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LIMITACIONES DE LA PRUEBA DEL ADN Las técnicas de identificación genética como cualquier otra actividad humana No están exentas de limitaciones o errores cuya incidencia habrá Que ponderar de forma particular en cada proceso. Los estudios de validación realizados sobre las mismas muestras Forenses entre diversos grupos de estandarización de genética forense (FEP-ISEPG,GEDNAP, ENFSI,) han desvelado que se trata de una tecnologia Que ofrece una alta reproducibilidad y fiabilidad, pero también Se han puesto de manifiesto la existencia de determinadas excepciones a Las leyes genéticas (mutacion, inestabilidad somática) que es necesario tener en Cuenta para una correcta interpretación de algunos casos Se detecta además en este tipo de ejercicios inter laboratorio un bajo Índice de resultados discrepantes (errores) debido a cuestiones metodológicas, a Errores de custodia y a errores de transcripción de distinta Influencia en la interpretación final del supuesto practico y cuya influencia En la prericia es difícil de diagnosticar. Una de las limitaciones de los análisis de ADN es la contaminación biológica humana La preservación del indicio biológico de la contaminación de ADN Exógeno desde su recogida y durante el analiss en el laboratorio

Pagina 1870 Autor Antonio Alonso Alonso

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obligados, además de desarrollar medidas para evitar al máximo laposibilidad de una contaminación, a analizar de forma sistemática unaserie de controles negativos para monitorizar la posible influencia de lacontaminación durante el análisis de cada muestra pericial. Determinados indicios biológicos invisibles al ojo humano en los queni siquiera es posible determinar su naturaleza biológica (tipo de fluidoo tipo de células) hoy son susceptibles de

ser analizadas mediante ADN.Hay que tener en cuenta, por tanto, . CONCEPTOS BÁSICOS DE ADN FORENSE Antonio Alonso Alonso Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses. Servicio de Biología. Madrid. SUMARIO: 1. INTRODUCCIÓN.–2. ALGUNOS PRINCIPIOS BÁSICOS EN IDENTIFICACIÓN GENÉTICA.–3. LOS GENOMAS HUMANOS Y LOS TIPOS DE HERENCIA: 3.1 El ADN nuclear: la herencia compartida de los padres. 3.2 El ADN mitoconsrial: la herencia materna. 3.3 El cromosoma y: la herencia paterna de los varones.–4. LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN.–5. EL PODER IDENTIFICATIVO DE LOS ADNS FORENSES.–6. EL ADN NO CODIFICANTE Y LA INTIMIDAD PERSONAL.–7. EL ANÁLISIS GENÉTICO COM- PARATIVO EN BASES DE DATOS.–8. LIMITACIONES DE LA PRUEBA DEL ADN

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.1. INTRODUCCIÓN La presente ponencia que inaugura este curso («Nuevas Técnicas deInvestigación del Delito: Intervenciones Corporales y ADN». CEJ 21-23/06/2004) tiene por objeto presentar algunos de los principios básicos enlos que se asientan las técnicas de identificación genética humana conespecial referencia a la aplicación del ADN en la investigación del delito.Se pretende abordar de forma divulgativa algunos principios biológicos ygenéticos que nos permitan entender determinados aspectos prácticos dela utilización del ADN en las distintas fases del proceso penal, incluyen-do: la toma de muestras de la escena o del cuerpo de la victima, la tomade muestras de referencia de los imputados, la realización de las distin-tas pruebas de ADN y la utilización de la información genética obtenidadel análisis del ADN, incluido el uso de bases de datos de ADN para lacomparación de distintas causas penales. Todos estos aspectos del proceso serán tratados de forma más deteni-da en sucesivas ponencias de este curso. En esta ponencia introductoriaintentaremos, pues, ofrecer al lector algunas respuestas sencillas a lossiguientes interrogantes generales:

¿De donde puede obtenerse el ADN? ,¿En que consiste un análisis de ADN?, ¿Por qué el análisis de ADN ha deser comparativo?, ¿Cuántos tipos de ADN se utilizan en el campo forenPAG 1860.

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CONCEPTOS BÁSICOS DE ADN FORENSE

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, ¿Qué es el ADN no codificante?,

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¿Cuál es el poder Identificativo delas distintas pruebas de ADN?

