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DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD RESUMEN En la práctica de laboratorio se realizaron diferentes métodos de extracción para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford. Metodos de extracción tales como la Extracción con TrisHCL y SDS, Extracción con sonicación y NaCl 1 M y Extracción alcalina fueron los que se llevaron a cabo, dando como resultado la cantidad de proteína presente en la muestra según correspondiera, se tendrá en cuanta los errores sistemáticos y aleatorios a la hora de discutir los resultados de la práctica; también se realizó un análisis comparativo con los diferentes métodos de extracción para una mejor realización de la práctica. OBJETIVOS Determinar el contenido de proteínas en una muestra de harina de trigo utilizando el método de Bradford bajo tres métodos de extracción diferentes.

INTRODUCCION La cuantificación de la cantidad de proteína en una solución es posible en un espectrómetro simple. La absorción de radiación en la luz ultravioleta cercana por las proteínas depende del contenido de Tirosina y Triptófano (y en un grado muy pequeño de la cantidad de enlaces de fenilalanina y disulfuro). Por lo tanto, A280 varía mucho entre diferentes proteínas (para una solución de 1 mg / ml, de 0 a 4 [para algunas proteínas de lana ricas en tirosina], aunque la mayoría de los valores están en el rango de 0.5-1.5 [1]). Las ventajas de este método son que es simple y la muestra es recuperable. El método tiene algunas desventajas, incluida la interferencia de otros cromóforos, y se debe determinar el valor de absorción específico para una proteína determinada. Un método rápido y preciso para la estimación de la concentración de proteínas es esencial en muchos campos de estudio de proteínas. Un ensayo originalmente descrito por Bradford [2] se ha convertido en el método preferido para cuantificar proteínas en muchos laboratorios. Esta técnica es más simple, más rápida y más sensible que el método Lowry y cuando se compara con este, está sujeto a menos interferencia por reactivos comunes y componentes no proteicos de muestras biológicas. El ensayo de Bradford se basa en la unión del colorante Azul de Coomassie G250 a la proteína. Los estudios detallados indican que el tinte libre puede existir en cuatro formas iónicas diferentes para los cuales los valores de pKa son 1.15, 1.82 y 12.4 [3]. De las tres formas cargadas del colorante que predomina en la solución de reactivo de ensayo ácido, la roja catiónica y las formas verdes tienen máxima absorbancia a 470 nm y 650 nm, respectivamente. A diferencia de la forma azul más aniónica del colorante, que se une a la proteína, tiene un máximo de absorbancia a 590 nm. Por lo tanto, la cantidad de proteína puede estimarse determinando la cantidad de colorante en la forma iónica azul. Esto generalmente se logra midiendo la absorbancia de la solución a 595 nm. El colorante parece unirse más fácilmente a los residuos de arginina y lisina de las proteínas [4,5]. Esta especificidad puede conducir a una variación en la respuesta del ensayo a diferentes

proteínas, que es el principal inconveniente del método. El ensayo original de Bradford muestra variaciones en la respuesta entre diferentes proteínas [6-7]

PALABRAS CLAVES Ensayo de Bradford, colorante Azul de Coomassie, absorbancia, Estándar de proteína, Solución tampón Tris-HCl, Sodio Dodecil Sulfato (SDS), sonicación. MARCO TEORICO

