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• Monse Benavente

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INTRODUCCION El suelo es el medio donde se desarrolla la vida de innumerables formas de organismos que tienen una gran variedad de actividades, y que contribuyen a incrementar la capacidad productiva del mismo. En un solo gramo de tierra podemos encontrar millones de microorganismos benéficos; bacterias, actinomicetos, hongos, algas y protozoarios (Alexander, 1980). Una forma de conocer la biología de los hongos y levaduras es por medio de los cultivos puros de cepas in vitro con éstos se pueden conocer su capacidad fisiológica o bioquímica de cada cepa en la forma de degradar los compuestos carbonatados y nitrogenados o su resistencia a crecer en condiciones extremas que aseguren el éxito en el establecimiento de las plantaciones forestales y en la recolecta de hongos comestibles. MARCO TEORICO Hongos. Un hongo es en general, un organismo eucarionte heterótrofo unicelular, pluricelular o multicelular cuyas células se distinguen por tener una pared celular con el polisacárido quitina. Los hongos constituyen un grupo muy amplio de organismos y suelen clasificarse en 2 reinos. Los llamados hongos “verdaderos” son aquellos que constituyen el reino Fungi y que tienen las características antes descritas, otros hongos se clasifican entre los protoctistas y tienen características especiales. Entre los hongos “verdaderos” podemos distinguir tres grandes grupos según su morfología; a saber: -

Hongos filamentosos Levaduras Setas

Aunque esta clasificación no tiene valor taxonómico resulta práctica para agrupar distintos tipos de hongos por sus características afines. Los hongos son organismos eucariotes cuyas células contienen mitocondrias, un núcleo bien definido y otros organelos rodeados de membrana, carecen de clorofila y cloroplastos, por lo que no fotosintetizan. Las células de los hongos están rodeadas de paredes constituidas por quitina, un polímero que consiste en subunidades de un azúcar nitrogenado y es el componente más resistente que la celulosa a la degradación por microorganismos (Alexopoulis, 1995). Dado que son heterótrofos, son incapaces de sintetizar su propia materia orgánica, pero no ingieren alimento. Los hongos secretan enzimas digestivas y después absorben el alimento predigerido a través de su pared celular y membrana plasmática.

Obtienen nutrimentos de otros organismos vivos a los que parasitan o de materia orgánica muerta a la que descomponen (Solomon, 2000). La mayoría de los hongos están constituidos por finas fibras, que contienen protoplasma, llamadas hifas. Éstas a menudo están divididas por tabiques llamados septos. En cada hifa hay uno o dos núcleos y el protoplasma se mueve a través de un diminuto poro que ostenta el centro de cada septo (Fig. 1). También existen hifas llamadas cenocíticas porque no se dividen en células individuales, sino que tienen el aspecto de una célula gigante multinucleada alargada (Guzmán, 1993). Las hifas crecen por alargamiento de las puntas y también por ramificación. La proliferación de hifas, resultante de este crecimiento, se llama micelio (Courtecuisse y Duhem, 2000).

Fig. 1 Estructura de un hongo, mostrando hifas, micelio y cuerpo fructífero Los hongos se desarrollan mejor en hábitats oscuros y húmedos, requieren humedad y pueden obtener agua de una atmosfera húmeda así como del medio en que vive. Cuando el ambiente se toma demasiado seco, los hongos sobreviven entrando en una fase latente o produciendo esporas resistentes a la desecación. El pH óptimo para ellos es de 5.6, sin embargo algunos hongos toleran ambientes con pH de 2 a 9 y pueden desarrollarse en soluciones salinas concentradas, o en azucaradas como jalea, que dificultan o impiden la proliferación de bacterias. Los hongos también prosperan en un amplio intervalo de temperatura (Guzmán, 1993) Los hongos se reproducen por medio de esporas microscópicas, que carecen de flagelos y son estructuras reproductivas inmóviles, dispersadas, lo que permite que las esporas sean llevadas por el viento a nuevas zonas. En algunos hongos las hifas aéreas forman estructuras reproductivas grandes y complejas a las cuales se producen esporas. Estas estructuras se denominan cuerpos fructíferos o esporocarpos (Fig.1) (Solomon, 2000).

Los hongos pueden producir esporas de manera sexual o asexual. Las células fungales por lo general poseen núcleo haploide. En la reproducción sexual, las hifas de dos tipos de apareamiento genéticamente distinto de hongos (ascomicetos y basidiomicetos), las hifas se fusionan pero los dos núcleos distintos no se fusionan de inmediato, si no que permanecen separados dentro del citoplasma fungal. Cuando la espora fungal entra en contacto con una fuente de alimento adecuada, germina y comienza a desarrollarse. Una hifa filiforme emerge de la diminuta espora y crece, ramificándose con frecuencia (Guzmán, 1993). 

