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• Josue Chan

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Instituto Tecnológico Superior del Sur del Estado de Yucatán

Trabajo: Informe técnico Asignatura: Microbiología Docente: M.C. Damaris Ortegón Rivero Alumnos:  Vanesa Kituk Dzul  Lucely Burgos Dzul  Ángeles Santos Santos  Pedro Chan Uicab  Ayani Zapata Chan  Eloy Estrella Fajardo Sexto semestre

Grupo: “A”

Introducción El tamaño de los microorganismos impide detectarlos a simple vista, por lo que es esencial el uso del microscopio. Para que un objeto pueda ser percibido a través del microscopio, este debe poseer cierto grado de contraste con el medio circundante. Es ahí donde el empleo de las técnicas de tinción se torna imprescindible para el estudio microbiológico de las bacterias, ya que, generalmente todas las bacterias vivas son prácticamente incoloras, no presentando suficiente contraste con el medio acuoso donde se encuentran suspendidas, con lo cual no pueden ser observadas con claridad. Por medio de dichas técnicas, las bacterias teñidas producen un gran contraste con el medio que las rodea, permitiendo observar adecuadamente su morfología y así poder clasificarlas según sus características hacia un grupo taxonómico u otro de la clasificación bacteriana. La mayoría de los colorantes usados para teñir son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por algún componente celular. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los nucleicos y los polisacáridos ácidos, por ejemplo el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como las proteínas. Estos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo congo. Los colorantes tienen las siguientes funciones: permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes, revelan su forma y tamaño, muestran la presencia de estructuras internas y externas, producen reacciones químicas específicas. Existe un gran número de tinciones las que se aplican con objetivos específicos; se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante; tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular.

Tinciones El termino tinción significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras, sin embargo antes de teñir los microorganismos se debe fijar (adherir) al portaobjetos. Cabe mencionar que existen distintos tipos de tinciones en las que podemos encontrar las siguientes:

Tinciones simples Es una solución acuosa o alcohólica y de un colorante único y básico; el propósito principal de una tinción simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se aplica al extendido fijado durante un tiempo determinado y luego se lava, a continuación el portaobjetos se seca y se examina. Algunas de las tinciones simples utilizadas con frecuencia en el laboratorio son el azul de metileno, la carbolfocsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina. (Observar en la figura 1.1)

Tinciones diferenciales Reaccionan de modo diferente con las distintas clases de bacterias y por lo tanto pueden ser empleadas para establecer una distinción entre ellas. Las tinciones diferenciales más utilizadas con más frecuencia para las bacterias son la tinción de Gram y la tinción de ácido-alcohol resistencia. (Observar en la figura 1.2) 

Tinción de Gram

Fue desarrollado por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de violeta oscuro o púrpura. Las bacterias que conservan este color después de haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican como Gram positivas (retienen el colorante y permanecen de color violeta) y las bacterias que pierden el color violeta obscuro después de la decoloración se clasifican como Gram negativas (no retiene el colorante). (Observar en la figura 1.3)

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Tinción de ácido- alcohol resistencia

Con esta tinción se pueden identificar todas las bacterias de genero mycobacterium que comprende dos patógenos importantes mycobacterium tuberculosis, agente causal de la tuberculosis y mycobacterium leprae el agente causal de la lepra. Para llevarse a cabo esta tinción se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un extendido fijado y se calienta suavemente el portaobjetos durante varios, luego se enfría el portaobjetos y se lava con agua. A continuación el extendido se trata con ácido- alcohol, un decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes. Luego del extendido se colorea con azul de metileno que actúa como colorante de contraste (las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes aparecen azules después de la aplicación del colorante contraste). (Observar en la figura 1.4)

Tinción negativa para cápsulas La tinción de cápsula es más difícil que otros tipos de procedimiento de tinción porque los materiales capsulares son hidrosolubles y pueden desprenderse o eliminarse durante los lavados rigurosos, para llevar a cabo esta tinción, se mezclan las bacteria en una solución que contenga una suspensión coloidal fina de partículas coloreadas (tinta china o nigrosina) que proporcione un fondo que contraste y luego teñir las bacterias con un colorante simple , como la safranina , debido a su composición química las cápsulas no aceptan la mayoría de los colorantes biológico, como la safranina y así aparecen como halos que rodean cada célula bacteriana teñida. (Observar en la figura 1.5)

