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• Jose Carlos Sanchez

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Departamento Académico de Química Curso: Microbiología General - Laboratorio INFORME DE LA PRÁCTICA N°3

Título:T ​ inción diferencial ácido-resistente. Integrantes

N° de matrícula

Bullón Lizama, Carlo

20170225

Lopez Carranza, Milagros

20170250

Salazar Sandi, Walter

20170261

Sánchez Portocarrero, José

20170237

Horario de práctica: ​lunes de 11 am a 1pm / Grupo: B* Apellidos y nombres del profesor: ​Juscamaita Morales, Juan Gabriel Fecha de la práctica:​ 8 de abril del 2019 Fecha del informe: ​15 de abril del 2019 Mesa: ​N°6

LA MOLINA – LIMA – PERÚ

I.

INTRODUCCIÓN El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión. En la presente práctica se hará uso de la técnica de tinción diferencial de Dörner y la de Schaeffer-Fulton para el reconocimiento de endosporas utilizando colorantes, decolorantes y contrastantes que nos ayudarán a preparar las muestras que serán vista en el microscopio óptico compuesto, en donde se visualizarán dichas estructuras coloreadas.

II.

OBJETIVO Identificar endosporas y diferenciarlas de la estructura vegetativa de las muestras a través de las técnicas de tinción diferencial de Dörner y Schaeffer - Fulton.

III.

RESULTADOS Figura

Observación

Figura 1. Observación de endosporas por tinción simple

Se colocó una gota de agua destilada en un portaobjetos y con el asa de kölle se tomó una muestra de cultivo de agar, la cual se esparció junto con la gota por todo el portaobjetos. Una vez obtenida una película delgada se fija la muestra, después se echa colorante verde malaquita y lo dejamos actuar por 1 minuto para luego enjuagarlo. Con ayuda del aceite de inmersión podemos ver que la parte vegetativa se tiñe de verde y la endospora queda sin colorante, brillando.

Figura 2. Observación de endosporas por el método de Dörner

Figura 3. Observación de endosporas por el método de Schaeffer y Fulton

Figura 4. Observación de endosporas por el método de Juscamaita

En un tubo de ensayo se introducen una gota de agua y una muestra de cultivo bacteriano de agar con 2 gotas de carbolfucsina, se calienta en baño María por 15 minutos, de esta suspensión de células hervidas se transfiere una gota a un portaobjetos. Se le agrega nigrosina y se frota con otro portaobjetos hasta tener una película delgada. Se seca la lámina y se examina en el microscopio con aceite de inmersión. Las endosporas estarán teñidas de rojo, mientras que la parte vegetativa incolora. Se fija una muestra del cultivo bacteriano de agar, se le agregan unas gotas de carbolfucsina. Se calienta ligeramente la lámina portaobjetos con el mechero hasta observar el desprendimiento de gases, evitar que el colorante se seque. Se añade decolorante alcohol ácido y se enjuaga. Se cubre la preparación con colorante verde malaquita y se enjuaga otra vez. Se seca la lámina y se examina en el microscopio con aceite de inmersión. Se observa que la endospora está teñida de color verde y la parte vegetativa de color rojo. Se hace lo mismo que en Dörner, nuestra variante va a ser que una vez sacado el tubo de muestra del calor se extrae una gota de este y se fija en un portaobjetos, se le pasa el decolorante alcohol ácido, se enjuaga y luego se le añade el colorante verde malaquita y una vez que pasen 2 minutos se enjuaga y pasa al microscopio con aceite de inmersión para observar las endosporas que deben ser de color rojo, la parte vegetativa será verde.