Clasificación de los hongos

La clasificación de los hongos se basa sobre todo en las características de su heterotrofismo, formación de esporas, presencia de quitina en sus paredes y cuerpos fructíferos. Después de las últimas modificaciones hechas en el Congreso Internacional de Micología de 1994, donde se han introducido muchos cambios, el reino queda dividió en 4 filos: Chytridiomycota (quitridios), Zygomicota (zigomicetos), Ascomycota (ascomicetos) y Basidimycota (basidiomicetos) (Alexopoulus, 1995). Factores físicos La humedad ya que esta debe encontrarse en alto porcentaje de lo contrario en hongo no podrá desarrollarse; de igual manera necesita de agua especialmente en forma libre, ya que de esto depende la germinación de esporas. La temperatura óptima para el crecimiento y desarrollo de los hongos se encuentra entre los 25 y 30ºC, y puede llegar a los 40 y 45 ºC, sin embargo hay excepciones con especies que crecen a 0 ºC y 55 ºC sin ningún problema. Factores químicos PH los hongos tienen la capacidad de tolerar intervalos de PH entre (2,5 - 7,5) esto significa que soportan más el medio acido que el alcalino. Es importante decir que los hongos tienen la propiedad de modificar el PH por medio de los ácidos orgánicos del alimento y los excretados por bacterias acidificantes los cuales utilizan como energía. En cuanto a la riqueza del sustrato los hongos no son exigentes en cuanto al punto nutricional, ya que ellos se nutren de los macro elementos y micro elementos existentes el sustrato, sin embargo el hierro y el zinc son importantes para el desarrollo de los hongos. Factores biológicos

La presencia de insectos ayuda a la multiplicación de los hongos ya que metabolismo del insecto ayuda al aumento de la humedad.

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Levaduras. La levadura es un organismo unicelular perteneciente al reino Fungi. Al ser un microorganismo necesita energía para llevar adelante los procesos celulares fundamentales como crecer, reproducirse, mantener sus estructuras y reaccionar ante estímulos del ambiente. Esta obtención de energía se da a través de una serie de reacciones fisicoquímicas llamadas metabolismo que permite la obtención o la transformación de algo en energía. Una reacción química es el proceso químico por el cual dos sustancias o más, denominadas reactivos se convierten en otras sustancias. Estas reacciones químicas pueden ser aeróbicas o anaeróbicas. Que sean aeróbicas significa que la levadura utiliza oxígeno para obtener energía. Podemos decir que al utilizar oxígeno la reacción será más eficiente. Cuando la reacción es de manera anaeróbica no hay oxígeno presente para ayudar con el proceso y se la llama fermentación. Este tipo de reacción química es utilizada para la producción de alimentos (como pan, vino, cerveza, etc.). Al no haber oxígeno disponible, el reactivo fundamental que se utiliza es el azúcar. El proceso empieza cuando una molécula de azúcar ingresa por el mecanismo de difusión facilitada a la membrana plasmática de una levadura. La difusión facilitada es un tipo de transporte pasivo (donde las sustancias se desplazan del lado que hay más concentración al que hay menos espontáneamente hasta homogeneizarse y alcanzar el equilibrio dinámico, van a favor de gradiente y sin un gasto de energía). La difusión facilitada, específicamente, se da a partir de moléculas hidrofilias a través de proteínas integrales. Después, la molécula de azúcar aporta energía y finalmente se libera etanol y dióxido de carbono. La temperatura afecta también a las levaduras reduciendo su capacidad de realizar estas reacciones químicas. Las altas temperaturas dañan los tejidos, por lo tanto existe un rango temperaturas óptimas donde la levadura realiza el metabolismo de forma óptima. La identificación de las levaduras se puede llevar a cabo atendiendo a cuatro criterios diferentes: morfológicos, bioquímicos, inmunológicos o genéticos.

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Aislamiento de hongos filamentosos y levaduras:

Medios de cultivo: Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento de los hongos. En general su pH oscila alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez que se ha aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios deben utilizarse medios de cultivo con un pH menor para favorecer el crecimiento de los hongos por sobre el de las bacterias, un pH de 3,5 resulta en general adecuado. Algunos medios propicios para el desarrollo de hongos son: Cuadro 1: Composición de algunos medios de cultivo usados con frecuencia para cultivar hongos

Cuando lo que se busca es aislar hongos filamentosos, el pH de los medios comerciales (≥5,4) se puede reducir adicionando ácido tartárico al 10% (1 mL por cada 100 mL de medio de cultivo ya estéril y a 50 ºC). Los medios no deben calentarse luego de esta acidificación pues provocaría la hidrólisis del agar y por lo tanto la pérdida de su capacidad para gelificar. Muchos medios además están diseñados para inhibir el crecimiento de bacterias por lo que están adicionados de substancias como el rosa de Bengala (2,6 Dicloro

