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Determinación por espectrofotometría del contenido de Clorofila en la Espinaca (Spinacia oleracea) _________________________________________________________________________ _

Mónica María López Paz, Maria Camila Alvarado Martínez. Universidad de La Sabana, Facultad de Ingeniería, Ingeniería Química, Laboratorio de Bioquímica. Campus Puente del Común. Chía, Cundinamarca, Colombia. Abstract. Se llevó a cabo el análisis del contenido de clorofila en un extracto de muestra de espinaca mediante espectrofotometría. La metodología de normalización se lleva a cabo bajo un límite de absorbancia correspondiente a 0.8, con un coeficiente molar normalizado de 21,59. La concentración (mg/mL) de clorofila se obtiene mediante la curva de calibración establecida previamente. Se encuentra que la cantidad de clorofila en 9,1 mg de extracto de acelga es de 0,243 mg. Introducción. Las plantas siempre han estado presentes en el desarrollo de la especie humana, inicialmente cobraron importancia en la agricultura para las primeras civilizaciones y fueron un factor detonante de la sedentarización. Estas se han aprovechado de múltiples maneras desde cuestiones nutricionales hasta estética. El desarrollo de las ciencias en etapas posteriores, permitió conocer más a fondo las utilidades de las plantas en donde destacó uno de sus componentes, la clorofila, su capacidad de absorción de luz solar que hace posible uno de los procesos naturales más eficientes que existe la fotosíntesis . La clorofila fue descubierta por un par de químicos franceses gracias a la acción de los disolventes que permiten su aislamiento. A nivel de laboratorio es posible cuantificarla y mediante extracción aislarla de hojas y tallos de plantas. Sus usos industriales abarcan la farmacología por sus efectos antioxidantes y beneficiosos para algunos sistemas funcionales del cuerpo humano. Metodología. La metodología desarrollada en esta práctica se divide en tres componentes principales: la normalización del método espectrofotométrico, la extracción de muestras de espinaca, y la determinación de la absorbancia de la solución problema. Los tres son descritos en detalle a continuación: Normalización del método espectrofotométrico. Se prepara una solución patrón de concentración 0,2 mg/mL disolviendo una pastilla de clorofila (10 mg de clorofila por pastilla) en un volumen de 50 mL. Una vez preparada, se procede a realizar la medición de la absorbancia de la solución patrón en el espectrofotómetro UV-vis. El valor de la absorbancia para la solución patrón resulta ser de 2.53. Puesto que el presente estudio se desarrolla bajo un límite de absorbancia correspondiente a 0.8, resulta necesario realizar cinco diluciones de la solución patrón con el fin de generar

muestras con concentraciones inferiores, para así obtener absorbancias en el intervalo de 0 a 0,8. Se realiza la primera disolución llevando un volumen de 3 mL de solución patrón hasta 10 mL en un balón aforado. Las siguientes disoluciones se llevan a cabo bajo el mismo proceso, tomando como concentración inicial la concentración obtenida con la disolución previa. La tabla 1 muestra las concentraciones empleadas y sus respectivas absorbancias:

Al graficar los datos presentados en la tabla 1, se obtiene la curva de calibración. Esta curva debe presentar una relación lineal entre concentración y absorbancia, pues esto simplifica los cálculos y asegura que se han establecido las condiciones óptimas para el procedimiento analitico. (Díaz, 2002)

La curva de calibración se grafica con el fin de determinar el coeficiente de extinción molar; el cual, es equivalente a la pendiente de la recta. No obstante, el comportamiento de la curva en la gráfica 1 no es completamente lineal, por lo que resulta necesario hacer un ajuste lineal con ayuda de un software computacional. Dicho ajuste permite conocer la siguiente información:

Regresión Lineal ajuste del conjunto de datos: Gráfica 1. Usando función: A*x+B Y: Desconocido Desde x = 0,0079 a x = 0,06 B (y-intersección) = -0,0837285239503073 +/- 0,0331328324580413 A (pendiente) = 21,5923967519516 +/- 0,990382079705063 De tal manera, el coeficiente de extinción molar es de 21,5923 para el cromóforo en cuestión.