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¿Cuáles pueden ser los usos «inteligentes»del ADN en la investigación criminal? o

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¿Cuáles son las limitaciones deluso del ADN en el proceso penal?

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.2. ALGUNOS PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA IDENTIFICACIÓN GENÉTICA El genoma humano es un termino que se utiliza para describir el contenido total de ADN (siglas del ácido ácido, que es la molécula portadora de la información genética) en cada célula humana y contiene el conjunto de instrucciones (código genético) para la síntesis de las pro-teínas, las cuales son, en última instancia, las responsables de la fisiología y morfología de las células que, a su vez, son los componentes básicos de todos nuestros tejidos y órganos. Todas y cada una de los trillones de células que componen nuestros tejidos y nuestros órganos (excepto las células sexuales: el espermatozoides y el óvulo, que han reducido a la mitad el contenido del ADN y determinadas células como los glóbulos rojos de la sangre que han perdido su núcleo celular) son portadoras del mismo conjunto de instrucciones genéticas (de un mismo genoma) . Por lo tanto, independientemente del órgano o tejido del que extraigamos el ADN de un mismo individuo, el perfil genético que obtengamos será el mismo. Este es el principio básico de Universalidad del genoma en el que se basa el análisis genético comparativo que se lleva a cabo entre la muestra dubitada (en general un vestigio biológico encontrado en la escena del delito o en el cuerpo de la victima: sangre, semen, saliva pelos, tejidos, restos epidérmicos,...) y una muestra de referencia indubitada (en general sangre o saliva) extraída de la persona de la que se sospecha pueda haber dejado el indicio biológico dubitado. Independientemente del tejido u órgano de procedencia el perfil genético que se obtenga será el mismo si vestigio y muestra de referencia provienen de la misma persona. Otra característica fundamental que hace del genoma humano una herramienta aplicable al campo de la identificación humana es su Diversidad. Es decir, el código genético (que es idéntico en todas las células de un mismo individuo) presenta variaciones en los distintos individuos de la población. Más adelante analizaremos de forma mas detenida la naturaleza y el significado de esta diversidad genética, quedémonos ahora simplemente con la idea de que este principio de diversidad nos ofrece la posibilidad de obtener un código genético identificador que teóricamente permite distinguir de forma precisa a cada individuo de

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3. ANTONIO ALONSO ALONSO una población (con la excepción de los gemelos idénticos o univitelinos). También veremos mas adelante que la precisión o la fiabilidad

de dicha identificación vendrá limitada fundamentalmente por dos factores :el tipo de análisis de ADN comparativo que pueda realizarse y las posibles relaciones de parentesco genético entre los individuos que hay que diferenciar en el análisis genético. Una tercera característica del genoma es su Estabilidad en muestras forenses. La molécula de ADN presenta en condiciones normales una gran estabilidad tanto en fluidos biológicos que forman manchas secas(sangre, semen, saliva,...) sobre distintos soportes como a partir de diversos tejidos humanos incluso mucho después de la muerte. Es posible pues, obtener y descifrar la secuencia de parte del material genético a partir de un gran número de vestigios biológicos de interés forense para obtener su código genético identificador y compararlo con el obtenido a partir de una muestra de referencia de la persona de la que se sospecha proviene el vestigio.3. LOS GENOMAS HUMANOS Y LOS TIPOS DE HERENCIA Realmente la información genética de las células humanas se organiza en dos genomas: El gran genoma nuclear de herencia compartida por ambos progenitores y el pequeño genoma mitocondrial que transmiten exclusivamente las madres en sus óvulos.3.1 El ADN nuclear : La herencia compartida de los padres El genoma nuclear se localiza como su propio nombre indica en el núcleo celular y representa el 99 por 100 del contenido de ADN celular total. Se encuentra asociado de forma muy específica a ciertas proteínas formando unas estructuras filamentosas denominadas cromosomas que pueden ser visualizadas al microscopio en el núcleo de las células endivisión. Un zigoto humano tiene 23 pares de cromosomas (46 cromo-somas), un miembro de cada par proviene de la madre, mientras que el otro proviene del padre. . Por el contrario, las células reproductoras(óvulo y espermatozoide) durante su formación reciben al azar sola-mente un miembro de cada par, es decir solo tienen 23 cromosomas. El número de cromosomas volverá a ser de 46 tras la fertilización del óvulo por el espermatozoide y de este modo se mantendrá constante el número de cromosomas a través de las generaciones. 

