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Universidad Santiago de Cali.

Asignatura: Biología.

Docente: Iván Darío Ocampo Ibáñez.

Practica de laboratorio N° 2.2. Transporte a través de la membrana

Grupo Nº3. Hugo Steban Cárdenas Caicedo. Heidy Vanessa Escobar Sánchez. Henry Andrés Mosquera Montoya. Isabella Pipicano Rodríguez. Daniela Vera Hermann.

Santiago de Cali, 10 de abril del 2020.

Título: Membrana plasmática, una vía transportadora. Pregunta / problema: ¿Es posible identificar los diferentes tipos de transporte y las propiedades osmóticas presentes en la membrana plasmática de la célula animal y vegetal a través del microscopio? Hipótesis: En el transporte a través de la membrana existe un fenómeno conocido como difusión simple, de este se deriva la osmosis y su clasificación, será posible observar microscópicamente la distribución de esta usando determinada muestra y teniendo en cuenta las características que las identifican a cada una o por el contrario cada una de estas no adoptarían las características necesarias para su clasificación, tornando así compleja su identificación.

Lista de materiales: MATERIALES 1. Microscopio 2. Portaobjetos y cubreobjetos (laminas y laminillas). 3. Micropipeta 10-10 µL y 0.5-10 uL. 4. Caja de puntas blancas y amarillas. 5. Marcador Sharpie. 6. Gotero 7. Guantes de látex. 8. Lanceta. 9. Algodón. 10. Toallas secantes. 11. Bandeja de tinción.

REACTIVOS 1. Tinción de Giemsa (diluida con buffer fosfato). 2. Metanol. 3. Soluciones salinas (NaCl) al 0.4%, 0.9% y 2%. 4. Elodea (Estudiante). 5. Muestra de sangre. 6. Alcohol antiséptico.

Procedimientos: 

MEDIO HIPOTÓNICO, ISOTÓNICO E HIPERTONICO 1. Dividir dos laminas portaobjetos en tres secciones con un marcador Sharpie y rotular con 0.4%, 0.9% y 2% respectivamente. 2. Adicionar 20 µL de cada solución en la sección de la lámina respectiva (agregar cada una con puntas diferentes). 3. Limpiar una lámina (sin marcar) con alcohol.

4. Lavar las manos para proceder a limpiar una de las yemas de sus dedos con alcohol antiséptico. 5. Usar una lanceta estéril para punzar la yema del dedo sin causar una herida profunda. 6. Presionar el dedo hasta obtener una gota pequeña de sangre. 7. Depositar la sangre sobre la lámina. 8. Transferir 5 uL de la muestra de sangre, usando la micropipeta de 0.5-10 uL y depositar en cada sección de la lámina portaobjetos al lado de la gota de solución (sin mezclar). 8.1) Depositar la lanceta junto con la punta de micropipeta impregnada de sangre en el tarro guardián que se encuentra en el laboratorio. 9. Mezclar la solución al 2% y la sangre, re suspendiendo suavemente con la micropipeta. 10. Repetir el paso anterior con las soluciones 0.9% y 0.4%. 11. Esperar 5 a 10 minutos. 12. Extraer 5 µL de la mezcla de la sección de la lámina 2% y ponerla hacia un extremo de una lámina nueva marcada con 2% 13. Usar una laminilla o cubreobjetos y hacer un extendido de la gota de sangre. 14. Limpiar la lámina con la que hizo el extendido con una toalla de papel secante para usarla con las otras dos muestras. 15. Repetir los pasos 12, 13 y 14 para las muestras 0.9% y 0.4%. 16. Dejar secar las muestras entre 10-15 minutos. 17. Aplicar 1 a 2 gotas de metanol absoluto para cubrir el extendido. 18. Dejar secar. 19. Aplicar 2-3 gotas de colorante de Giemsa y dejar sobre el extendido aproximadamente 15 minutos. 20. Desechar el exceso de colorante inclinando el portaobjetos sobre una hoja de papel secador. 21. Lavar la muestra agregando gotas de agua con un gotero y desechar el exceso de líquido inclinando el portaobjetos sobre hojas de papel sacador. 22. Dejar secar por 5 minutos y observar en el microscopio (sin usar laminilla). 23. Empezar por la muestra 0.9%, esta solución se conoce como solución salina normal (fisiológica) porque es isotónica con respecto al citoplasma de las células sanguíneas. 24. Mover el anillo macrométrico con el objetivo de menor aumento en posición (2X) para enfocar las células. 25. Cambiar el objetivo por el de 10X y enfocar las células.

