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Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL INFORME

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Grupo de campus

Edna Karina Caviedes Cedeño Luz Estella Castellanos Leidy Tatiana Ramírez Alexander Ortiz Rojas Diana Jimena Zapata Mayron Mazabel Castro Juan Carlos Moreno Nupia

[email protected] [email protected]

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41109672 [email protected]

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TUTOR DE LABORATORIO: Diego Lancheros ([email protected])

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD PROGRAMA INGENIERIA AMBIENTAL CEAD NEIVA

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Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental 2016-5 INTRODUCCION En el desarrollo de esta práctica se conoce las diferentes Normas de Bioseguridad que se deben tener en cuenta en un Laboratorio, con el fin de evitar accidentes o contraer enfermedades. Además, se identifican los diferentes tipos de materiales y equipos necesarios para el desarrollo de las diferentes practicas dentro del Laboratorio. Se realiza un análisis Microbiológico con diferentes tipos de técnicas empleadas en el campo de la Ingeniería, con el fin de determinar los distintos tipos de hongos y bacterias. Dentro de las técnicas empleadas se utilizó la Tinción de Gram con el fin de lograr observar las Bacterias presentes en la saliva de la Boca de una persona; en el análisis microbiológico de suelo se lleva a cabo con el fin de crear un medio de cultivo para hongos. En la actualidad existen técnicas aplicadas en el Campo de la Microbiología Ambiental con el fin de diagnosticar e implementar alternativas para el desarrollo agrícola en el ámbito de la Ingeniería Ambiental y la Industria, realizando pruebas para determinar los indicadores de contaminación de agua potable, teniendo en cuenta las Normas Ambientales Vigentes (Resolución 2115 del 2007). Entre las técnicas más utilizadas encontramos la Filtración por membrana. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Reconocer e identificar los diferentes tipos de técnicas de análisis utilizadas en el campo de la Microbiología en el momento de determinar los diferentes tipos de bacterias y hongos presentes en diferentes sustancias y/o medios. OBJETIVOS ESPECIFICOS   

Aplicar las Normas de Bioseguridad para la realización de prácticas en el Laboratorio. Conocer las diferentes técnicas para identificar hongos y bacterias en el laboratorio. Identificar los diferentes medios de cultivo para el crecimiento de Microorganismos.

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PRACTICA 1- BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la protección contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la confiabilidad de los resultados. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO 

Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el lugar que se les indique para tal fin.



Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer completamente cerrada.



Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesión práctica.



Lavar las manos con agua y jabón antes de realizar las actividades programadas, antes de salir del laboratorio y siempre después de manejar materiales que se sabe o se sospecha que son contaminantes.



Trabajar cerca del mesón, adoptando una buena postura y estando físicamente cómodo.



Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las áreas de laboratorio.



Evitar llevar en el laboratorio accesorio que pueda ser fuente de contaminación (por ejemplo joyas).



Recoger el cabello largo.



Evitar desplazamientos indispensable.



No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse cosméticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningún área del laboratorio.



Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades indicadas en la práctica. Si usted tiene alguna duda, diríjase al profesor.



Mantener el área de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales, exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realización del trabajo práctico.

innecesarios,

movimientos

bruscos.

Hablar

sólo

lo

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Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar éste desatendido.



Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier daño de los mismos al profesor.



No usar ningún reactivo que no esté debidamente identificado, verificar las etiquetas de los mismos y estar seguro de cómo emplearlo.



Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo experimentos no autorizados.



Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.



Emplear técnicas asépticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental PRÁCTICA No. 1ª RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO Y MATERIALES DE MICROBIOLOGIA 

Escriba debajo de cada instrumento del laboratorio el nombre

Probeta Graduada

Vaso de Precipitado

Trípode

Gradilla plástica con escurridera

Mortero con mazo

Vidrio reloj

Matraz Erlenmeyer

Embudo de vidrio

Caja de Petri Cápsulas de porcelana

Desecadores Bureta Graduada

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Cilindro Graduado

Espátula

Pipeta Volumétrica

Frasco lavador o Pisetas

Pipeteador de Cremallera

Botella Winkler

Agitador Matraz aforado o Volumétrico

Tubo de Ensayo

Termómetro

Pinza para crisol

Embudo de Separación

Soporte universal

Aro metálico

Escobilla o Churrusco Lavador

Mechero

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Ayudante de pipeta o pipeteador

Rejilla Balanza Analítica o Precisa  1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 1 2 1 3 1

Frasco Volumétrico

Escriba el número que corresponda de acuerdo a su empleo o utilidad. MATRAZ ERLENMEYER BALON FONDO PLANO MATRAZ DE SUCCION VASO DE PRECIPITADO BOTELLA YODOMETRICA O WINKLER TUBOS DE ENSAYO MATRAZ AFORADO O VOLUMETRICO CILINDRO GRADUADO

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Se emplea para triturar sustancias.

