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• Sergio Barragan

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GLICEMIA ENZIMÁTICA AA Para la determinación de glucosa en suero, plasma, orina o líquido cefalorraquídeo. Fundamento Del Metodo Reactivo A: solución conteniendo glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa (POD), 4-aminofenazona (4-AF), buffer fosfatos pH 7,0 y 4-hidroxibenzoato. Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, se recomienda el uso de Anticoagulante G (EDTA / fluoruro) para su obtención. Sustancias interferentes conocidas: no se observan ainterferencias por: bilirrubina hasta 10 mg/dl, triglicéridos hasta 500 mg/dl y hemoglobina hasta 350 mg/dl. El ácido ascórbico interfiere en la determinación en orina en cualquier concentración. La sangre debe centrifugarse dentro de las 2 horas de la extracción. El sobrenadante límpido se transfiere a otro tubo para su conservación. De esta forma la glucosa es estable 4 horas a temperatura ambiente o 24 horas refrigerada. El LCR puede contaminarse con bacterias y otras células por lo que la determinación debe realizarse de inmediato. - Long. de onda: 505 nm en espectrofotómetro. - Tº Rx: 37 ºC. El color de reacción final es estable 30 minutos.

Suero o plasma Adultos: 74 - 106 mg/dl Niños: 60 - 100 mg/dl Neonatos: 1 día: 40 - 60 mayor a 1 día: 50 - 80 mg/dl Orina aislada fresca: 1 - 15 mg/dl de 24 horas: < 0,5 g/24 hs LCR Niños: 60 - 80 mg/dl Adultos: 40 - 70 mg/dl COLESTAT ENZIMÁTICA AA Método enzimático para la determinación de colesterol en suero o plasma. Fundamento Del Método Reactivo A: solución conteniendo colesterol esterasa (CHE), colesterol oxidasa (CHOD), peroxidasa (POD),

4 aminofenazona (4-AF) y buffer Good, conteniendo fenol y colato de sodio. Sustancias interferentes: - Excepto la heparina, los anticoagulantes comunes interfieren en la determinación. - Los sueros con hemólisis visible o intensa producen valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usados. El colesterol en suero es estable por lo menos 1 semana en refrigerador y 2 meses en congelador, sin agregado de conservantes. - Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro. - Tº Rx: 37ºC El color de reacción final es estable 30 minutos. Valores de Referencia: Deseable: < 2,00 g/l Moderadamente alto: 2,00 - 2,39 g/l Elevado: ≥ 2,40 g/l TG COLOR GPO/PAP AA Método enzimático para la determinación de triglicéridos en suero o plasma. Fundamento Del Metodo Reactivo A: solución conteniendo buffer Good (pH 6,8), clorofenol, lipoprotein lipasa (LPL), glicerol kinasa (GK), glicerol fosfato oxidasa (GPO), peroxidasa (POD), adenosina trifosfato (ATP) y 4-aminofenazona (4-AF). Recolección: previo ayuno de 12 a 14 hrs, obtener suero o plasma. Separar de los glóbulos rojos dentro de las 2 horas de extracción. - Longitud de onda: 505 nm - Tº de Rx: 37ºC El color de reacción final es estable 60 minutos. Valores de Referencia: Deseable: < 1,50 g/l Moderadamente elevado a elevado: 1,50 - 1,99 g/l Elevado: 2,00 - 4,99 g/l Muy elevado: ≥ 5,00 g/l

HDL COLESTEROL FT Reactivo precipitante (ácido fosfotúngstico) para la separación de las Lipoproteínas de Alta Densidad (HDL) en suero o plasma. Fundamento Del Metodo: Las HDL se separan precipitando selectivamente las LDL y VLDL mediante el agregado de ácido fosfotúngstico en presencia de iones magnesio. Las HDL quedan en el sobrenadante separado por centrifugación, donde se realiza la determinación del colesterol ligado a las mismas, empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetría según Trinder (Fenol/4AF).