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4. CONCEPTOS BÁSICOS DE ADN FORENSE Un cromosoma es básicamente una fina hebra de ADN rodeada por otros componentes, fundamentalmente proteínas. La molécula de ADN,portadora de la información genética, es una larga cadena doble compuesta de una unidad química que se repite a lo largo de la cadena: elnucleótido. El componente fundamental de un nucleótido son las bases nitrogenadas. Existen cuatro tipos de bases A, G, T y C (A: Adenina, G:Guanina, T: Timina y C: Citosina) cuya ordenación a lo largo de la cadena del ADN será lo que determine la información genética. La cantidad total de ADN de una célula es alrededor de 3000 millones de nucleótidos. Un gen es un segmento de ADN (cuyo tamaño puede variar entre 3000100.000 nucleótidos) que contiene la información para la síntesis de una proteína. Se estima que el numero de genes humanos es de 30.000, siendo desconocida en la actualidad la función de más del 50 por 100 de estos genes. Sin embargo, estos 30.000 genes solo representan una pequeñísima fracción (2-3 por 100) del ADN total de una célula. El resto de ADN, que representa la fracción mayoritaria del genoma nuclear humano, esta compuesto en gran parte de secuencias de ADN repetitivo sin una función clara y que se suele denominar «ADN no codificante» en el sentido de que no codifica

información para la síntesis de proteínas. Es precisamente una fracción de este ADN no codificante la que mas interés tiene en genética forense, ya que se trata de regiones de ADN con una gran variabilidad de tamaño entre los individuos dela población. Las regiones de ADN no codificante de mayor interés en genética forense son las denominadas regiones de ADN microsatélite.Se trata de pequeñas regiones ADN repetitivo en tandem (de 100-500nucleótidos) compuestas por una secuencia (de 4-5 bases) que se repite en tandem n veces. Es precisamente el número de veces que se repite esta unidad de secuencia lo que presenta una gran variabilidad entre los individuos de una población. De aquí que a estas regiones se las denomine «STRs» (del ingles: «Short Tandem Repeats»: «pequeñas repeticionesen tandem»). Hoy en día, la mayoría de los análisis forenses de ADN sebasan en el estudio simultaneo de un conjunto de 10 a 15 de estas regio-nes cortas distribuidas en los distintos cromosomas humanos. Un «perfilgenético» no es mas que el patrón de estos fragmentos cortos de ADNordenados por su tamaño. Dicho patrón es fácilmente convertible en unsencillo código numérico muy fácil de almacenar, manejar y comparar,ofreciendo un alto poder de discriminación genética tanto en la identi-ficación de vestigios biológicos de interés en la investigación criminalcomo en la investigación biológica de la paternidad ya que estos perfilesgenéticos tienen una procedencia al 50 por 100 paterna y materna (vermás adelante). 

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5. ANTONIO ALONSO ALONSO3.2 El ADN mitocondrial: La herencia materna Además del ADN nuclear, las células humanas contienen un pequeñogenoma circular (de 16.569 nucleótidos) que se encuentra dentro de lasmitocondrias (los orgánulos celulares del citoplasma celular cuya funciónprincipal es la producción de energía) y que se hereda exclusivamentepor la vía materna ya que las mitocondrias son aportadas por el citoplasma del óvulo y no por el espermatozoide. El ADN mitocondrial también presenta variabilidad genética (en lasecuencia del ADN) y, por lo tanto, es una herramienta muy útil en laidentificación genética humana. Se trata, además, de un genoma cuyoestudio ofrece una ventaja importante con respecto al estudio del ADNnuclear : Su gran sensibilidad. Es un genoma que se presenta en un grannúmero de copias (hay 100-10000 copias de ADN mitocondrial por cadacopia de genoma nuclear, según el tipo celular) y, por tanto, será deaplicación en muchos casos en los que no sea posible la obtención deADN nuclear (p.ej: tallos de pelos, restos óseos antiguos,...). Sin embargola variabilidad genética del ADN mitocondrial es menor que la observadamediante el análisis de las secuencias de ADN repetitivo del gran genomanuclear. Como consecuencia de su menor variabilidad, el perfil genéticoque se obtiene mediante el estudio del ADN mitocondrial presenta unpoder discriminación en general mucho mas limitado (ver mas adelante).No olvidemos que si el ADN mitocondrial se hereda de forma inalteradade madres a hijos todos los miembros de una familia que compartan lalínea materna tendrán el mismo perfil de ADN mitocondrial. Es decir,que este tipo de ADN mas que perfiles individuales permite identificarlinajes maternos.3.3 El cromosoma Y : La herencia paterna de los varones Hay una parte del genoma nuclear que es especifico