6 9

Se utilizan para calentar pequeñas cantidades de líquidos, y hacer ensayos a pequeña escala. Se utiliza para separar líquidos inmiscibles.

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Se utiliza para colocar tubos de ensayo.

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Se emplean para lavar precipitados y transferirlos a otro recipiente.

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EMBUDO DE SEPARACION BURETA GRADUADA BURETA AUTOMATICA PIPETA GRADUADA

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PIPETAS VOLUMETRICAS EMBUDOS

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Se utiliza sobre el mechero para calentar Se utiliza para calentar líquidos con poca perdida de evaporación y para construir generadores de gases. Sirven para tomar cantidades pequeñas de muestras sólidas para ser pesadas o trasferidas de un envase a otro Se utiliza para sostener múltiples aditamentos, tales como pinzas, aros o anillos etc. Se utiliza para pesar sólidos, cubrir vasos de precipitado y evaporar gotas de líquidos volátiles. Se utiliza para la determinación de oxígeno disuelto. Se utiliza para medir volúmenes aproximados de líquidos. Se emplean para calcinar sustancias

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Mide con precisión volúmenes variables de

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15 5 8

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VIDRIO RELOJ

10

1 6

ESPATULAS

7

1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2

CAPSULA

3

CRISOLES

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MORTERO CON MAZO GRADILLA

4

SOPORTE UNIVERSAL PISETAS

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2 3

TRIPODE

1

2 4

CAJA DE PETRI

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líquidos. Se emplea para titular soluciones, añadiendo volúmenes regulados se llena y se enrasa manualmente. Sirve para medir un volumen específico. Se utiliza para preparar soluciones a concentración exactas. Se utiliza para filtraciones al vacío con bomba de succión. Se utilizan para filtrados y trasvasar líquidos de un recipiente a otro. Se utiliza para disolver sustancias, calentar líquidos y recoger filtrados. Se usa para calentar sustancias y evaporar líquidos. Mide volúmenes exactos de líquidos. Es utilizada para preparar cultivos de hongos y bacterias, y también para seleccionar muestras de animales. Se utiliza para calentar líquidos, con poca perdida de evaporación, hacer titulaciones y recristalizar un sólido. Se emplea para titular soluciones, añadiendo volúmenes regulados se llena y se enrasa automáticamente.

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental PACTICA No 3 MÉTODOS DE SIEMBRA –PARTE B En esta etapa los estudiantes utilizarán una de las técnicas de siembra más usadas en laboratorio, que permite el recuento de microorganismos en una muestra como aguas, suelos etc. La técnica a realizar en este punto hace referencia a los recuentos de microorganismos utilizando diluciones seriadas en base 10, donde se dispersa la población de microorganismos permitiendo conocer el número aproximado en una muestra. MATERIALES 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Muestra de suelo o agua residual. Frascos con solución salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90 ml) Tubos tapa rosca con 9 ml de solución salina o agua peptonada al 0.1% (6 tubos) Cajas de Petri con agar Lisina (8 cajas) Pipetas de vidrio o pipeta automática. (1 ml) Rastrillos.

PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de solución salina o agua peptonada. Se utilizó una muestra de suelo traída por una compañera de Nataga-Huila, el tutor nos dividió en dos grupos y se procedió a pesar los 10 gramos en la balanza, luego se midió 90 ml de solución salina en una probeta y se adicionaron a un frasco volumétrico de tapa rosca, luego se adicionaron los 10 gramos de suelo al frasco con los 90ml de la solución salina.

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2.