Hemólisis visible (concentración de hemoglobina > 0,08 g/dl) interfiere. Longitud de onda: 340 nm Tº de Rx: 25, 30 ó 37ºC. CALCULOS: CK U/I = ∆A/min x factor

Reactivo A (Reactivo Precipitante): solución de ácido fosfotúngstico 0,44 mmol/l y cloruro de magnesio 20 mmol/l. Colestat enzimático: No provisto. Aditivos: en caso de utilizar plasma, recogerlo únicamente con heparina. Sustancias interferentes conocidas: anticoagulantes distintos de la heparina y bilirrubinemia mayor de 50 mg/l son causas de interferencia. Longitud de onda: 505 nm en espectrofotómetro. Tº de Rx: 37ºC El color de reacción es estable 2 horas. Valores de Referencia: 0,40 - 0,60 g/l CK-NAC UNITEST Y AA Método UV optimizado (IFCC) para la determinación de Creatina Kinasa (CK) en suero o plasma. En el caso del infarto agudo de miocardio (IAM), la actividad sérica de CK comienza a aumentar entre 2 y 6 horas después de producido el episodio y alcanza un máximo después de 18 a 24 horas. Fundamento Del Metodo: Creciente Reactivo B: solución de buffer imidazol pH 6,7. Reactivo A: frasco con sustrato desecado. Aditivos: en caso de emplear plasma, debe usarse heparina (concentración < 15 UI/ml) o EDTA como anticoagulante.

GPT(ALT) AA Método UV optimizado (IFCC) para la determinación de alanina aminotransferasa (GPT/ALT) en suero o plasma. Los mayores aumentos de actividad ALT en suero, se producen como consecuencia de alteraciones hepáticas. Sus valores se comparan con los de otras enzimas de similar origen tisular, permitiendo así completar el perfil enzimático de órganos como el hígado. Fundamento Del Metodo: Decreciente Reactivo A: viales conteniendo 2-oxoglutarato, nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH) y lactato deshidrogenasa (LDH). Reactivo B: solución de buffer TRIS pH 7,5 (a 30ºC) conteniendo L-alanina. Aditivos: en caso de que la muestra a utilizar sea plasma, se debe usar heparina como anticoagulante. Sustancias interferentes conocidas: - Las muestras con hemólisis visible o intensa producen valores falsamente aumentados por lo que no deben ser usados.

- Las muestras de pacientes hemodializados o con hipovitaminosis u otras patologías asociadas con deficiencia de piridoxal fosfato producen valores falsamente disminuidos.

Valores Referencia:

Longitud de onda: 340 nm Tº de Rx: 25, 30 ó 37ºC. CALCULO DE LOS RESULTADOS: GPT (U/l) = ∆A/min x factor

Se consideran valores normales de transaminasas (GOT y GPT) hasta 12 U/l. Si bien se han hallado individuos normales con valores hasta 18 U/l, los niveles de transaminasas que se encuentren entre 12 y 18 U/l deben considerarse sospechosos. TRANSAMINASAS 200 Para la determinación de Transaminasa Glutámico Oxalacética (GOT(AST) y Transaminasa Glutámico Pirúvica (GPT/ALT) Las transaminasas GOT y GPT son enzimas ampliamente difundidas en el organismo con elevada concentración en corazón, hígado, músculo esquelético, riñón y eritrocitos. Fundamento Del Metodo: El piruvato formado (el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato), reacciona con la 2,4-dinitrofenilhidracina produciéndose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 505 nm. Reactivo A: solución con 100 mM de l-aspartato y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mM, pH 7,4. - Transaminasas 200 GPT provee: Reactivo A: solución con 200 mM de dl-alanina y 2 mM de α-cetoglutarato en buffer fosfatos 100 mM, pH 7,4. Además, ambos equipos proveen: Reactivo B: solución conteniendo 1 mmol de 2,4 dinitrofenilhidracina (2,4-DNFH) en ácido clorhídrico 1 mol/l. Reactivo C: solución de hidróxido de sodio 4 mol/l. Long. onda: 505 nm Tº de Rx: 37ºC. El color de la reacción es estable durante 30 minutos.