La extracción de proteínas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los métodos más utilizados se basan esencialmente en la homogenización de los tejidos y la destrucción de los límites celulares por medio de diferentes procedimientos físicos y/o químicos. Obteniéndose lo que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberación de las proteínas de interés, evitando la degradación térmica o las alteraciones secundarias por oxidación, proteólisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de técnicas de disrupción celular, que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) métodos físicos mecánicos: agitación con abrasivos, homogeneización a alta presión o extrusión por presión; b) métodos físicos no mecánicos: shock osmótico, ciclos de congelación descongelación, sonicación o secado; c) métodos químicos: tratamiento con álcali, solventes, detergentes, ácidos o sustancias caotrópicas. Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separación y purificación de los componentes celulares. Como primera medida, puede realizarse una centrifugación diferencial para obtener fracciones subcelulares o para aislar organelas específicas. En este caso, las proteínas asociadas a membrana quedarán en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugación) y las solubles en el sobrenadante. En general, el extracto obtenido es sometido a tratamientos que separan las proteínas en diferentes fracciones basados en algunas propiedades tales como tamaño o carga, proceso denominado fraccionamiento. Las primeras fases en este proceso suelen utilizar diferencias en la solubilidad de las proteínas. Existen diversos factores que afectan esta solubilidad; en particular, la composición en aminoácidos (una proteína rica en aminoácidos polares es en general más soluble que una rica en aminoácidos hidrofóbicos); la estructura tridimensional (las proteínas fibrosas son en general menos solubles que las globulares) y el entorno de la propia proteína. Respecto a las condiciones del entorno de las proteínas, los principales factores que pueden afectar su solubilidad son la temperatura; la constante dieléctrica del medio; el pH del mismo; y la fuerza iónica. La precipitación salina de las proteínas es una técnica en donde se logra la precipitación de una fracción de proteínas mediante el aumento de la fuerza iónica del medio. Grandes cantidades de una sal agregada a una solución de proteínas, disminuye la interacción proteínaH2O porque quita la capa de solvatación, predominando la interacción proteína-proteína y generando la precipitación de las mismas. La concentración salina a la que se produce la precipitación no es igual para todas las proteínas, lo que permite usar ésta propiedad para la separación y purificación de proteínas particulares a partir de mezclas complejas.

La extracción asistida por ultrasonido (EAU) se puede aplicar a fuentes alimenticias para diversas aplicaciones, incluida la modificación de micronutrientes vegetales para mejorar la biodisponibilidad, la extracción simultánea y el encapsulamiento, desactivar la sonoquímica radical para evitar la degradación de bioactivos y aumentar la bioactividad de fenoles y carotenoides mediante hidroxilación dirigida [8]. El efecto degradativo de la sonoquímica radical, que es el aspecto más relevante en términos de mejora de la biodisponibilidad de proteínas de algas, no es producido por las ondas de ultrasonido, sino por la formación, crecimiento e implosión de burbujas formadas por lo que se conoce como cavitación acústica [9]. La violenta implosión de estas burbujas crea regiones microscópicas de presión y temperatura extremas, lo que resulta en la excitación química del líquido sonicado y su contenido, lo que facilita la descomposición de las partículas y la degradación del compuesto objetivo [10]. Las principales ventajas de los Emiratos Árabes Unidos son su rápido tiempo de procesamiento, las propiedades no térmicas y el bajo consumo de solventes, lo que da como resultado un producto final de mayor pureza con un menor procesamiento posterior requerido [11].

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Se hizo la determinación del contenido de proteína de una muestra de harina de trigo (ARINA CAPRI). Se utilizaran tres métodos de extracción. Extracción con Tris-HCL y SDS Se pesaron 2 g de harina con 20 ml de buffer Tris-HCl 40 mM con 2% SDS, pH 6.8. Se Incubaron durante una hora a temperatura ambiente en agitador magnético. Se Centrifugo a 15000 g (10 min, 4 °C). Se separó el sobrenadante. De la extracción se adquirieron 2 ml y se aforaron en un balón de 10mL posteriormente se sacó 1 mL de este solución y se llevó a un balón aforado de 10, de esta disolución se retiraron 0,5 mL más 5 mL de Bradford ya para ser analizados en el UV Extracción con sonicación y NaCl 1 M Se pesaron 4,99 g de harina y se mezcló con la solución de NaCl 1M. La suspensión se agito durante 30 minutos y posteriormente se aplicó sonicación por 20 min. Los extractos se centrifugaron por 15 min y los sobrenadantes se almacenaron a – 20 ⁰C. El volumen total de la extracción fue de 50 mL se obtuvieron 6 mL y estos se aforaron en un balón de 25 mL de esta solución se obtuvo 1 mL que se llevó a un balón de 25 mL, de la disolución se extrajo 0,5 ml junto con 5 mL de Bradford y se llevaron para su posterior análisis. Extracción alcalina Disolvieron 2,5g de harina en 25 mL de agua destilada pH 12 manteniendo una relación final harina/solución de extracción 1:10 p/v. se centrifugo la mezcla a 13.000 rpm durante 20 min y se conservó el sobrenadante a -20 ⁰C. Del extracto alcalino se obtuvieron 2 mL se aforaron en un