Realizar diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-4

Este procedimiento se realizó dentro de la caja de Flujo laminar y se prendió el Mechero para evitar contaminar con agentes externos al procedimiento. Se tomaron 3 tubos de ensayo por grupo en nuestro caso se realizaron las diluciones solo en los tres tubos de la 10-1 hasta 10-4 luego de agitar la mezcla de suelo y solución salina para homogenizarla se procedió con una pipeta a extraer 1 ml y adicionarlo por cada uno de los tubos de ensayo Los cuales ya contenían 9ml de solución salina al 5.5%. Se procedió a marcar los tubos de ensayo según correspondía 10-1 10-2 10-3 10-4 En nuestro caso igual que el punto anterior se tomaron 4 cajas de Petri con agar lisina que era el medio de cultivo que había en el laboratorio Servilab donde se desarrolló la práctica; se marcaron con la fecha y el número de las diluciones correspondientes 10-1 10-2 10-3 10-4 con un lápiz rojo; en el borde de la tapa de cada caja de Petri.

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3. Sembrar por duplicado las diluciones 10 -2 10-4 10-6 tomando 0,1 ml de cada dilución por superficie, con ayuda del rastrillo homogenizar la microgota sobre la superficie del agar sin romperlo. Se tomó un ml de cada dilución con la pipeta, utilizando una pipeta diferente por cada dilución; según orientación de la Microbióloga Goretti quien realizo acompañamiento a la práctica de laboratorio. Se procedió con la misma pipeta de forma suave agregar el 0.1 ml de dilución en cada una de las cajas de Petri y de una forma suave se esparció en la superficie, sin ir a romper el medio de cultivo en este caso el Agar lisina.

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4. Incubar por 48 horas a 36 a 38 °C y realizar el recuento. Se procedió a observar por medio del Estereoscopio, la cual se visualizó en la muestra 10-1 13 hongos redondos blancos en el fondo de la caja, en el 10 -2 se observan 5 hongos filamentosos en la parte superior, 10-3 se observa 2 hongos filamentosos en la superficie y en la 10-4 se pueden ver 2 hongos filamentosos. El hongo tiene como nombre Aspergillus niger, es común en nuestra vida cotidiana ya que produce un moho que se encuentra en diferentes alimentos que consumimos, esta se puede formar en levaduras e Hifas. Su característica más común es que son hongos Filamentosos compuesto de células llamadas Hifas.

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PRACTICA 4. TECNICAS DE TINCIÓN PARTE A - TINCIÓN DE GRAM PARA BACTERIAS. Para poder observar al microscopio los distintos tipos de microorganismos existen distintos tipos de coloraciones o tinciones que tienen afinidad con ciertas partes de la célula y permite diferenciarlas y observar algunos órganos de las células. Para el caso de bacterias la técnica más usada es la tinción de Gram, donde se permite clasificar las bacterias en Gram positivas (violetas) y Gramnegativos (Fucsias). MATERIALES 1. Muestras de Microorganismos, (practica aislamiento) 2. Colorantes para tinción de Gram (Cristal violeta, Lugol. Alcohol acetona, Fucsina de Gram)

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental 3. Aceite de inmersión 4. Microscopio. 5. Asas redondas PROCEDIMIENTO 1. Tomar las colonias de bacterias que los estudiantes sembraron anteriormente (técnicas de aislamiento) y realizar un frotis en una lámina portaobjetos, colocando una gota de agua y con ayuda del asa redonda homogenizar para expandir el frotis en la lámina. En este caso lo realizamos mediante frotis bucal se tomaron muestras de tres estudiantes voluntarios; frotando la lengua con un aplicador de madera con algodón luego se colocó la muestra en una lámina portaobjetos se procedió a realizar el extendido de forma uniforme. Antes del procedimiento se dio explicación por parte de la Microbióloga donde nos explicó que con este procedimiento se lograban observar e identificar cocos, bacilos y células epiteliales.

2. Dejar secar al aire libre la muestra, una vez se encuentre seca, fijar al calor la muestra en el mechero (se coloca 3 veces rápidamente sobre el fuego la lámina) para fijar la muestra.

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3. Una vez se encuentra la muestra fijada se procede a colocarle varias gotas de cristal violeta, dejando por un minuto y luego lavar en el grifo (solo para quitar el exceso de colorante. Se procedió a colocar las muestras en una parrilla, se les aplico varias gotas de cristal violeta, con el fin de colorear las bacterias Gram positivas dejando por un minuto, luego se lava con agua destilada de forma suave para evitar quitar la muestra.

