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Espectrometría de masas,

Emilio Rodríguez Fernández

Espectrometría de masas Las moléculas de gas son ionizadas y aceleradas en un campo eléctrico. A continuación, el haz pasa a un campo magnético donde se resuelve en sus componentes iónicos con la misma relación m/z. Las partículas más ligeras (42He+), se desvían en mayor medida que las más pesadas (126C+). La variación del campo magnético hace que pasen por el colector las distintas partículas.

Introducción El primer espectrómetro de masas fue desarrollado por J. J. Thomson en 1912 para demostrar la existencia de isótopos estables trabajando en tubos de vacío. Un espectrómetro de masas esencialmente usa un campo eléctrico y/o magnético para ionizar y separar los iones atendiendo a la relación masa/carga, m/z, donde m es la masa en dalton (Da) y z el número de cargas elementales. Un dalton es una uma, unidad de masa atómica con referencia al 12C6, y equivale a 1/NA g. 1 uma = 1 Da = (1/12)[(12 g 12C/mol12C)/6,023·1023 átomos de 12C/mol 12C] = 1,66054·10-24 g/átomo de 12C = 1,66054·10-27 kg/ átomo de 12C. Un espectrómetro de masas es un aparato en el cual se producen iones a partir de la muestra, los separa de acuerdo con su relación masa/carga, m/z y proporciona un registro en función de la intensidad (número de iones). Consiste en una fuente de iones, un analizador y un detector. Este número se obtiene dividiendo la masa de un ion por el número de cargas que tiene. Dado que la mayoría de los iones de la espectrometría de masas tienen una sola carga se puede identificar esta relación con la masa del ion. Existen muchos tipos de fuentes pero durante mucho tiempo ha sido usado el impacto electrónico. En este caso se requiere tener la muestra en estado gaseoso a una presión de 10-6 torr, la cual va a interaccionar con un haz colimado de electrones procedente de emisión termoiónica desde un filamento de volframio o renio y una intensidad de 10-4A. Lo que le suceda a la molécula de la muestra dependerá de la energía de estos electrones. Se usa normalmente una energía de 70 eV, que provoca la expulsión de un electrón de una molécula de la muestra para dar el catión radical [M·]+, que recibe el nombre de ion molecular el cual a su vez puede fragmentarse en iones o especies neutras menores. Otra posibilidad es que la muestra capture un electrón, con fragmentación o no, dando iones cargados negativamente. Una variación de esta técnica consiste en la ionización química que emplea iones producidos anteriormente como fuente para impactar sobre la muestra, en vez de impactar directamente los electrones. En ambos métodos se exige la vaporización previa de la muestra. Los compuestos no volátiles o que se descompongan térmicamente no es posible estudiarlos por estas técnicas. Para

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paliar esta limitación han sido desarrollados métodos de desorción que facilitan la producción de iones a partir de fases condensadas, sólidas o líquidas. El primero de estos métodos muy usado ha sido el de desorción de campo (field desorption), en el cual los iones son desorbidos mediante la aplicación de un potente campo eléctrico (109-1010 V/m), producido al aplicar un alto potencial a una arista aguda o a un filamento fino. Se trata de transferir energía a la muestra de manera que moléculas o iones de esta muestra pasen a la fase gaseosa. Otras fuentes de energía pueden ser haces de iones (espectrometría de masas de iones secundarios, ‘secondary ion mass spectrometry’, SIMS), o átomos con alta energía normalmente argón (fast atom bombardment, FAB). El FAB ha tenido un amplio desarrollo y aplicabilidad a multitud de sistemas como proteínas, conglomerados (clusters) de haluros alcalinos y complejos organometálicos. Una característica de los métodos de desorción es la alta proporción de ion molecular que se produce. Se pueden determinar pesos moleculares de hasta 9000 uma. La espectrometría de termoespray (thermospray mass spectrometry, electrospray ionization, ESI), consiste en la inyección directa de una disolución de electrolito mediante un capilar calentado en vacío. El disolvente se evapora rápidamente de las gotitas dejan simples iones negativos y positivos gaseosos. No se precisa de energía adicional para generar iones, por lo que se observa poca fragmentación con esta técnica, incluso se observan dicationes como [Me3N(CH2)3NMe3]2+. En los espectrómetros de alta resolución los iones son acelerados aplicando un potencial de algunos miles de voltios. Después son analizados en un campo electrostático y en un campo magnético. Estos campos electrostático y magnético colocados perpendicularmente a la dirección de los iones hace que estos se muevan en círculos de un radio r que depende de la relación m/z. Además tiene un efecto de enfoque de estos haces de iones. Los iones acelerados con un potencial V en un campo magnético B adquieren un radio: r2 = 2Vm/B2e donde e es la carga z del ion Espectrómetro de doble enfoque. Los iones que emergen de la fuente son acelerados mediante el potencial V. Después deflectados y enfocados por el analizador electrostático. Por último, son deflectados y enfocados por el analizador magnético según su relación m/z.

Variando el campo magnético o el voltaje de aceleración es posible hacer llegar al detector diferentes iones a la vez que la corriente de iones es medida y es proporcional al número de iones y a la intensidad del pico registrado. El espectro es una simple representación de la corriente de iones frente a las relaciones m/z. Los espectrómetros de cuadrupolo son caros de baja resolución pero rápidos. En ellos se envía un potencial y una radiofrecuencia a cuatro barras paralelas (ver

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más adelante). La mayoría de los iones tienen la carga simple de un electrón pero es posible obtener iones de dos o tres cargas. Otro tipo de espectrómetro de masas es de resonancia ciclotrón, que tiene especial aplicación en el estudio de reacciones con iones o moléculas. En ellos los iones se mueven circularmente en un campo magnético con una frecuencia angular que depende de la relación m/z. Cuando esta frecuencia entra en resonancia con un campo eléctrico alternante de radiofrecuencia, se produce una absorción de energía que detecta el ion.

A).Esquema de un equipo FAB. B) Detalle de la fuente FAB: Cañon de átomos (a) y rayo de átomos (b); portamuestras metálico (c); extremo de la sonda(d); disolución de la muestra (e); placa de extracción de iones (g); enfoque hacia el analizador(h).

Método FAB Se utiliza un rayo de gas inerte (argon o xenon) de una energía de 5-8 keV, procedente de un cañón de átomos. Se usan también Cs+ en lugar de átomos neutros de Xe e incluso moléculas como SF6 han sido utilizadas como agentes para el bombardeo de la muestra. Como matriz para la dispersión de la muestra se utiliza 3-nitrobencilalcohol (NBA) o glicerol. Puede reaccionar la matriz con el compuesto o incluso el compuesto (especialmente si tiene mercurio), con el extremo de la sonda que suele ser de cobre. Frecuentemente se obtiene especies protonadas (M+1). También se pueden estudiar los iones negativos (FAB-), en este caso normalmente como especies desprotonadas.

Métodos de desorción La irradiación de una muestra con un pulso de láser de alta intensidad produce iones susceptibles de ser analizados. Esto se denomina desorción con láser (LC) y es útil para moléculas polares o no volátiles, pero el limite se sitúa en 5-10 kDa, debido a que la energía trasferida se emplea en la ruptura y no deserción a partir de ciertos tamaños moleculares. Una restricción de esta técnica es la corta duración del ion por lo que no se emplea como analizador cuadrupolos o sectores magnéticos, se usa preferentemente para TOF (time3

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of-flight). La introducción de una matriz con el analito permite evitar parte de los inconvenientes. La matriz debe absorber eficazmente el pulso del láser y tener una masa lo suficientemente pequeña que permita la sublimación. El analito debe estar disuelto en la matriz en baja concentración para una más eficaz ionización. El mecanismo no está totalmente dilucidado. Un esquema aparece a continuación.

Analizadores de sector magnético Es el analizador clásico en los aparatos de masas. En los últimos años paralelamente al desarrollo de técnicas de ionización más suaves como MALDI y ESI, ha hecho que se desplace el uso de este analizador a favor del cuadrupolo para ESI y TOF para MALDI o el más versátil FT-ICR-MS. Utilizan un imán permanente o un electroimán para hacer que el rayo de iones que surge de la fuente realice una trayectoria circular. Se puede realizar un barrido de los iones producidos y que pasan por una rendija, variando el potencial de aceleración o el valor del campo magnético. La energía cinética de los iones en la rendija de salida para un ion de carga z y masa m es: Ec = zeV = (1/2)mv2, donde V es el potencial aplicado, v la velocidad del ion después de la aceleración y e la carga del electrón (e = 1,60·10-19 C). Todos los iones que dejan la rendija tienen prácticamente la misma energía cinética pero los más pesados viajarán más lentos en el sector magnético. La trayectoria seguida en el sector magnético es un equilibrio entre la fuerza magnética y la fuerza centrífuga: FM = Bzev, Fc = mv2/r; Bzev = mv2/r; v = Bzer/m; B, intensidad del campo magnético. Sustituyendo en la expresión de la energía cinética:

m/z = B2r2e/2V Esta expresión nos indica que los espectros de masas se pueden registrar variando una de las tres variables (V, B, r), manteniendo las otras dos constantes. Los aparatos más modernos tienen un electroimán que permite variar el campo B manteniendo V y r constantes. Aplicación: ¿Qué potencial de aceleración se necesita para dirigir una molécula de agua con una carga através de la salida de una rendija sabiendo que el imán tiene una fuerza de campo de 0,240 teslas y el radio de curvatura del ion a través del campo es 12,7 cm?. carga se cada ion ze = 1x1,60·10-19 C

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r = 0,127 m masa m = [18,02gH2O+ /mol]/[6,02·1023H2O+/mol] = 2,99·10-23 g = 2,99·10-26 kg V = B2r2ez/2m = [(0,240W/m2)2(0,127m)2(1,60·10-19 C)]/2x2,99·10-26 kg = 2,49·103[W2C/m2kg] = 2490 V. La equivalencia de las unidades se puede deducir de las definiciones: 1 weber (W) = N·s·m/C; N = kg·m/s2; J = N·m = V·C

Espectrometría de masas TOF La espectrometría de masas basada en la duración de la trayectoria de un ion (TOF-MS, Time-of– flight Mass Spectrometry), ha sido desarrollada desde hace cincuenta años pero solo recientemente ha cobrado importancia cuando se han fabricado aparatos de mayor resolución. Este analizador no tiene prácticamente límite en el rango de masas a estudiar y se obtiene el espectro en pocos microsegundos. Ha cobrado importancia para los aparatos MALDI (MatrizAssisted Laser Desorption/Ionization) Componentes de TOFMS. Cuanto más grande es el ion, menor es su velocidad y más tiempo tarda en atravesar el espacio de campo cero (field-free, Ed = 0)

En el caso ideal todos los iones producidos en la fuente abandonan la fuente al mismo tiempo y con la misma energía cinética porque han sido acelerados por el mismo potencial. En este caso el tiempo de vuelo de los iones dependerá solo de m/z. Despreciando el tiempo de extracción del ion de la fuente, la expresión para el TOF es: (m/z)i = 2e·E·ls[ti/ld]2 (m/z)i = relación para el ion i; E = campo para la extracción del ion; ti = TOF; ls = longitud de la fuente; ld = longitud recorrido del ion donde Ed = 0; e = 1,6022x10-19 C/ electrón. Se puede incrementar la resolución diseñando el aparato con tubos de largo recorrido o provistos de de dispositivos especiales como el reflectrón.

Analizador de cuadrupolo En este analizador se emplea únicamente campos eléctricos para separar los diferentes iones de acuerdo con su m/z. Consiste el cuadrupolo en cuatro barras paralelas entre las cuales pasan los iones seleccionados. Estas barras o polos tienen un voltaje fijo DC, y un voltaje alterno RF. Dependiendo del campo aplicado solamente los iones de una relación m/z particular podrán pasar entre los polos, los demás iones serán expulsados de esta trayectoria. La longitud y el diámetro de estas barras determina la resolución de estos aparatos.

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Cada dos barras opuestas tienen un potencial +[U+Vcos(Zt)] y -[U+Vcos(Zt)], donde U es un potencial fijo y Vcos(Zt)] es una radiofrecuencia de amplitud V y frecuencia Z. El voltaje aplicado varía de manera sinusoidal de forma que la polaridad entre barras opuestas es también opuesta. Entre las barras un ion oscila de manera compleja. Escogiendo valores apropiados de U, V y w solamente los iones de una determinada m/z podrán atravesar el cuadrupolo sin desviación y alcanzar el detector. Todos los iones con una oscilación de mayor amplitud acabarán impactando Analizador cuadrupolo. Consiste en en torno a 1-2 en las barras y no alcanzarán el detector. En la práctica se tipo suele fijar la frecuencia potencial eléctrico que varía con el MHz. tiempo formado, a su vez, por una componente dc (U) y una componente ac (Vcos(Zt)); aplicados a elementos opuestos. Solamente iones con una determinada m/z llegarán al detector, haciendo un barrido de U y V simultáneamente. Se aprecia la trayectoria de un ion estable y otro inestable.

Analizador de iones confinados Estae analizador consiste en tres electrodos hiperbólicos: Un electrodo anular,un electrodo de entrada y otro de salida. Estor electrodos forman una cavidad en la cual es posible atrapar y analizar los diferentes iones. Los electrodos de entrada y salida poseen un agujero que permite el paso de los iones y entre ellos se coloca el electrodo anular. Los iones procedentes de la fuente entran en la cavidad. Al electrodo anular se le aplica un potencial variable producido por una frecuencia constante con lo que se produce un potencial cuadrupolar 3D dentro de la cavidad quedando atrapados los iones de una determinada m/z. Durante la detección los potenciales se alteran de manera que se desestabilizan las trayectorias y expulsan los iones axialmente en el orden de su m/z a la vez que son enfocados hacia el detector.

Componentes básicos de un espectrómetro de trampa de iones

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Iones moleculares El proceso más simple que ocurre en un aparato es la interacción de un electrón con una molécula, resultando como efecto del impacto la pérdida de un electrón de la misma dando un catión radical. Este ion tiene la misma masa que la molécula de la que proviene y es el ion molecular, suele ser el ion de mayor masa del espectro, sin embargo iones de masa superior pueden originarse por subsiguientes reacciones ion-molécula. Para el carbonilo de manganeso se observa un ion a masa m/z = 390 uma que corresponde a la masa molecular Mn2(CO)10. El pico molecular no tiene porque ser el más intenso del espectro, incluso puede no ser visible. Con el impacto electrónico la intensidad del pico molecular puede ser incrementada rebajando el potencial y la energía del haz de electrones, con lo que hay menos energía para la fragmentación. La información con este método se relaciona con la obtenida mediante el espectro de fotoelectrones (UPS y XPS). Los métodos de ionización proporcionan un ion molecular más prominente, especialmente la desorción con láser. El método de desorción informa sobre la estructura de la fase condensada que pasa a gas, esta estructura puede ser diferente del estado sólido o líquido de la muestra original. Cuando la ionización se consigue con la técnica FAB, los fragmentos de iones no suelen ser muy prominentes, pero el pico más intenso no es necesariamente el ion molecular. La muestra se mezcla con un agente dispersante como el glicerol. Los iones positivos se forman por protonación por lo que aparecen masas una unidad mayor de la esperada o con una masa una unidad menos si son aniones que se forman por desprotonación. Una ventaja especial del FAB es que pueden ser estudiados ambos iones positivos y negativos a partir de una muestra iónica. En este caso los iones pueden ser observados sin protonación o desprotonación, pero el espectro se puede complicar por la formación de ‘clusters’ o conglomerados. Así el espectro de NaX muestra picos de [Na2X]+. El caso extremo lo presenta el CsI que origina series de iones [CsnIn-1]+, pudiendo n llegar hasta 60, a la vez que proporciona un excelente método para calibrar el aparato. La determinación de la masa de un ion por el número entero más cercano a veces no es suficiente. Así, un carbonilo de hierro da el ion molecular cerca de 504 uma. Como el hierro tiene masa 56 (equivalente en primera aproximación a 2CO), se puede ajustar la masa a la fórmula Fe(CO)16, Fe2(CO)14, Fe3(CO)12, Fe4(CO)10, Fe5(CO)8. Con aparatos de alta resolución se puede medir la masa en unas pocas ppm. En este ejemplo las masas para la tercera y cuarta fórmula son 503,7438 y 503,6889; comparando con el espectro es fácil decidir que fórmula es la más adecuada. Un mismo valor de masa puede ser atribuido a más de una composición. así en los hidruros de boro existen ambos átomos 10B y 11B por lo que 10BH y 11B tienen la misma masa. Con alta resolución se puede ver la composición isotópica de cada pico y además se conocen ambos valores con suficiente precisión (11,0209 y 11,0093 uma), como para decir la participación en el hidruro en cuestión. Además del boro muchos otros elementos tienen más de un isótopo por lo que aparecen en el ion moléculas como una serie cuya intensidad depende de la abundancia natural de cada isótopo. Esto vale de diagnóstico de la presencia de un elemento en un determinado fragmento. 7

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Composición isotópica para algunos átomos, grupos de átomos o moléculas. Se puede simular la composición para cualquier agrupamiento atómico, utilizando un programa adecuado (www. webelements.com).

Fragmentación Cuando una molécula es ionizada en un espectrómetro el exceso de energía puede ser cedida al ion, sobre todo si se trata de impacto electrónico y moléculas gaseosas. El ion puede ser formado en un estado excitado y probablemente se fragmentará dando una parte neutra y otro ion. Una posterior fragmentación puede ocurrir de manera que el espectro resultante contenga un gran número de iones con abundancias que van a depender de diversos factores como la vida media y estabilidad de sus precursores. Un cuidadoso estudio puede conducir a establecer la vía de fragmentación así como la evaluación de las energías de enlace. Una simple molécula ABC puede dar cuatro fragmentos iniciales: Rotura del enlace A-B y fragmentos [A]+ y BC o A y [BC]+. Rotura de B-C, [AB]+ y C o [C]+ y AB. Todo esto puede suceder y además la posterior rotura de los demás iones. Así el espectro de puede incluir alguno o todos de los posibles iones: [ABC]+, [AB]+, [BC]+, [A]+, [B]+ y [C]+. No aparece el ion [AC]+ lo que evidencia que el compuesto no es BAC o ACB. Sin embargo otras reacciones de reagrupamiento pueden ocurrir y no se puede asegurar que un grupo de átomos, que aparecen en un fragmento, estén necesariamente unidos en la molécula original; se pueden haber originado en un reagrupamiento posterior. En el espectro de Re2Cl2(CO)8 hay fragmentos en los que se van perdiendo hasta los ocho carbonilos pero siempre aparece el núcleo Re2Cl2, lo que evidencia la unión de ambos átomos metálicos por puentes de cloro.

Reacciones de iones En un espectro de masas se obtienen los productos de todos los iones posibles pero poco se puede saber de las reacciones entre ellos. Algunos iones tienen una vida media corta y se disocian mientras se mueven en el espectrómetro. Un ion de masa m1 es acelerado después de la ionización pero un ion diferente procedente de él, m2, pasa por el analizador magnético. el pico resultante que llega al analizador, no es ni de m1 ni de m2 sino una masa que es m* = (m2)2/m1. Los iones metaestables que normalmente son observados son los formados en los 10-5 segundos transcurridos entre los analizadores del campo eléctrico y magnético, dan lugar a picos muy anchos en comparación a los picos observados normalmente, como aparece en la figura.

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Espectrómetro de masas de geometría invertida, usado para el registro de espectros MIKES. Se ha + seleccionado el ion m2 y se analizan los iones procedentes de su descomposición en el analizador

Para el estudio de estos iones metaestables se puede usar un aparato con los analizadores invertidos. El campo magnético puede ser ajustado de manera que solo determinados iones pasen por la segunda rendija. Este ion decae en una serie de iones hijos que son recogidos por el analizador electrostático, dando un espectro de los iones provenientes de este ion. Un ejemplo de este análisis de la energía cinética de iones (mass-analyzed ion kinetic energy, MIKES) aparece en la figura siguiente

El espectro del ion molecular del sulfuro de la fosfina [Cl(C6F5)2P=S]+ se descompone dando C6F5S por lo que se puede suponer que tiene lugar un reordenamiento de Arbusov , a la forma [Cl(C6F5)P-C6F5]+, antes de descomponerse. También otro desarrollo de la espectrometría de masas es la espectrometría tandem o espectrometría de varias etapas (multi-stage mass spectrometry, MS/MS). Aquí una muestra es ionizada y los iones son separados en el espectrómetro. Se selecciona un determinado ion y se le transfiere energía mediante un proceso de colisión, hasta fragmentarlo. Los iones producidos son analizados en un segundo espectrómetro. Dos son las aplicaciones más importantes.

