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• Ivan A Juarez Turriza

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CAMPECHE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO-BIOLÓGICAS Licenciatura en Ingeniería Bioquímica Ambiental Bioquímica Reporte 2: Identificación de aminoácidos por cromatografía en papel ALUMNOS: Ingrid Candelaria Catzin Tajer Iván Alexander Juárez Turriza Saida Monserrat Acopa Castro Camily Soledad Cantan Balam Gerson Darío Zapata Méndez Edgar Everardo Salazar Piedras Grado/Grupo: 4 ‘‘A’’ Fecha de entrega del Reporte: 5 de febrero del 2019

Identificación de aminoácidos por cromatografía en papel CONOCIMIENTOS PREVIOS 

Aminoácidos y péptidos



La estructura tridimensional de las proteínas

PROPÓSITOS 

Identificar los aminoácidos con base en la distancia recorrida y a las características físicas de las manchas obtenidas en la cromatografía.

MARCO TEÓRICO Los métodos cromatográficos pueden aplicarse no solamente a la separación, identificación y análisis cuantitativo de mezclas de aminoácidos, sino también de péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, lípidos e hidratos de carbono. Existe un tipo de cromatografía muy importante como es la cromatografía de papel de los aminoácidos. La celulosa de las fibras de papel esta hidratada. A medida que un disolvente asciende por capilaridad por el papel, manteniendo en posición vertical (o descendiente, en la cromatografía descendiente), se producen multitud de distribuciones microscópicas de los aminoácidos en la fase que fluye y la fase estacionaria acuosa, ligada a las fibras de papel.

Al final del proceso, los diferentes aminoácidos han recorrido distancias diferentes desde su origen. El papel se seca, se pulveriza con disolución de ninhidrina y se calienta, con objeto de localizar los aminoácidos.

METODOLOGÍA -Recursos materiales  Material: 

5 tubos capilares

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Papel Whatman de 8 × 16 cm

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

Guantes de Hule

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Atomizador

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Pinza para tubo de ensaye

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Papel estraza



1 frasco de plástico de boca ancha con un diámetro aproximado de 5.5 cm y altura de 13.5 cm

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Hilo de algodón grueso

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Pinzas para tender ropa

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Regla

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1 lápiz

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2 clips inoxidables

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Cubrebocas

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Papel aluminio

 Equipo de laboratorio: 

Ventilador

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Placa de calentamiento

 Reactivos: 

Soluciones de aminoácidos de prueba 0.1 M. el instructor las suministrará en pequeños volúmenes

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Disolventes para la cromatografía: prepare el volumen adecuado para la cámara que se vaya a emplear, de mezcla de butanol – ácido acético glacial – agua en la proporción 4:1:1. (aprox. 30 mL)

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Alfa – naftol al 0.15%. Preparar 100 mL.

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Solución reveladora

TÉCNICA 1. Corte una tira de papel Whatman de 8 × 16 cm. No toque el papel con los dedos, use guantes de hule o corte y manipule sobre otro papel ordinario.

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2. Trace con lápiz una línea, a 2 cm de la base de rectángulo de papel. Sobre la línea marque los puntos, cada 3 cm. Verifique que el sentido de las fibras de papel corresponda al sentido en que va a correr el disolvente.

3. En los puntos marcados, coloque una gota de capilar de cada una de las disoluciones de aminoácidos patrón que supone contiene el problema, según las pruebas anteriores, colocando además una gota capilar de su problema en uno de los puntos centrales de la hoja de papel.

4. Mediante un esquema o en la parte superior de la hoja debe poner el nombre o un numero clave para identificar que aminoácido puso en cada punto y en donde puso el problema. Enrolle la hoja formando un cilindro, deteniendo los extremos con clips inoxidables. La línea donde puso las muestras debe quedar en la cara externa del cilindro y las gotas deben estar perfectamente secas antes de continuar.