BILIRRUBINA Para la determinación de bilirrubina directa y total FUNDAMENTOS DEL METODO: La bilirrubina reacciona específicamente con el ácido sulfanílico diazotado produciendo un pigmento color rojo-violáceo (azobilirrubina) que se mide fotocolorimétricamente a 530 nm. Si bien la bilirrubina conjugada (directa) reacciona directamente con el diazorreactivo, la bilirrubina no conjugada (indirecta) requiere la presencia de un desarrollador acuoso (Reactivo A) que posibilite su reacción. De forma tal que, para que reaccione la bilirrubina total (conjugada y no conjugada) presente en la muestra, debe agregarse benzoato de cafeína al medio de reacción. Reactivo A: solución acuosa de benzoato de cafeína0,13mol/l, tamponada y estabilizada. Reactivo B: solución de ácido sulfanílico 29 mmol/l y ácido clorhídrico 0,17 mol/l. Reactivo C: solución de nitrito de sodio 0,07 mol/l. Suero, plasma amniótico

o

líquido

Recolección: obtener suero o plasma de la manera usual. Proteger de la luz natural o artificial, envolviendo el tubo con papel negro. Aditivos: en caso de que la muestra a emplear sea plasma, debe usarse heparina para su obtención. Sustancias interferentes conocidas: hemólisis moderada o intensa inhibe la reacción directa, obteniéndose valores de bilirrubina total falsamente aumentados.

La acción de la luz es capaz de destruir en una hora hasta un 50% de la bilirrubina presente en la muestra. Longitud de onda: 530 nm Tº Rx: temperatura ambiente Calculo de Resultados: Bilirrubina total (mg/l) = (T - B) x f Bilirrubina directa (mg/l) = (D - B) x f Bilirrubina libre (indirecta) = BRB total - BRB directa VALORES DE REFERENCIA Bilirrubina en suero o plasma Adultos: Directa: hasta 2 mg/L Total: hasta 10 mg/L

Los valores comienzan luego a disminuir para alcanzar el nivel promedio del adulto al mes del nacimiento. En los prematuros, los niveles de bilirrubina tardan más en alcanzar la normalidad, dependiendo del grado de inmadurez hepática. ALBÚMINA AA Método colorimétrico para la determinación de albúmina en suero La hipoalbuminemia ocurre en condiciones patológicas tales como pérdida excesiva de proteínas en el síndrome nefrótico, desnutrición, infecciones prolongadas, quemaduras severas. Otras causas son disminución en la síntesis por una dieta deficiente, enfermedad hepática o malabsorción. FUNDAMENTOS DEL METODO: La albúmina reacciona específicamente (sin separación previa) con la forma aniónica de la 3,3',5,5'-tetrabromo cresolsulfonftaleína (BCF). El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del Blanco de reactivo, es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra. Reactivo A: solución de BCF 0,3 mmol/l, buffer acetato 0,1 mol/l y polioxietilén lauril éter 0,9 g/l. Longitud de onda: 625 nm Tº Rx: 15 - 28ºC El color es estable 20 minutos. Calculos:

Valores Referencia: Albúmina: 3,5 a 4,8 g/dl Relación A/G: 1,2 a 2,2 PROTEINAS TOTALES AA Método colorimétrico para la determinación de proteínas totales en suero. La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos estados de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma múltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentración de diversos orígenes, (ej.: deshidratación) se observan hiperproteinemias. FUNDAMENTOS DEL METODO: Los enlaces peptídicos de las proteínas reaccionan con el ión cúprico en medio alcalino, para dar un complejo color violeta con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra. Reactivo A: complejo EDTA/Cu 13 mmol/l en hidróxido de sodio 875 mmol/l y alquil aril poliéter (AAP). Longitud de onda: 540 nm Tº Rx: 37ºC El color de la reacción es estable durante 12 horas. Calculo De Los Resultados