26. Hacer un recorrido general por la muestra para identificar zonas con diferentes tipos de células; (observara muchas células teñidas de color rosa pálido (glóbulos rojos o eritrocitos) y otras menos numerosas teñidas intensamente de color purpura (glóbulos blancos o leucocitos)). 27. Cambiar el objetivo por el de 40X. Dibujar al menos tres tipos de célula haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan. 28. Utilizar una guía para los tipos de leucocitos e indicar en su dibujo los nombres de las células que usted encontró. 29. Responder las preguntas correspondientes encontradas en el análisis. 30. Observar la muestra con la solución salina al 2%. Responda las preguntas correspondientes. 31. Enfocar la muestra con los objetivos 4X, 10X y 40X. Dibujar los eritrocitos a 40X haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan. 32. Observar la muestra al 0.4%. Responda las preguntas correspondientes. 33. Enfocar la muestra con los objetivos 4X, 10X y 40X. 34. Dibujar los eritrocitos a 40X haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan. Responda la pregunta correspondiente. 

OSMOSIS Y PLASMOLISIS EN LA PLANTA ACUATICA ELODEA 1. Colocar una hoja de Elodea sobre un portaobjetos y adicionar una gota de agua. 2. Cubrir la muestra con un cubreobjetos, acercarlo en un ángulo de 45 grados y dejarlo caer lentamente intentando que no se formen burbujas. 3. Mover el anillo macrométrico con el objetivo de menor aumento en posición (4X) para enfocar las células. 4. Cambiar el objetivo por el de 10X. Usar el anillo micrométrico y enfocar la muestra. 5. Hacer un recorrido por la hoja hasta lograr enfocar una sola capa de células, generalmente esta se encuentra en el borde o el centro de la hoja. 6. Cambiar el objetivo por el de 40X. Usar el anillo micrométrico para enfocar la muestra. 7. Dibujar lo observado. 8. Responder las preguntas correspondientes. 9. Cambiar el objetivo por el de 4X y retirar la muestra del microscopio.

10. Adicionar una o dos gotas de solución salina al 10% al borde del cubreobjetos. 11. Usar un papel secante para acelerar la llegada de la solución salina a la muestra y tocar el lado opuesto del cubreobjetos. 12. Enfocar la muestra nuevamente. 13. Observar el proceso de plasmólisis con el objetivo de 40X y dibujarlo. 14. Responder las preguntas correspondientes. Tabla de datos: Objetivo

Razón

Milímetros

Micras

4X

1

3,4 mm

3400 µm

10X

2,5

1,36 mm

1360 µm

15X

3,75

0,906mm

906 µm

40X

10

0,34 mm

340 µm

60X

15

0,226 mm

226 µm

100X

25

0,136 mm

136 µm

150X

37.5

0.090 mm

90.6 µm

Análisis:

MUESTRAS DE SANGRE

Se obtuvieron 3 muestras de sangre en las cuales se observaron las células reconociendo su estructura, luego se aplicó a 2 muestras una solución salina que contenían diferentes concentraciones y a la muestra restante se le aplica agua destilada, estas se usaron en el experimento elaborado para identificar las reacciones que se podían presentar en cada una las muestras.

Se realiza una extracción de una hoja de la elodea, para identificar lo que sucede en la célula vegetal en el momento de agregarle diferentes solutos y todo este proceso se verifica por medio del microscopio óptico.

MUESTRA DE SANGRE OBJETIVO 15X (Sin soluto) En esta muestra se puede empezar a visualizar la abundancia de eritrocitos que contiene la sangre.

OBJETIVO 60X (Sin soluto) En este objetivo se observa la estructura que tiene los eritrocitos la cual corresponde a una forma bicóncava.

OBJETIVO 150X (Sin soluto) En este objetivo se visualiza mejor definida la estructura de la célula la cual en su centro se observa una depresión.

OBJETIVO 100X (Sin soluto) Observación de un leucocito (Glóbulo blanco) Se realiza una mejor visualización de la muestra en donde logra identificar un glóbulo blanco (leucocito) y al observarlo detalladamente resalta entre los eritrocitos puesto que su desplazamiento en más lento. OBJETIVO 40X Solución 0.4% (Hipotónica) En esta muestra agregarse una solución hipotónica, se evidencia que comienzan un proceso de hemolisis y este hace que ocurra una coagulación OBJETIVO 100X Solución salina 0.9% (Isotónica) Los eritrocitos en esta solución comienzan a acumularse en el centro sin cambios por osmosis.