4-Nitroanilina) o antibióticos como Penicilina (50 UI/mL) y Estreptomicina (100 UI/mL). Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH óptimo mediante adición de ácido clorhídrico o ácido fosfórico, no con ácidos orgánicos pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de igual forma a como se explicó para los hongos filamentosos. Para favorecer el aislamiento de levaduras sobre el de las bacterias se recurre a las mismas substancias que se usan con el mismo fin, en el cultivo de hongos filamentosos, aunque no se utiliza la estreptomicina. Sea cual sea el microorganismo que se desea cultivar se suelen hacer diluciones decimales en agua (a veces en otros agentes como solución salina) de la muestra de interés para luego tomar un mL. de la dilución correspondiente y mezclarlo con el medio de cultivo elegido. Para luego incubarlo a 28 ºC durante 5 días. Aunque tales condiciones de incubación son las más comúnmente sugeridas, de acuerdo a las condiciones del medio, a las características ambientales del lugar de origen del hongo y la técnica utilizada, se pueden seguir otras recomendaciones, como el colocar las placas dentro de una bolsa de plástico acompañada de un recipiente con agua para evitar la desecación, durante 3 a 7 días a 28 °C en las regiones subtropicales; a 30 °C en las tropicales, y a 22 °C en las templadas. EN TUBO O EN PLACA Las placas de medio de cultivo con hongos, a diferencia de aquellas donde se siembran bacterias, no se invierten (salvo en contadas excepciones). Tras el tiempo de incubación las placas se observan y se analizan los hongos y levaduras que han crecido en las mismas para luego tomar muestras aisladas de una sola colonia que pueden resembrarse en nuevas placas con medio de cultivo. Se deben de descartar para su estudio aquellas placas que tengan más de 200 colonias, puesto que de estas placas el aislamiento se hace muy difícil y poco certero. Tras incubar las placas con las diluciones de hongos y habiendo contado el número de colonias en estas se puede proceder a establecer cultivos puros como se señaló ya resembrándolas en nuevas placas con medios de cultivo. Un cultivo puro de levaduras se obtiene dispersando el material tomado de la colonia a estudiar, mediante estrías sucesivas sobre la placa de medio. En cambio, un cultivo puro de hongos filamentosos se obtiene por repique de un pequeño manojo de hifas o grumo de esporas en varios puntos de una placa de medio selectivo. En algunos casos esta técnica no es satisfactoria y entonces conviene hacer una

dispersión de esporas sobre la superficie de agar estéril. Se toman las esporas del hongo en el cultivo primario y luego se ponen sobre la placa de agar estéril. Por lo general es necesario resembrar sucesivamente los hongos de un cultivo puro, para garantizar que efectivamente solo haya un tipo de hongos en este. TÉCNICAS DE ENRIQUECIMIENTO: En ocasiones es preciso potenciar, o amplificar, la presencia de hongos en una muestra, previo a su aislamiento. En esos casos resultan adecuadas las técnicas de enriquecimiento. El primer paso consiste en incorporar la muestra en un medio líquido que contenga extracto de carne o extracto de levadura y su pH sea 3,7. A continuación se incuba de 24 a 72 horas a temperaturas entre 25 º y 30 ºC, y del crecimiento obtenido se hacen siembras en medios sólidos. Este método sin embargo no permite a diferencia de la siembra directa en medios sólidos, conocer la proporción real en que se encuentra lo buscado en la muestra. Si se desea aislar levaduras, a partir de muestras muy contaminadas con hongos filamentosos, el desarrollo de estos últimos se puede restringir por varios métodos como la exclusión de aire que se logra añadiendo una capa de parafina líquida estéril sobre la superficie del medio de cultivo, una vez realizada la adición de la muestra. Esta capa debe tener un grosor de 1 cm. Se incuba como se explicó previamente, hasta obtener un crecimiento adecuado. También puede añadirse la muestra al medio en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. (ej. 10 g de muestra en 90 mL. de medio). Tras lo cual, los matraces se agitan durante un tiempo adecuado (24-72 horas) a las temperaturas ya señaladas. Los hongos filamentosos, en estas condiciones, no generan esporar, sus micelios se agregan en forma de esferas y se ven superados en multiplicación por las levaduras presentes, que se distribuyen de forma homogénea en el medio de cultivo. En general se prefieren los medios de cultivos sólidos ya que posibilitan la observación de las colonias (caracteres macroscópicos). Sin embargo, para el estudio de hongos acuáticos el aislamiento debe iniciarse en medios líquidos para lograr una aproximación a su hábitat. https://es.scribd.com/doc/77101910/Aislamiento-de-hongos https://www.redalyc.org/pdf/629/62926234007.pdf https://www.uaeh.edu.mx/nuestro_alumnado/icap/licenciatura/documentos/Selecci on%20e%20identificacion%20de%20especies.pdf