Valores de Referencia: Proteínas totales: 6,1 a 7,9 g/dl Relación A/G: 1,2 a 2,2 UREA/BUN – COLOR UREASA/SALICILATO Se encuentran concentraciones elevadas de urea en plasma como consecuencia de una dieta hiperproteica, aumento del catabolismo proteico, después de una hemorragia gastrointestinal, ligera deshidratación, shock e insuficiencia cardíaca o tratamiento con glucocorticoides (uremia prerrenal). La uremia postrenal está causada por condiciones que obstruyen el flujo urinario: nefrolitiasis, tumor o hipertrofia prostática. La utilidad de la urea como indicador de la función renal está limitada por la variabilidad de su concentración plasmática como consecuencia de factores no renales.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO:

Reactivo B: solución conteniendo buffer Good pH 7,8, 4aminofenazona (4-AF), uricasa (UOD), peroxidasa (POD), y ferrocianuro de potasio.

Reactivo A: Salicilato sódico 62 mmol/L, nitroprusiato sódico 3,4 mmol/L, tampón fosfatos 20 mmol/L, pH 6,9. Reactivo A2: Ureasa > 500 U/mL. Reactivo B: Hipoclorito sódico 7 mmol/L, hidróxido sódico 150 mmol/L.

Las sustancias fuertemente reductoras, tales como el ácido ascórbico (vitamina C), la Buscapina (butil bromuro de hioscina), etc. en dosis elevadas interfieren. Por tal razón debe suspenderse la medicación, siempre que sea posible, 24 horas antes de la toma de muestra.

Muestras: Suero, plasma u orina recogidos mediante procedimientos estándar. Diluir la orina 1/50 con agua destilada antes del ensayo.

Long de onda: 505 nm Tº Rx: 37ºC o 18-25ºC

VALORES DE REFERENCIA Suero y plasma: 15-39 mg/dL urea = 7-18 mg/dL BUN = 2,5-6,5 mmol/L urea. Orina: 26-43 g/24-h urea = 12-20 g/24 h BUN = 428-714 mmol/24-h urea CALCIUM liquicolor Prueba fotométrica colorimétrica para calcio Método CPC FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Los iones de calcio reaccionan con o-cresolftaleína-complexona en un medio alcalino, para formar un complejo de color púrpura. BUF: Buffer Lisina, Azida de sodio RGT: 8-hidroxiquinolina, o-cresolftaleína-complexona, Acido clorhídrico Muestra: Suero o plasma heparinizado.

Valores de Referencia: Suero/plasma: 8,1 – 10,4 mg/dl ó 2,02 – 2,60 mmol/l

URICOSTAT ENZIMÁTICO AA Para la determinación de ácido úrico en suero, plasma u orina FUNDAMENTO DEL MÉTODO: Reactivo A: solución conteniendo buffer Good pH 7,8 y la sal sódica de 3,5 diclorohidroxibenceno sulfónico (DHS).

El color de reacción final es estable 30 minutos. VALORES DE REFERENCIA Hom: 2,5-6,0 mg/dl. Muj: 2,0-5,0 mg/dl. FOSFATEMIA AA Método UV para la determinación de fósforo inorgánico (Pi) en suero, plasma u orina Niveles elevados de fósforo sérico son encontrados en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo conduce a la situación contraria. También puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y defectos en la reabsorción de fósforo a nivel renal. FUNDAMENTOS DEL METODO El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el molibdato para dar un complejo fosfomolíbdico que se mide espectrofotométricamente a 340 nm. Reactivo A: solución de molibdato de amonio 2 mmol/l en ácido sulfúrico 1%. Muestra: Obtener suero de la manera usual o plasma con EDTA o citrato. También puede realizarse la determinación en orina. En este caso, recoger orina de 24 horas en un recipiente que contenga 2 ml de ácido clorhídrico concentrado. Interferencias: La hemólisis o lipemia son causa de resultados erróneos. Estabilidad de la muestra: El fósforo inorgánico es estable en el suero 8 horas a temperatura ambiente. En caso de no procesarse dentro de ese lapso, se puede refrigerar (2-10ºC) hasta 7 días. La orina de 24 horas es estable 7 días refrigerada (2-10ºC).