OBJETIVO 150X Solución salina 2% (Hipertónica) En esta solución los eritrocitos empiezan a evidenciar el proceso de crenación, por ende, se deshidratan llevando a que la membrana celular se deforme. OBJETIVO 40X ELODEA Solución salina 0.4% (Hipotónica) La muestra de la elodea en esta solución hipotónica ocurre que en la vacuola se empieza a llenar de agua y en los cloroplastos ocurre un proceso llamado ciclosis. OBJETIVO 40X ELODEA Solución salina 2% (Hipertónica) Las células empiezan a evidenciar el proceso de plasmólisis en el cual la vacuola expulsa su agua hacia el exterior de la célula haciendo así que los cloroplastos se dirijan hacia el centro de esta. OBJETIVO 40X ELODEA Solución salina 0.9% (Isotónica) No se observa ningún cambio en las células y no se evidencia el proceso de osmosis ya que la salinidad esta equilibrada.

Con la muestra 0,9% y el objetivo 40X (es decir, solución salina normal) no se observaron cambios en la célula, pues esta corresponde a una solución isotónica, la cual hace que la célula permanezca del mismo tamaño, ya que el porcentaje de la solución y el porcentaje del soluto fueron los mismos dentro y fuera de la célula, quiere decir que se mantuvo en equilibrio. También se identificaron algunos tipos de células como los eritrocitos, los monocitos y basófilos. La tinción de los eritrocitos en el centro es menor, ya que su forma consta de un hundimiento en su centro, por lo tanto, tiene una forma bicóncava y ayuda para que los glóbulos rojos sean capaces de deformarse al momento de entrar a los vasos; sabemos que existen vasos extremadamente pequeños, en los cuales la deformación de los glóbulos rojos es necesaria para que estos puedan entrar en ellos.  Por otro lado, la solución salina 2% es hipertónica, pues la solución fuera de la célula tiene mayor concentración de soluto que la solución dentro de la célula, el agua fluye desde el interior de la célula a la solución exterior para diluir las áreas altas de concentración de soluto. Por lo tanto, la célula pierde agua (el agua sale de la célula) y se encoge (deshidrata). En el caso de la solución salina 0,4% es hipotónica, ya que la solución dentro de la célula tiene mayor concentración de soluto que la solución fuera de la célula, esto hace que los glóbulos rojos y demás células se hinchen, haciendo así que se vean más grandes, es decir aumente (turgencia) su volumen ya que el agua va hacia dentro de la célula Por otro lado, el objetivo del experimento con la planta acuática Elodea, era identificar las células vegetales de la misma, y para ello se observó una hoja de esta, primero visualizándolo con un objetivo de 4X hasta llegar a un objetivo de 40X.  Estas células están expuestas a un medio acuoso, lo que quiere decir que como dicho anteriormente; un medio hipotónico; en el cual el agua entra a las células, haciéndolas más grandes, sin embargo, las células vegetales contienen una pared celular, esta no permite que las células estallen y después se mueran, a este proceso se le llama turgencia. 

 MEDIO HIPOTÓNICO, ISOTÓNICO E HIPERTONICO 1. Ahora cambie el objetivo por el de 40x. Dibuje al menos tres tipos de célula haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 2).

2. Usando una guía para los tipos de leucocitos, indique en su dibujo los nombres de las células que usted encontró (Figura 2).

3. ¿Qué estructura de la célula (que está teñida en los leucocitos), está ausente en los eritrocitos? El núcleo, ya que en los eritrocitos maduros de la mayoría de los mamíferos no lo poseen al llegar a su madurez y en la estructura interna del leucocito si posee un núcleo.

Eosinófilos.

Neutrófilos.

Basófilos.

Figura 2. Observación a 40x. Tipos celulares observados

4. La tinción de los eritrocitos es mucho más débil en el centro, al punto que parecen tener un hueco. Explique ¿Por qué los eritrocitos se ven así? Lo presentan ya que este perdió sus organelos intracelulares y los eritrocitos humanos no poseen núcleo. 5. Esta forma particular de los eritrocitos los hace mejor en su trabajo, que es llevar el oxígeno a los tejidos corporales. Explique ¿Por qué? Este diseño es el óptimo para el intercambio de oxígeno con el medio que lo rodea, pues les otorga flexibilidad para poder atravesar los capilares donde liberan la carga de oxígeno. 6. Ahora observe la muestra con solución salina al 2%, los solutos están más concentrados que en el citoplasma de las células. ¿Por lo tanto la solución es: hipertónica, hipotónica o isotónica con respecto a las células? Hipertónica ya que la solución tiene una mayor concentración de soluto que el citoplasma de la célula haciendo así que se evidencie el proceso de plasmólisis.