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a) Una herramienta analítica muy poderosa para mezclas de picogramos siendo posible distinguir entre isómeros. b) Es un método para estudiar la descomposición de iones selectivamente. Así se pueden obtener iones de masas 164 y 165 de [(Me3P)2BH2]+Br-. Ambos iones difieren sólo en el diferente contenido de isótopos de boro. Los picos que tienen la misma masa en MS/MS no contendrán boro,

mientras que los que tengan boro tendrán masas diferenciadas en una unidad. La fórmula empírica de los iones hijos puede ser determinada de esta manera.

Datos termodinámicos En un experimento en el cual es necesario suministrar energía a una molécula para fragmentarla se podrá controlar esta cantidad de energía suministrada y concluir acerca de las reacciones que tienen lugar. En primer lugar por impacto electrónico es posible variar la energía de los electrones y hallar la energía mínima a la cual un ion molecular se forma. Es necesario una práctica muy cuidadosa para obtener resultados satisfactorios mediante una curva de eficiencia de ionización de la cual es posible obtener el potencial de ionización de una molécula. En la figura aparece la curva para el O2. En este caso los potenciales que van apareciendo son claros y la corriente de iones es lineal con el potencial del haz de electrones empleado. El gradiente va cambiando a diferentes potenciales, precisamente, los puntos de inflexión corresponden al comienzo de los diferentes orbitales moleculares. Los resultados son concordantes con el espectro de fotoelectrones en el espectro ultravioleta (UPS) y con los diagramas de orbitales moleculares.

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Para moléculas más complejas datos combinados de ambas técnicas pueden suministrar información acerca de la descomposición. Si un ion [AB]+ se descompone en [A]+ y B, entonces el potencial al que aparece [A]+ será la suma del potencial de ionización más la energía de disociación de AB. Si el ion se forma en un estado excitado obtendremos el límite superior de la energía de disociación, pero esto no es frecuente para el caso de iones positivos. Por supuesto si la energía de ionización de B es menor que la de A obtendremos A y [B]+ como productos principales. Si el fragmento iónico tiene una energía conocida podemos deducir la energía de disociación. Esto ocurre en el ejemplo siguiente en el cual la ionización para producir el fragmento [MX3]+ es conocida.

Espectrometría de masas por electrospray La característica del esta técnica de ionización, ESI, es que normalmente proporciona muchas cargas a la muestra, especialmente cerca del peso molecular. El molecular ion está altamente cargado y sufre muy poca fragmentación. Por ejemplo, cuando se somete a esta técnica la seroalbúmina bovina (M = 66266 Da), produce iones cargados entre +40 y +65 con valores de m/z desde 1658 y 1020, respectivamente. De esta manera se pueden determinar masas de iones de alto peso molecular en un rango modesto de m/z. Se utiliza el electrospray (ESI-MS), para el análisis de muchos compuestos tales como glicoproteínas, nucleótidos, DNA, RNA y oligonucleótidos, fulerenos, polímeros sintéticos, complejos inorgánicos. Proporciona una buena ionización de moléculas biológicas térmicamente lábiles, interacciones de biomoléculas como DNA con otra molécula o fármaco, inhibición de enzimas, interacción proteína-proteína. Es una técnica de amplia utilización en investigación farmacéutica, biotecnología y estudios bioanalíticos.

Representación de un aparato ESI-MS (thermospray mass spectrometry, electrospray ionization). 12

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El proceso del electrospray En este proceso se produce un fino aerosol de gotitas en presencia de un potente campo eléctrico. Desde que Zeleny registró este procedimiento hace 80 años, ha encontrado aplicaciones en aplicaciones electrostáticas de pinturas, atomización de fueles en combustiones, propulsión de cohetes, aplicaciones de medicamentos y, por supuesto, en la ionización por electrospray. Requiere este método un flujo continuo de la disolución por un capilar muy fino en presencia de un campo eléctrico elevado. El líquido es expelido en forma de gotitas cargadas con una relación carga-volumen que se aproxima al valor máximo físico permitido que se consigue cuando la densidad de carga superficial excede a la tensión superficial de la gotita. La inestabilidad de la gota se manifiesta como una ‘explosión de Coulomb’. Se cree que el disolvente se pierde cuando sucede esta explosión y se producen gotas más pequeñas. No está claro si los iones escapan de las gotitas o bien se evapora todo el disolvente dejando libre a los iones.

Acoplamiento del espectrómetro de masas al electrospray El capilar de electrospray es un capilar de diámetro ”100 Pm de metal o de vidrio con una diferencia de potencial aplicada de ±1-5 kV (positivo para los cationes y negativo para aniones). La solución del analito se pasa por el capilar a 0,01-10 PL/min y es nebulizado en la ‘pluma’ del electrospray. Por ejemplo para péptidos se utilizan concentraciones de 10-5-10-7 M y un disolvente MeOH/H2O, 50/50 con 1% de acético. Quitar el disolvente es muy importante para el análisis. Esto se hace en un capilar de desolvatación que tiene un diámetro interno de 400 Pm~1mm y una longitud de 10~25 cm. Se emplea una contracorriente de nitrógeno caliente y puro. Los dos extremos del capilar están recubiertos de oro y se le aplica una diferencia de potencial entre ambos extremos y los elementos de los alrededores. Después se colocan una serie de conos para eliminar el disolvente con diámetros de apertura desde 300 Pm a 1,5 mm. Estos transmiten al espectrómetro de masas los iones procedentes de la muestra. También los campos eléctricos en estos conos van a guiar a los iones. La transmisión de iones desde la fuente hasta el analizador se debe potenciar mediante ciertos dispositivos como las lentes de Einzel o una serie de cuadrupolos u octopolos de radiofrecuencia. Este último consiste en cuatro barras de electrodos situados de manera equidistante y en pares. A ellos se le aplica un potencial ac o dc variable con el tiempo. Solamente los iones con un muy fino margen m/z son transmitidos por el cuadrupolo. Los iones fuera de este rango se mueven en órbitas inestables y colisionan con los electrodos. Los iones que llegan al detector producen una corriente eléctrica proporcional a su abundancia o intensidad del pico.

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Espectro ESI-MS de la cadena D de la hemoglobina humana donde se aprecia el fenómeno de especies con multicarga, siendo la más abundante, en este caso, la especie con 17 protones. Cada uno de estos picos puede

ser resuelto con un aparato de mayor resolución es una serie de picos debidos a las proporciones de C12 y C13; en la figura se aprecia esta estructura fina para la especie [M+20H]20+.

Interpretación del espectro EIS-MS En otras técnicas se producen iones simplemente cargados, y, de esta manera, la medida de m/z coincide con la masa del analito. En el espectro ESI-MS no es tan sencillo ya que es necesario considerar la multicarga. En la figura aparece un espectro de la cadena D de la hemoglobina humana. Ha sido obtenido con una muestra de diez eritrocitos intactos equivalentes a sólo 4,5 fmol (fentomoles, 10-15 mol), de hemoglobina. La envoltura del pico es un síntoma de la protonación de la especie para originar el fenómeno de multicarga característico de este método en moléculas grandes. Cada pico en la figura representa a un analito y se diferencia de los picos contiguos según el numero de protones capturados, es decir de su carga total. Cada pico se puede representar así [M+zH]z+ donde M es la molécula neutra y z el número de protones capturados, estando el aparato trabajando en modalidad de ionización positiva. En modo negativo los picos corresponden a [M-zH]z-. Las proteínas son susceptibles de protonación, especialmente los restos de aminoácidos que tienen grupos amino (lisina y arginina); por lo que se pueden obtener buenos espectros en modo positivo de disoluciones a pH bajos que faciliten esa protonación. Un algoritmo simple puede ser aplicado a un simple conjunto de picos, basado en la asunción de que cada pico se diferencia de sus vecinos por una sola carga (es decir, protones en este caso). La carga de un pico, el valor de zLOW se determina así:

zLOW = (m/z)HI/{[m/z)HI-(m/z)LOW]}/'n  donde zLOW es la carga de un pico seleccionado de bajo m/z, (m/z)LOW, 'n es el número de picos entre este pico y otro pico seleccionado como alto (m/z)HI. Por ejemplo, si se etiqueta arbitrariamente el pico de m/z = 757,2 como (m/z)LOW y el pico a 1164,6 como (m/z)HI, 'n es 7 y, según la ecuación, la carga del pico a 757,2 es:

zLOW = 1164,6/[(1164,6-757,2)]/7 = 20,01 § 20

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Conocida la carga de un pico (que debe ser un número entero), la carga de los demás picos se puede calcular por simple adición o sustracción. Así el pico situado a 797,1 corresponde a [M+19H]19+, el pico a 834,3 es [M+18H]18+ y el 1261,5 a [M+12H]12+. De esta medida de m/z y conocida la carga, la masa iónica mi, es:

mi = (m/z)·z La masa del analito neutro es

Mr = [(m/z)·z]-zMa donde z es el número de aductos cargados, M. En este caso Ma = 1,007, por tratarse de protones. La masa de [M+20H]20+

Mr = 757,3x20-(20x1,007) = 15125,9 Da Como cada estado de carga da una masa independiente, la masa está influenciada por el promedio de la forma de la envoltura del pico

Mr = (1/N)6iMr, donde iMr es la masa de un pico y N el número de estados de carga considerados. Los espectrómetros de alta resolución pueden resolver la estructura fina de un determinado pico de una carga determinada. Los compuestos contienen isótopos de cada elemento en concordancia con su abundancia natural. Por ejemplo, el carbono está formado por 98,9% del isótopo 12 (12,000.... uma) y 1,1 % de C-13 (13,0034 amu). amu es la unidad de masa atómica, uma. Las moléculas poliatómicas muestran una distribución isotópica basada en la distribución natural de los diferentes átomos. En la figura podemos ver la expansión para el pico [M+19H]19+ en la que aparece la alta resolución para el isótopo de C-13. Cada pico difiere del adyacente en el número de átomos de C-13 incorporados. El pico monoisotópico con todo C-12 no se observa claramente, solo se presenta en una proporción del 0,5% con relación a los picos que incorporan uno o varios C-13. La diferencia de masas entre dos picos es simplemente la diferencia de masas de ambos isótopos, 1,0034 amu. Así la carga de la envuelta total del pico es: z = 1/'(m/z) donde '(m/z) es la diferencia de m/z entre dos picos isotópicos vecinos. La carga de la envuelta isotópica de la figura es z = 1/(757,294-757,244) § 20. La masa del pico neutro a m/z = 757,244 es 757,244x20-20x1,007 = 15124,74. Los picos isotópicos es posible distinguirlos con suficiente resolución por su diferencia en una unidad de masa si el ion tiene una sola carga, para un ion con doble carga esta diferencia es 0,5 y, en general 1/z para el ion con carga z.

Espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICPMS) Constituye actualmente una de las técnicas más importantes para el análisis elemental debido al bajo límite de detección conseguidos para la mayoría de los elementos, su buena selectividad y razonable precisión y exactitud. Aquí una antorcha de ICP sirve de atomizador y ionizador. Se introduce la muestra en forma de disolución mediante un nebulizador convencional o ultrasónico. para muestras sólidas se puede utilizar la ablación por chispa o láser. los iones producidos en la antorcha se introducen a través de una interfase de vacío diferencial unida al espectrómetro cuadrupolar. Los espectros son mucho más sencillos que los

15

Espectrometría de masas,

Emilio Rodríguez Fernández

anteriormente descritos ya que consisten en una serie sencilla de picos de isótopos de cada elemento presente en la muestra. Fuente de plasma de acoplamiento inductivo o antorcha

Instrumentos de transformada de Fourier (FT) Como ocurre con los aparatos de IR y de NMR los espectrómetros con transformada de Fourier proporcionan unas relaciones señal/ruido superiores a los aparatos convencionales así como velocidad, resolución y sensibilidad elevadas. Es posible la determinación de masas moleculares superiores a 106 Da y resolución de 105. La parte esencial del aparato es una trampa de iones en la cual éstos circulan en órbitas bien definida durante largos periodos. Estas cavidades se construyen aprovechando el fenómeno de resonancia de ion ciclotrón.

Resonancia de ion ciclotrón (ICR) Un ion gaseoso formado o conducido en un campo magnético describe un movimiento circular en un plano perpendicular a este campo magnético. La frecuencia angular de este movimiento se llama frecuencia de ciclotrón, Z dada en radianes por segundo y se puede derivar de la expresión anteriormente escrita

Z = v/r = zeB/m Para un campo fijo esta frecuencia depende sólo de la inversa de m/z. El aumento de la velocidad del ion debe ir acompañada de un aumento de radio para que Z sea constante. Un ion atrapado en esta trayectoria circular es capaz de absorber energía de un campo eléctrico de corriente alterna, siempre que la frecuencia del campo eléctrico sea la misma que la del ciclotrón. La energía absorbida aumenta la velocidad del ion y por lo tanto su radio, sin alterar Z. La trayectoria original se representa por el círculo más pequeño. La aplicación del campo eléctrico hace que aumente la velocidad y el radio según la trayectoria punteada. Cuando la señal de corriente alterna acaba el radio vuelve a ser constante según el círculo continuo más grande. Cuando la región entre las placas contiene un grupo de iones con la misma relación m/z, la aplicación de la señal eléctrica de frecuencia coincidente con la del ciclotrón permite agrupar todas las partículas en un movimiento coherente en fase con el campo. Los iones de frecuencia

16

Espectrometría de masas,

Emilio Rodríguez Fernández

diferente, diferente m/z, no están afectados por el campo de corriente alterna. El movimiento circular coherente de los iones crea la llamada ‘corriente de imagen’ que es susceptible de ser observada al finalizar la señal de frecuencia suministrada. Así, si el interruptor se desconecta de la posición 1 y se conecta a la 2, se observa una corriente que disminuye proporcionalmente con el tiempo. Esta corriente-imagen es corriente de inducción o provocada por el movimiento circular de los iones que tienen la misma m/z. Por ejemplo, cuando un grupo de iones se aproxima a la placa superior los electrones son atraídos desde tierra a esa placa, dando lugar a una corriente momentánea. Cuando el grupo continúa hacia la otra placa la dirección del flujo de electrones se invierte. La magnitud de la corriente alterna resultante depende del número de electrones en el grupo. La frecuencia de la corriente es característica del valor m/z de los iones del grupo. Esta corriente se utiliza en los espectrómetros de ion ciclotrón para medir la concentración de iones que son recogidos en resonancia cuando se aplica diferentes frecuencias de señal. Esta corriente-imagen inducida se amortigua en pocas decenas de segundo o varios segundos debido a que se va perdiendo el carácter coherente del grupo de iones. Esta disminución de corriente-imagen proporciona una señal dependiente del tiempo y que es similar a la señal FID de los experimentos de FT-NMR. Todas las frecuencias y sus equivalentes m/z, dan lugar a un espectro acumulado frente al tiempo (free induction decay, FID), que se almacena en el computador, convirtiéndolo seguidamente en un espectro en función de la frecuencia o de m/z.

Espectrómetros con transformada de Fourier En primer lugar se generan los iones mediante un breve impulso de un haz de electrones. Los iones atrapados en la celda de iones se someten a una radifrecuencia que aumenta linealmente durante su tiempo de vida. Por ejemplo se puede utilizar un impulso de 5 ms aumentando la

Duración de una señal de radiofrecuencia (a) y de la imagen transitoria (b), [izquierda]. Variación con el tiempo (a,b) de la frecuencia o de la masa de Cl3HCCH2Cl. [Derecha].

frecuencia desde 0,07 a 3,6 MHz. Finalizado el barrido la corriente-imagen se amplifica, digitaliza y se almacena en la memoria. La señal amortiguada se transforma para dar una señal de frecuencia que a su vez puede mostrarse como una señal dependiente de la masa. La resolución de un espectrómetro con transformada de Fourier es muy elevada ya que está limitada por la medida de la frecuencia más que por las rendijas o medidas del campo. La frecuencia se puede medir con alta precisión de manera que la resolución de estos aparatos es de orden de 106. 17

Espectrometría de masas,

Emilio Rodríguez Fernández

Trayectoria de un ion en un campo magnético. La línea continua representa la trayectoria original del ion. La línea punteada espiral es la trayectoria cuando se conecta brevemente en 1. La línea continua exterior es la trayectoria cuando se abre el interruptor de nuevo.

Resolución de un espectrómetro de masas La resolución es la capacidad de un espectrómetro de masas para distinguir entre las masas de dos picos próximos. Dos picos próximos se consideran resueltos cuando la altura del valle entre ellos no sobrepasa el 10% de la altura media de ambos. Se expresa: R = m/'m 'm es la diferencia entre las masas de dos picos adyacentes que están resueltos y m es la masa nominal del primero, o la masa media de ambos picos. Dos picos se consideran bien separados o resueltos si la altura del valle entre ellos no excede en un porcentaje, normalmente el 10%, de su altura. Un aparato con una resolución de 4000 podrá distinguir bien entre dos picos con valores de m/z de 400,0 y 400,1 (o de 40,00 y 40,01). Para diferenciar entre iones de la misma masa nominal tales como C2H4+, CH2N+, N2+ y CO+ (todos de masa 28), de masas exactas de 28,0313, 28,0187, 28,0061 y 27,9949 Da respectivamente; se necesitará un aparato con una resolución de varios miles. Si los iones del problema difieren en una unidad de masa o más y de baja masa molecular, se pueden resolver con un aparato de menor resolución. Así para distinguir entre NH3+ (17 Da) y CH4+ (16 Da) bastará una resolución inferior a 50. Los aparatos comerciales tienen resoluciones desde 500 a 500000. Aplicación: ¿Qué resolución se necesitará para separar los dos primeros iones citados? 'm = 28,0313-28,0187 = 0,0126; R = 28,025/0,0126 = 2220.

Bibliografía DA Skoog, FJ Holler, TA Nieman, Principios de Análisis Instrumental, 5ª ed, McGraw-Hill. EAV Ebsworth, DWH Rankin, S Cradock, Structural Methods in Inorganic Chemistry, Blackwell http://www.ionsource.com/ Programas y cálculos en MS. http://www.ionsource.com/tutorial/spectut/spec1.htm Interpretación ESI-MS. http://masspec.scripps.edu/information/history/ Visión historica de MS.