balón de 10 mL, de esta disolución se sacaron 0,5 mL junto con 5 mL de Bradford para su posterior análisis Método estándar Para 0.5 mL de solución de la muestra que contenía 10 y 100 mg/L de proteína en un tubo de ensayo se agregó 5 mL de reactivo, se homogenizo suavemente en un vortex y se esperó dos minutos. Se Leyó la absorbancia a 595 nm junto con los tubos de la curva de calibración. Posteriormente se Preparó duplicados de cada muestra. Para la curva de calibración, se preparó estándares entre 0- 100 mg/L (20, 40, 60, 80 y 100 mg/L) a partir de la solución estándar de Albúmina de suero bobino de 1mg/mL. En tubos de ensayo se agregó 5 mL de reactivo de Bradford a 0,5 mL de cada solución estándar que se preparó entre 0 – 100 mg/L, se homogenizo suavemente en un vortex y se esperó dos minutos. Se prepararon triplicados de los patrones, se midió la absorbancia a 595 nm de las muestras y los estándares contra el blanco del reactivo preparado con agua destilada.

DATOS OBTENIDOS

numero de repeticiones 1 2 3 4 5 6 7 8 9 promedio

valor 1,0069 0,9927 0,9953 0,9916 1,0002 0,9915 0,9904 1,006 0,9919 0,9962777 8

valor- promedio 0,010622222 -0,003577778 -0,000977778 -0,004677778 0,003922222 -0,004777778 -0,005877778 0,009722222 -0,004377778

desviación estándar incertidumbre

resultado al ^2 0,000112832 1,28005E-05 9,56049E-07 2,18816E-05 1,53838E-05 2,28272E-05 3,45483E-05 9,45216E-05 1,91649E-05 3,72128E-05 0,006100233 0,9962+0,0061

ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

REFERENCIAS (1) Kohler, G. and Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495–497 (2) Chial, H. J., Thompson, H. B., and Splittgerber, A. G. (1993) A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G. Analyt. Biochem. 209, 258–266. (3) Compton, S. J. and Jones, C. G. (1985) Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analyt. Biochem. 151, 369–374. (4) Congdon, R. W., Muth, G. W., and Splittgerber, A. G. (1993) The binding interaction of Coomassie Blue with proteins. Analyt. Biochem. 213, 407–413. (5) Friendenauer, S. and Berlet, H. H. (1989) Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Analyt. Biochem. 178, 263–268. (6) Reade, S. M. and Northcote, D. H. (1981) Minimization of variation in the response to different proteins of the Coomassie Blue G dye-binding assay for protein. Analyt. Biochem. 116, 53–64

(7) Nicholas J. Kruger, The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition, Edited by: J. M. Walker © Humana Press Inc., Totowa, NJ. The Bradford Method for Protein Quantitation Nicholas J. Kruger (8) Vilkhu K., Mawson R., Simons L., Bates D. Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry—A review. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 2008;9:161–169. doi: 10.1016/j.ifset.2007.04.014. [Cross Ref] (9) Ashokkumar M., Sunartio D., Kentish S., Mawson R., Simons L., Vilkhu K., Versteeg C.K. Modification of food ingredients by ultrasound to improve functionality: A preliminary study on a model system. Innov. Food Sci. Emerg. Technol. 2008;9:155–160. doi: 10.1016/j.ifset.2007.05.005. [Cross Ref] (10) . Mason T., Paniwnyk L., Lorimer J. The uses of ultrasound in food technology. Ultrason. Sonochem. 1996;3:S253–S260. doi: 10.1016/S1350-4177(96)00034-X. [Cross Ref] (11) Chemat F., Khan M.K. Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction. Ultrason. Sonochem. 2011;18:813–835. doi: 10.1016/j.ultsonch.2010.11.023. [PubMed][Cross Ref]