Long de onda: 340 nm Tº Rx: temperatura ambiente. La reacción final es estable 20 minutos. VALORES DE REFERENCIA Suero o plasma Adultos: 2,5 - 5,6 mg/dl Niños: 4,0 - 7,0 mg/dl Orina 0,3 - 1,0 g/24 horas CREATININA DIRECTA Métodos para la determinación de creatinina en suero y orina La determinación de creatinina sérica es más utilizada como índice de funcionalismo renal. FUNDAMENTOS DEL METODO: La creatinina y otros compuestos de la muestra reaccionan con el ácido pícrico en medio alcalino dando un complejo color rojo que se cuantifica mediante lectura fotométrica. La determinación de creatinina puede llevarse a cabo por medio de una técnica de punto final, o por una técnica cinética eliminándose en ambas el color que se debe a los cromógenos no creatinina. En el primer caso, la adición de ácido al medio, destruye el picrato de creatinina pero no el color formado por los demás compuestos. Por lo tanto la diferencia entre la lectura fotométrica antes y después del agregado de ácido, permite cuantificar la creatinina en forma específica. En la técnica cinética, los cromógenos no creatinina, reaccionan dentro de los primeros 30 segundos de iniciada la reacción, que se comporta como cinética de primer orden para la creatinina. De manera que entre los 30 segundos y los 5 minutos posteriores al inicio de la reacción, el incremento de color se debe exclusivamente a la creatinina.

Tecnica de Cinetica no la hicimos en el Lab es informativo Long Onda: 500 nm en espectrofotómetro. Tº Rx: 25ºC El control de la temperatura no es crítico, pudiendo oscilar entre 22 y 30ºC.

Valores de Referencia: Suero: 8 - 14 mg/l Orina: 0,9 - 1,5 g/24 hs D.C.E.: 80 - 140 ml/min (promedio 125 ml/min) para adultos de hasta 60 años. MAGNESIO LIQUICOLOR Prueba fotométrica para el magnesio con factor aclarante de lipidos (LCF)

Reactivo A: solución de ácido pícrico 41,4 mmol/l. Reactivo B: solución 0,4% de polioxietilén lauril éter (PLE) en buffer alcalino, pH 12,4. Reactivo C: ácido acético al 20%.

FUNDAMENTO DEL METODO: Los iónes de magnesio en medio alcalino forman un complejo azul coloreado con el azul de xilidil. El ácido glicoleterdiamina-N,N,N1,N1-tetraacético (GEDTA) es usado como agente bloqueador para el calcio.

Estabilidad de la muestra: la creatinina en suero es estable hasta 24 horas y en orina hasta 4 días, en refrigerador sin agregado de conservadores.

Muestra: Suero, plasma, líquido cefalorraquídeo y orina. Interferencias: No usar EDTA. La prueba es lineal hasta concentraciones de magnesio de 5 mg/dl o 2.05 mmol/l.

Tecnica de Punto Final Longitud de onda: 510 nm. Tº Rx: 37ºC

El color de la reacción es estable durante 6 horas.