18

Espectrometría de Masas

4. ESPECTROMETRIA DE MASAS La espectrometría de masas (EM) es una técnica de análisis basada sobre la separación de acuerdo a sus razones masa/carga de las especies cargadas formadas a partir de la ionización de una muestra. Se trata de una técnica extremadamente sensible, de gran versatilidad y cuyos campos de aplicación experimentan un crecimiento vertiginoso en nuestros días. La EM suministra información muy valiosa sobre los compuestos químicos: la masa molecular, la fórmula global y, a partir del patrón de fragmentaciones, la estructura molecular. asi como la composición isotópica en sustancias naturales o marcadas. Debe reiterarse la elevada sensibilidad de la EM (en condiciones muy especiales pueden detectarse señales correspondientes a sólo 10 iones) por lo que es la preferida para la determinación de trazas en química ambiental y en los controles antidopaje. Los orígenes de la EM se remontan al estudio de la conducción de la electricidad en los gases a finales del siglo XIX. El descubrimiento por Goldstein en 1886 de los rayos canales (iones positivos) y la medición de su razón masa/carga por Wien en 1898, mediante deflexión bajo

la acción de campos eléctricos y

magnéticos, son los hitos iniciales del desarrollo de la espectrometría de masas. Wien encontró que los rayos canales tenían carga opuesta y una razón masa/carga muy superior a las del electrón, determinada ese mismo año por J.J.Thomson. Thomson comienza en 1905 a estudiar estos rayos canales positivos y recibe en 1906 el premio Nóbel de Física por sus estudios de la conductividad eléctrica en gases. En 1913 logra separar iones con diferente razón masa/carga, determinando la existencia de los dos isótopos del neón 22 P

P

20 P

P

Ne y

Ne. Francis Aston construye en 1919 el primer espectrógrafo de masas rudimentario con un poder de

resolución de 130 y recibe en 1922 el premio Nóbel por su descubrimiento, mediante el espectrógrafo de masas, de un gran número de isótopos de elementos no radiactivos. 1934 Mattauch y Herzog desarrollan un espectrómetro de masa de doble enfoque y Dempster en 1936 la fuente de ionización por chispa. En 1937 Aston construye un espectrógrafo con un poder de resolución de 2000. En 1931 Lawrence desarrolla el ciclotrón por lo que recibe el premio Nóbel en 1939 y sus principios son aplicados al enriquecimiento de uranio en el proyecto Manhattan. La urgente necesidad de métodos de análisis eficientes de las fracciones de petróleo durante la segunda guerra mundial llevó a la aplicación de la EM al campo de los compuestos orgánicos. Los primeros EM comerciales aparecerán al finalizar la guerra. En 1946 Stephens presenta al concepto de EM con analizador de tiempo de vuelo. La aplicación de la EM a los compuestos orgánicos y el estudio de las fragmentaciones como fuente de información estructural se desarrollan muy rápidamente desde fines de los años cuarenta del siglo XX. En 1956 Mc Lafferty propone la reacción de transferencia de hidrógeno o reordenamiento que 243

Espectrometría de Masas

lleva su nombre. En 1959 se comienzan a desarrollar los sistemas acoplados (cromatógrafo gaseosoespectrómetro de masas). Aparecen nuevos métodos de generación de iones y de analizadores. En 1966 se introduce la ionización química y en 1968 Dole desarrolla la ionización por electronebulización. En 1974 Comisarow y Marshall diseñan la EM mediante resonancia ión ciclotrón-transformada de Fourier y en 1976 Mc Farlane y colaboradores desarrollan la EM por desorción de plasma. En los años ochenta se desarrollan nuevas técnicas de ionización efectivas que permiten la ionización de especies no volátiles, con mínima descomposición. Estos métodos abren las puertas a las aplicaciones de la EM al campo de las macromoléculas y en particular las biomoléculas. En 1984 Fenn y colaboradores aplican la electronebulización para ionizar biomoléculas. En 1985 Hillencamp, Karas y otros describen la ionización por desorción con láser inducida por matrices (MALDI) y en 1987 Tanaka perfecciona el método para ionizar proteínas intactas. En 1989 Paul recibe el premio Nóbel por el desarrollo de la trampa de iones. En 2002 Fenn y Tanaka reciben el premio Nóbel de Química por el desarrollo de métodos de ionización por desorción suaves para el análisis por EM de macromoléculas biológicas. 4.1 Espectrómetro de masas 4.1.1 Principios Los fundamentos de la espectrometría de masas pueden ejemplifican mediante la técnica de ionización electrónica. Electrones acelerados a través de un campo eléctrico adquieren energía cinética considerable y pueden interactuar con moléculas (M) para originar especies cargadas: M .+ + 2e-

M + eEn este caso M

.+ P

P

P

P

es un catión-radical molecular. Normalmente

M

.+ P

P

se forma en un estado excitado y

puede sufrir fragmentación , que puede ser de diferentes formas: E+ + P

P

M

P

P

P

P

P

P

.+ P

P .+ + Los iones E + y

R . (radical)

P

N (molécula)

P .+ a su vez pueden fragmentarse y así sucesivamente. La forma de fragmentación P

P

dependerá en cada caso de la estructura molecular. La mayoría de los iones producidos tiene una carga correspondiente a la pérdida de un solo electrón (e = 1.6 10 -19 C), aunque también se pueden obtener iones P

P

multicargados. La carga total de los iones se representa usualmente por q (q=ze), donde e es la carga del 244

Espectrometría de Masas

electrón y z el número de cargas sobre el ión. Todos los iones producidos son separados en un espectrómetro de masas de acuerdo con su razón masa/carga. La masa se expresa en unidades de masa atómica (u) o Dalton (Da) (1u = 1Da = 1.6654 10 -2 7 kg) de manera que la razón masa/carga (m/z) se expresa en Thompson (Th = P

PP

P

Da/z). Los iones así separados son detectados como corrientes iónicas

cuyas

intensidades son

proporcionales a sus abundancias respectivas. Procesando esta información se obtiene un espectro de masas (EM), tal como se muestra en la Figura 4.1

Figura 4.1 Espectro de masas del metanol obtenido mediante una fuente de ionización por EI. Representado como gráfico de líneas y como tabla.

El pico más intenso en el EM se denomina pico base y en los gráficos de líneas, como el mostrado en la figura 4.1, se utiliza como intensidad de referencia para el resto de los picos significativos. De acuerdo con lo descrito hasta el momento, un espectro de masas puede ser representado por un gráfico en el cual el eje (x) corresponde a la razón m/z de cada ión y el eje (y) a la abundancia o intensidad relativa correspondiente a cada valor de m/z. Para obtener un espectro de masas es necesario: -

Introducir la muestra en forma y cantidad apropiada [Sistema de introducción de la muestra]

-

Producir iones [Fuente de ionización]

-

Separar los iones de acuerdo con su razón m/z [Analizador]

-

Registrar (detectar) el resultado de la separación de los iones [Detector ]

-

Representar los resultados.

En la Figura 4.2 se muestra esquematicamente un espectrómetro de masas, en este caso con ionización electrónica y analizador magnético.

245

Espectrometría de Masas

Figura 4.2 Esquema de un espectrómetro de masas Como se puede apreciar, la relación de los aspectos necesarios para obtener un espectro de masas de hecho incluye los componentes básicos de un espectrómetro de masas. Todos los espectrómetros de masas tienen que funcionar en condiciones de alto vacío. Esto es necesario para lograr que los iones puedan llegar al detector sin interactuar con otras moléculas gaseosas .Esas interacciones unidas a las que pueden ocurrir con las paredes del instrumento provocan que los iones pierdan su carga. Por otro lado, las interacciones ión-molécula pueden producir reacciones no deseadas e incrementar la complejidad de los espectros. Reducir el número de interacciones es tan importante que resulta necesario utilizar sistemas de bombas de vacío muy eficientes, que incluyen bombas mecánicas en unión de bombas turbomoleculares, de difusión o criogénicas. 4.1.2 Sistema de introducción de la muestra En la mayoría de las técnicas utilizadas para analizar compuestos de baja masa molecular la ionización ocurre en fase gaseosa, surgiendo la necesidad de que la muestra en el espectrómetro de masas se transfiera de la fase condensada a presión atmosférica a la fase vapor (alto vacío), sin comprometer las condiciones del vacío. Para las fuentes por ionización electrónica (Electron Ionization: EI) y por ionización química (Chemical Ionization: CI) existen cuatro opciones principales: -

Recipiente de calentamiento de tabique con válvula de entrada. Es básicamente un recipiente de calentamiento conectado a la fuente iónica. La muestra se inyecta al recipiente a través de un tabique. Este sistema se utiliza para gases y líquidos volátiles.

-

Sonda de inyección directa. La muestra se carga en un tubo de cuarzo al final de una sonda y se inserta directamente en la fuente iónica. Si se requiere, el final de la sonda puede ser calentado. Se utiliza para sólidos relativamente volátiles. 246

Espectrometría de Masas

-

Cromatografía gaseosa (CG). La mezcla se inyecta en la columna de CG que se conecta directamente a la fuente iónica. Los componentes de la mezcla son separados por la columna de CG y entran sucecivamente en la fuente iónica. Se utiliza para mezclas volátiles.

-

Interfase de flujo de partículas. Las muestras se disuelven en un disolvente apropiado y la disolución se introduce en el espectrómetro de masas. El líquido se nebuliza con helio gaseoso para formar un aerosol de gotas de disolvente. El aerosol se pasa a través de una cámara de desolvatación y se remueven el disolvente y el helio, permitiéndose que el flujo de partículas sólidas de la muestra entre en la fuente EI o CI. Este sistema se utiliza para compuestos semivolátiles que pueden ser tratados mediante las fuentes de ionización EI y CI.

En realidad existe una estrecha relación entre el sistema de introducción de la muestra y la fuente de ionización, de tal forma que la frontera de separación entre ambas es muy difusa para otras fuentes diferentes a las EI y CI. El estudio de las fuentes de ionización permitirá profundizar también en los sistemas de introducción de las muestras. 4.1.3 Fuentes de ionización En espectrometría de masas se utiliza una variedad de fuentes de ionización, siendo la energía que se transfiere durante el proceso de ionización y las propiedades químico-físicas de la especie a ionizar, los dos aspectos más importantes que deben considerarse en relación con las mismas. Algunas técnicas de ionización producen iones con gran exceso de energía, y se denominan técnicas duras, dando lugar a una fragmentación extensiva de la muestra. Otras, por su parte, sólo producen esencialmente el ión molecular y se denominan técnicas de ionización blandas. Las fuentes de ionización producen iones principalmente por ionización de una molécula neutra, mediante la expulsión o captura de electrones, protonación, desprotonación, formación de aductos o la transferencia de una especie cargada a partir de una fase condensada a la fase gaseosa. La producción de iones frecuentemente implica reacciones ión-molécula en fase gaseosa. 4.1.3.1 Ionización electrónica La fuente de ionización electrónica (Electron Ionization: EI) fue la técnica inicialmente más utilizada en espectrometría de masas y su descripción permite comprender los aspectos esenciales de este método. Las moléculas pueden interactuar con los electrones para dar iones, los cuales son micropartículas cargadas eléctricamente. La interacción molécula-electrón suele denominarse erróneamente impacto electrónico, aunque no es realmente una colisión en el sentido de la Física Clásica. La fuente de EI, cuyo esquema se muestra en la Figura 4.3, consiste en un filamento cargado negativamente y calentado por una corriente que circula en el mismo que actúa como emisor de electrones. 247

Espectrometría de Masas

Figura 4.3 Fuente de iónización electrónica (EI)

Los electrones son acelerados hacia un ánodo e interaccionan con las moléculas gaseosas de la muestra inyectada en la fuente o procedente del sistema de introducción. En la Figura 4.4 se muestran los gráficos típicos del número de iones producidos por longitud de recorrido libre (cm) y por presión de la muestra (mm de Hg) (F) cuando se varía el potencial de aceleración de los electrones (o su energía cinética). Estos gráficos reciben el nombre de curvas de eficiencia de ionización.

Figura 4.4 Curvas de eficiencia de ionización.

Cuando la energía de los electrones es menor que el potencial de ionización de la especie química no se generan iones. A energía electrónicas elevadas, la interacción molécula-electrón es poco eficiente. De acuerdo con la mecánica cuántica, la interacción es de máxima efectividad cuando la longitud de onda de los electrones (λ) es comparable con las dimensiones de los enlaces (d). La existencia de un máximo ancho en la curva de eficiencia de ionización precisamente alrededor de los 70 eV (λ ≈ d ≈140 pm en moléculas orgánicas).

A este nivel de energía, pequeños cambios en la energía electrónica no afectan

significativamente el patrón espectral. Como promedio se produce un ión por cada 1000 moléculas que 248

Espectrometría de Masas

entran a la fuente en condiciones usuales, a 70 eV. En estas condiciones de 10 a 20 eV son transferidos a las moléculas durante el proceso de ionización. Dado que aproximadamente 10 eV son suficientes para ionizar la mayoría de las moléculas orgánicas, el exceso de energía origina una fragmentación abundante, pues la ruptura de enlaces químicos requiere energías del orden de 3-5 eV. La ionización utilizando electrones con energías ligeramente superiores al potencial de ionización genera iones moleculares con poca energía en exceso y poco proclives a la fragmentación. Por encima de 30eV todos los iones fragmento que se observan a 70eV ya están presentes en el espectro A un potencial de aceleración dado y a temperatura constante, el número de iones producido por unidad de tiempo I en un volumen V está relacionado con la presión p y la corriente electrónica i mediante la expresión: I=NpiV

[4.1]

Donde N es una constante. Esta proporcionalidad directa entre la corriente iónica y la presión de muestra permite la utilización de la técnica en mediciones cuantitativas. En la Figura 4.5 se muestran los espectros de EI de una β-lactama obtenidos a 70 y 15 eV. Como era de esperar, a 15 eV la fragmentación es menos abundante, detectándose más fácilmente el ión molecular.

Fig. 4.5 Espectros de masas EI de β-lactama

Sin embargo, la intensidad absoluta (en unidades arbitrarias), que es proporcional al número de iones detectados, es realmente menor a 15 eV que a 70 eV. Así, el incremento en intensidad relativa debido a la baja fragmentación es ilusorio. Realmente hay una pérdida general de intensidad debida al decremento de la eficiencia de la ionización cuando la energía electrónica es baja. Por lo tanto, en general, la fuente de EI no será muy útil para la detección del ión molecular. No obstante, la disminución de la energía de los electrones ionizantes podría favorecer algunos procesos de fragmentación, lo cual puede ser conveniente en algunos 249

Espectrometría de Masas

casos. Es necesario destacar que en el proceso de interacción entre los electrones acelerados y las moléculas, éstas pueden también ganar electrones originándose aniones-radicales (M .- ) . La formación de estos últimos P

P

requiere de apreciable electroafinidad Los aniones radicales se forman con gran energía interna fragmentándose totalmente a diferencia de los cationes radicales, donde buena parte de la energía en exceso se disipa como energía cinética de los electrones libres. Para la mayoría de las moléculas es más efectiva la producción de cationes-radicales y en la EM-EI sólo éstos serán considerados en lo adelante. Una modificación de la técnica de EI consiste en desorber la muestra a partir de un filamento de renio calentado cerca del flujo electrónico. Este método se denomina de Ionización Electrónica por Desorción (Desorption Electronic Ionization: DEI). 4.1.3.2 Ionización química La ionización química (Chemical Ionization: CI) es una técnica blanda que produce iones con pequeña energía en exceso. La fuente de CI es muy similar a la de EI, en muchos instrumentos el cambio de fuente es expedito. En la fuente CI el flujo de electrones crea un plasma de gas reactivo ionizado (por ejemplo: metano, isobutano, amoníaco, agua) que se encuentra a mucha mayor concentración que la muestra (presión parcial 60 Pa, relación gas reactivo/muestra 1000:1). La ionización se origina entonces por la interacción entre las moléculas de la muestra y el gas, y no por la interacción directa de aquellas con el flujo electrónico. Como ilustración de los procesos que tienen lugar, se muestra lo que ocurre cuando se utiliza el metano como gas reactivo. Si se introduce metano como gas reactivo, la reacción primaria con los electrones será una clásica reacción de ionización: CH4 + e

CH4 + 2e

El

ión-radical puede fragmentarse siguiendo principalmente las reacciones siguientes: CH4

CH3

+ H

CH4

CH2

+ H2

Sin embargo, en su mayor parte, dada la elevada presión, reaccionará con otras moléculas de metano dando lugar a : CH4

+

CH4

CH5

+ CH3

Otras reacciones de los iones formados con el metano ocurrirán en el plasma:

CH3

+ CH4

C2 H5

+

H2

250

Espectrometría de Masas

También se forma un ion C 3 H 5 B

B

B

+ B

P

P

CH2

debido a las reacciones sucesivas siguientes: +

CH4

+ H2

C 2H 3

+

H

C2H3 + CH4 C3 H 5 + H2 La abundancia relativa de todos esos iones dependerá de la presión. En la Figura 4.6 se muestra el espectro

del plasma obtenido a 20 Pa por ionización del metano.

Figura 4.6 EM metano a 20 Pa.

Las moléculas de la muestra M reaccionarán en su mayor parte adquiriendo un protón en una reacción del tipo ácido-base con uno de los iones del plasma si la afinidad protónica (AP, energía liberada en la protonación) de M es mayor que la del metano: MH

M + CH5

+ CH4

En el caso de moléculas que contienen heteroátomos, la reacción de ionización principal ocurre a través de reacciones ácido-base como la antes mostrada y con los iones C 2 H 5 B

B

B

+ B

P

P

y C3H5 B

B

B

+ B

P

P

. Si la muestra es un

hidrocarburo saturado RH u otro compuesto de baja afinidad protónica , la reacción de ionización principal será una abstracción de hidruro : RH

+ CH5

R + CH4

+ H2

Cuando se trate de moléculas polares, se observará también la formación de aductos ion-molécula, lo cual es un tipo de solvatación en fase gaseosa: (M +CH3)

M + CH3

Los iones ( MH)

+ P

P

, R + , ( M + CH 3 ) P

P

B

B

+ P

P

y otros aductos de iones con la molécula se denominan "especies

moleculares " o menos frecuentemente "iones pseudomoleculares o cuasimoleculares". Ellos permiten la determinación de la masa molecular de la muestra. Los procesos que ocurren en la fuente de CI son menos energéticos que los presentes en la ionización electrónica y pueden formarse tanto iones positivos como negativos de la sustancia en estudio como 251

Espectrometría de Masas

resultado de reacciones químicas con los iones del plasma. El surgimiento de iones negativos se explica porque el plasma contiene electrones de baja energía, los cuales bien fueron utilizados para la primera ionización y posteriormente se hicieron más lentos, o bien fueron producidos por reacciones de ionización. Esos electrones lentos pueden asociarse con moléculas originando así iones negativos. Los iones formados cuando se utiliza la técnica de CI son relativamente estables y los procesos de fragmentación son mucho menos acentuados que en la técnica de EI. Así, la técnica de CI tiene la ventaja de producir un espectro de masas en el cual la especie molecular es fácilmente reconocible. Consecuentemente, la ionización química es complementaria con la ionización electrónica y es muchas veces recomedable obtener ambos espectros de la muestra en estudio. En la Figura 4.7 se muestran los espectros de masas del metacrilato de butilo registrados utilizando las fuentes de CI y EI respectivamente. En el espectro de masas-EI (a) no es observable el pico del ión molecular en m/z 142 mientras que en los espectros (b) y (c) se observa el pico del ión pseudomolecular protonado en m/z 143. Cuando el gas portador utilizado es metano (espectro b) el pico base se encuentra en m/z 87 y cuando es isobutano (espectro c) el pico base corresponde al ión pseudomolecular en m/z 143.Se evidencia aquí el efecto del gas portador sobre el espectro de masas-CI. En función de la acidez del agente protonante se formarán iones MH + con mayor o menor tendencia a la fragmentación. La fortaleza como P

P

agente protonante de un ión puede expresarse como la afinidad protónica (AP) de su base conjugada, definida como la energía liberada durante la protonación. A menor afinidad protónica de un gas portador mayor será la fortaleza de su agente protonante. Con el gas portador metano cuya afinidad protónica es baja (AP = 5.7 eV) la tendencia a la fragmentación es mayor que con isobutano (AP = 8.5 eV) y en éste mayor que con amoniaco (AP = 9.0 eV), reflejando la acidez decreciente del agente protonante (CH 5 + > (CH 3 ) 3 C + > B

PB

P

B

B

B

B

P

P

NH 4 + ). B

PB

P

4.1.3.3 Bombardeo con átomos rápidos El aspecto esencial de la técnica de ionización mediante el bombardeo con átomos rápidos (Fast Atom Bombardment: FAB) es que la muestra está disuelta en una matriz líquida no volátil, siendo la glicerina la sustancia más frecuentemente utilizada con este fin. Sobre la disolución se hace incidir un flujo de átomos (Xe, Ar) con elevada energía cinética, lográndose extraer iones y partículas neutras hacia la fase gaseosa. En condiciones favorables las moléculas de la muestra forman una monocapa en la superficie de la disolución que puede mantenerse continuamente pese al bombardeo, por difusión de otras moléculas de muestra del seno de la disolución hacia dicha superficie. Esto garantiza dos características muy deseables: reproducibilidad y presencia reducida de iones procedentes de la matriz en el espectro. En la Figura 4.8 se muestra un diagrama de la fuente de ionización por FAB.

252

Espectrometría de Masas

Figura 4.7 Espectros de masas del metacrilato de butilo. (a) EI. (b) CI (metano). (c) CI (isobutano)

Figura 4.8 Fuente de ionización por FAB

De acuerdo con el diagrama, inicialmente ocurre la ionización del argón, estos iones son acelerados, y en la cámara de intercambio el choque de los iones con átomos de argón genera el flujo de átomos rápidos: Ar .+ (rápido) + Ar (lento) ------------> Ar .+ ( (lento) + Ar ( rápido) P

P

P

P

253

Espectrometría de Masas

El flujo pasa entre dos electrodos que elimina todas las especies iónicas, de manera que solamente los átomos neutros rápidos impactan sobre la muestra disuelta en la matriz. Los iones extraídos son acelerados y enfocados por electrodos hacia el analizador. El bombardeo puede realizarse con iones (Cs + ) en lugar de átomos neutros reportándose una mayor P

P

sensibilidad para masas moleculares altas. Sin embargo, la utilización de iones es desventajosa pues se acumulan cargas eléctricas en la matriz, sobre todo cuando se trata de muestras no conductoras. Si las especies a estudiar pueden ser preionizadas ya en la matriz mediante reacciones ácido-base la sensibilidad del método se eleva considerablemente La fuente de ionización FAB es muy eficiente para producir iones a partir de compuestos polares con masas moleculares altas, siendo muy útil para el estudio de péptidos y nucleótidos. Como se trata de una técnica de ionización blanda, los EM-FAB contienen esencialmente las señales de los iones pseudomoleculares y muy escasa presencia de iones fragmento. Mediante esta fuente los flujos de iones pueden mantenerse por largos períodos de tiempo, en ocasiones de varios minutos, lo cual garantiza la reproducibilidad y permite realizar diferentes tipos de análisis a la misma muestra. En la Figura 4.9 se muestra el espectro FAB de una mezcla de péptidos.