4. Colocar unas gotas de Lugol, dejar por un minuto y lavar. Se colocó unas gotas del mordiente Lugol que nos ayuda a un más a fijar la muestra. Luego se lava como se debe hacer en cada procedimiento.

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5. Colocar una gota de alcohol acetona, dejar por 15 minutos, lavar. Se agregó ala muestra una gota de alcohol acetona para decolorar la muestra se dejó los quince minutos, luego se lavó nuevamente.

6. Colocar unas gotas de Fucsina de Gram, dejar por un minuto, lavar y dejar secar la muestra. Se procedió a colorear con fucsina con el fin de dar coloración a las bacterias Gram negativas; luego se lavó y se dejó secar.

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7. Una vez se encuentra seca la muestra agregar una gota de aceite de inmersión y observar en el microscopio en el objetivo de 100x. La función del aceite de inmersión es restringir el movimiento de la muestra, además de evitar el rozamiento entre el cubre objetos y el objetivo, generalmente se utiliza cuando vamos observar con el objetivo 100x. Otra función del aceite de inmersión es evitar que la luz se desvíe; al contrario lo que se pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra.

8. Observar las morfologías (bacilos, cocos, Gram positivos, Gram negativos) Hubo dificultad para enfocar la muestra y la imagen no fue lo suficientemente clara; pero sabemos que los bacillos son de forma alargada, los cocos de forma redonda, las bacterias Gram positivas se observan de color violeta y las Gram negativas de color rojizo o rosado.

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Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental PRACTICA 5 ALGUNAS TECNICAS APLICADAS EN MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL. La microbiología enfocada en la parte ambiental ha permitido diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo agrícola, en el ámbito de la ingeniería ambiental y la industria. Con los conocimientos adquiridos en el curso y teniendo un conocimiento básico de la microbiología, los estudiantes realizaran las siguientes pruebas que actualmente se utilizan a nivel mundial y específicamente en el país. INDICADORES DE CONTAMINACION DE AGUAS POTABLES Los indicadores de contaminación son utilizados para medir el grado de contaminación o afectación de cuerpos de agua, agua de consumo etc., en Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un valor de 0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de agua muestreada para el caso de coliformes totales como indicador. FILTRACIÓN POR MEMBRANA La Filtración por membrana son filtros de superficie, estas muestran una estructura microporosa. Es una técnica utilizada para retener solidos suspendidos y otras sustancias de un líquido y así purificarlos. Durante el proceso de la Filtración las partículas de gran tamaño son retenidas por los poros de la membrana, existen 3 procesos: La Microfiltración, la Ultrafiltración y Nanofiltración. Estos filtros preferiblemente deben de ser de un diámetro para así poder captar el grado de Coliformes fecales y totales presentes en el agua, deben de estar libres de químicos para evitar el crecimiento de Microorganismos.

Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Programa Ingeniería Ambiental CONCLUSIONES Esta práctica nos permitió adquirir destrezas en el manejo de los diferentes materiales utilizados en el Laboratorio de Microbiología, en el empleo de Técnicas para identificar diferentes Microorganismos como Bacterias y Hongos. Se puso en práctica las Normas de Bioseguridad necesarias para evitar cualquier incidente sanitario. Se realizó la muestra de Tinción de Gram tomada del frotis bucal de una persona, ya que por falta de tiempo fue necesario realizar esta; en el análisis de la muestra obtenida no se reconoce con exactitud los Microorganismos presentes en la muestra. En el análisis Microbiológico de suelos después de 48 horas a una temperatura dentro de 36 a 38°C, las cuales fueron puestas en la Incubadora se lograron identificar en las 4 muestras la presencia de Hongos Filamentosos comúnmente llamados Mohos que como nombre científico es Aspergillus Niger. BIBLIOGRAFÍA Prof. Alessandra Garcés. Normas de Seguridad en el Laboratorio de Microbiología. Abril 2008 http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_normas_de_bioseg uridad.pdf

Laboratorio de Tecnología Educativa. Departamento de Microbiología y Genética. Universidad de Salamanca. Recuento de Coliformes Totales-Filtración a través de membrana. (n.d.). http://virus.usal.es/Web/demo_fundacua/demo2/FiltraMembColiT_auto.html