SODIUM RAPID Determinación fotométrica de sodio en suero Método Mg acetato de uranilo, prueba colorimétrica. FUNDAMENTO DEL METODO: El sodio se precipita con Mg acetato de uranilo, los iones de uranilo que permanecen en suspensión forman un complejo de color café amarillosos con ácido tioglicólico. La diferencia entre el blanco del reactivo(sin precipitación de sodio) y la muestra es proporcional a la concentración de sodio. Longitud de onda: 410 nm Temperatura: 20-25ºC El ajuste cero del fotometro se efectua con agua destilada. Los resultados de DO deben ser corregidos por el blanco de reactivo (BR). Valores Referencia Suero: 135-155 mmol/L SISTEMA DE PRUEBA TIROXINA TOTAL (tT4) Determinación cuantitativa de Concentración total de Tiroxina en Suero o plasma mediante un inmunoensayo enzimático en microplaca. De acuerdo con este método, la referencia sérica, la muestra del paciente o el control es primero adicionado a un pozo de microplaca. El conjugado de enzima T4 es adicionado y luego los reactivos son mezclados. El resultado es una reacción de competencia entre el conjugado de enzima y la Tiroxina nativa para un número limitado de anticuerpos que combinan sitios inmovilizados en el pozo. Fundamento del metodo: Inmunoensayo competitivo de Enzima (TIPO 5). Los reactivos esenciales requeridos para un inmunoensayo enzimático de fase sólida incluyen anticuerpos inmovilizados, conjugado de enzima-antígeno y el antígeno nativo. Después de la mezcla se obtiene una reacción de competencia entre el antígeno nativo y el conjugado enzima-antígeno para un número limitado de sitios de unión insolubilizados. La fracción unida al anticuerpo es separada del antígeno no unido mediante decantación o aspiración. Al utilizar varias referencias séricas diferentes de valores de antígenos conocidos, se puede generara una curva de

respuesta de dosis a partir de la cual se establece la concentración de antígeno de una sustancia desconocida. Reactivo T4 enzima: conjugado de tiroxina -peroxidasa de rábano picante (HRP) en una matriz estabilizante de albúmina de bovina. Buffer conjugado T3/T4: buffer, tinta roja. Placa recubierta con anticuerpo T4. Sustrato A: Tetrametil bencidina (TMB) en buffer. Sustrato B: Peróxido de hidrógeno (H2SO2) en buffer. Solución stop: Ácido fuerte (1.0N HCl). Evite la exposición prolongada al calor y a la luz. La sangre se recolecta en tubo para punción venosa de banda roja en la sección superior sin aditivos ni anticoagulantes (para el suero) o tubo (s) evacuado que contenga EDTA o heparina. Preparación de Reactivos Reactivo A de trabajo = Solución de conjugado T4-enzima Diluir el conjugado T4-enzima en una relación de 1:11 con buffer de conjugado total T3/T4 en un recipiente adecuado. Por ejemplo, diluir 80µl de conjugado con 0.8 ml de buffer para 8 pozos (se forma un exceso ligero de la solución). Buffer para Lavado: Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada en un contenedor de almacenamiento adecuado. Solución de Substrato de Trabajo: Verter el contenido del vial color ámbar marcado como Solución ”A” dentro del vial transparente Solución “B”, colocar la tapa amarilla en el vial transparente para una fácil identificación. Procedimiento: 1. Formatear los pocillos de a microplaca para cada suero de referencia, control y espécimen de paciente que deba ensayarse en duplicado. 2. Pipetear 0.025 ml (25μl) del suero de referencia apropiado, control o espécimen dentro del pocillo asignado. 3. Adicionar 0.100ml (100μl) del reactivo de trabajo A, Reactivo de enzima T4 en todas las pozos. 4.Agitar suavemente la microplaca durante 20-30 segundos para mezclar y tapar. 5. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. 6. Eliminar el contenido de la microplaca mediante decantación o aspiración. 7.Adicionar 350μl de buffer de lavado, decantar, secar o aspirar. Realizar un total de tres (3) lavados. 8. Adicionar 0.100 ml (100μl) de solución sustrato de trabajo a todos los pozos. 9. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. 10. Adicionar 0.050ml (50µl) de solución de parada de reacción a cada pozo y mezclar suavemente durante 15-20 segundos.