Figura 4.9 Espectro de masas FAB de una mezcla de cinco péptidos. Se detectan los iones cuasimoleculares de cada uno de dichos péptidos. La fragmentación es escasa de acuerdo al carácter blando de la ionización.

La fuente de ionización FAB tiene

baja sensibilidad comparada con otras fuentes recientemente

desarrolladas. El uso de una matriz hace que los espectros sean más complicados debido a las señales que las

254

Espectrometría de Masas

mismas introducen. En la Tabla 4.1 se dan los picos asociados a las matrices más utilizadas en fuentes de ionización FAB. Tabla 4.1 Matrices utilizadas en fuentes de ionización FAB y señales en el espectro de masas. Matriz Glicerol 45 57 75 93 Tioglicerol 45 57 91 109 Bala mágica* 103 119 135 152 Alcohol nitrobencílico 89 107 132 154 Polietilenglicol 89 133 177 219 Trietanolamina 110 150 194 267 * Mezcla eutéctica de ditiotreitol y ditioeritriol (5:1)

Picos (m/z) 185 277 369 217 323 325 155 195 279 243 307 460 459 503 547 297

461 429 309 613

553 487 461

539 515

643 613

4.1.3.4 Ionización mediante desorción por láser asistida por matriz La desorción por láser (Laser Desorption: LD) es un eficiente método para producir iones gaseosos. Generalmente, pulsos de láser intensos (10 6 - 10 10 W cm -1 ) se enfocan sobre una superficie reducida de P

P

P

P

P

P

muestra (10 -3 - 10 -4 cm 2 ), usualmente un sólido. Esos pulsos de láser actúan sobre el material de la superficie P

P

P

P

P

P

y crean un microplasma de iones y moléculas neutras, los cuales pueden reaccionar entre ellos en la densa fase vapor, cerca de la superficie de la muestra. El pulso de láser realiza ambas funciones: la vaporización e ionización de la muestra. La técnica LD se utiliza en el estudio de superficies para el análisis de la composición total de muestras, tal como la inclusión de partículas en minerales. Mediante el ajuste de la longitud de onda del láser, se logra una ionización selectiva. Dado que los iones se generan en los cortos intervalos de tiempo en que se aplica el láser, se requiere utilizar analizadores rápidos de detección simultánea o de tiempo de vuelo. La probabilidad de obtener un espectro de masas útil depende críticamente de las propiedades físicas de la muestra analizada (fotodisociación, volatilidad, etc.). Más aún, los iones producidos son casi siempre productos de fragmentación de la molécula original si su masa está por encima de 500 Da aproximadamente. Las limitaciones de la fuente de ionización LD se superan en gran medida mediante el desarrollo de la técnica MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) donde la preparación de la muestra es esencial. El proceso de ionización utilizando una fuente de ionización MALDI se realiza en dos etapas. En la primera, el compuesto que se analiza se mezcla con un disolvente que contiene moléculas orgánicas pequeñas en disolución, que se utilizarán como matriz. Estas moléculas deben presentar una absorción fuerte a la longitud de onda del láser. La mezcla se seca antes del análisis, removiéndose todo el disolvente líquido utilizado, lo cual permite obtener un sólido formado por las moléculas orgánicas pequeñas (matriz) embebido del

255

Espectrometría de Masas

compuesto que se analiza. Las moléculas de éste se encuentran completamente aisladas unas de otras en la matriz sólida. El segundo paso corresponde a la aplicación de pulsos intensos y cortos del láser sobre la disolución sólida. La irradiación con el láser induce un rápido calentamiento de los cristales debido a la acumulación de una gran cantidad de energía en la fase condensada a través de la excitación de las moléculas de la matriz. El rápido calentamiento causa la sublimación localizada de los cristales de la matriz y la expansión de ésta en la fase gaseosa, lo cual permite la entrada de compuesto intacto en la matriz extendida. Se transfiere poca energía interna a las moléculas del compuesto estudiado y éstas pueden enfriarse durante el proceso de expansión. Las reacciones de ionización pueden ocurrir en cualquier momento durante este proceso. El origen de los iones producidos en la técnica MALDI no está aún suficientemente aclarado. Los caminos de ionización química y física sugeridos para la técnica MALDI son la fotoionización en fase gaseosa, transferencia protónica en estado excitado, reacciones ión-molécula y desorción de iones preformados. El mecanismo de formación de iones más ampliamente aceptado es la transferencia protónica en fase gaseosa desde las moléculas de matriz fotoionizadas. En la Figura 4.10 se muestra un diagrama del proceso MALDI.

Figura 4.10 Diagrama de la fuente de ionización MALDI.

La fuente de ionización MALDI es más sensible que otras técnicas de ionización por láser, a lo cual contribuyen diferentes factores. El número de moléculas de la matriz excede ampliamente al de la muestra analizada, separando a éstas y evitando la formación de agrupaciones moleculares que pueden inhibir la aparición de iones moleculares. La matriz también sirve para minimizar el daño que puede causar el pulso de láser a la muestra, absorbiendo la mayor parte de la energía incidente e incrementando la eficiencia de la transferencia de energía del láser a la muestra. Por esta vía se incrementa notablemente la intensidad. También es más universal que otras técnicas de ionización por láser, pues no es necesario ajustar la longitud de onda para hacerla coincidir con la absorción de cada muestra pues es la matriz la que absorbe la radiación del láser. Además, dado que el proceso es independiente de las propiedades de absorción y tamaño del 256

Espectrometría de Masas

compuesto que se analiza, MALDI permite la

desorción e ionización de sustancias con masas

moleculares muy altas. Por ejemplo, es posible la detección de picomoles de proteínas con masas moleculares superiores a 300 000 Da. En la técnica de ionización MALDI se han utilizado láseres de diferente tipo. Los láseres ultravioleta (UV) son los más utilizados debido a su fácil manipulación y bajo costo, siendo los de nitrógeno (λ= 337 nm) los estándares. También se pueden utilizar láseres infrarrojos (IR) tales como los de CO 2 (λ= 10,6 μm). Los B

B

espectros de masas MALDI obtenidos con láseres UV e IR son esencialmente idénticos. Una de las pocas diferencias es que en MALDI-IR ocurre menos formación de aductos y menos fragmentación que con un láser UV. Los pasos más importantes para la obtención de un espectro de masas MALDI son la selección de la matriz y el protocolo de preparación de la muestra. Las matrices, como se ha señalado antes, deben tener una fuerte absorbancia a la longitud de onda del láser, masa suficientemente baja para que la sublimación ocurra con facilidad, estabilidad al vacío y prácticamente carecer de reactividad química excepto su capacidad para ceder protones. No obstante, esta generalización es insuficiente para garantizar que se pueda disponer de una matriz apropiada, que continúa siendo una selección guiada por la experiencia práctica. En la Tabla X.2 se incluyen algunas matrices UV-MALDI comunes. Una preparación típica de muestra para MALDI se logra disolviendo 20mg de ácido sinápico en 1mL de una mezcla acetonitrilo: agua: ácido trifluoroacético 50:50:0.1, se añade la muestra y finalmente se evapora cuidadosamente el solvente. Tabla 4.2 Matrices UV-MALDI comunes. Matriz Ácido α-ciano-4-hidroxicinámico Ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico(sinápico) Ácido 2,5-dihidroxibenzóico(gentísico) Ácido 3-hidroxipicolínico Trihidroxiacetofenona Ácido 5-clorosalicílico

Aplicaciones Péptidos, proteínas, compuestos orgánicos Biopolímeros de elevada masa molecular Péptidos,proteínas, carbohidratos Oligonucleótidos Oligonucleótidos, péptidos Polímeros insolubles en agua.

La espectrometría de masas con fuente de ionización MALDI es un poderoso método para el estudio de polímeros y biopolímeros sintéticos. Un espectro MALDI típico incluye principalmente especies moleculares monocargadas (iones cuasimoleculares), algunos iones con carga múltiple y muy pocos fragmentos. En proteómica se utiliza la técnica MALDI-TOF para identificar proteínas aisladas por electroforesis en gel y en la llamada peptide mass fingerprint (ver aplicaciones). En la Figura 4.11 se muestran dos espectros de masas obtenidos utilizando la fuente de ionización MALDI. Obsérvese en (a) la detección del ión molecular del anticuerpo monoclonal y de algunas especies multicargadas y la ausencia de fragmentaciones. En el espectro

257

Espectrometría de Masas

del polimetacrilato de metilo (b) pueden detectarse las especies moleculares de diferente grado de polimerización.

Figura 4.11 Espectros de masas registrados mediante una fuente de ionización MALDI: (a) de un anticuerpo monoclonal y (b) del polimetacrilato de metilo de masa molecular promedio 7100 Da donde se observa la dispersión de masas moleculares

4.1.3.5 Ionización por electronebulización (Nebulización eléctrica) La fuente de ionización por electronebulización (Electrospray Ionization: ESI) se incluye en el conjunto de técnicas denominadas de ionización a presión atmosférica (Atmospheric Pressure Ionization: API). En la Figura 4.12 se muestra un diagrama de una fuente ESI. La muestra se disuelve en una fase móvil volátil, tal como una mezcla de agua con acetonitrilo o metanol (1:1), se bombea a través de un fino capilar de acero inoxidable cuyo extremo se encuentra a un potencial eléctrico elevado (3-6 kV). Este elevado potencial unido al pequeño radio de curvatura al final del capilar crean un fuerte campo eléctrico, que produce reacciones de oxidación-reducción y hace

que el líquido emerja como gotas finas cargadas

eléctricamente. En la formación de las gotas cargadas resultan críticas la velocidad del flujo, la tensión 258

Espectrometría de Masas

superficial y la conductividad de la solución. La conductividad debe ser baja lo que implica concentraciones de electrolitos menores que 10 -4 M. La nebulización ocurre a presión atmosférica y es usualmente asistida P

P

por un flujo de nitrógeno gaseoso (el gas nebulizador) que fluye a través de un tubo coaxial al capilar principal. La niebla atraviesa una serie de cámaras con vacío creciente. En la medida en que las gotas pasan por las cámaras, se evaporan y se hacen cada vez más pequeñas debido a la evaporación del disolvente. Al mismo tiempo, dado que el área superficial de las gotas se reduce, aumenta la densidad de carga eléctrica sobre la superficie hasta llegar a un límite en que se tornan inestables y estallan.

Figura 4.12 Diagrama de una fuente por electronebulización

Un importante aspecto de la fuente de ionización ESI es la tendencia a producir iones multicargados, lo cual por una parte beneficia la exactitud de las mediciones de masas moleculares elevadas y por otra origina espectros de masas complicados. Para péptidos y proteínas las moléculas intactas adquieren un número n de protones generados por reacciones oxidativas que ocurren en la punta del capilar, de manera que los iones moleculares tienen una masa [M+nH], adquiriendo n cargas positivas. Dado que el espectrómetro de masas registra el valor de m/z = [M+nH]/n, m/z es sólo una fracción de la masa molecular en una magnitud que depende de n. Realmente el espectro consiste en una serie de iones cuasimoleculares que poseen carga múltiple [M+nH] n+ .Cada ión en la serie difiere por más o menos una carga de los iones adyacentes. Así, el P

P

espectro de masas-ESI contiene información redundante sobre la masa molecular, pues cada señal corresponde a un estado cargado de la sustancia sin fragmentar. Se han desarrollado algoritmos que transforman esa distribución de iones multicargados en una señal única. En la Figura 4.13 se muestra el espectro de masas- ESI de la mioglobina del corazón de caballo (parte superior) y el espectro obtenido luego de la aplicación de un algoritmo de deconvolución (parte inferior) que suministra la masa molecular de la proteína. La espectrometría de masas-ESI se caracteriza por su elevada exactitud, que se debe precisamente a la información redundante de m/z que origina y que corresponde a los diferentes estados con carga múltiple de cada especie analizada. Es posible resolver en los picos individuales, como los mostrados en la 259

Espectrometría de Masas

Figura 4.13, los componentes individuales correspondientes a las diferentes distribuciones isotópicas. Esto permite una determinación directa de la carga de cada pico.

Figura 4.13 Espectro de masas-ESI de la proteína mioglobina de corazón de caballo

La fuente ESI se considera una de las más suaves. Aún para moléculas altamente polares y térmicamente lábiles, se produce una escasa fragmentación. 4.1.3.6 Fuentes de ionización para compuestos inorgánicos La espectrometría de masas se aplica exitosamente en el campo de

las sustancias inorgánicas y

organometálicas, siendo destacables los notables avances que se han logrado en la diversificación de las fuentes de ionización. De éstas, la ionización electrónica es la fuente de ionización preferida para el trabajo con sustancias inorgánicas volátiles, mientras las no volátiles son analizadas mediante fuentes tales como FD, FAB o ESI. En la Figura 4.14 se muestran el espectro de masas del azufre ortorrómbico (S 8 ) obtenido con B

B

una fuente EI.

Figura 4.14 Espectro de masas del S 8 obtenido con una fuente EI. B

B

260

Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas permite realizar el análisis elemental cualitativo y cuantitativo de compuestos inorgánicos con elevadas exactitud y sensibilidad. Para el análisis elemental, la atomización de la muestra y la ionización de los átomos resultantes ocurren en la fuente. La descomposición completa de la muestra en sus átomos constituyentes resulta necesaria, porque de lo contrario se originaría un espectro de masas en el cual la superposición de picos podría causar interferencias espectrales insospechadas. Más aún, la dispersión de cualquier elemento en especies diferentes lleva al decremento en la sensibilidad de su detección. Para el análisis elemental de trazas de compuestos inorgánicos se utilizan ampliamente cuatro técnicas basadas en la espectrometría de masas, que son: ionización térmica, de chispa, de descarga incandescente y de plasma acoplada inductivamente. Todas son fuentes de ionización clásicas que se utilizan también en la espectroscopia óptica. La diferencia fundamental es que en este caso se utilizan para generar iones en lugar fotones. Las técnicas basadas en la espectrometría de masas muestran un incremento en la sensibilidad y en el rango analítico de trabajo de algunos órdenes de magnitud cuando se comparan con las técnicas ópticas de espectrometría para el análisis elemental. Las interferencias más comunes son las llamadas espectrales o isobáricas, las cuales se deben a la superposición de picos, que pueden enmascarar a las de la muestra de interés y dar resultados erróneos. Tales interferencias pueden ocurrir debido a la presencia de iones de otros elementos dentro de la matriz de la muestra, combinación elemental, formación de óxidos

o iones

doblemente cargados. Una solución al problema de la superposición de picos consiste en la identificación de las especies que interfieren y aplicar correcciones a su contribución a la señal a de la muestra analizada. Esta corrección no es apropiada cuando la interferencia es más abundante que la propia muestra. Otra solución es aumentar la resolución espectral, lo cual puede lograrse mediante espectrómetros de masas de alta resolución, capaces de eliminar muchas interferencias isobáricas y permitir la realización de análisis cuantitativos sin ambigüedad. 4.1.3.7 Consideraciones sobre las fuentes de ionización Las fuentes de ionización EI y CI son generalmente las más utilizadas para el estudio de compuestos de baja masa molecular (M < 1000 Da), volátiles y térmicamente estables. La fuente CI genera espectros que tienen información sobre la masa molecular de la sustancia analizada, mientras que la fuente EI origina una gran fragmentación, siendo muy útil para obtener información estructural. Los espectros de masas obtenidos con una fuente de ionización EI son reproducibles y pueden ser utilizados para la identificación estructural de sustancias con el auxilio de extensos bancos de datos, lo cual no ocurre con otras fuentes de ionización. Para el análisis de una sustancia es con frecuencia conveniente registrar los espectros de masas EI y CI, por su complementariedad. En el caso de compuestos térmicamente lábiles o con baja presión de vapor, los iones tienen que ser directamente extraídos de la fase condensada, para lo cual existen dos variantes: la extracción 261

Espectrometría de Masas

de iones de la fase líquida y de la fase sólida. En el primer caso, la muestra se encuentra en disolución, ésta se transforma

mediante un procedimiento de nebulización

y las

gotas formadas se introducen en el

espectrómetro mediante el auxilio de una bomba de vacío. Las fuentes de ionización por electronebulización (ESI) y termonebulización corresponden a este tipo. En el caso de la fuente FAB se utiliza una matriz líquida no volátil. La fuente FAB es útil para el estudio de sustancias de masa molecular elevada (6 kDa), no volátiles, polares y térmicamente inestables. Los péptidos, proteínas pequeñas y otros biopolímeros son ejemplos de sustancias a las cuales se ha aplicado con éxito la técnica de ionización FAB. No obstante la fuente FAB ha sido gradualmente sustituida en este campo por fuentes como MALDI y ESI. En el caso de una fuente de ionización con extracción de iones de la fase sólida, la muestra se encuentra embebida en una matriz y ésta se irradia con partículas energizadas o fotones que desorben iones cercanos a la superficie sólida. Esos iones pueden ser extraídos mediante un campo eléctrico y enfocados hacia el analizador. La fuente de ionización MALDI es apropiada para registrar espectros de masas de sustancias con propiedades similares a las descritas para la fuente FAB, pero su sensibilidad es muy superior. Se aplica a compuestos con masas moleculares por sobre 500 kDa. Dado que los iones producidos por esas fuentes son predominantemente monocargados, la elevada razón masa/carga hace necesaria la utilización de analizadores con gran alcance de masas como los de tiempo de vuelo. Por su parte, la fuente de ionización ESI es apropiada para compuestos similares a los que se estudian mediante la fuente MALDI, con una ligera reducción en la sensibilidad y en el rango de masas. Cuando se utiliza esta técnica se generan iones con carga múltiple, lo cual hace que la razón masa /carga se encuentre dentro del alcance de masas de los espectrómetros de masas comunes, aun para proteínas de elevada masas moleculares. En Tabla 4.3 se resumen los aspectos básicos analizados sobre las fuentes de ionización que hemos considerado previamente. Tabla 4.3 Aspectos básicos de algunas fuentes de ionización. Fuente de ionización

Tipo de muestra Masas relativamente pequeñas/Volátiles

Sistema de introducción CG o sonda líquida /sólida

Rango de masas Hasta 1000 Da

Características principales. Método duro. Versátil. Información estructural

Ionización electrónica (EI)

Ionización química (CI) Masas relativamente pequeñas/Volátiles

CG o sonda líquida /sólida

Hasta 1000 Da

Método blando. Pico del ión molecular.

Electronebulización (ESI)

Péptidos/Proteínas.

Cromatografía líquida/Inyección

Hasta 200 kDa

Método blando. Iones con carga múltiple.

Bombardeo con átomos rápidos (FAB).

Carbohidratos/Organometálicos/ Péptidos

Muestra mezclada Hasta en matriz viscosa. 6 kDa

Método blando, pero más duro que ESI y MALDI.

Desorción por láser asistida por matriz (MALDI).

Péptidos/Proteínas/Nucleótidos.

Muestra mezclada Hasta en matriz sólida. 500 kDa

Método blando./Masas muy altas.