Tinción para endosporas (esporas) Una endospora es una estructura especial, resistente, y latente que se forma dentro de una célula y que protege a una bacteria de las condiciones ambientales adversas, no se tiñen con los métodos comunes, porque los colorantes no atraviesan sus paredes. La tinción utilizada es la de schaefferfulton para endoesporas y para ello se aplica el colorante primario verde de malaquita a un extendido fijado con el calor y se calienta hasta la emisión de vapores durante

alrededor de 5 minutos (el calor ayuda a que el colorante atraviese la pared celular). Luego se lava el preparado con agua durante cerca de 30 segundos para eliminar el verde de malaquita de todas las paredes de las células salvo las endoesporas. A Continuación se aplica sobre el extendido safranina para teñir las porciones de las células distintas de las esporas (las endoesporas aparecen verdes dentro de células rojas o rosadas). (Observar en la figura 1.6)

Tinción para flagelos Los flagelos bacterianos son estructuras de locomoción demasiado pequeñas. El procedimiento de tinción se basa en el empleo de un mordiente (aditivo) y el colorante carbolfucsina para aumentar los diámetros de los flagelos hasta que se tornen visibles con el microscopio óptico como ayudas diagnosticas adicionales los microbiólogos utiliza la cantidad y la disposición de flagelos. (Observar en la figura 1.7)

Anexos

Figura 1.1 (Tinción simple) procedimiento y tinción en el que se observa la bacteria Micrococcus luteus teñida con azul de metileno para destacar el microorganismo completo y ver las formas y las estructuras celulares básicas.

Figura 1.2 (Tinciones diferenciales) observación de la bacteria clostridium perfringens y escherichia E. Colli. Esta técnica sirve para diferenciar microorganismos de manera más explícita.

Figura 1.3 (Tinción de Gram) a) procedimiento b) micrografía de bacterias teñidas con Gram los bacilos y los cocos (de color violeta) son Gram positivas y los vibriones (de color rosado) son Gramnegativos.

Figura 1.4 (Tinción ácido- alcohol resistentes) las bacterias del genero Mycobacterium especie leprae que infectaron este tegido se tiñeron de rojo con una tinción de ácido- alcohol resistencia. Las células que no son ácido – alcohol resistentes se tiñen con el colorante de contraste azul de metileno.

Figura 1.5 (Tinción negativa para cápsulas) la tinción de la cápsula proporciona un fondo que contrasta de modo que las cápsulas de estas bacterias (klebsiella pneumoniae) se vean como áreas claras alrededor de las celulas teñidas.

Figura 1.6 (Tinción para endoesporas) con la tinción para endoesporas schaeffer-fulton las endoesporas se visualizan como ovalos verdes en estas células bastoniformes de bacillus cereus.

Figura 1.7 (Tinción para flajelos) los flajelos aparecen como extenciones ondulantes de los extremos de estas células de la bacteria spirillum volutans, en relación con el cuerpo de la celula los flajelos son mucho mas gruesos que lo normal debido a la acumulacion de capas de colorante para el tratamiento de las muestras con mordiente.

Conclusión

A lo largo de la historia se fueron desarrollando técnicas de tinción por medio de la experimentacion, permitiendo primeramente la observacion, por medio del microscopio, de estructuras celulares lo que llevó a su conocimiento y posteriormente a su clasificación, resolviendo asi interrogantes sobre la etiología microbiana. Actualmente, todos las prácticas realizadas en esta área son de gran importancia, siendo de utilidad el conocer la técnica correcta de tinción para identificar a cada microorganismo responsable de cierta actividad. Tal es la importancia de las técnicas de tinción, que han sido y son utilizadas para la detección de enfermedades infecciosas, lo que ha ayudado a la medicina a la identificación temprana de microorganismos patógenos. Aunado a esto, se han puesto en práctica nuevas técnicas de tinción, teniendo como característica su especificidad a cada tipo de microorganismos, por ejemplo, la tinción de Wright que es utilizada para el diagnóstico de enfermedades muy particulares en el rubro de la parasitología; esta y otras técnicas se están implementando para la detección pronta y precisa de agentes infecciosos. Las tinciones juegan un papel proponderante en la decisión de tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas, por lo cual resulta imperativo practicar la tinción adecuada según el agente infeccioso en sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal, siendo ineludible conocer sus fundamentos y procedimientos para tener un correcta interpretación de los resultados.

Referencias bibliográficas Tortora, G. J., Funke, B. R., y Case, C. L. (2007) Introducción a la Microbiología. Novena Edición. Editorial Panamericana. México.pp.68 -72.