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• Patricio Morillo Crispatri

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. PROPOSITOS La aplicación de las técnicas microbiológicas, de realizar el control microbiológico de materias primas y productos cosméticos y farmacéuticos no estériles, utilizando metodologías oficiales (USP). Estas pruebas se basan en la capacidad de determinar la presencia de microorganismos a través del uso de medios de cultivo: nutritivos, de enriquecimiento, selectivos y/o diferenciales, capaces de permitir su recuperación a partir de materias primas o productos no estériles y/o de evidenciar ciertas características bioquímicas, producto del metabolismo de los diferentes microorganismos a investigar. Recuentos microbianos, referidos básicamente al recuento total de microorganismos aerobios y el recuento total de mohos y levaduras. Investigación de microorganismos específicos: bacterias Gram negativas tolerantes: Bilis, Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. RESPONSABILIDADES Es responsabilidad de todo el personal involucrado en el área conocer y seguir los detalles listados en este procedimiento.

RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS TOTALES. RECUENTO EN PLACA (MÉTODO DEL VACIADO EN PLACA). MATERIALES Muestras a analizar (Agua, materias primas y/o cosmético) Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y de 10 mL Pipetas Cintas indicadoras de pH Jeringas esteriles Tubos de agar soya-caseína fundido y enfriado a 45-50ºC Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7,2 Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora a 32,5 ± 2,5º C Contador de colonias PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar el frasco vigorosamente (25 veces) o hasta homogenizar. Rotular 10-1. 2. Con una pipeta y con el uso de las tiras indicadoras de pH determinar el pH de la dilución anterior. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10 -1 a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10 --2. 4. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la dilución 10 -2 a un frasco de dilución con 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 estéril. Agitar. Rotular 10 --3. 5. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10 -1 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 6. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10 -2 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 7. Con una pipeta estéril, transferir porciones de 1 mL de la dilución 10 -3 a cada una de 2 placas de Petri estériles. 8. Verter en cada una de las placas, 15 mL de Agar Soya Caseína, fundido y enfriado a 45ºC, mezclando cuidadosamente las muestras con el agar. Dejar solidificar e incubar en posición invertida a 32,5 ± 2,5º C por 3 a 5 días.

RESULTADOS 1. Seleccionar aquellas placas con el número más alto de UFC, pero menor de 250 UFC por placa. 2. Contar el número de colonias en las placas seleccionadas usando el contador de colonias. 3. Calcular el número de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (ufc/mL) (ver Anexo de notación científica y diluciones). 4. Anotar los resultados en la bitácora correspondiente :

2. Recuento Total de Mohos y Levaduras. Recuento en placa (Método del vaciado en placas o siembra en profundidad) MATERIALES Muestras a analizar: (materias primas y/o medicamentos) Placas estériles Pipetas estériles de 1 mL y 10 mL Pipetas Cintas indicadoras de pH Pipetas Pasteur Tubos de agar Sabouraud Dextrosa fundido y enfriado a 45-50ºC. Frascos de dilución con buffer fosfato pH 7,2 Mechero Baño de María a 45-50ºC Estufa o incubadora a 22,5 ± 2,5º C Contador de colonias PROCEDIMIENTO Proceder de la misma forma descrita para el Recuento de Microorganismos Aerobios Totales, pero utilizando Agar Sabouraud Dextrosa, en vez de Agar Soya Caseína, e incubar las placas (sin invertir) a 22,5 ± 2,5º C por 5 a 7 días. RESULTADOS Seleccionar aquellas placas con el número más alto de ufc, pero menor de 50 ufc por placa. Contar el número de colonias en las placas seleccionadas usando el contador de colonias. Calcular el número de microorganismos viables por mL de muestra, expresado como unidades formadoras de colonias por mL (ufc/mL) (ver Anexo de notación científica y diluciones). Anotar los resultados: Placa 1: __________ Placa 2: __________ Promedio: __________ Factor de dilución correspondiente a las placas seleccionadas: _____________________ Número de ufc/mL de muestra: _____________________ CONCLUSIONES __________________________________________________________________

3. Investigación de Microorganismos Específicos 3.a. Investigación de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estériles Cintas indicadoras de pH Pipetas Pasteur Caldo Soya Caseína Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias (90mL) Estufa o incubadora a 22,5 ± 2,5º C Estufa o incubadora a 32,5 ± 2,5º C Asa de platino Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa Mechero PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un balón o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Caseína (CSC) y agitar. 2. Determinar el pH de la dilución anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Incubar a 22,5 ± 2,5º C por un periodo de 2 a 5 horas. 4. Agitar la mezcla incubada (CSC) y transferir 10mL a un balón o fiola con 90 mL de Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias (CMEE). Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 24 a 48 horas. Aislamiento de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis 5. Agitar la mezcla incubada (CMEE) y con el uso del asa hacer un aislamiento a partir del Caldo Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias al Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 24 horas. Si no hay crecimiento, la muestra cumple los requisitos en cuanto ausencia de bacterias Gram negativas tolerantes a bilis.