del varón, setrata del cromosoma Y. En la especie humana el sexo esta determinadopor los cromosomas sexuales X e Y de tal forma que el genoma de lasmujeres esta contenido en 22 parejas de autosomas y dos cromosomas X(46, XX), y el de los varones es de 22 parejas de autosomas mas un solocromosoma X y un cromosoma Y (46, XY). El cromosoma Y se transmiteexclusivamente por vía paterna a la descendencia de varones de maneramas o menos inalterada a lo largo de las generaciones. En este cromoso-ma existen también regiones cortas de ADN repetitivo variables en tama-ño, cuyo estudio permite en este caso trazar linajes paternos separadosincluso varias generaciones. Además el cromosoma Y es una herramienta 

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6. CONCEPTOS BÁSICOS DE ADN FORENSEque permite obtener un patrón genético específico del varón, lo cualtiene un gran interés práctico en la identificación genética de restos desemen y otros fluidos biológicos del supuesto agresor en los casos deagresiones sexuales a mujeres. El análisis de regiones cortas de ADN repetitivo del cromosoma Yque hoy se realiza de rutina ofrece también un poder de discriminaciónmás bajo que el normalmente obtenido mediante el estudio de las regio-nes STR autosómicas. No olvidemos que, en ultimo termino, el análisisgenético del cromosoma Y no permite diferenciar genéticamente a losmiembros de una familia que compartan la misma línea paterna.4. LA OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN La obtención de ADN en el ámbito penal suele tener al menos dosescenarios y dos momentos distintos dentro del proceso. Por un lado setrata de obtener el ADN dubitado (la prueba) de la escena del delito odel cuerpo de la victima y, por otro, la obtención del ADN de referenciade las personas implicadas en el proceso con las que realizar el análisisgenético comparativo . Dada la sensibilidad de las técnicas actuales de análisis genético enmuestras forenses (cuyo limite de sensibilidad esta cercano a detectar elcontenido de ADN de unas docenas de células) el tipo y el número deposibles muestras e indicios biológicos susceptibles de ser identificadospor ADN (sangre, semen, saliva, pelos, tejidos, restos celulares en objetos tocados, ..) se ha ido incrementando en los últimos años. Cada vezse hace mas necesario el desarrollo de protocolos de investigación queaseguren el rápido aislamiento de la escena (evitando posibles conta-minaciones o transferencia de indicios) para una adecuada recogida ydocumentación de los indicios biológicos por personal especializado queaseguren la correcta conservación y la custodia de las muestras desde surecogida. La posibilidad de poder demostrar de forma documentada lacadena de custodia de las muestras es una garantía más para la admisi-bilidad de la prueba del ADN durante el acto de la vista oral. La facilidad con que en la actualidad puede obtenerse una muestrabiológica de referencia para acceder al perfil genético de un individuo(sin necesidad de violentar su integridad física con una extracción san-guínea mediante, por ejemplo, una toma de saliva o, incluso sin suparticipación directa, mediante la recogida de indicios abandonadospor el imputado o mediante al análisis de sus familiares) ha modificadotambién el tipo de intervención corporal necesaria (a veces innecesaria)