262

Espectrometría de Masas

4.1.4 Analizadores Luego de que los iones se han producido en la fuente de ionización, deben ser separados y enfocados hacia el detector de acuerdo con el valor de la razón masa/ carga de cada uno. Esto se logra mediante los analizadores, que constituyen la óptica iónica de un espectrómetro de masas. Esta óptica iónica es frecuentemente un sistema de campos eléctricos y magnéticos mediante el cual un flujo de iones puede ser separado en sus componentes de acuerdo con sus valores de m/z y enfocado hacia el detector. Al sistema de campos eléctricos y magnéticos se le denomina lentes por analogía con su contraparte óptica. Las tres características principales de un analizador son el límite de masas superior o alcance de masas, la transmisión y la resolución. El límite de masas es el valor más alto de la razón m/z que puede ser medido y se expresa en thomson (Th) o unidades atómicas (u) para un ión portador de una carga elemental, esto es z =1. La transmisión es la razón entre el número de iones que llega al detector y el número de iones producido en la fuente. El poder de resolución es la capacidad del espectrómetro para detectar señales diferentes correspondientes a iones con una diferencia de masas pequeña. Al igual que existe una gran variedad de fuentes de ionización, también existen analizadores de diferente tipo. 4.1.4.1 Analizadores de sector magnético y eléctrico y lentes de enfoque eléctrico Analizador de sector magnético Cuando especies cargadas en movimiento son sometidas a la acción de un campo magnético sufren deflexión, bajo la acción de fuerzas descritas por la ley de Lorentz y cuya magnitud está gobernada por el momento del ión, tal como se muestra en la Figura 4.15. La energía cinética del ión es esencialmente la adquirida a través de la aceleración a la salida de la fuente iónica y viene dada por:

1 2 mv = zV 2

[4.2]

siendo V el potencial de aceleración aplicado a los iones que salen de la fuente iónica y z el número de cargas sobre cada ión de masa m que se mueve a la velocidad v. La fuerza centrípeta sobre el ión que experimenta la acción del campo magnético B es igual a la fuerza ejercida por dicho campo sobre una carga en movimiento y se expresa por: mv 2 = zvB r

a partir de donde :

mv = zB r

[4.3]

r es el radio del arco de la trayectoria del ión que es deflectado en el campo magnético B.

263

Espectrometría de Masas

Figura 4.15 Fundamentos del analizador magnético. Una partícula con carga z a una velocidad v experimenta al ingresar en un campo magnético B la acción de una fuerza dada por F = z v × B . Si los vectores v y B son perpendiculares la fuerza tiene una magnitud igual a zvB , produciendo una deflección que corresponde a un arco de circunferencia de radio r

De las ecuaciones [4.2] y [4.3] se obtiene:

m B 2r 2 = z 2V

[4.4]

Esta es la ecuación fundamental del analizador magnético. El radio r de las trayectorias iónicas es:

P

P

⎛ m 2V ⎞ r =⎜ 2 ⎟ ⎝ zB ⎠

1

2

[4.5]

Para iones con z =1, manteniendo constantes B y V, el radio del arco de la trayectoria depende de la masa de cada ión, lo cual permite su separación. En la Figura 4.16 los iones que arriban a la posición 1 sufren la mayor deflexión (menor r), lo cual se corresponde a su menor masa.

Figura 4.16 Deflexión de un haz de iones en un campo magnético homogéneo

Es posible lograr que los iones arriben a un solo punto del detector de forma secuencial, lo cual significa que r se mantiene constante, de donde:

m=

kB 2 V

[4.6]

De la ecuación [4.6] se desprende que mediante un barrido de campo B, de voltaje de aceleración V o de ambos, el rango total de masas de los iones puede ser enfocado secuencialmente hacia un punto del detector. Generalmente un espectrómetro de masas de sector magnético realiza el trabajo manteniendo 264

Espectrometría de Masas

V constante y variando el campo magnético B y el alcance de masas depende de la potencia del magneto. Una posibilidad adicional del campo magnético es hacer convergente un haz de iones divergente que entra en su zona acción. En este caso se dice que el campo magnético realiza un enfoque direccional (o angular) del haz, lo cual se ilustra en la Figura 4.17 El campo magnético realiza solamente un enfoque direccional o simple enfoque.

Figura 4.17 Enfoque direccional (angular) de un haz iónico en un campo magnético.

Al plantear la ecuación [4.2] se ha asumido que todos los iones que salen de la fuente de ionización tienen la misma energía cinética, lo cual no es rigurosamente cierto. En una fuente de EI la dispersión de valores de la energía cinética puede ser mayor de 1 eV y en el caso de una fuente FAB de 4 eV. Este rango de valores de energía cinética causa una imagen difusa en el detector porque el campo magnético no puede enfocar los iones de la misma masa y diferente energía cinética hacia un mismo punto. Analizador de sector eléctrico

Un analizador electrostático (AE)

está compuesto por dos arcos de sección cilíndrica cargados

eléctricamente tal como se muestra en la Figura 4.18. Este analizador realiza enfoque direccional (o angular) y también dispersivo de la energía de un haz de iones.

Figura 4.18 Analizador electrostático.

265

Espectrometría de Masas

La energía adquirida por los iones acelerados a partir de la fuente iónica viene dada por la ecuación (4.2), mientras que la fuerza centrípeta que actúa sobre ellos en el sector es:

mv 2 = zE r

[4.7]

donde E es el potencial eléctrico (voltaje) entre los platos del analizador electrostático y r el radio de curvatura de la trayectoria del ión. Es evidente que los iones con igual energía cinética se moverán en una trayectoria común de igual radio r. Por lo tanto un analizador electrostático dispersa un haz iónico de acuerdo a sus energías cinéticas. De las ecuaciones [4.2] y ([4.7] se obtiene:

r=

2V E

[4.8]

Según la ecuación [4.8], en el sector eléctrico la trayectoria de un haz de iones con igual energía cinética describe un arco que depende solamente del voltaje de aceleración V y del campo eléctrico E del analizador electrostático. Combinación de analizadores magnético-electrostático

Los sistemas combinados que hacen uso de analizadores electrostáticos y magnéticos están presentes en los equipos EM llamados de doble enfoque o doble sector. En esta combinación el flujo de iones puede ser colimado primero en un analizador electrostático y entonces los haces correspondientes a iones de igual relación m/z pero diferencias ligeras en sus energías cinéticas pueden ser reenfocados por el analizador magnético tal como se muestra en la Figura 4.19.

Figura 4.19 Óptica iónica de doble enfoque con geometría directa.

266

Espectrometría de Masas

Esta combinación de analizadores se denomina doble enfoque, porque incluye los enfoques direccional (o angular) y de energía. El espectrómetro de masas de doble enfoque está diseñado de forma tal que iones de la misma masa con energías diferentes converjan a un mismo punto del registrador por lo que estos equipos poseen muy alta resolución y se pueden utilizar para la determinación de fórmulas globales de los iones (ver epígrafe 4.2.2.6) y mediciones muy exactas de masas moleculares. Los sistemas ópticos de espectrometría de masas de doble enfoque pueden ser de dos tipos en dependencia de las posiciones relativas de los analizadores magnético y eléctrico. En la Figura 4.18 se ha mostrado el de geometría directa (configuración EB o de Nier-Johnson) donde el haz iónico penetra primero en el analizador electrostático. En los equipos con geometría inversa el haz iónico penetra primero en el analizador magnético. El sistema de doble enfoque permite compensar la dispersión del haz iónico debido a las diferencias en energía cinética en el mismo

y garantiza que iones con el mismo valor de la razón m/z lleguen a un

mismo punto del registrador, garantizando un alto poder de resolución, por lo que son muy útiles para la determinación exacta de valores de m/z, por el amplio rango de masas que cubren y por su sensibilidad sobre todo a valores elevados de la razón m/z. 4.1.4.2 Analizador cuadrupolar

Los analizadores de masas cuadrupolares se componen de cuatro varillas paralelas equidistantes a un eje central imaginario, como se muestra en la Figura 4.20. La sección transversal contiene las cuatro superficies conductoras o polos que adoptan idealmente la forma de 2 hipérbolas ortogonales.

Figura 4.20 Esquema de un analizador cuadrupolar.

A las varillas opuestas, que corresponden a cada una de las hipérbolas, se le aplica un potencial electrostático U (500-2000 V) de igual signo y opuesto al de las otras dos varillas. Adicionalmente se aplica un potencial alterno V (0- 3000 V) asociado con una radiofrecuencia ω:

φ0 = +(U − V cos ωt )

− φ0 = −(U − V cos ωt )

En estas condiciones los iones avanzarán a lo largo del analizador siguiendo trayectorias oscilantes siendo repelidos y atraídos continuamente por las placas polares. Para valores definidos de U y V sólo 267

Espectrometría de Masas

atravesarán el analizador cuadrupolar los iones con determinada m/z, los demás se desestabilizan y chocan contra las paredes. Manteniendo constante la razón entre la amplitud de los campos estático y oscilante (U/V constante) y variando su intensidad puede lograse que salgan sucesivamente del analizador iones de diferentes

m/z y generarse un espectro de masas. El funcionamiento del

analizador cuadrupolar no depende de la energía cinética de los iones cuando éstos abandonan la fuente de ionización. Es práctica común acelerarlos 10-15 eV. Se requiere que el tiempo empleado por los iones en transitar el analizador sea corto comparado con el necesario para cambiar la selección de un valor de m/z a otro pero lo suficientemente largo para que ocurran varias oscilaciones del potencial alterno. El alcance de masas, o relación m/z mas elevada detectable, se limita a unos 4000 Th. Dado que la velocidad de barrido de un analizador cuadrupolar puede ser de 1000 Th/s e incluso mayor, el barrido de un espectro completo es muy rápido lo que resulta muy apropiado para su acoplamiento con sistemas cromatográficos y en el estudio de reacciones rápidas. Estos analizadores son además robustos, muy compactos, de bajo costo comparados con otros tipos de analizadores y de fácil utilización. Por otra parte, se trata de instrumentos de baja resolución (~3000), lo cual implica que usualmente los espectrómetros de masas con analizadores cuadrupolares son operados a "resolución unitaria ", es decir que trabajan con resolución suficiente para separar dos picos distantes una unidad de masas. Es posible resumir el trabajo de un analizador cuadrupolar de la manera siguiente: mediante la aplicación de potenciales eléctricos estáticos y alternantes a un ordenamiento de cuatro placas polares paralelas, un haz de iones puede ser filtrado a lo largo de su eje central para dar un espectro de masas. Los analizadores cuadrupolares son los más ampliamente utilizados en los EM modernos. Un cuadrupolo con potencial estático U nulo y valores adecuados del potencial alterno V puede utilizarse para explotar la capacidad de estos sistemas para enfocar los iones hacia el eje central del mismo, actuando como un lente de enfoque y dejando que todos los iones de relaciones m/z superiores a un mínimo dado por V lo atraviesen. Un espectrómetro de masas puede utilizar varios analizadores cuadrupolares situados uno después de otro (tándem de masas en el espacio), con lo que se pueden realizar diferentes tipos de barrido. Está muy extendido el EM cuadrupolar triple con 3 cuadrupolos: el primero separa los iones procedentes de la fuente iónica, en el segundo se realiza la activación colisional de los iones con un gas inerte o se producen reacciones ión-molécula si el gas es reactivo, actuando como lente, y en el tercero se

268

Espectrometría de Masas

analizan los iones resultantes de la fragmentación de los iones generados en el segundo sistema de cuadrupolos. En la Figura 4.21 se muestra un esquema de este tipo de instrumento.

Figura 4.21 Espectrómetro de masas en tándem con 3 cuadrupolos

En la Figura 4.22 se muestran diferentes tipos de barrido para un tándem de 3 cuadrupolos. Esta configuración incrementa notablemente la capacidad del espectrómetro al poder realizar barrido de iones fragmento, barrido de pérdida de fragmentos neutros e identificación de iones precursores.

Figura 4.22 Diferentes tipos de barrido para un EM cuadrupolar triple. CID- disociación inducida por colisiones

El primer tipo de barrido consiste en seleccionar un ión de determinada m/z mediante el primer espectrómetro o analizador cuadrupolar EM-1. Este ión se activa por colisiones con moléculas de un gas inerte en el segundo cuadrupolo, que actúa como lente focalizador de iones, induciéndose fragmentaciones. Los productos de las reacciones son analizados en el tercer cuadrupolo, que actúa como un segundo espectrómetro de masas, EM-2. Este barrido se denomina de iones fragmento o de iones hijos.

269

Espectrometría de Masas

La segunda posibilidad consiste en enfocar el segundo espectrómetro en un ión seleccionado de determinada m/z y utilizar el primer cuadrupolo EM-1 para realizar un barrido de m/z. Todos los iones que producen el seleccionado por fragmentación serán detectados. Este método se denomina barrido de precursores o de iones padres. En el tercer tipo de tándem ambos espectrómetros realizan barridos pero con una diferencia de masas Δm constante entre ellos. Para un valor seleccionado de Δm cuando un ión de masa m es seleccionado en EM-1 y se fragmenta para dar un ión en m - Δm, será detectado en EM-2. Este tipo de barrido se denomina de fragmentos neutros. Así por ejemplo, los alcoholes tienden a perder agua. Un barrido de este tipo con Δm = 18 permitirá detectar los alcoholes presentes en una mezcla. 4.1.4.3 Analizadores de tiempo de vuelo

En un espectrómetro de masas con analizador de tiempo de vuelo (Time-Of-Flight: TOF), los iones son extraídos en pulsos de la fuente de ionización e inmediatamente son acelerados mediante la acción de un campo eléctrico para lograr la uniformidad en sus energías cinéticas antes de que entren al analizador. Posteriormente los iones con movimiento rectilíneo uniforme atraviesan un tubo evacuado hacia el detector. El tiempo necesario para atravesar la longitud del tubo (tiempo de vuelo) depende del valor de la razón m/z de cada ión. Para iones con carga unitaria (z=1; m/z=m), el tiempo necesario para recorrer la distancia de la fuente al detector es depende de su masa, de manera que mientras mayor sea ésta, más lentamente arribará el ión al detector. En el caso del analizador TOF no existen campos eléctricos o magnéticos que obliguen a los iones a describir complicadas trayectorias. En la Figura 4.23 se ilustra el funcionamiento de un analizador TOF, que en este caso se denomina TOF-lineal.

Figura 4.23. Esquema del funcionamiento de un analizador TOF-lineal

270

Espectrometría de Masas

Como se puede apreciar, un pulso de iones se extrae de la fuente de ionización. La necesidad de que la extracción de los iones sea en forma de pulsos se debe a que es importante que todos los iones salgan de la fuente de ionización simultáneamente. Inmediatamente los iones son acelerados mediante un campo eléctrico E, de manera que la energía cinética que adquieren viene dada por:

mv 2 = zeE 2 Reordenando:

⎛ 2 zeE ⎞ v=⎜ ⎟ ⎝ m ⎠

[4.9] 1

2

[4.10]

Si d es la distancia de la fuente de ionización al detector, entonces el tiempo necesario para que un ión atraviese el tubo de corrimiento será: t = d (m/z) 1/2 / (2eE) 1/2 P

P

P

P

[4.11]

y manteniendo E constante en el instrumento, el tiempo de vuelo resulta: t ≈ (m/z) 1/2 P

P

[4.12]

Es decir, el tiempo de vuelo t es proporcional a la raíz cuadrada de m/z. En principio no existe un límite superior en el rango de valores de la masa de los analizadores TOF, lo que los hace especialmente útiles combinados con fuentes de ionización blandas en el análisis de macromoléculas. Los analizadores TOF tienen una transmisión iónica eficiente por lo que son instrumentos muy sensibles. Además el barrido de un espectro es muy rápido convirtiéndolo en componentes ideales en los equipos acoplados con cromatógrafos. La deficiencia principal de los analizadores TOF es su baja resolución espectral, lo que tiene su origen en que iones de igual m/z presentan cierta dispersión en los valores de energía cinética después de la aceleración, y por lo tanto iones de un valor de m/z dado se superponen con los valores de m/z próximos al llegar al detector. Entre las variantes más utilizadas para enfrentar esta dificultad se destaca la utilización de un reflector iónico electrostático, denominado reflectrón, que usualmente está compuesto por una seria de rejillas y electrodos de anillo, El reflectrón crea un campo retardador que actúa como un espejo y envía los iones de retorno hacia el tubo de vuelo. En la Figura 4.24 se ilustra su funcionamiento.

271

Espectrometría de Masas

Figura 4.24 Esquema del funcionamiento de un analizador TOF-reflectrón con pulso de iones de igual m/z.

El reflectrón introduce una corrección en la energía de dispersión de los iones que salen de la fuente de ionización y que tienen el mismo valor de la razón m/z. Los iones con más alta energía cinética penetrarán más profundamente en el reflectrón y por lo tanto estarán un tiempo mayor en el mismo. Así, estos iones impactarán al detector al mismo tiempo que aquellos iones más lentos que tienen el mismo valor de m/z y penetran menos en el mismo. El reflectrón incrementa la resolución espectral a expensas de la sensibilidad dado que muchos iones se pierden en su área y además introduce una limitación en el alcance de masas. Este sistema se denomina TOF-reflectrón, para diferenciarlo del TOF-lineal. Los analizadores TOF son directamente compatibles con las técnicas de ionización por pulsos, tales como el MALDI o plasma, dado que en éstas los tiempos de ionización están definidos exactamente y son cortos. Por ejemplo, una combinación ampliamente utilizada es el MALDI-TOF. Las técnicas de ionización continuas también pueden ser compatibles con analizadores TOF, pero requieren algunas adaptaciones para transformar un haz iónico continuo en otro en forma de pulsos. Resulta difícil lograr el acoplamiento de una fuente de ionización por electronebulización con un analizador TOF. Los analizadores TOF con su elevado alcance de masas, rapidez de operación y resolución elevada en su

272

Espectrometría de Masas

variante con reflectrón se aplican cada vez con más frecuencia en EM comenzando a desplazar a los analizadores cuadrupolares en numerosas aplicaciones. 4.1.4.4 Trampa de iones

La trampa de iones utiliza un campo cuadrupolar (análogo al analizador cuadrupolar pero en tres dimensiones) para confinar iones en un volumen interior. Consta de un electrodo hiperbólico en forma de anillo y otros dos que actúan como tapas como se muestra en la Figura 4.25. Los iones con trayectorias estables son capturados en el volumen central, oscilando a frecuencias que dependen de su masa y carga. Se aplican diferencias de potencial de signo contrario al electrodo de anillo y las tapas con componentes de corriente directa y alterna (radiofrecuencia). La existencia de trayectorias estables depende de la carga y masa del ión, de las dimensiones de la trampa, de las amplitudes de las corrientes directa y alterna y de la frecuencia de esta última. La ejección puede realizarse por desestabilización de las trayectorias al modificar las amplitudes de las corrientes. Iones con m/z inferiores a un límite son desestabilizados y abandonan la trampa lo que permite obtener el espectro de masas por cambio en los parámetros del campo cuadrupolar. Otra técnica de ejección efectiva es por irradiación resonante a la frecuencia de oscilación de cada uno de los iones. Estos iones son selectivamente acelerados y expulsados de la trampa. Esta técnica permite obtener espectros con mayor resolución y alcance de masas. La trampa de iones es una técnica simple, robusta y de costo reducido, que permite un análisis rápido. A diferencia de otros analizadores la separación tiene lugar en un vacío moderado (0.1Pa). Esta presión es necesaria para enfriar por colisiones con especies neutras (He) a los iones que penetran en la trampa para que puedan formar órbitas estables dentro de la misma. Al igual que en el analizador cuadrupolar ordinario, aquí la resolución es constante en todo el rango de masas y se alcanzan valores del orden de 2000 (con técnicas especiales hasta 10 6 ). El alcance de masas P

P

típico es de 4000-6000 Th. Este analizador es muy versátil en cuanto a su acoplamiento con técnicas de ionización continuas (ESI) o pulsantes (MALDI). También se puede implementar en equipos del tipo CG-EM y CL-EM. Otra ventaja es la posibilidad de almacenar iones de m/z definida con exclusión de todos los demás. Esto permite utilizar al ión seleccionado como precursor y manipularlo para que mediante colisiones con moléculas en la propia trampa se generen nuevos iones, permitiendo la EM/EM en un sólo espectrómetro (tándem en el tiempo). El almacenamiento posterior del ión hijo permite la repetición del proceso y en principio las técnicas (MS) n . Las limitaciones principales de este P

P

analizador vienen dadas por la reducida cantidad de iones a almacenar en la trampa (su incremento

273

Espectrometría de Masas

reduce la resolución), así como su limitado alcance de masas que, al igual que en el analizador cuadrupolar, depende de la amplitud máxima de la RF que mantiene la oscilación.