3.b. Investigación de Escherichia coli MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estériles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Caseína Caldo MacConkey Agar MacConkey Agar soya Caseína Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) Asa y filamento de platino Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa a 32,5 ± 2,5º C Estufa a 42 - 44º C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilución anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la mezcla anterior a un balón o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Caseína y agitar. 4. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 a 24 horas. 5. Agitar la mezcla anterior (CSC) y transferir 1 mL a un balón o fiola con 100 mL de Caldo MacConkey (CMcC). Incubar a 42 - 44º C por 24 - 48 horas. Aislamiento de E. coli. 6. Agitar la mezcla incubada (CMcC) y con el uso del asa hacer un aislamiento a partir del Caldo MacConkey a una placa con Agar MacConkey. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 72 horas. 7. El crecimiento de colonias indica la posible presencia de E.coli. Las colonias de coliformes en agar MacConkey son de color rojo ladrillo, eventualmente rodeadas de zonas de bilis precipitada. 8. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de coliformes. 9. Si hay colonias típicas, transplantar una de ellas a un tubo con Agar Soya Caseína inclinado. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 24 horas. 10. Hacer una coloración de Gram: E. coli es un bacilo Gram negativo. 11. Transferir el crecimiento de Agar Soya Caseína a un tubo con agar TSI. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 24 horas. Los cultivos típicos de E. coli en agar TSI presentan el bisel y el taco amarillo, sin oscurecimiento y con formación de gas.

Confirmar la presencia de E. coli por medio de pruebas bioquímicas adicionales como por ejemplo el Test del IMViC, o utilizando sistemas miniaturizados tales como API® o MicroID®. 3.c. Investigación de Salmonella (género) MATERIALES Pipetas de 10 mL y de 1 mL Propipetas Placas estériles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Caseína Caldo de Enriquecimiento para Salmonella Rappaport Vassiliadis Agar Desoxicolato Lisina Xilosa (XLD) Agar Soya Caseína Agar Triple Azúcar Hierro (TSI) Asa y filamento de platino Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa a 32,5 ± 2,5º C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilución anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la mezcla anterior a un balón o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Caseína (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 a 24 horas. 5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y transferir 0,1 mL a un tubo con 10 mL de Caldo de Enriquecimiento para Salmonella Rappaport Vassiliadis (CESRV). Incubar a 32,5 ± 2,5 º C por 18 - 24 horas. Aislamiento de Salmonella 6. Agitar la mezcla incubada (CESRV) y con el uso del asa hacer un aislamiento en Agar Desoxicolato Lisina Xilosa. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 48 horas. 7. Notar la presencia de colonias típicas del género Salmonella: Colonias rojas con o sin.

8. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple los requisitos en cuanto a ausencia de Salmonella. 9. Si se encuentran colonias típicas, transferir una de ellas a un tubo con Agar Soya Caseína inclinado. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 24 horas. 10. Hacer una coloración de Gram: los miembros del género Salmonella, son bacilos Gram negativos. 11. Transferir el crecimiento de Agar Soya Caseína a un tubo con agar TSI. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 24 horas. Los cultivos típicos de Salmonella en agar TSI presentan el taco amarillo (formación de ácido) y el bisel rojo (alcalino), con o sin oscurecimiento y/o con formación de gas.

12. Confirmar la presencia de Salmonella por pruebas bioquímicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API ® o MicroID® y mediante pruebas serológicas.

3. d. Investigación de Pseudomonas aeruginosa MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estériles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Caseína Agar Soya Caseína Agar Cetrimide Papel de filtro Reactivo Taxo N (p-aminodimetilanilina clorhidrato) Asa y filamento Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa o incubadora a 32,5 ± 2,5º C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilución anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la mezcla anterior a un balón o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Caseína (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 a 24 horas. Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa. 5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y con el uso del asa hacer un aislamiento a Agar Cetrimide. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 72 horas. 6. Las colonias típicas de Pseudomonas aeruginosa en Agar Cetrimide son pequeñas, generalmente de color verdoso, con fluorescencia verdosa a la luz ultravioleta.

7. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa. 8. Si hay colonias típicas, transferir una de ellas a un tubo de Agar Soya Caseína inclinado. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 24 horas.

9. A partir del Agar Soya Caseína hacer una coloración de Gram: la Ps. aeruginosa es un bacilo Gram negativo. 10. Realizar la prueba de oxidasa a partir del cultivo puro: En una placa de Petri colocar un disco de papel de filtro. Impregnar con el reactivo Taxo N y dejarlo secar en la estufa. Con una pipeta Pasteur estéril con la punta cerrada, transferir una pequeña cantidad del cultivo del tubo de agar inclinado, al papel de filtro. El desarrollo de un color rosado, casi púrpura, se considera una prueba de oxidasa positiva.

Oxidasa positiva

Si la prueba de oxidasa es negativa, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Ps. aeruginosa.

Oxidasa Negativa 11. Si la prueba de oxidasa es positiva, la presencia de Ps.aeruginosa debe confirmarse por pruebas bioquímicas adicionales. 12. Realizar la prueba de crecimiento a 42º C: Inocular un tubo de Agar Soya Caseína con el cultivo puro, e incubar en la estufa a una temperatura de 42º C por 24 – 72 horas. La Ps.aeruginosa es capaz de crecer a esta temperatura y es una prueba adicional para su identificación. 13. Confirmar la presencia de Ps.aeruginosa por pruebas bioquímicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API ®

3.e. Investigación de Staphylococcus aureus. MATERIALES Pipetas de 10 mL Propipetas Placas estériles Tiras indicadoras de pH Pipetas Pasteur Buffer fosfato pH 7,2 Caldo Soya Caseína Agar Manitol Sal Agar Soya Caseína Plasma EDTA (para coagulasa) Caldo Cerebro Corazón Baño de María a 37º ± 1º C Asa y filamento Mechero Equipo para coloración de Gram Estufa o incubadora a 32,5 ± 2,5º C PROCEDIMIENTO 1. Transferir 10 g o 10 mL de la muestra y añadirlos a un frasco de dilución que contiene 90 mL de buffer fosfato pH 7,2 y agitar. 2. Determinar el pH de la dilución anterior con el uso de una pipeta Pasteur y de tiras indicadoras de pH. El mismo debe estar entre 6 y 8. 3. Transferir con una pipeta estéril, 10 mL de la mezcla anterior a un balón o fiola que contiene 90 mL de Caldo Soya Caseína (CSC) y agitar. 4. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 a 24 horas Aislamiento de Staphylococcus aureus 5. Agitar la mezcla incubada (CSC) y mediante un asa hacer aislamiento a Agar Manitol Sal. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 72 horas.

6. La posible presencia de colonias típicas de S.aureus en Agar Manitol Sal, se observan como colonias amarillas o blancas, rodeadas por una zona amarilla. 7. Si no hay colonias típicas, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. 8. Si hay colonias típicas, con ayuda de un filamento, transferir una de ellas a un tubo de Agar Soya Caseína inclinado. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 18 - 24 horas. 9. A partir del tubo de Agar Soya Caseína, hacer coloración de Gram: el S. aureus

es un coco Gram positivo. Preparar un cultivo en Caldo Cerebro Corazón. Incubar a 32,5 ± 2,5º C por 24 horas. 10. Realizar la prueba de coagulasa de la siguiente forma: En un tubo de Wassermann colocar 0,5 mL de Plasma EDTA (para coagulasa); añadir 2 gotas (0,1 mL) del cultivo del microorganismo cultivado en Caldo Cerebro Corazón. Incubar en baño de agua a 37 ± 1º C, durante 4 horas. Examinar al cabo de este tiempo y luego periódicamente durante 24 horas, para comprobar la formación de coágulos; cualquier grado de coagulación, por pequeño que sea, se considera un resultado positivo. Si no se observa coagulación, la muestra cumple el requisito en cuanto a ausencia de Staphylococcus aureus. Si se observa coagulación confirmar la presencia de S. aureus por pruebas bioquímicas convencionales y/o por sistemas miniaturizados tales como API ® 3. f. Investigación de Clostridium. MATERIALES Pipetas de 10 mL