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7. ANTONIO ALONSO ALONSOpara la obtención de las muestras de referencia de los imputados. Eneste punto es necesario resaltar los últimos cambios legislativos, llevadosa cabo en nuestro país, con respecto a la obligatoriedad a someterse ala toma de muestras, que sin duda abren las puertas a la toma contra el consentimiento de los sospechosos si existen acreditadas razones según resolución motivada por un juez de acuerdo a los principios de propor-cionalidad. La jurisprudencia en este punto nos ofrecerá una respuestaacerca de la posibilidad de interpretar esta reforma legal del artículo 363de la Ley de Enjuiciamiento Criminal como una puerta abierta en determinadas situaciones a la toma de muestras para el análisis de ADN sinnecesidad del consentimiento informado (sin conocimiento del afectado)y la posible colisión de esta práctica con la presunción de inocencia yotros derechos fundamentales.5. EL PODER IDENTIFICATIVO DE LOS ADNS FORENSES Ya hemos hecho referencia a lo largo de este capitulo al distintopoder de discriminación individual que ofrece el estudio de las distin-tas regiones (STRs, STRs del cromosoma Y y ADN mitocondrial) de losgenomas humanos. Son los perfiles genéticos obtenidos mediante el análisis simultaneode un numero significativo (1017) de regiones STRs en los cromosomasautosómicos los que ofrecen un mayor poder de discriminación indivi-dual, alcanzándose índices de identificación en los que la frecuencia deaparición del perfil en la población es tan baja ( por encima de 1 en unbillón) que hace teóricamente imposible (en una población real de 6000millones) la existencia de un segundo individuo no relacionado genéti-camente con el mismo perfil de ADN. De la misma forma los perfiles STRs autosómicos heredados al 50por 100 de la madre y del padre ofrecen un gran poder de individuali-zación para el análisis de familiares ascendientes y descendientes directos, ofreciendo lo que se denomina un «Poder de Exclusión a priori»(Porcentaje de falsos padres que serian efectivamente excluidos por unconjunto de 13-17 regiones STRS) superior al 99,99 por 100. Hay sin embargo un conjunto de muestras de la escena del delito enlas que por diversas razones técnicas solo es posible realizar un análisisde ADN mitocondrial. Este es el caso de una alta proporción de muestrasde pelos que se analizan en los laboratorios forenses. En este caso nosenfrentamos a una clara reducción en el poder de discriminación indivi-dual ya que algunos perfiles genéticos (se denominan haplotipos) tienen PAG 1866

. CONCEPTOS BÁSICOS DE ADN FORENSEuna alta incidencia (alrededor del 2 por 100) en distintas poblacionesEuropeas. Lo mismo ocurre en la actualidad con el estudio de regionesSTR del cromosoma Y, ya que hay un haplotipo que es muy común (3por 100 de la población Europea). En cualquier caso el poder de

discriminación de un análisis genéticode STRs autosómicos puede verse influenciado, también, por diversosmotivos, tales como la disponibilidad de la muestra de referencia ade-cuada para la comparación, la obtención de perfiles genéticos parcialeso mezclas de perfiles, o el grado de parentesco genético entre los indi-viduos que hay que discriminar.6. EL ADN NO CODIFICANTE Y LA INTIMIDAD PERSONAL Desde un punto de vista funcional el ADN se ha clasificado comoADN codificante y no codificante para referirse a los genes (con infor-mación para la síntesis de proteínas) o a las regiones de ADN cuyasecuencia no aporta información directa para la síntesis de proteínas,respectivamente. Ya sabemos desde el año 2001 (año en el que se obtuvoel primer borrador de la secuencia completa del genoma humano) que elnumero total de los genes humanos ronda alrededor de 30.000 genes, loque supone una porción muy pequeña (alrededor del 2 por 100) de todoel genoma humano. Tanto las regiones cortas de ADN repetitivo nuclear(muy abundantes en todo el genoma) como las regiones del ADN mito-condrial que se utilizan en el campo forense se localizan en regiones deADN no codificante y por tanto de su estudio no obtendremos informa-ción alguna acerca de características físicas o fenotípicas del individuo(tales como la predisposición individual a padecer enfermedades de basegenética,...). La única información que nos proporciona el estudio deestas regiones es un código anónimo diferenciador que denominamosperfil genético y que en último término es una colección de fragmentosde ADN ordenados de acuerdo a su tamaño que son característicos decada individuo. De hecho, la información aportada por estas regionescarece de valor hasta que es comparada con otro perfil anónimo deuna muestra de referencia para establecer la identidad o la no identi-dad genética entre las muestras comparadas o su grado de parentescogenético. Podemos decir, por tanto, que el perfil genético que se obtienedel estudio de estas regiones variables de ADN no codificante es comoel código de barras que se utiliza para clasificar los productos en unsupermercado que nada nos dice de las características del producto peronos sirve para identificarlo. PAG 1867