IV.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS En la práctica para lograr observar las endosporas de la muestra de bacterias de un agar nutritivo, se utilizó dos clases de tinción diferencial ácido-resistente: la técnica de Dörner y la de Schaeffer y Fulton. En ambas técnicas se emplean como colorante primario a la carbolfucsina. El fenol de la carbolfucsina y el calor suministrado en ambos casos ayuda a que el colorante penetre en las bacterias, pero la diferencia entre el modo de suministro de calor (directo e indirecto) se reflejan en el tamaño y volumen de éstas (Keller PJ., 2011). Las endosporas son formas de resistencia altamente deshidratadas y con una serie de cubiertas muy poco permeables, esto hace que sean difíciles de teñir , excepto si se calienta la preparación para permeabilizarlas; sin embargo, pueden evidenciarse en preparaciones a fresco o con diversas tinciones, pues las esporas aparecen como estructuras refringentes no coloreadas (Rodríguez, 2005). Donde por medio de una tinción simple se pudo comprobar que las esporas se presentaba incolora por lo resistentes que son y lo que se tiñó fue la parte vegetativa. Una característica resaltante viene a ser el uso de tinta china como agente decolorante y de tinción negativa en la técnica de Dörner. La tinta china es una suspensión de partículas de carbono coloidal que decolora la parte vegetativa de las células pero no la endospora ya que la corteza de ésta que se encuentra en su membrana contiene peptidoglucano y más las otras complejas estructuras causan una impermeabilidad que impiden la decoloración de la endospora de tal manera que cuando se utilizó este método pudimos observar y afirmar como la parte vegetativa se encontró incolora mientras que las esporas se tiñeron de un color rojo (Díaz, Gamazo y López-Goñi, 1995). En la técnica de Schaeffer y Fulton se emplea el colorante primario verde de malaquita a un extendido fijado con calor. Donde el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora donde será enjuagado para quitar el colorante de todas partes de la célula excepto de la endospora y donde a continuación se adiciona safranina para teñir de rojo la parte vegetativa. Donde en un extendido adecuado la endospora se presentará verde dentro de células rojas o rosadas (Tortora, 2007). Comprobando así que las endosporas se tiñeron verdes pero no pudimos observar mucho la parte teñida de rojo en la célula o parte vegetativa ya que seguro la muestra no fue totalmente adecuada por algún error que se haya cometido en el proceso.

V.

CONCLUSIONES ● Por medio de la tinción simple se comprobó esporas incoloras. ● Se comprobó que con la tinción de Dörner las esporas se tiñeron de rojo. ● Usando la técnica de Schaeffer y Fulton se observó esporas verdes y poca parte vegetativa roja.

VI.

CUESTIONARIO ● ¿Cuál de los dos métodos le permitió observar mejor las endosporas bacterianas? ¿A qué atribuye la diferencia? Si bien al aplicar ambas técnicas nos permitió reconocer las endosporas bacterianas, en la técnica de Schaeffer y Fulton se observó con mayor precisión y nitidez la ubicación de las endosporas, pudiéndose notar que las endosporas bacterianas se encontraban teñidas de color rojo diferenciándose de la parte vegetativa teñida de color verde. ● ¿Qué efecto produciría el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el alcohol cetona? Las bacterias ácido-alcohol resistentes está determinada por la composición de la pared celular, la cual además de contener peptidoglicano está constituída por un alto porcentaje de glucolípidos hidrofóbicos. Un componente importante de estos, son los ácidos micólicos. La presencia de estas capas hidrofóbicas previenen la penetración de soluciones acuosas, siendo esta la causa por la cual estos microorganismos no pueden teñirse con los métodos convencionales (tinción de Gram). Una vez que el colorante penetra a la célula bacteriana, este se combina con las mismas estructuras con las que se combina en cualquier otra bacteria (ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y además reacciona con ácidos micólicos libres, lo cual hace que la pared celular se vuelva aún más hidrofóbica. Con la tinción de Ziehl-Neelsen tanto las bacterias ácido-alcohol resistentes como las no ácido-alcohol resistentes se tiñen con el colorante primario. Sin embargo, al aplicar el agente decolorante, compuesto por una mezcla de alcohol-ácido, este no solubiliza los lípidos de la pared de las bacterias ácido-alcohol resistentes con lo cual se decoloran fácilmente, por lo que se vuelven a teñir al aplicar el colorante de contraste. Teniendo en cuenta este concepto, el uso de otros decolorantes como el alcohol cetona debido a su naturaleza química podría efectivamente decolorar las estructuras teñidas, de modo tal que no se podría notar una diferenciación clara entre la endospora bacteriana y la parte vegetativa (Villa, Fernandez y Castillo, ​2012).

● ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas? Cuadro 1. Géneros más representativos de bacterias esporoformadoras. GÉNERO Desulfotomaculum

CARACTERÍSTICA Bacilos. Reductores de sulfato.

Sporolactobacillus

Microaerofílicos, catalasa productores de ácido láctico.

negativa,

Alicyclobacillus

Acidófilos (pH=3).

Heliobacterium

Fotótrofos anoxigénicos que producen una única forma estructural de bacterioclorofila. Alcalófilo (pH=9).

Sporosarcina

Forma de cocos. Son microorganismos aerobios estrictos, esféricos u ovalados.

Fuente: ​Madigan, Martinko y Parker, 2004. ● Revise otras técnicas de tinción de esporas y comparelas con las usadas en este ejercicio. Destaque ventajas y desventajas. El método de Moeller utiliza cloroformo y ácido crómico en un primer momento después se lava con agua destilada y procede a teñirse con fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen (carbolfucsina) en caliente para sensibilizar y colorear la espora. La decoloración se realiza con alcohol clorhídrico y se usa como colorante de contraste azul de metileno. Las esporas se observarán de color rojo (debido a su tinción con carbolfucsina), la parte vegetativa presentará un color azul (debido a su tinción con el azul de metileno). Este método presenta cierta similitud en el procedimiento que utiliza la técnica de Schaeffer y Fulton, además que aplica a la muestra la misma solución colorante la cual es carbolfucsina; la diferencia es que el método de Moeller utiliza azul de metileno en cambio la técnica de Schaeffer y Fulton utiliza verde malaquita (​García, Colom y Jaramillo, 2003). Ventajas: Gran utilidad para la observación de las endosporas bacterianas. Desventajas: Un lavado excesivo con alcohol clorhídrico puede alterar los resultados. Otro ejemplo es el método de Wirtz, en el cual se tiñe con verde malaquita en caliente para sensibilizar y colorear la espora, después se lava con agua destilada. No se realiza ninguna decoloración, se procede a usar como colorante de contraste safranina o

fucsina diluida, finalmente se lava otra vez. Las esporas se observarán de color verde (debido a su tinción con verde malaquita), la parte vegetativa presentará un color rojo (debido a su tinción con safranina o fucsina diluida). Este método utiliza las mismas soluciones colorantes que la técnica de Schaeffer y Fulton; la diferencia es que el método Wirtz no emplea ninguna solución decolorante en cambio en la técnica de Schaeffer y Fulton utiliza el alcohol ácido, además en esta técnica la espora queda teñida de un color rojo y la parte vegetativa de un color verde (​Granados y Villaverde, 1997). Ventaja: La utilización de pocos reactivos aumenta la posibilidad de observar con claridad las endosporas bacterianas. Desventaja: Un lavado excesivo con agua destilada puede alterar los resultados. VII.

BIBLIOGRAFÍA Díaz, R., Gamazo, C., y López-Goñi, I. (1995). ​Manual práctico de Microbiología​. Barcelona: MASSON. García, M., Colom, M. y Jaramillo, J. (2003). ​Manual del Auxiliar de Laboratorio (2a. ed). Sevilla: MAD. Granados, R. y Villaverde, M. (1997). ​Microbiología Tomo 1: Bacteriología, características y clasificación bacteriana; Virología, características y técnicas bioquímicas.​ Madrid: Paraninfo. Keller, PJ. (2013) Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights. ​Science, 340​(6137). Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J. (2004). ​Brock, B ​ iología de los microorganismos​ (10a. ed.). Madrid: Prentice Hall. Rodríguez, E. (2005). B ​ acteriología general : principios y prácticas de laboratorio​. San José: Editorial de la Universidad de Costa Rica. Tortora, G. (2007). ​Introducción a la microbiología 9° Edición.​ Buenos Aires:Médica Panamericana. Villa, M., Fernandez, E. y Castillo, C. (2012). ​Bacteriología y micología veterinaria: Manual de Prácticas de Laboratorio.​ México: Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Recuperado el 13 de abril de 2019 de: http://files.gerardo-castillo.webnode.mx/200000059-1ad5b1bc4c/MANUALB ACTERMUM.pdf