7. ¿En esta solución salina al 2%, usted espera que el agua salga de la célula o entre a la célula? Sale de la célula: por lo que al ser una solución hipertónica ocurre el proceso de crenación y/o plasmólisis en el cual al ser una solución con alta concentración de soluto tiende a liberal el agua de la célula 8. Enfoque la muestra con los objetivos 4x, 10x y 40x. Dibuje los eritrocitos a 40x haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 3).

Figura 3. Observación de los eritrocitos a 40x en solución salina al 2%.

9. Ahora observe la muestra al 0.4%. En esta solución los solutos están menos concentrados que en el citoplasma de las células. ¿Por lo tanto la solución es hipertónica, hipotónica o isotónica con respecto a las células? Hipotónica ya que la solución tiene una menor concentración de soluto que el citoplasma de la célula haciendo así que suceda el fenómeno de turgencia. 10. En la muestra con la solución al 0.4%, ¿Usted espera que el agua salga o entre a la célula? Entra a la célula ya que ocurre el proceso de hemolisis y/o turgencia. 11. Enfoque la muestra con los objetivos 4x, 10x y 40x. Dibuje los eritrocitos a 40x haciendo una representación realista de la proporción del campo visual que las células ocupan (Figura 4).

Figura 4. Observación de los eritrocitos a 40x en solución salina al 0.4%

12. ¿Qué espera usted que le pase al volumen de las células en esta solución? El volumen de la célula aumenta y su forma bicóncava desaparece ya que al entrar el agua a la célula empieza a ocupar un espacio extra al que tiene comúnmente.

 OSMOSIS Y PLASMOLISIS EN LA PLANTA ACUATICA ELODEA 6. Ahora cambie el objetivo por el de 40x. Usando el anillo micrométrico enfoque la muestra. Dibuje lo observado (Figura 5).

Figura 5. Células de Elodea a 40x en agua.

7. Las células de esta hoja están expuestas a un medio acuoso y por lo tanto hipotónico. ¿En estas condiciones el agua está tendiendo a salir o a entrar a la célula?

Entra a la célula, por lo que al estar en una solución hipotónica se observa que comienza a ingresar el agua a la vacuola y esto hace que aumente el volumen de la célula. 8. ¿Qué estructura evita que la célula se explote? La célula está protegida por la pared celular y es la que evita que la célula explote. 9. ¿Cómo se llama la presión que la pared celular ejerce en contra de la presión del agua moviéndose por ósmosis? A este se le denomina turgencia. 10. Ahora enfoque la muestra nuevamente. Con el objetivo de 40x observe el proceso de plasmólisis. Dibújelo (Figura 5b).

Figura 5b. Células de Elodea a 40x en solución salina 10%

11. ¿Qué estructura de la célula que era invisible antes se hace evidente luego de unos minutos en solución salina 10%? La membrana celular, ya que al ser una solución hipertónica se deshidrata la célula y esta puede ser visualizada. 12. La solución hipertónica (solución salina al 10%) está forzando al agua a moverse. ¿En qué dirección se está moviendo el agua y por qué? Se mueve a favor del gradiente de concentración ya que el agua que se encuentra dentro de la célula que tiene mayor concentración se dirige hacia donde esta menos concentrada en el exterior de esta.

Conclusión/ resumen: En esta práctica de laboratorio se logró reconocer en tiempo real cierta parte del transporte a través de la membrana; identificando así la reacción de determinadas células expuestas a diferentes tipos de soluciones,

analizando el cambio de cada una de ellas y logrando identificar las diferencias que se presentan en cada una de las muestras obtenidas, adquiriendo bases claves de conocimiento para aplicarlos en la vida cotidiana de la carrera profesional, ya que se reconocieron los tipos de fenómenos derivados del transporte pasivo en este caso enfocado en la osmosis. No obstante, cabe resaltar que, aunque no se tuvo la oportunidad de llevar a cabo esta práctica de manera presencial es importante decir que fue satisfactoria para la aclaración de gran mayoría de los conceptos vistos en clase derivados del transporte a través de la membrana.