Figura 4.25 Trampa de iones

4.1.4.5 Resonancia ciclotrón-ión y espectrometría de masas por transformada de Fourier. Aspectos generales

Si un ión penetra en una región donde está presente un campo magnético y su vector velocidad es ortogonal al vector inducción magnética, comenzará a moverse describiendo un arco de círculo. A bajas velocidades y campo magnético suficientemente intenso, el radio de la trayectoria será pequeño y en estas condiciones puede ser "atrapado" de forma tal que describa una trayectoria circular: este es el denominado movimiento ciclotrónico y el principio de la técnica denominada resonancia ciclotrón-ión (ICR). Un ión de carga q (q = z.e) con velocidad lineal v inyectado en un campo magnético B experimentará una fuerza magnética equivalente a la fuerza centrípeta del movimiento:

F = qvB =

mv 2 r

[4.13]

El ión se estabilizará en una trayectoria en la cual:

qB =

mv r

[4.14]

Partiendo de la relación entre las velocidades lineal v y angular ω , v = ω r, y la ecuación (X.14) se obtiene: ⎛q⎞ ⎛z⎞ ⎟ B = ⎜ ⎟ Be ⎝m⎠ ⎝m⎠

ω =⎜

[4.15]

y dado que ω = 2πν (ν: frecuencia ciclotrónica) : ω = 2πν = (z/m) Be

[4.16]

274

Espectrometría de Masas

Así, tanto la velocidad angular como la frecuencia dependen de la razón z/m, siendo independientes de la velocidad lineal. En la mayoría de los equipos ICR el campo magnético B es constante por lo que la frecuencia ciclotrónica (kHz-MHz) depende sólo de la relación m/z. No obstante, el radio de la trayectoria crece, para un ión dado, proporcionalmente con la velocidad lineal según la ecuación [4.14]. De acuerdo con la ecuación [4.16], la determinación de la masa en este caso consiste en la determinación de la frecuencia, lo cual puede ser hecho con métodos diferentes, que son clasificados en dos categorías: los que se basan en la observación de frecuencias aisladas y los que utilizan ondas complicadas y transformaciones de Fourier. Resonancia ciclotrón ión

En la Figura 4.26 el campo magnético B está orientado a lo largo del eje-z. Los iones son inyectados en la trampa a lo largo del ese eje-z, siendo atrapados en esa dirección por un potencial eléctrico V (típicamente de 1V) aplicado a los platos frontal y trasero. Los iones rotan en el plano xy alrededor del eje-z debido al movimiento ciclotrónico. El sentido de la rotación indicado en la figura corresponde a iones positivos. La aplicación de una radiación electromagnética (platos emisores en la Figura 4.26) sólo modifica el estado de movimiento de los iones si aquella posee la misma frecuencia que la del movimiento ciclotrónico, es pues un fenómeno de resonancia. Los iones pueden en estas condiciones absorber energía de la radiación. La energía que de esta forma se transfiere al ión eleva su energía cinética e incrementa el radio de la trayectoria. Es posible medir la "corriente imagen" inducida por la circulación de los iones en la pared de la celda perpendicular a la trayectoria de los iones (platos receptores). Para que los

iones

puedan ser

detectados, tienen que circular en sus órbitas coherentemente, como paquetes compactos. Cuando esto se cumple, iones de la misma m/z excitados con la misma energía se encontrarán en la misma órbita y rotarán con la misma frecuencia. Si los iones estuvieran distribuidos aleatoriamente en cualquier parte la órbita, cuando uno de ellos pasa cerca de uno de los platos detectores estadísticamente habrá otro de igual m/z pasando cerca del plato detector opuesto, por lo que la corriente inducida resultante sería nula. Para lograr observar una señal los iones tienen que ser excitados en un intervalo de tiempo muy corto, tal que se encuentren agrupados en la órbita y de esa forma estén en fase.

275

Espectrometría de Masas

Figura 4.26 Diagrama de un instrumento de resonancia ciclotrón-ión.

Transformada de Fourier (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, FT-ICR, FT-MS)

Esta técnica consiste en la excitación simultánea de todos los iones presentes en el ciclotrón mediante un barrido rápido de un rango amplio de frecuencias en un tiempo de alrededor de 1 μs. Esto induce trayectorias que se acercan a la pared perpendicular a la órbita donde los iones se mueven en fase (coherencia). Lo importante es que iones de determinada m/z tienen una frecuencia ciclotrónica característica. El registro de la corriente imagen como función del tiempo permite mediante una transformación de Fourier obtener el espectro de frecuencias ciclotrónicas que se corresponde con el espectro de masas tal como se muestra en la Figura 4.27. Estos analizadores actúan simultáneamente como detectores (a través de la corriente imagen) y permiten conservar a los iones para manipulaciones posteriores. Como es usual para una técnica basada en la transformada de Fourier, la resolución depende del tiempo de observación, el cual se relaciona con la desaparición de la coherencia del haz iónico (tiempo de relajación). En el caso de la espectrometría de masas, la desaparición de la señal se debe principalmente a que los iones se hacen más lentos por las colisiones residuales molécula-ión. Se puede alcanzar una muy alta resolución en condiciones de alto vacío. Los equipos FT-MS son excelentes en cuanto a resolución y sensibilidad en el campo de la EM pero sus altos costos hacen que estén poco difundidos. Los métodos experimentales basados en la resonancia ciclotrónica permiten la observación de iones durante un período de tiempo prolongado, lo que permite la detección de iones de elevada m/z que se desplazan lentamente en el ciclotrón y que no son observables mediante otras técnicas de espectrometría de masas. El hecho de que la resonancia ión ciclotrón posibilite la eliminación selectiva de iones de la celda mediante irradiación intensa a la frecuencias de resonancia correspondientes a cada uno, y que también se puedan mantener iones de un solo valor de la razón m/z dentro de la celda, hace factibles los estudios de alta 276

Espectrometría de Masas

resolución de reacciones iónicas. La técnica permite, la igual que la trampa de iones, el trabajo en tándem en el tiempo (MS n ). P

P

Figura 4.27 Corriente imagen y su espectro de frecuencias

En la Tabla 4.4 se resumen las características principales de los analizadores estudiados. Tabla 4.4 Aspectos básicos de algunos analizadores Analizador

Principio

Magnético Eléctrico-magnético

m R2 B2 = z 2V m = k .t 2 z Filtro de iones Retención de iones

Tiempo de vuelo Cuadrupolar Trampa de iones ICR (FT)

m Be = z 2πν

Alcance masas 4-6 kTh

de

Resolución

Trasmisión

Otras propiedades

2000 Hasta 10 6

Moderada

Lento

> 300 kTh

Baja, se eleva con reflectrón

Muy alta

Rápido. Fuentes pulsantes

4 kTh 4-6 kTh

3000 2000 (10 6 )

Alta Muy alta

5.10 6 Th

Muy alta

Muy alta

Rápido Versátil Rango dinámico limitado Rango dinámico limitado. Puede detectar 10 iones.

P

P

P

P

P

P

4.1.5 Detectores 4.1.5.1 Introducción

Luego de la separación de los iones en el analizador del espectrómetro de masas, éstos deben ser detectados. La detección dependerá de cómo se efectuó la separación de los iones, es decir del tipo de analizador utilizado. Un analizador cuadrupolar separa iones con valores diferentes de la razón masa/carga (m/z) de forma secuencial, esto es, iones a m/z 200; 201; 202 que pasarán al detector uno después de otro. Por lo tanto, el detector iónico situado al final de analizador cuadrupolar necesita cubrir solamente un punto o foco en el espacio de manera que un espectro de masas completo se registra en el dominio del tiempo. Este tipo de detector de iones se denomina detector puntual. Por su parte, un analizador de sector magnético puede separar iones en el espacio, lo cual permite 277

Espectrometría de Masas

que su arribo al detector pueda ser registrado de forma simultánea. Este tipo de detector iónico se denomina detector compuesto, y mediante su utilización el registro del arribo de los iones se realiza en el dominio del espacio. Ambos tipos de detectores se ilustran en la Figura 4.28.

Figura 4.28 Detección secuencial y simultánea

Los detectores puntuales dan espectros de masas donde el registro es función del tiempo y en los detectores compuestos es función del espacio. Dependiendo del analizador, los espectrómetros de masas pueden utilizar detectores puntuales, compuestos o ambos. 4.1.5.2 Multiplicadores electrónicos

Resulta importante conocer cómo funciona un mutiplicador electrónico, pues elementos de este tipo se encuentran entre los más utilizados en los detectores de iones. En la Figura 4.29 se muestra el esquema de un multiplicador electrónico.

Figura 4.29 Esquema de un multiplicador electrónico

Un ión positivo o negativo proveniente del analizador y registrado en el dinodo de conversión causa la emisión de varias partículas secundarias, las cuales pueden a su vez dar lugar a iones positivos y negativos así como a partículas neutras. Cuando iones positivos impactan al dinodo de conversión de alto voltaje negativo, las partículas secundarias de interés serán iones negativos y electrones. Por el contrario, cuando iones negativos impactan al dinodo de conversión de alto voltaje positivo, las partículas secundarias de interés serán iones positivos. Esas partículas secundarias son aceleradas en el dinodo continuo e impactan al cátodo con energía suficiente para desalojar electrones en la medida en que chocan con las paredes internas curvilíneas. Los electrones pasan 278

Espectrometría de Masas

posteriormente al multiplicador electrónico e impactan nuevamente las paredes causando la emisión de más y más electrones en la medida en que se desplazan hacia el potencial situado al final de las paredes. De esa forma se crea una cascada de electrones que finalmente origina una corriente medible al final del multiplicador electrónico. La potencia de amplificación es el producto del factor de conversión (número de partículas secundarias emitidas por el dinodo de conversión) y el factor de multiplicación del multiplicador electrónico dinodo contínuo. Este valor puede resultar del orden de 10 7 . Los multiplicadores electrónicos son muy sensibles, si bien es cierto que su P

P

tiempo de vida es limitado debido a la contaminación de la superficie por los iones o debido a un vacío relativamente pobre. 4.1.5.3 Detector (colector) iónico compuesto

El detector iónico compuesto consiste en un número de elementos de detección iónicos ordenados en una línea o en varias líneas unas sobre otras en un plano. Cada elemento de detección es un multiplicador electrónico. Por esta razón para la construcción de los detectores compuestos los multiplicadores electrónicos individuales tienen que ser muy pequeños de manera que puedan ser situados unos al lado del otro en el menor espacio posible. Así, el diseño de un elemento de un detector compuesto es significativamente diferente al de un multiplicador electrónico estándar utilizado para un detector de iones puntual, aun cuando sus métodos de trabajo son similares. Considere un detector compuesto por dos multiplicadores electrónicos como se muestra en la Figura 4.30 y suponga que un flujo de iones ha sido dispersado de acuerdo con los valores de m/z 200 y 201.

Figura 4.30 Detector iónico compuesto

El ión de m/z 200 entrará al primer elemento del detector y el de m/z 201 al segundo, de forma tal que iones con los valores señalados de m/z pueden ser detectados separadamente a este nivel de dispersión. Siguiendo con esta idea puede asumirse detectores equivalentes con n elementos. Una extrapolación de lo anterior lleva a que más valores de m/z pueden ser obtenidos si existen más elementos de detección. Sin embargo, ubicar un número muy grande de elementos en un detector compuesto se torna tanto más difícil mientras mayor sea el número de elementos del detector y en la práctica se utiliza un número limitado de elementos.

279

Espectrometría de Masas

Considere ahora iones con valores de m/z 200.1 y 200.2. Estos iones pueden ser detectados si la capacidad de diferenciación entre valores de m/z del espectrómetro (resolución) es de 0,1 unidades de masas; pero en estas condiciones el número de valores de m/z que pueden ser medidos al mismo tiempo disminuye. En un detector compuesto de 10 elementos para una resolución de 0.1 solamente se puede cubrir el rango de masas de 200.0 a 201.1. Dado que el número de elementos del detector compuesto no cambia, mientras menor sea el rango espectral registrado mayor será la resolución. Así, detectores compuestos pueden ser utilizados para registrar amplias regiones de un espectro de masas a baja resolución y sólo regiones pequeñas a alta resolución. La mayor ventaja de los detectores de iones compuestos sobre los detectores de iones puntuales se encuentra en la posibilidad que brindan de registrar un rango de valores de m/z y la abundancia correspondiente de los iones, todo a un mismo tiempo, que además es muy breve. Hay dos situaciones importantes en las cuales son preferibles mediciones rápidas en espectrometría de masas: 1.- Cuando se utilizan fuentes de ionización como la desorción por laser, en cuyo caso se produce un pulso en un intervalo de tiempo muy corto, usualmente del orden de los nanosegundos. Si el detector se demora 1s para intentar barrer el rango de valores de m/z de los iones producidos, sólo podrá detectar iones durante los primeros nanosegundos. La utilización de un detector de iones puntual cuando la ionización se ha efectuado por pulsos del orden de tiempo descrito llevaría a la situación siguiente: luego de transcurridos los primeros intervalos del barrido no llegarán más iones al detector porque no deben existir. En el detector de iones compuesto la detección simultánea elimina esta dificultad. 2.- Cuando resulta necesario detectar trazas de un material. El problema práctico es que el espectro de masas debe ser registrado lo más rápidamente posible para evitar el riesgo de que los fragmentos iónicos de la sustancia que existe en tan baja cantidad no sean detectados durante el barrido. El detector de iones compuesto permite registrar una región estrecha del espectro e incluso monitorear un solo valor de m/z. 4.1.6 Computadoras

Un espectrómetro de masas es una fuente de datos, los cuales tienen que ser adquiridos, procesados, almacenados y representados gráficamente. Es también un instrumento que tiene que ser

calibrado y controlado en su

funcionamiento. Las computadoras juegan un rol esencial en todos estos aspectos. La señal que sale de un espectrómetro de masas es un voltaje analógico de amplitud variable en el tiempo, que debe ser transformada a digital para que pueda ser almacenada en la memoria de la computadora. Esto se logra mediante un convertidor analógico-digital (ADC). Los convertidores ADC/DAC

permiten el acoplamiento

espectrómetro-computadora. La señal digital proveniente del ADC es amplificada y procesada para estimar el área (abundancia iónica) y centro de gravedad (equivale al valor de m/z) de cada pico. Estas dos informaciones, que se guardan en la memoria de la 280

Espectrometría de Masas

computadora, identifican a cada pico del espectro de masas. Es importante destacar que los datos recogidos y almacenados corresponden sólo a los picos y no a los intervalos entre ellos, lo cual significa que el procesador realiza una importante reducción del volumen de información que se genera. Mediante las computadoras se controla el funcionamiento del espectrómetro de masas, introduciendo los valores de diferentes parámetros necesarios para el trabajo del instrumento. De forma análoga se realizan las calibraciones necesarias. Luego de que la información espectral ha sido adquirida y almacenada, las computadoras pueden realizar un gran número de operaciones, entre las que se incluyen las siguientes: Generar datos en la forma usual de un espectro de masas, es decir, valores de m/z e intensidades de los picos, tanto para el espectro total como para un sector del mismo. También pueden ser obtenidos datos dependientes del tiempo tales como: corriente iónica total, temperaturas, voltajes, potenciales de aceleración y otras variantes posibles. •

Creación de bases de datos así como la utilización de éstas en el análisis espectral. En estos casos los resultados confiables se han obtenido utilizando principalmente fuentes de ionización electrónica, las cuales generan espectros con buena reproducibilidad. Productos totalmente diferentes podrían tener, de manera accidental, espectros de masas similares.

•

Calcular las composiciones posibles de iones de una masa dada teniendo presente solamente los elementos incluidos en la fórmula molecular.

En resumen, mediante el acoplamiento espectrómetro-computadora se logra la adquisición y procesamiento de datos experimentales, el control del funcionamiento del espectrómetro de masas y la presentación y manipulación de la información obtenida. 4.1.7 Acoplamiento con otras técnicas instrumentales

Excelentes resultados pueden obtenerse mediante el acoplamiento de espectrómetros de masas con diferentes instrumentos. Los sistemas que se originan reúnen las ventajas de cada componente individual de manera que, por una parte permiten solucionar problemas que resultarían insolubles o muy difíciles de solucionar para las técnicas individuales y por otro lado, y esto es muy importante, dan lugar a novedosos sistemas de trabajo experimental con amplias capacidades de aplicación. Dos de los sistemas más importantes son el acoplamiento cromatografía - espectrometría de masas (C-EM) y el tándem de espectrometría de masas (EM/EM). 4.1.7.1 Acoplamiento cromatografía-espectrometría de masas.

La cromatografía es un método utilizado para la separación de mezclas en sus componentes individuales, haciendo que éstos pasen a través de una columna de un sólido o un líquido. Para que ocurra el proceso 281

Espectrometría de Masas

cromatográfico, son necesarias una fase móvil y una estacionaria. En la cromatografía gaseosa (CG) la fase móvil es un gas y la estacionaria una columna embebida de líquido. En la cromatografía líquida (CL) la fase móvil es un líquido y la estacionaria generalmente es una columna de un sólido poroso. El flujo de la fase móvil a través de la

estacionaria, fuerza a la mezcla a moverse por la columna

cromatográfica. Una variante de la (CL) es la cromatografía líquida (High Performance

Liquid

Chromatography: HPLC), en la cual la fase móvil se somete a presión para obtener una mayor eficiencia de separación. Los métodos cromatográficos son muy eficientes para separar los componentes de una mezcla, pero la información que brindan no es en general suficiente para identificar con seguridad a cada uno de ellos. Por su parte, la espectrometría de masas es un método altamente eficiente para deducir la estructura química de una sustancia. Sin embargo, su utilidad es limitada en el análisis de mezclas debido a que el espectro de masas de éstas es una complicada superposición de los espectros correspondientes a los componentes individuales. Para el análisis de mezclas complejas de sustancias se utilizan los acoplamientos CG-EM y CL-EM. La idea esencial es realizar la separación cromatográfica de los componentes de la mezcla, que una vez separados se inyectan en sucesión al espectrómetro de masas para obtener los espectros de cada uno de ellos, tal como se ilustra en la Figura4.31.

Figura 4.31 Diagrama de funcionamiento de un sistema cromatógrafo-espectrómetro de masas

Dado que los métodos de separación cromatográfica suministran un flujo de eluyentes líquidos o gasosos, generalmente a presión atmosférica, que deben ser introducidos en la fuente de ionización del espectrómetro de masas donde existe alto vacío, resulta necesario utilizar interfases entre el cromatógrafo y el espectrómetro de masas. Existen diferencias significativas entre las interfases utilizadas que dependen del tipo de cromatografía utilizada, lo que será ilustrado con algunos ejemplos. 282

Espectrometría de Masas

Cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (CG/EM)

Existen dos tipos de interfases entre el cromatógrafo de gases y el espectrómetro de masas que son: el acoplamiento de hendidura abierta y el acoplamiento directo. Acoplamiento de hendidura abierta

Un acoplamiento de hendidura abierta se muestra en la Figura 4.32. Un tubo en forma de T contiene a su vez a un tubo de diámetro pequeño en el cual se introduce un extremo de la columna cromatográfica. A este tubo llega también un capilar de platino o de sílice fundida que va hacia la fuente de ionización del espectrómetro de masas. El capilar se mantiene sellado al vacío y se calienta para eliminar la condensación.

4.32 Esquema de un acoplamiento CG/EM de hendidura abierta.

La longitud y el diámetro del tubo que entra al espectrómetro de masas se seleccionan de forma que el flujo suministrado a la fuente de ionización sea cercano al máximo aceptable con respecto a la conductancia gaseosa de la fuente y la capacidad de bombeo. Por ejemplo, por un capilar de 0.15 mm de diámetro y 50 cm de longitud calentado a 250 o C, se conducen 2.5 ml min -1 de gas eluido, que en la P

P

P

P

práctica resulta suficiente para bombear cualquier sustancia que sale de una columna capilar. Este tipo de acoplamiento permite trabajar bajo condiciones cromatográficas usuales, estando uno de los extremos de la columna a presión atmosférica. No requiere ningún montaje especial y cambiar la columna cromatográfica resulta muy sencillo. En principio se puede utilizar con cualquier tipo de columna. Acoplamiento directo

Este acoplamiento consiste en que la columna capilar entre directamente a la fuente de ionización del espectrómetro por medio de un conjunto de uniones selladas al vacío, lo que le permite un 100% de rendimiento. El bombeo no resulta problemático porque el capilar en necesariamente muy largo. Por ejemplo, para una columna de 0.25 mm de diámetro interior es necesaria una longitud de al menos 15 m. Dado que la columna es suficientemente larga, la cromatografía se lleva a cabo entre la presión atmosférica del inyector y el vacío en su otro extremo que entra a la fuente de ionización del 283

Espectrometría de Masas

espectrómetro de masas. El acoplamiento directo tiene los inconvenientes de no permitir la eliminación del disolvente y que el cambio de columna resulta complicado. Este último inconveniente puede ser reducido conectando un extremo de la columna cromatográfica a un capilar de vidrio que entre a la fuente de ionización a través de un pasador de teflón de manera que la unión resulte sellada. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (CL/EM)

El acoplamiento CL/EM es más complicado debido principalmente a dos factores: en la espectrometría de masas se tienen que producir iones en fase gaseosa y resulta necesario eliminar el disolvente utilizado en la elución. Dos de los métodos utilizados para solucionar estos problemas se describen a continuación. Acoplamiento por interfase de flujo de partículas

Se trata de un procedimiento mediante el cual se puede separar el disolvente de las moléculas eluidas en una columna de cromatografía líquida de forma rápida y eficiente. El eluato cromatográfico se bombea a través de un capilar hacia un nebulizador concéntrico de vidrio, según se muestra en la Figura 4.33.

