10 mL de agua destilada.

MEDIDA 1.7cm 2.3cm 1.5cm 2cm 1.0cm

Y en una caja Petri lo cual contenía gelosa-almidón, la dividimos en cuatro sectores. En cada sector perforamos con un gotero un pequeño círculo, y en cada una se colocaron cinco gotas del macerado de los dientes germinados, y se les añadió saliva. Imagen 6 Alfalfa machacada en mortero. (Foto de: Dos Santos J.)

Dejamos una de las cajas de Petri a temperatura ambiente por 24 horas. Pasado un tiempo añadimos lugol hasta cubrir la superficie de la paca. Dejando reposar durante una hora la caja de Petri para verificar si los halos se conservan del mismo diámetro.

Imagen 7Division de caja de Petri. Alfalfaavena-soya-trigo-saliva (foto de: Dos Santos J.) Medida del diámetro tomado después de de reposo:

24hrs

Imagen 8 Caja Petri con lugol después de 24hrs. (foto de: Dos Santos J.)

ANÁLISIS DE RESULTADOS Y DISCUSIÓN: Por medio de los resultados logramos conocer la actividad enzimática. En el experimento de la glucocinta, de acuerdo a los resultados obtenidos observamos que en el vidrio de reloj con agua y solución enzimática no ocurrió un cambio ya que las enzimas no se activan al no tener como sustrato de glucosa lo cual en la fila “B” si se logra cambiar de color debido a que contiene sacarosa y las enzimas ayudan a obtener glucosa fructosa. Por medio de los tubos con sacarosa y glucosa con reactivo de benedict podemos identificar las azucares reductoras, las sacarosas no cambian de color porque no es una azúcar reductora. CUESTIONARIO PARTE 1 EXTRACCION DE UNA ENZIMA 1.- ¿Cómo demostraría que la levadura se encuentra muerta después del tratamiento con acetona fría? Porque las células de la levadura necesitan estar a una temperatura de mínimo 30 grados centígrados al enfriar la temperatura estas mueren. 2.- Si observas las tiras reactivas de la fila B desde el tiempo cero, se nota que gradualmente va apareciendo un tono verde en ella mientras se encuentran húmedas. Esto no se desarrolla en la muestra comparativa de la fila A. ¿A qué lo atribuye? A que en la fila “A” no hay presencia de glucosa, mientras que en la fila “B” al haber sacarosa esta se descompone en fructuosa y glucosa, por lo que la glucocinta cambia de color. 3.- ¿Cómo demostraría que la sacarosa por si sola es incapaz de descomponerse en glucosa fructuosa? Mediante el uso de agua destilada, ya que la mezcla que tenía agua destilada no cambió en su concentración. Se utiliza después una glucocinta, pero al no haber cambio de color después de determinado tiempo se comprobará que la sacarosa no se descompuso por sí sola. 4.- Investigue cuál es la composición del reactivo de Benedict.

El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato anhídrido de sodio, sulfato cúprico y citrato de sodio. 5.- ¿Qué es un azúcar reductor? Los azúcares reductores son aquellos que poseen su grupo carbonilo intacto, y que a través del mismo pueden reaccionar con otras moléculas. Se unen con otras moléculas de manera inespecífica. Se dice que un azúcar es reductor cuando puede oxidarse. 6.- ¿Es la sacarosa un azúcar reductor? Explique. No contiene ningún átomo de carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí, covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor. 7.- ¿Cómo se llama la enzima que se extrajo de la levadura? Sacarosa. PARTE 2 ACCION ENZIMATICA DE GERMINADOS VEGETALES 8.- ¿Cómo explica el cambio observado en los dos últimos tubos a los que añadió reactivo de Benedict? El Na2CO3 confiere a la solución un pH alcalino necesario para que la reacción pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solución ya que tiene la propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solución de azúcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullición, el azúcar en solución alcalina a elevadas temperaturas se convertirá en D-gluconato y su ene-diol, rompiéndose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionarán con el Cu++. Se obtiene entonces el azúcar oxidado y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH- presentes en la solución para formar el hidróxido de cobre. El hidróxido pierde agua. La aparición de un precipitado amarillo, anaranjado o rojo que evidencia la presencia de un azúcar reductor. 9.- ¿Por qué se utilizaron los diferentes germinados y la saliva? Para comparar las diferentes cantidades de glucosa que cada uno posee. 10.- ¿Cuál será la explicación si los halos son de diferentes diámetros? A mayor diámetro de halo la concentración de glucosa es mayor. 11.- ¿A qué se debe la coloración azul alrededor de los halos?

Al reactivo de lugol que solo ha teñido a la parte del agar que no tiene presencia de glucosa pura. 12.- ¿Cuál es el nombre del compuesto químico que ha funcionado en esta prueba y qué tipo de actividad ha realizado? Enzimática, el almidón de la caja de Petri se empieza a descomponer por acción de distintas enzimas, por ejemplo la saliva contiene una enzima capaz de romper las cadenas de almidón: la ptialina. 13.- ¿A qué conclusiones se llegaría, en caso de que se presente algún cambio si se deja a temperatura ambiente la caja de Petri que se mantuvo en el refrigerador? La mayoría de las reacciones químicas aumentan su velocidad a medida que aumentamos la temperatura. Un incremento en la temperatura resulta en un importe mayor de energía cinética a las moléculas restantes, lo que conduce en un mayor índice de colisiones productivas por unidad de tiempo.

CONCLUSION En esta práctica hemos concluido que las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una reacción química que energéticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja sea sistemáticamente favorable, es decir actúan sobre otras moléculas denominadas sustratos las cuales se convierten en moléculas diferentes denominadas productos, casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran en tazas significativas. En esta práctica también nos dimos cuenta lo que ocurría cuando se le agregaba diferentes sustancias a la enzima, como factores tales como la temperatura y el tiempo definía la calidad de reacción y la identificación del sustrato o azúcar que existe en una reacción enzima- sustrato.

BIBLIOGRAFIA Rev.R.Acad.Cienc.Exact.Fís.Nat. (Esp) Vol. 101, Nº. 2, pp 399-417, 2007 VIII Programa de Promoción de la Cultura Científica y Tecnológica http://www.rac.es/ficheros/doc/00552.pdf González-Morán Ma.G. 1996. Técnicas en Biología Celular. AGT Ed.S.A.