Extracción de la muestra de espinaca. Utilizando un montaje Soxhlet se lleva a cabo la extracción de una muestra de espinaca. Se obtienen en total 9.1 mg de extracto de espinaca. Enseguida, se diluyen los 9.1 mg de muestra en 10 mL de solvente, compuesto en un 90% por etanol y 10% agua. Posteriormente se efectúa la medición de la absorbancia para la solución problema en el espectrofotómetro. El resultado es de 0,441. Resultados y Discusión. Cuando se toma como objeto de estudio la clorofila que ha sido aislada de los tallos y hojas de espinaca, se encuentra que la clorofila es una molécula fotorreceptora. La espinaca pertenece a un grupo bastante amplio de plantas verdes que presentan clorofila a, un tetrapirrol sustituido (Stryer, Berg, Tymoczko, 2008). De igual manera se toma en consideración su no pertenencia a otros tipos de clorofila como puede serlo la b, c1 y c2 que se encuentran en otros tipos de plantas como las algas y en muchos protistas. A continuación se adjunta la estructura en la figura 1.

Figura 1. Estructura de la clorofila a. Es un tetrapirrol cíclico. Imagen tomada de ChemSpider search and share Chemistry. Disponible en: http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.16736115.html?rid=fd385eec-fdbe-4c3b-b611a634bdb2aab6

Una vez dicho esto, se procede a la determinación y análisis de la cantidad de clorofila a presente en la planta de espinaca. La solución de extracto de espinaca [0,91 mg/mL] presenta una absorbancia de 0,441. Asumiendo que el único compuesto de carácter cromóforo en el extracto de espinaca es la

clorofila, y con base a la absorbancia obtenida, es posible determinar la cantidad de clorofila en el extracto de la planta. Se llega al resultado de manera analítica utilizando la ecuación de la curva de calibración o bien utilizando la gráfica. Determinación de la cantidad de clorofila mediante la curva de calibración. Mediante el ajuste lineal de la curva, se obtiene la ecuación de la recta “y = 21,5923 x - 0,08372” . De ahí que el valor en x correspondiente a y = 0,441 es x = 0,0243, lo cual representa 0,0243 mg Clorofila/mL. La concentración de la solución problema es de 9,1 mg extracto de espinaca/ 10 mL y las concentraciones empleadas para la construcción de la curva de calibración se trabajan en mg Clorofila/10 mL. Bajo esta lógica, es válido afirmar que de los 9,1 mg de extracto de espinaca presentes en 10 mL de solvente, 0,243 gramos son de clorofila, lo que equivale al 2,67% p/p. De manera convencional, la composición química de las plantas se expresa en g/100g; realizando las operaciones aritméticas pertinentes se obtiene que la composición de clorofila en la espinaca es de 2,67 g/100 g. Ahora bien, es posible determinar el error presente en el proceso matemático descrito anteriormente. Para esto, se determina el valor del coeficiente de extinción molar utilizando la ecuación de Lambert-Beer. (Harris, 2003) Dicha ecuación relaciona la absorbancia de la luz monocromática a una longitud de onda fija y la concentración del cromóforo bajo la siguiente expresión: A= ɛCI donde A es la absorbancia, ε el coeficiente de extinción molar, C la concentración del cromóforo e I , el ancho de la celda que contiene la muestra al momento de realizar la medición en el espectrofotómetro. Partiendo de que el ancho de la celda utilizada en el laboratorio es de 1.00 cm y de la concentración del cromóforo obtenida en el anterior análisis (0,0243) junto con la absorbancia de 0,441, se tiene que el coeficiente molar es de 18.1481. Por tanto, el error es del 15,97% . Rendimiento de la extracción Es posible calcular el rendimiento por peso húmedo por peso seco de lo obtenido de clorofila a continuación se establecen ambas relaciones. de clorofila ∗100=¿ ( g demgespinaca húmeda )

Rendimiento por peso húmedo

0, 243 mg =¿ 0,026* 100= 2.6 % 9,1mg espinaca humeda de clorofila =¿ ( g mg de espinaca seca )

Rendimiento por peso seco

0, 243 mg =0,027∗100=2,7 8,9mg seca

Conclusiones. ● El espectro de absorción UV-Vis se emplea con bastante frecuencia en química analítica, la interacción de la radiación electromagnética con la materia producida en el barrido permite un análisis cuantitativo que pudo establecerse para la clorofila extraída de la espinaca, la concentración de clorofila en la muestra es de 0,243 mg/ seleccionada de extracto de espinaca corresponde a un 12% del porcentaje peso. ● El modelo matemático, la ley de Lambert-Beer principalmente apunta a una proporcionalidad existente entre el espesor del analito, la concentración y una constante que obedece determinados parámetros, permitió hallar la concentración de clorofila en el analito a partir de los datos medidos en el barrido debido a la intensidad de la luz absorbida, cabe resaltar que esta ley puede describir muchos fenómenos de este tipo, sin embargo tiene unas limitaciones que fue necesario tener en cuenta a la hora de llevar a cabo la práctica puesto que describe bien comportamientos de disoluciones diluidas (