Figura 4.33 Esquema del acoplamiento CL/EM por interfase de flujo de partículas.

Seguidamente el eluato se transforma en una nube de gotas que son dispersadas mediante un flujo concéntrico de helio. La nube pasa a través de una cámara de desolvatación cuyas paredes están calentadas y en la que existe una presión ligeramente inferior a la atmosférica. Durante el trayecto estas gotas sufren una desolvatación parcial y producen gotas de los compuestos eluídos ligeramente solvatadas. Cuando el flujo abandona la cámara de evaporación la mezcla de helio, vapor de disolvente y moléculas eluidas sufre una expansión en la primera etapa de bombeo, de lo cual resulta un flujo de gas a alta velocidad que contiene a las moléculas eluidas. Estas moléculas difunden más lentamente del centro del flujo hacia la periferia. Mediante un selector se escogen las capas periféricas del flujo de manera que el vapor de disolvente escogido y el helio son extraidos y bombeados mecánicamente fuera del aparato. Este proceso se repite en la segunda etapa del bombeo. Finalmente, un estrecho flujo de partículas enriquecido en las moléculas de interés, de lenta difusión, es enviado hacia el espectrómetro de masas sin perturbar el vacío. En las fuentes de ionización (EI) o (CI) las partículas inyectadas se vaporizan 284

Espectrometría de Masas

rápidamente antes de la ionización. En la fuente FAB, el flujo de partículas se dirige sobre una boquilla FAB cubierta por una matriz. Así, las partículas chocan con la superficie de la matriz y son atrapadas en ella. Acoplamiento FAB de flujo contínuo

Consiste en unir el extremo de una columna cromatográfica capilar con el extremo de una boquilla FAB mediante un capilar que pase a través de la boquilla de introducción. Se añade de 1 a 5 % de glicerol al disolvente cromatográfico. La velocidad del flujo varía de 1 a 5 μl min -1 , por lo que se puede bombear P

P

con facilidad. El disolvente se evapora pero el glicerol permanece en la superficie de la boquilla con la elución de los componentes y sirve como una matriz de la fuente de ionización FAB. 4.1.7.2 Espectrometría de masas en tándem

Un tándem de espectrometría de masas (EM-EM, en inglés MS n ) es cualquier sistema que contiene al P

P

menos dos etapas de análisis, separadas por una interfase en la cual los iones procedentes del primer analizador generalmente son activados y se fragmentan. El sistema de tres cuadrupolos ya ha sido tratado en el epígrafe correspondiente. La espectrometría de masas en tándem es también posible en los equipos de doble enfoque con analizadores magnético y electrostático, utilizando la técnica denominada de barrido ligado (linked scan). Esta técnica consiste en el barrido simultáneo de los campos E y B de acuerdo a una relación matemática que depende de la geometría empleada, de la región donde ocurren las fragmentaciones y del tipo de información deseada (espectro de iones producto, iones precursores o neutrales). Aquí mencionaremos los aspectos más generales de EM-EM. Entre las técnicas de activación utilizadas con este fin se incluyen las siguientes: disociación inducida por colisión (collision-induced dissociation : CID), disociación por captura electrónica (electron capter dissociation: ECD), disociación por transferencia electrónica (electron transfer dissociation: ETD) , disociación multifotónica infrarroja (infrared multiphoton dissociation: IFMPD). El principio de trabajo del tándem de espectrometría de masas, se ilustra en la Figura 4.34. En el más simple de los experimentos de masas, EM-EM, el primer analizador (EM 1 ) genera el espectro de masas de una sustancia y selecciona los iones correspondientes a B

B

un mismo valor de m/z, que se denominan iones precursores. Los iones precursores son activados y se fragmentan, pasando al segundo analizador (EM 2 ), con lo que se obtiene el espectro de masas de los iones B

B

precursores seleccionados (barrido de iones fragmento). Existen dos categorías principales de espectrómetros que permiten realizar experimentos

EM-EM:

tándem de espectrómetros en el espacio y en el tiempo. El tándem en el espacio es el resultado del acoplamiento de instrumentos (cuadrupolo triple) y el tándem en el tiempo es la realización de una secuencia apropiada de eventos en un mismo instrumento de almacenamiento de iones (por ejemplo en 285

Espectrometría de Masas

una trampa de iones o la cámara de iones en un ciclotrón). En lo que sigue nos referiremos al primero de los sistemas. El más simple de los sistemas tándem de espectrometría de masas incluye dos analizadores EM/EM o EM 2 ; no existen en principio límites para el número de espectrómetros que pueden acoplarse, es decir, P

P

sistemas EM n . Hasta ahora se han construido sistemas que incluyes hasta cuatro analizadores de masa P

P

acoplados. En la medida en que aumenta el número de analizadores acoplados crecen las capacidades experimentales, también la complejidad y por supuesto, el costo del instrumento.

Figura 4.34. Espectrometría de masas en tándem

La espectrometría de masas en tándem también es útil cuando de trata de analizar una mezcla de sustancias. En la Figura 4.35 una mezcla de compuestos A+B+C se introduce a una fuente de ionización blanda

donde se originan los iones correspondientes A + , B +, C + , que son iones moleculares. El P

P

P

P

P

P

analizador EM-1 genera el espectro de masas de la mezcla y selecciona el ión que será fragmentado en cada caso. Mediante el analizador EM-2 se registra el espectro de masas del ión seleccionado. El analizador EM-1 realiza la separación de los componentes de la mezcla y el espectrómetro EM-2 registra el espectro de masas de cada componente. El sistema EM/EM funciona de manera análoga al sistema cromatografía-masas, pero a una velocidad incomparablemente mayor.

286

Espectrometría de Masas

La espectrometría de masas en tándem permite obtener más información que cualquiera de las técnicas aisladas de espectrometría de masas ante un mismo problema, y además abordar problemas no accesibles a las técnicas individuales.

Figura 4.35 Sistema tándem EM/EM aplicado a una mezcla de sustancias

En la Figura 4.36 se muestra el espectro de masas-FAB de una fracción aislada que contiene varios factores de nodulación (familia de lipoquitooligosacáridos segregados por bacterias) que aparecen a diferentes valores de m/z. El ión de m/z 1244 seleccionado y fragmentado pasa a un analizador B/E (EM) obteniéndose su espectro de masas correspondiente. De esta forma resulta identificado. En este sistema el espectrómetro de masas-FAB realiza las funciones de separación de los componentes de la mezcla y el espectrómetro B/E el espectro de masas del ión seleccionado.

Figura 4.36 Elucidación estructural mediante EM/EM de un factor de nodulación de la bacteria Rhizobia

287

Espectrometría de Masas

4.1.8 Indicadores de la eficiencia de un espectrómetro de masas

Como en toda técnica de medición, un conjunto de indicadores expresa la eficiencia y confiabilidad de un espectrómetro de masas. Algunos ya han sido definidos previamente al estudiar los analizadores. (a) Límite de masas superior o alcance de masas: es el valor más elevado de la razón m/z que puede ser medido. Se expresa en thomson (Th) o unidades atómicas(u) para un portador de una carga elemental. (b) Poder de resolución. La capacidad del espectrómetro para diferenciar las señales de dos iones con valores de m/z cercanos. Se considera que dos picos están resueltos cuando el valle entre los mismos tiene una fracción determinada de la intensidad del pico más débil (10% en analizadores magnéticos o ICR, 50% en analizadores cuadrupolares). Si δm es la menor diferencia de masas entre dos picos de masa m y (m + δm) que pueden ser resueltos, se define la resolución R como: R=

m δm

(c) Transmisión. La razón entre el número de iones que llega al detector y el número de iones producidos en la fuente de ionización. Depende del analizador y es determinante en la sensibilidad. (d) Sensibilidad. Se define como la razón entre la corriente iónica y la cantidad de muestra en la fuente y expresa la capacidad del espectrómetro de masas para detectar las señales de un ión. (e) Límite de detección. Debe diferenciarse de la sensibilidad. Es la cantidad más pequeña de muestra que produce una señal distinguible del ruido de fondo (generalmente una señal con intensidad diez veces superior al nivel de ruido). Se debe destacar que esta cantidad mínima no tiene que corresponder con la cantidad de muestra necesaria para obtener un espectro de masas interpretable. Por ejemplo, el límite de detección puede ser menor de 1 pg, pero que se necesite 1 ng del compuesto para obtener el espectro. El límite de detección depende considerablemente de la abundancia de la especie iónica dependiendo de la abundancia de esta especie respecto al total de iones derivados de la molécula analizada. Así, para reducir el límite de detección se debe generar una señal todo lo intensa que sea posible, para lo cual se utilizan métodos tales como: modificar las condiciones de ionización, emplear técnicas más suaves de ionización, obtener derivados de la muestra para incrementar el número de iones producidos en la fuente o reducir sus fragmentaciones.

288

Espectrometría de Masas

4.1.9 Consideraciones generales

El proceso de la formación de iones es el punto de partida de la espectrometría de masas y determina su alcance y utilidad. No siempre resulta del todo claro cómo se originan los iones y este aspecto constituye una importante área de investigación actualmente. El desarrollo en los últimos años de métodos de ionización blandos, los cuales generan una escasa fragmentación, ha dado lugar a progresos sustanciales en la caracterización de macromoléculas mediante espectrometría de masas. Así, los métodos de ionización basados en la desorción, la formación directa o emisión de iones a partir de una superficie líquida o sólida, han permitido extender las aplicaciones de la espectrometría de masas a compuestos no volátiles y térmicamente inestables, eliminando la necesidad de una evaporación de las moléculas neutras previa a la ionización, con lo cual se logra hacer mínima la degradación térmica de las especies moleculares. El área de los biopolímeros ha sido una de las más favorecidas por los avances logrados en la espectrometría de masas. Así, desde los años 80, mediante la espectrometría de masas-FAB se pudo realizar la determinación exacta de masas moleculares de péptidos y proteínas pequeñas. Más recientemente las fuentes MALDI y ESI han extendido notablemente el rango de determinación de masas moleculares desplazando significativamente a la técnica FAB. 4.2 Informaciones que se obtienen mediante espectrometría de masas

Las características de los espectros de masas son muy dependientes de las técnicas utilizadas en el registro experimental. Particularmente influyente es la técnica de ionización que se utilice, y por ello se debe especificar al reportar un espectro de masas. No obstante, algunos conceptos, procedimientos de trabajo y análisis de resultados obtenidos mediante espectrometría de masas tienen un carácter general. Varios de esos aspectos se analizan en este epígrafe. 4.2.1 Los isótopos de los elementos químicos y la espectrometría de masas

La mayoría de los elementos químicos existen en la naturaleza como mezclas de isótopos. En la Tabla 4.5 se dan los datos sobre los isótopos estables de un importante grupo de elementos químicos. Se puede apreciar que el isótopo de menor masa es el más abundante en todos los casos incluidos en la tabla, lo cual constituye un importante hecho experimental para la espectrometría de masas, como podrá apreciarse posteriormente. Atendiendo a la abundancia isotópica, los elementos químicos pueden ser clasificados en tres categorías: A : sólo existe un isótopo (F, P, I) o uno de ellos es el fundamental (H). A+1: elementos químicos con un isótopo que es una unidad de masas más pesado que el más abundante (C, N). A+2 : elementos químicos con un isótopo que es dos unidades de masas más pesado que el más abundante ( O, Si, S, Cl, Br). Son los más fáciles de reconocer en un espectro de masas. 289

Espectrometría de Masas

Una clasificación similar se utiliza para los picos del espectro de masas: un pico A es aquel cuya fórmula elemental se compone de solamente los isótopos más abundantes. Un pico A+1 es el de una unidad de masas mayor y así sucesivamente. Tabla 4.5 Isótopos estables de elementos químicos representativos en EM Isótopo Masa Masa Composición % relativo al isotópica promedio isotópica del isótopo más elemento (%) abundante. 1 H 1.007825 1.00794 99.895 100 2 H 2.014 0.015 0.015 12 C 12.000000 12.011 98.90 100. 13 C 13.003355 1.10 1.112 14 N 14.003074 14.00674 99.63 100 15 N 15.000108 0.37 0.37 16 O 15.994915 15.9994 99.76 100 17 O 16.999133 0.04 0.04 18 O 17.999164 0.20 0.20 19 F 18.998403 18.9984 100 100 28 Si 27.976927 28.0855 92.21 100 29 Si 28.976495 4.67 5.065 30 Si 29.973770 3.10 3.336 31 P 30.973762 30.9738 100 100 32 S 31.972070 32.066 95.03 100 33 S 32.971456 0.75 0.789 34 S 35.769866 4.22 4.44 36 S 35.967080 0.02 0.021 35 Cl 34.968852 35.453 75.37 100 37 Cl 36.965903 24.23 31.98 79 Br 78.918336 79.904 50.69 100 81 Br 80.916289 49.31 97.28 127 I 126.904476 126.9045 100 100 P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

PU

P

P

P

P

P

P

P

P

U

P

Las masas atómicas utilizadas en los cálculos químicos comunes están basadas en los valores promedios de las mezclas de los isótopos de los elementos químicos. Por ejemplo, en el caso del diclorometano la masa molecular resulta: 12.01 + 2(1.00) + 2(35.45)= 84.91 u. Si la resolución del espectrómetro es insuficiente para que se observen los picos correspondientes a los isótopos, esos picos se combinan en uno solo que se extiende en un rango de masas. La masa molecular determinada por el espectrómetro de masas será la masa promedio de la mezcla de isótopos. Realmente lo usual es que los picos correspondientes a los diferentes isótopos sean separados por el espectrómetro de masas, de manera que se observen varios picos con valores de m/z diferentes y con razones de intensidades que dependen de la abundancia de cada isótopo. En la región del ión molecular del espectro de masas del diclorometano se observan varios picos isotópicos, siendo el más intenso el que se encuentra en m/z 84 que se corresponde con el valor calculado utilizando la masa del isótopo más abundante de cada elemento : 12.00 + 2(1.00) + 2(36.96)= 83.9 . 290

Espectrometría de Masas

Los fragmentos C 10 H 20 y C 8 H 12 O 2 tienen ambos una masa de 140 u. El primero fragmento produce además B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

un pico en m/z 141 con 11% de intensidad respecto el pico en m/z 140, y el segundo fragmento produce pico que aparece en m/z 141 con 8.8% de intensidad respecto al pico en m/z 140. La diferencia entre las intensidades relativas respecto al pico en m/z 141 se debe a las diferentes distribuciones del isótopo

13 P

P

C que

existe entre los fragmentos moleculares, lo cual permite su diferenciación mediante espectrometría de masas. Sin embargo, las posibilidades reales son limitadas porque las intensidades medidas pueden ser afectadas por diferentes factores. En el caso de fragmentos de moléculas pesadas, la intensidad observada puede provenir de varios fragmentos de diferente composición, todos presentes en el cluster isotópico, tal como C 10 H 21 de B

B

B

B

masa 141 u, siguiendo con el ejemplo anterior. En principio este riesgo no existe para el caso del ión molecular. Las abundancias relativas de isótopos en una molécula o en un fragmento son el resultado de su distribución estadística. Los isótopos son los responsables de que los picos en un espectro de masas aparezcan como clústeres isotópicos, que son característicos de la composición elemental de cada sustancia, constituyendo una importante fuente de información estructural. Mediante el ejemplo de la molécula de dibromo se ilustra el cálculo de un cluster isotópico. Cada uno de los isótopos del bromo ,

79 P

Br(50.69%) y

P

81 P

P

Br(49.31%), puede ocupar dos posiciones en la molécula, de manera

que el numero de combinaciones posibles es 2 2 =4 ( el exponente es el número de posibles posiciones de cada P

P

isótopo en la molécula) . Las combinaciones son: 81 P

P

79 P

P

Br 79 Br (m/z 158); P

P

79 P

P

Br 81 Br/ P

P

81 P

P

Br 79 Br (m/z 160); P

P

Br 81 Br (m/z 162). Para calcular la intensidad relativa de los picos se utilizan los datos de la composición P

P

isotópica de cada elemento. m/z 158 160 162

una combinación de dos átomos 79 Br : (0.5069) 2 x 100= 25.69 % dos combinaciones de 79 Br y 81 Br : 2(0.569) 2 (0.4931) x 100= 49.99% una combinación de dos átomos 81 Br : (0.4931) 2 x 100 = 24.31 % P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

P

El resultado final se expresa de la forma siguiente: 158(51%); 160(100%); 162(49%). La existencia en un espectro de masas de un cluster isotópico compuesto por tres señales espaciadas por dos unidades de masas y con la razón de intensidades calculadas en el ejemplo anterior es una firme evidencia sobre la existencia de dos átomos de bromo en el fragmento iónico. Varios elementos químicos tienen composiciones isotópicas que generan clústeres isotópicos característicos, como se muestra en la Figura 4.37. Se incluye la representación gráfica del resultado obtenido para dos átomos de bromo. Se puede apreciar que los clústeres isotópicos dependen del número y abundancia de los isótopos presentes, así como del elemento al cual pertenecen..

291

Espectrometría de Masas

Es notable el valor de la "información negativa" que se obtiene de los clústeres isotópicos. Por ejemplo, considere un pico A (que puede ser del ión molecular o de un fragmento iónico cualquier) en un espectro de masas y el pico dos unidades de masas más pesado, es decir A+ 2. Si [(A+2)]/[A] < 3% , el pico A no puede contener al isótopo más abundante de los elementos Si, S, Cl o Br. Se excluye al oxígeno porque su isótopo A+2 tiene una abundancia muy baja (0.20%).

Figura 4.37 Clústeres isotópicos en espectrometría de masas.

4.2.2 El ión molecular 4.2.2.1 La masa del ión molecular calculada y experimental

El in molecular (M +. ) brinda la información más valiosa en el espectro de masas. Su masa y composición P

P

elemental indican las fronteras dentro de las cuales se tienen que encontrar los fragmentos estructurales que se detecten en el espectro de masas. Las técnicas de ionización que existen actualmente hacen posible obtener el ión molecular para prácticamente todas las sustancias. La existencia de los isótopos de los elementos químicos hace necesario establecer la convención de que en espectrometría de masas la masa molecular (valor de m/z del pico del ión molecular) se calcule en términos de las masas del isótopo más abundante de cada elemento químico presente en la molécula. Así, la masa molecular del Br 2 es 158 u, aunque en el espectro de masas de esta sustancia el B

B

ión más intenso se encuentra en m/z 160. Con el valor calculado de la forma indicada se hace corresponder la masa molecular medida experimentalmente mediante espectrometría de masas. La forma del espectro de masas y el procedimiento para calcular el valor numérico de m/z para el ión molecular dependen significativamente de la fuente de ionización del espectrómetro.