11.Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (utilizando una longitud de onda de referencia de 620-630 nm para minimizar las imperfecciones de los pozos) en un lector de microplacas. Los resultados deberán ser leídos dentro de los 30 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. Nota: Para reensayar muestras con concentraciones superiores a 25 ug/ml, pipetear 12.5µl de la muestra y 12.5µl de la referencia de suero 0 dentro del pozo de la muestra (este procedimiento mantiene una concentración uniforme de proteínas). Multiplicar el valor de lectura por 2 para obtener la concentración de tiroxina. Calculos: Una curva dosis respuesta es usada para determinar la concentración de Tiroxina en especímenes desconocidos. Valores Referencia:

TRIYODOTIRONINA TOTAL (tT3) Determinación cuantitativa de la Concentración de Triyodotironina en Suero Humano o plasma por ensayo inmunoenzimométrico con microplacas. Fundamento del metodo: Es el mismo que T4. Reactivo de Enzima- T3 total: conjugado de T3- peroxidasa de rábano (HRP) en una matriz estabilizada con albúmina. Buffer de Conjugado T3/T4: contiene buffer, colorante rojo, preservante e inhibidores de unión a proteínas. Microplaca cubierta de Anticuerpo T3: Una microplaca de 96 pozos cubiertas con suero anti-T3 de oveja y empacada en una bolsa de aluminio con un agente desecante. Concentrado de Solución de Lavado: Contiene un surfactante en suero salino tamponado. Sustrato A: Tetrametil bencidina (TMB) en buffer. Sustrato B: Peróxido de hidrógeno (H2SO2) en buffer. Solución stop: Ácido fuerte (1.0N HCl). Evite la exposición prolongada al calor y a la luz. La sangre se recolecta en tubo para punción venosa de banda roja en la sección superior sin aditivos ni anticoagulantes (para el suero) o tubo (s) evacuado que contenga EDTA o heparina. Reactivo de Trabajo A- Solución de Conjugado T3- Enzima: Diluir el conjugado T3-enzima 1:11 con el buffer del conjugado T3/T4 total en un contenedor adecuado. Por ejemplo, diluir 80µl de conjugado con 0,8 ml de buffer para 8 pozos.

Buffer para Lavado: Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado a 1000 ml con agua destilada o desionizada. Solución de Substrato de Trabajo: Vierta los contenidos del vial ámbar marcada con “A” dentro del vial claro marcado como solución “B”.Colocar la tapa amarilla al vial claro para fácil identificación. Procedimiento: 1. Marque los pozos para cada suero de referencia control y suero de pacientes para ser procesadas por duplicado. 2. Pipetear 0.050 ml (50µl) del suero de referencia apropiado, control o muestra dentro del pozo asignado. 3. Adicionar 0.100ml (100µl) de Reactivo de trabajo A, solución de conjugado T3 Enzima a todos los pozos. 4. Agitar la microplaca ligeramente por 20-30 segundos para mezclar y cubrir. 5. Incubar 60 minutos a temperatura ambiente. 6. Descartar los contenidos de la microplaca por decantación o aspiración, si decanta, utilice papel absorbente para extraer el exceso de humedad. 7. Adicionar 350µl de buffer de lavado, decante o aspire. Repita 2 veces mas para un total de 3 lavados. 8. Adicione 0.100 ml (100µl) de solución de substrato de trabajo a todos los pozos. 9. Incube a temperatura ambiente por 15 minutos. 10. Adicione 0.050 ml (50µl) de solución de parada para cada pozo y mezcle ligeramente (por 15-20 segundos). 11. Lea la absorbancia en cada pozo de cada pozo a 450 nm (usando una longitud de onda de 620-630 nm para minimizar las imperfecciones del pozo) en un lector de microplaca. Los resultados deberán ser leídos dentro de los 30 minutos siguientes a la adición de la solución de parada. Nota: Para reprocesar muestras con concentraciones mayores de 7.5 ng/ml, pipetear 25µl de muestra y 25µl del suero de referencia 0 dentro del pozo de la muestra (esto mantiene una concentración uniforme de la proteína). Multiplicar el valor leído por 2 y obtendrá la concentración de Triyodotironina. Calculos: Una curva dosis respuesta es usada para determinar la concentración de Tiroxina en especímenes desconocidos. Valores de Referencia: 0.52 - 1.85 ng/ml