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Institutito Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis

Francisco Carmelo Fernández López

12/10/2020 4IM02

Nahui Ollin Morales López

“Determinación de Proteínas por el Método de Bradford”

Nahui Morales López

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1. Objetivos a) Elaborará una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un método fotométrico. b) Determinará el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pudieran interferir en el método. c) Determinará si hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión y exactitud respecto al método del ácido bicinconínico. d) Analizará las ventajas y desventajas de este método, con respecto a otros métodos para la determinación cuantitativa de proteínas. 2. Fundamento de la práctica El método de Bradford consiste en la formación de un compuesto de adsorción de coloración azul entre los residuos de aminoácidos básicos de las proteínas y el colorante azul brillante de Coomassie G-250, cambiando la lectura de absorbancia al formarse el complejo con la proteína de 465nm a 595nm. 3. Resultados y Cálculos

Tubo no.

Tabla1. curva de calibración para albúmina A 595 Concentración de Proteína (µg/mL) Serie A Serie B

1 2 3 4 5

2 4 6 8 10

0.141 0.232 0.301 0.36 0.438

0.135 0.219 0.303 0.355 0.426

Cálculo de la Concentración de proteína para cada tubo 𝟐𝟎 µ𝒈 (𝟏𝟎𝟎)µ𝑳 = 𝟐µ𝒈/𝒎𝑳 𝟏𝟎𝟎𝟎µ𝒈

Absorbancia vs Concentración Absorbancia

0.5 y = 0.036x + 0.075 R² = 0.9928

0.4 0.3 0.2 0.1 0 0

2

4

6

8

Concentración µg/mL

10

12

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3

Las variables de la ecuación obtenida de la curva de calibración pueden interpretarse como: y= 0.036x + 0.075; R= 0.9963 donde y= absorbancia, m= pendiente positiva, x= concentración y b= absorbancia del blanco. Cuando la absorción tiene un comportamiento lineal para producir resultados proporcionales, directamente o mediante una transformación matemática, a la concentración del analito en la muestra, se dice que se cumple con la ley de Bouger y Beer para este método se cumple dentro de nuestros límites de cantidad de proteína que van de 2 a 10 µg/mL. Derivado de la recta ajustada por regresión lineal a la ecuación obtenida, se llegó a la siguiente ecuación para el cálculo de concentración de proteína: 𝑥 = sustituyendo con los valores de nuestra curva de calibración: 𝑥 =

𝑦−0.075

𝑦−𝑏 𝑚

0.036

II. Análisis Estadístico

Tubo no. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tabla 2. Replica para el análisis estadístico tubo 3 A 595 Concentración de proteína (µg/mL) 0.318 6.75 0.334 7.1944 0.322 6.8611 0.327 7 0.314 6.6388 0.327 7 0.303 6.3333 0.309 6.5 0.308 6.4722 0.309 6.5

Cálculo de la concentración de proteína:

𝑦 − 0.075 0.036

=

0.318 − 0.075 = 6.75µ𝑔/𝑚𝐿 0.036

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Tabla 3. Resultados de análisis estadístico para el tubo 3 _ x

∑𝒏𝒊=𝟏 𝑿𝒊

Sx ̅) −𝑿 𝒏−𝟏 0.2822

S2x

∑𝒏𝒊=𝟏(𝑿𝒊

𝒏 6.7249

% C. V 𝑺𝒙 (𝟏𝟎𝟎) ̅ 𝑿 4.1963

0.0796

IC de µ ̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅ 𝒕𝑺𝒙 𝑿± √𝒏 [6.523, 6.926]

Precisión% Exactitud%

95.80

%Exactitud = 100 – Er

%Precisión= 100 - %C.V Ea= Vi – Ve Ea= 6.7249 – 6 = 0.7249 %Er = Ea/ Ve = 12.0816

Comparación estadística entre ambos métodos espectrofotométricos. Método de Prueba: Bradford

Método de Referencia: BCA

Precisión: Prueba de F S12= 0.2132

S22 = 0.0796

f tablas = 4.03

f calculada =

H0. S12 = S22;

Ha. S1 2 ≠ S22

𝑆12 𝑆22

𝐺.𝐿 𝐺.𝐿

=

=

9 9

0.2132 0.0796

= 2.6783

Se rechaza H0 si f calculada > f tablas. 2.6783 < 4.03 entonces f calculada < f tablas Conclusión: No hay diferencia estadísticamente significativa entre la precisión de ambos conjuntos de datos. El método de prueba cuenta con la precisión mínima necesaria. Exactitud: Prueba de t de student.

Tabla4. Comparación estadística entre el método de Bradford y BCA BCA Bradford P-R 6.0367 6.75 0.7133 6.9458 7.1944 0.2486 6.0151 6.8611 0.8460 5.6255 7 1.3745 6.1883 6.6388 0.4505 5.77 7 1.2300 6.6645 6.3333 -0.3312

87.91

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5.5389 6.5562 5.9502

5

6.5 6.4722 6.5

0.9611 -0.0840 0.5498

H0: Método BCA = Método Bradford;

𝑡=

̅̅̅̅̅̅̅̅ 𝑋𝐷 √𝑛 𝑆𝐷

=

0.5958(√10) 0.546

̅̅̅̅ 𝑺𝑫 𝑿𝑫 0.5958 0.546

Ha: Método BCA. ≠ Método Bradford

= 3.4507

Ttablas = 2.262 Tcalculada = 3.4507 Se rechaza H0 si t calculada > t tablas. 2.262 < 3.4507 entonces t calculada > t tablas Conclusión: Hay diferencia estadísticamente significativa. Los métodos no son exactos entre sí.

III. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford Tabla 5. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de Bradford Concentración Tipo de Tubo de proteína interferencia No. Sustancia A 595 (µg/mL) generada 1 Fenol 0.2% 0.343 7.4444 positiva 2 Detergente comercial 0.2% 0.194 3.3055 negativa 3 SDS al 0.2% 0.178 2.8611 negativa 4 Mercaptoetanol al 0.002% 0.321 6.8333 no hay 5 EDTA 30 mM 0.306 6.4166 no hay Cálculo de concentración de proteína:

𝑦 − 0.075 0.036

=

0.343 − 0.075 = 7.4444µ𝑔/𝑚𝐿 0.036

Cualquier dato fuera del intervalo de confianza se considera como interferencia, comparando con los datos bibliográficos sabemos que para el método de Bradford hay poco o nada de interferencia de cationes como sodio o potasio ni de carbohidratos como sacarosa. Se presenta una ligera interferencia en presencia de agentes tamponantes fuertemente alcalinos. Los únicos componentes que se encuentra que provocan una interferencia alta son cantidades relativamente grandes de detergentes como dodecil sulfato de sodio (SDS), Triton X-100 y detergentes comerciales para cristalería.

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Lo que coincide con nuestra interferencia negativa de SDS y detergente comercial aunque sean cantidades pequeñas. El fenol causa interferencia a partir del 5% por lo que al 0.2% no causa interferencias significativas aunque el valor salga del índice de confianza mínimamente. IV. Comparación de los métodos Utilizados para cuantificar proteínas MÉTODO

VENTAJAS • •

•

DESVENTAJAS •

RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS) POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS

•

•

NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA

BIURET •

•

•

A 280 nm

•

MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET) NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER MÉTODO NO DESTRUCTIVO

•

•

•

•

• • LOWRY

•

MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOS MUY SENSIBLE SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA

•

LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET) LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

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• •

• • BRADFORD

•

MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS) NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+ •

•

•

BCA

SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg) LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)

•

•

NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS POLIFENOLES NI CARBOHIDRATOS COMO LA SACAROSA MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O MAYOR DE 4 000 DALTONS EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA. LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN. ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN.

4. Discusión Observando la gráfica de la curva de calibración, la pendiente obtenida en el método de Bradford es menor que la obtenida en BCA. Lo que se puede interpretar como que el método del BCA es más sensible que Bradford, sin embargo los datos experimentales pueden estar sujetos a errores ya sean de tipo instrumental, del método o del analista. En el análisis estadístico se observa una diferencia visible entre el método del BCA y Bradford para los valores de la media y los valores de dispersión y concordancia, esto puede deberse a que en Bradford el valor de fondo para el reactivo disminuye continuamente a medida que se une más tinte a la proteína lo que hace que sea un método de reacción rápida pero ocasiona una estabilidad de corta duración. Se realizaron las pruebas estadísticas de t de student y f de Fisher para medir la exactitud y precisión respectivamente tomando como método de prueba Bradford y método de referencia BCA, se obtuvo como resultado que el método de Bradford cuenta con la precisión mínima necesaria con respecto al BCA pero los métodos no son exactos entre si ya que la hipótesis nula se rechaza y se presentan diferencias estadísticamente significativas.

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Finalmente, con respecto a las interferencias en los métodos por efecto de sustancias no proteínicas se observan valores negativos fuera del índice de confianza para los componentes en los que se observa un color excesivo en el ensayo tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) y detergentes comerciales. Cuando se encuentran en pequeñas cantidades, los efectos debidos a Tris, ácido acético, 2-mercaptoetanol, sacarosa, glicerol, EDTA, trazas cantidades de detergentes, Triton X-100 y SDS se puede eliminar la interferencia fácilmente ejecutando el control de tampón adecuado con el ensayo. Sin embargo, la presencia de grandes cantidades de detergentes presenta anomalías demasiado grandes para corregirlas. Comparando ambos métodos se puede concluir que en cuanto a interferencias se encuentra en ventaja el método de Bradford.

5. Conclusiones • Se cumple la ley de Bouger y Beer. • Se obtuvieron interferencias para SDS y detergente comercial. • No hay diferencia estadísticamente significativa en la precisión respecto al método del BCA. • Hay diferencia estadísticamente significativa en la exactitud respecto al método del BCA. • Se recomienda el método de Bradford para cuantificación de proteínas por reducción en el tiempo de reacción, sensibilidad del método y disminución de interferencias por efecto sustancias no proteínicas. 6. Referencia Bibliográfica Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72(1-2), 248–254. Davies, E. M.; (1988) (Review, Protein Assays) Amer. Biotech Lab. 28–37 Christian, G. 2009. Capítulo 16. Métodos Espectroquímicos En: Quimica Analitica. 6ta ediciòn. Editorial Mc Graw-Hill. pp 196-213 http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/acym/27_METODOS_PARA_LA_CUA NTIFICACION_DE_PROTEINAS.pdf

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