292

Espectrometría de Masas

4.2.2.2 Características del ión molecular

Para una sustancia pura, libre de picos extraños tales como los originados por el ruido de fondo y las reacciones ión-molécula, el ión molecular tiene una serie de características que, por un lado permiten identificarlo y por otro resultan muy útiles desde el punto de vista práctico como fuente de información estructural. Esas características son las siguientes: (a) Tiene el valor más elevado de la razón m/z del espectro de masas. El pico del ión molecular se toma como el correspondiente a la masa monoisotópica calculada utilizando la masa del isótopo más abundante de cada elemento presente en el ión molecular. Las masas de los fragmentos que de él se generan se calculan de la misma forma. (b) La mayoría de las veces es un ión con electrón no apareado. En la fuente EI la molécula de la muestra se ioniza por pérdida de un electrón y por lo tanto el ión resulta una especie radicálica. Este tipo de ión, que puede ser molecular o fragmento, con electrón no apareado, se simboliza como OE +. (OE: P

P

odd-electron ion). Estos radicales iónicos se deben distinguir de los cationes en los cuales los electrones de la capa externa están apareados y que se simbolizan como EE + (EE: even-electron ion). P

P

(c) Es el ión de menor potencial de aparición. El potencial de aparición de un ión es la energía mínima requerida para producirlo y cualquier especie neutra acompañante a partir de una molécula, ión o radical. Esta definición incluye la posibilidad de que los productos se encuentren en sus estados excitados. Si en un espectrómetro de masas-EI se reduce la energía de los electrones ionizantes, el ión molecular es el último en desaparecer puesto que para su formación sólo se necesita la energía de ionización. Para el resto de los iones es necesaria energía adicional para la fragmentación. (d) Contiene todos los elementos químicos que se pueden identificar en los fragmentos, en un número igual o mayor que en éstos. (e) Debe estar separado de los iones fragmentos más próximos por diferencias de masas lógicas desde el punto de vista químico. La existencia de picos que no cumplan con esta exigencia (Δm = 3-14, 2125, 33) puede ser debida a la presencia de impurezas o a una errónea selección del pico correspondiente al ión molecular. 4.2.2.3 La regla del nitrógeno

Para la mayoría de los elementos químicos existe una correspondencia entre la masa del isótopo más abundante y su valencia: ambos son números pares o ambos son números impares, con la excepción del nitrógeno. Esto da lugar a la denominada regla del nitrógeno, que puede establecerse en los siguientes términos: si un compuesto no contiene átomos de nitrógeno o contiene un número par de ellos, su ión molecular tendrá un número de masa par. Así, si el pico de mayor valor m/z se encuentra a un número de 293

Espectrometría de Masas

masa impar, el ión molecular contendrá un número impar de átomos de nitrógeno. Se debe recordar que la excepción del átomo de nitrógeno en cuanto a la igualdad de las paridades de carga y masa es válida solamente si se considera la masa del isótopo más abundante en todos los casos. De igual forma debe tenerse presente que la regla del nitrógeno no se cumple para compuestos marcados isotópicamente. 4.2.2.4 Paridad electrónica y paridad de masa

La gran mayoría de las moléculas tiene un número par de electrones, siendo excepciones los radicales estables. En muchos procesos químicos se pueden encontrar especies activas que son iones con un número par de electrones, así como también radicales,

que son especies sin carga con un número impar de

electrones. Por su parte, en la espectrometría de masas, se observan iones con un número par de electrones, pero también se encuentran iones radicálicos, una especie no común en la química en fase condensada. En el presente análisis se incluirán moléculas que pueden contener átomos de C, H, N, O, S, P y halógenos. Además, las masas moleculares que se consideran están calculadas utilizando el valor de la masa atómica del isótopo predominante de cada elemento químico, como es usual en espectrometría de masas. Bajo esa condición la regla del nitrógeno requiere que la masa molecular sea siempre par cuando no existan átomos de nitrógeno o esté presente un número par de ellos en la especie analizada. Considere una molécula que no contiene átomos de nitrógeno y que se ioniza en una fuente de ionización EI. El proceso de ionización consiste en expeler un electrón para producir un catión radicálico: M + e → M +. + 2e P

P

Al inicio la molécula M tiene una masa par y un número par de electrones. Luego de la ionización se mantiene la masa par, pero ha disminuido el número de electrones en una unidad haciéndose impar. De esta forma se obtiene un catión radicálico. Si la molécula M se ioniza utilizando un método blando usualmente se obtiene un ion pseudomolecular ( M + H) + que tiene una masa impar .Observe que la masa M ,que es par, se incrementa en una unidad debido al P

P

protón, mientras que se mantiene el mismo número de electrones que en la molécula neutra, es decir, un número par de electrones. Así surge un catión. Un análisis similar se puede hacer para los iones negativos. Por otra parte, un número impar de átomos de nitrógeno da lugar a una masa molecular impar tal como se define en espectrometría de masas.. El análisis realizado se resume en la denominada "regla de paridad" que consiste en lo siguiente: Cuando no hay átomos de nitrógeno o su número es par, cualquier ión con un número de masa par tiene un número impar de electrones y es un catión radical o un anión radical. Todo ión con masa impar tiene un número par de electrones y es un catión o un anión. Lo inverso es cierto para un número impar de átomos de nitrógeno. 294

Espectrometría de Masas

4.2.2.5 Determinación de una fórmula molecular mediante espectrometría de masas Fórmula molecular a partir de intensidades de iones isotópicos

La existencia de los isótopos de los elementos químicos hace posible la determinación de la fórmula molecular de una sustancia mediante espectrometría de masas a partir de las intensidades relativas de los picos isotópicos del ión molecular. En la Tabla 4.5 se incluyen los datos del % relativo al isótopo más abundante de un grupo de elementos químicos. Si un compuesto contiene un átomo de carbono, por cada 100 moléculas que contengan un átomo de carbono-12, alrededor de 1.08 moléculas contendrán un átomo de carbono-13, las cuales dan lugar a un pico (M + 1) de alrededor de 1.08% de intensidad respecto al pico de referencia (M). Los átomos 2 H P

P

presentes tendrán una contribución muy pequeña al pico (M + 1). Si un compuesto contiene un átomo de azufre, el pico (M + 2) será alrededor de 4.4% del pico de referencia. El número de átomos de Cl, Br o sus combinaciones se puede deducir a partir de los patrones característicos de los clústeres isotópicos que se observan en el espectro de masas, además de por su elevada contribución a la intensidad del pico (M + 2). Los elementos F, P y I están compuestos por un solo núclido. Cuando sólo están presentes C, H, N, O, F, P, I los valores aproximados de %( M + 1) y %(M + 2) vienen dados por las expresiones: %( M + 1) = 100{ [(M + 1)] / [M] } ≅ 1.1 n C + 0.38 n N B

B

[4.17]

B

B

%(M + 2) = 100{ [(M + 2)] / [M] } ≅ (1.1n C ) 2 /200 + 0.20 n O B

B

P

P

B

B

[4.18]

donde n X ( x = C, N, O ) son el número de átomos de C, N, O en cada caso. B

B

Siguiendo los procedimientos y criterios de cálculo descritos se ha confeccionado la denominada tabla de Beynon, que facilita el procedimiento de selección de fórmulas moleculares apropiadas a partir de datos de abundancia isotópica. Usualmente las diferentes variantes de esta tabla incluyen información sólo sobre los elementos C, H, O, N; por lo que previo a su utilización hay que determinar la presencia o no de S, Cl, Br en la molécula. La tabla de Beynon puede ser encontrada en diferentes textos especializados de espectrometría de masas. El procedimiento de trabajo se ilustra mediante un ejemplo. Los datos obtenidos del espectro de masas pueden ordenarse de la siguiente forma: m/z 150(M) 151(M + 1) 152(M + 2)

% 100

10.2 0.88

295

Espectrometría de Masas

El pico de referencia tiene m/z 150, de manera que se tiene la masa molecular. Atendiendo baja intensidad del pico (M + 2), se excluye la presencia de átomos de S o halógenos en la muestra. El pico (M + 1) tiene una intensidad relativa de 10.2%. De una tabla de Beynon se toma la información siguiente: Fórmula M+1 M+2 C 7 H 10 N 4 9.25 0.38 C 8 H 8 NO 2 9.23 0.78 C 8 H 10 N 2 O 9.61 0.61 C 8 H 12 N 3 9.98 0.45 C 9 H 10 O 2 9.96 0.84 C 9 H 12 NO 10.34 0.68 C 9 H 14 N 2 10.71 0.52 B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

Para una masa molecular de 150 u, se seleccionan las fórmulas cuyas contribuciones isotópicas a (M + 1) se encuentran en el rango de masas de 9.0 a 11.0 (el rango puede variar). Se toman también los valores correspondientes de (M + 2). Los valores de (M + 2) son la base de la siguiente selección. La mayor coincidencia entre los datos del espectro de masas de la sustancia y los de la tabla de Beynon ocurre para la fórmula molecular C 9 H 10 O 2 . No obstante, hay que utilizar informaciones adicionales para excluir con B

B

B

B

B

B

seguridad la fórmula C 8 H 10 N 2 O. Esas informaciones adicionales pueden ser obtenidas mediante otro tipo de B

B

B

B

B

B

datos de la propia espectrometría de masas (fragmentos iónicos, etc) o por otros métodos. Fórmula molecular a partir de razón m/z del ión molecular obtenida con alta resolución

La elevada exactitud con que se obtiene el valor de la razón m/z de los picos en un espectrómetro de masas de alta resolución permite determinar la fórmula molecular de una sustancia a partir de la razón m/z del ión molecular. Esto es posible debido a que las masas de los núclidos no son números enteros en unidades de masa atómica como se muestra en la Tabla 4.5. Así las especies: N 2 , CO, CH 2 N y C 2 H 4 en condiciones de B

baja resolución presentan

B

B

B

B

B

B

B

un ión molecular común a m/z = 28, lo que no permite su identificación. Este

problema es resuelto cuando la resolución es del orden de 0.001 m/z o superior. Se observarán picos perfectamente diferenciables: N 2 + m/z = 28.0064, CO + m/z = 27.9949, CH 2 N + m/z = 28.0187, C 2 H 4 + m/z = 28.0312 B

PB

P

P

P

Pueden encontrarse en tablas

B

B

P

P

B

B

B

PB

P

o mediante programa de cómputo sencillo la composición atómica

correspondiente a cada valor de m/z. La fórmula global de iones moleculares y fragmentos puede entonces determinarse directamente en condiciones de alta resolución a partir de sus relaciones m/z. 4.2.2.6 Cálculo del número de anillos más insaturaciones

En adición al tipo y número de átomos, la fórmula molecular de un compuesto permite calcular el número de anillos más instauraciones en la molécula. En una molécula de fórmula C x H y N z O n en número de anillos B

B

B

B

B

B

B

B

más dobles enlaces es igual a x + 1 - (1/2) y + (1/2) z. Por ejemplo, el valor de 4 encontrado para la piridina 296

Espectrometría de Masas

corresponde al anillo más los tres dobles enlaces de la molécula. La expresión de cálculo puede incluir a otros átomos, para lo cual considere una fórmula molecular tal como I y II n III z IV x donde: B

B

B

B

B

B

B

B

I(átomo monovalente): H, F, Cl, Br, I……; II(átomo bivalente): O, S…..; III(átomo trivalente): N, P…..; IV(átomo tetravalente): C, Si…. Observe que la fórmula C x H y N z O n está incluida en I y II n III z IV x . En la fórmula molecular generalizada B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

B

los átomos se agrupan de acuerdo con sus valencias respectivas para utilizar la expresión de cálculo. La generalización se basa en el estado de valencia más bajo de los elementos químicos presentes. Así, en una molécula que contenga átomos de Si y C, éstos se suman para encontrar el valor de x . El procedimiento de cálculo es aplicable a iones del tipo OE +. entre los cuales se encuentra el ión molecular . P

P

Cuando el cálculo se realiza para un ión del tipo EE + el resultado será siempre un múltiplo impar de 0.5. Por P

P

ejemplo, para el ión benzoilo: C 6 H 5 CO + : 7- 2.5 + 1 = 5.5; que representa al anillo , los tres dobles enlaces B

B

B

B

P

P

del benceno y el doble enlace del grupo carbonilo. Esto equivale a restar 1/2 al resultado obtenido. Al resultado del cálculo también se le denomina índice de deficiencia de hidrógeno (IDH). 4.2.2.7 Fragmentos neutros de baja masa molecular

La fragmentación del ión molecular conduce a la formación de iones y de fragmentos neutros que no son observados en el espectro de masas. La masa del fragmento neutro puede ser calculada a partir de la diferencia entre las masas del ión molecular y del fragmento iónico originado. Es posible obtener un gran volumen de información concerniente a la composición elemental de una sustancia a partir de las masas de los fragmentos neutros perdidos de baja masa molecular. En el caso de moléculas que contienen solamente átomos de carbono e hidrógeno, el rango de masas para tres átomos de carbono es de 36(C 3 ) a 43(C 3 H 7 ) u. Para dos átomos de carbono los límites son 24 y 29 u; B

B

B

B

B

B

para cuatro átomos de carbono 48 y 57 u y para cinco átomos de carbono el mínimo es de 60 u. Fragmentos iónicos o neutros con masas en el rango de 30 a 35 u necesariamente tendrán átomos diferentes del carbono y el hidrógeno. También, algunas pérdidas en una sola etapa

corresponden solamente a una fórmula

razonable para la especie neutra, como lo es caso de 20 u, que sugiere la eliminación de HF. Sin embargo es importante tener en consideración el hecho de que un fragmento puede ser el resultado de varios pasos sucesivos partiendo del ión molécula. Así, un ión con masa (M -20) u no significa necesariamente la presencia de flúor, pues el fragmento puede ser el resultado de pérdidas sucesivas de fragmentos neutros tal como (M + - H 2 O - H 2 ). P

P

B

B

B

B

La información que brindan los fragmentos neutros de baja masa molecular puede ser combinada con la obtenida a partir de las abundancias isotópicas. Por ejemplo, una masa de 47 u puede corresponder a las

297

Espectrometría de Masas

fórmulas CH 3 O 2 o CH 3 S. En el segundo caso el pico del ión m/z 47 tiene que estar acompañado por otro con B

B

B

B

B

B

m/z 49(4.2%) debido a la contribución a la intensidad del isótopo 34 S. P

P

4.2.3 Iones metaestables

En general, la estabilidad de los iones es un aspecto esencial en la espectrometría de masas. Comparando los tiempos de permanencia en la fuente de ionización y de llegada al detector con sus

tiempos de vida, los

iones generados en una fuente de ionización pueden clasificarse como: (a) Iones inestables con tiempos de vida inferiores a 1 μs que se descomponen íntegramente en la fuente de ionización y no se detectan. (b) Iones estables, que tiene tiempos de vida superiores a 10 -5 s que alcanzan el detector y son registrados P

P

como tales. (c) Iones metaestables, los cuales tienen tiempos de vida en el rango de 10 -6 - 10 -5 s y generalmente se P

P

P

P

descomponen parcialmente en el espectrómetro de masas entre la fuente y el detector. Cuando se registra un espectro de masas utilizando una técnica de ionización dura, se favorecen los procesos de fragmentación. Los espectros de masas registrados de esta forma son muy ricos en picos, lo cual constituye una inestimable fuente de información estructural. En este tipo de espectro de masas la estabilidad de los iones formados es un aspecto altamente significativo. De acuerdo con la clasificación previa, los iones inestables no se detectan y los iones estables se detectan como tales en el colector. Un comportamiento diferente tienen los denominados iones metaestables, cuyas características son objeto de análisis continuación. Considere un ión m 1 + que puede fragmentarse según: B

PB

P

m1 + B

PB

m2 +

→

P

B

PB

P

+

n

donde n es un fragmento neutro Si no ocurre fragmentación el detector registrará al ion m 1 + .Si la fragmentación ocurre en la fuente de B

PB

P

ionización el detector registrará sólo al ión m 2 + . Por su parte, para la fragmentación que ocurre entre la B

PB

P

fuente de ionización y el registrador existen dos posibilidades: que durante la fragmentación estén actuando campos eléctricos o magnéticos sobre el ión o que la fragmentación ocurra en una región libre de la acción de esos campos, como la existente entre el acelerador y el analizador magnético. En el primer caso la detección de los iones es muy difícil debido a las condiciones cambiantes, no así en el segundo caso, donde las condiciones son favorables para la detección. Por ejemplo, en un acelerador magnético, el ión es acelerado como m 1 + , de manera que su energía cinética B

PB

P

antes de la fragmentación viene dada por la expresión [4.2]: (1/2)m 1 v 2 = eV B

B

P

P

298

Espectrometría de Masas

v 2 = 2eV/m 1

De donde

P

P

B

Al fragmentarse el ión m 1 + producirá m 2 + B

PB

P

B

B

P

PB

y n. La energía cinética más probable de m 2 + B

PB

P

será

eV(m 2 /m 1 ), lo que equivale a plantear que m 2 + se mueve a la velocidad original de m 1 + . Dado que la B

B

B

B

B

P

PB

B

PB

P

energía cinética de del ión m 2 + es diferente a la del resto de los iones, en su caso no se cumple la expresión B

P

PB

(X.4): m/e = r 2 B 2 /2V P

P

La trayectoria del ión m 2 + B

PB

P

P

P

en el analizador magnético depende de su momento lineal según la expresión

[4.3]: m 2 v =e B r B

B

de donde v = eBr/m 2 , y sustituyendo en la expresión v 2 = 2eV/m 1 B

B

P

P

B

e 2 B 2 r 2 / m 2 2 = 2 e V /m 1

se obtiene :

P

P

P

P

P

P

B

PB

P

[4.19]

B

2

2

B

2

(m 2 /m 1 ) (1/e) = r B /2V

Reordenando:

B

P

PB

B

B

P

m* = m 2 2 / m 1

haciendo:

B

P

PB

B

P

[4.20]

P

P

[4.21]

B

( m*/e) = r 2 B 2 /2V

resulta :

P

P

P

[4.22]

P

La expresión [4.22] es equivalente a la ecuación básica de los analizadores magnéticos

[4.4] y sólo se

distingue de ésta en que la masa (m) se sustituye por m*=m 2 2 /m 1 . Así, la expresión [4.22] indica que el ión B

m2 B

+ PB

P

producto de la fragmentación de m 1 B

+

P

B

B

en la región libre del efecto de campos se detecta en el espectro

P

PB

PB

a una razón masa/carga m*/z. Dado que el ión se acelera como m 1 + , adquiere una velocidad menor que la B

PB

P

correspondiente a su masa (m 2 + ), y por lo tanto se desvía más fuertemente en el campo magnético del B

PB

P

analizador, registrándose a un valor de m/z menor que el correspondiente a (m 2 + ). Al pico de masa m* se le B

PB

P

denomina pico de ión metaestable o señal de transición. El orden de aparición en el espectro de masas en el sentido de m/z creciente es: m* ≤ m 2 B

+ PB

PB

≤ m 1 + . En conclusión, si un ion m 1 + se fragmenta después de salir

B

B

PB

P

B

PB

P

de la fuente de ionización en una región libre de la acción de campos y antes de llegar al detector, se detecta como un pico de ión metaestable m*=m 2 2 /m 1 . B

PB

P

B

B

Los picos de iones metaestables aparecen en el espectro de masas como señales difusas y de baja intensidad, extendiéndose en ocasiones sobre varias unidades de masa con una distribución frecuentemente gaussiana en la cual el valor de m* corresponde al máximo de la curva. Son comunes también otras distribuciones menos simétricas. La utilidad fundamental de los picos de iones metaestables es que constituyen una evidencia experimental del mecanismo de fragmentación que relaciona a dos iones. La detección de un pico de ión metaestable m* , es B

B

decir, el hecho de que en el espectro de masas se encuentre un pico con las características previamente descritas y a un valor m/z dado por m*=m 2 2 /m 1 indica que el ión m 2 B

PB

P

B

B

B

+ PB

P

se origina, al menos parcialmente, 299

Espectrometría de Masas

por fragmentación del ión m 1 + . La descripción textual de un proceso de este tipo puede ser, por ejemplo, la B

PB

P

siguiente: (m*, 43→28) m/z calculado 18.2, m/z observado 18.3 significaría que para la fragmentación m/z 43→28 B

B

B

B

se observa un pico de ión metaestable a m/z = 18.3 (calculado 18.2). Las fragmentaciones que conducen a moléculas neutras favorecen la formación de picos de iones metaestables. La información que suministraban los picos de iones metaestables sobre los caminos de fragmentación se obtiene actualmente con mayor eficacia y rapidez haciendo uso de otras técnicas como el tándem de masas, como se ha discutido anteriormente. En la Figura 4.38 se muestra un típico pico de ión metaestable.

Figura 4.38 Región del EM-EI del meta-nitrofenol. Se observa un pico de ión metaestable a relación m/z fraccionaria, ancho y de baja intensidad que corresponde a la pérdida de NO a partir del ión molecular (139 → 109, m* calculada: 85.48). Las curvas corresponden a registros superpuestos con diferente amplificación, usual en la etapa inicial del desarrollo de la espectrometría de masas.

300

0123456783569  3 1 1

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