5. Introduzca el cilindro en la cámara, previamente preparada saturándola con la mezcla de disolventes, al menos durante 2 horas antes de efectuar el experimento. Tápela herméticamente y espere a que los disolventes asciendan por lo menos a una altura de 13 cm.

6. Saque el cilindro de papel, marque la altura a donde llegaron los disolventes y deje sacar al aire. Extienda la hoja, cuélguela de los extremos y rocíe con la disolución reveladora, sin que ésta escurra por el papel y homogéneamente puede utilizar un rociador comercial.

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7. Deje que seque al aire el exceso de reactivo y luego coloque la hoja de papel sobre una placa caliente recubierta en papel de aluminio u otra tira de papel, hasta que se observen las manchas claramente delineadas. (Figura 1.)

Figura 1. Manchas delineadas de los diferentes aminoácidos

8. Determine los valores de Rf y Rx para todas las manchas que aparecen. Interprete los resultados para confirmar la presencia de los aminoácidos identificados en su mezcla problema.  NOTA: La solución será añadida a la cámara (frasco) desde el día anterior a la práctica, con el fin de se sature y el solvente ascienda más rápido en el papel.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN A pesar de que, en el momento de rociarle la disolución reveladora, la cual fue ácido acético, al cilindro de papel, esta no ayudo mucho en el proceso de calentó y revelado de manchas claramente delineados, porque se volvió a repetir el proceso de rociado, pero esta ves sustituyendo el ácido acético por ninhidrina y dejándolo secar en la intemperie, y no por medio del aire acondicionado, como hicimos nosotros; luego del roció y del secado, se calentó en la placa y si hubo reacción inmediata, el color se notaba en todo el cilindro de papel, incluso algunas partes quemadas. Cabe aclarar, que el proceso repetido con la ninhidrina no afecto en la

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identificación de aminoácidos. Luego de dar una variación en las coloraciones, procedimos a medir del origen hasta donde llego el color de cada aminoácido, incluyendo el problema (Tabla 1.); a pesar de que todos mostraron un color morado o magenta, se logro notar que hay similitud entre la muestra problema y la glicina por su color morado fuerte. AMINOÁCIDO PATRÓN Lisina

Rf 1cm

Triptófano

2.6 cm

Glicina

1.7 cm

Tirosina

1.4 cm

Problema

1cm

Tabla 1. Distancia recorrida de las muestras de aminoácidos empezando desde el origen

Se pudo identificar en el papel cromatográfico que la muestra estándar de glicina es la que más se asemeja a la de la muestra original de la solución problema; logramos observar en el papel cromatográfico varias manchas redondas amarillas a las que se denomina prolina su coloración se debe a que estas no presentan reacción ya que no tienen el grupo amino libre. En general, este informe nos sirvió para discernir sobre este tipo de cromatografía que nos permite identificar aminoácidos y que da origen a una reacción como consecuencia de la interacción entre la ninhidrina y los distintos aminoácidos por la presencia del grupo amino, por lo tanto, presenta un color característico como es el morado o magenta. CONCLUSIONES La técnica resulto ser la esperada, aunque al principio del experimento, luego de sacar el cilindro de papel (papel de Whatman) del cilindro cámara, la cual se encontraba saturada de una mezcla de disolventes y con una espera de al menos media hora (cabe aclarar que la práctica menciona dos horas, pero por falta de tiempo se dejó reposar durante el tiempo ya antes mencionado), este cilindro de papel se dejó secar al aire por un rato, para luego colocarle la solución reveladora, en la cual hubo una confusión en el rocío de ácido acético en el cilindro de papel, el

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cual luego se calentó y no hubo manchas claramente delineadas, dado por esto, se decidió rociarle ninhidrina y luego ponerlo a calentar, permitiendo observar claramente las manchas delineadas. Esta técnica de separación cromatográfica es de las más simples, aunque también de las más didácticas, ya que debemos preparar y cortar el papel, aplicar la muestra y revelar la posición de los aminoácidos. Durante este proceso, la reacción de los aminoácidos con la ninhidrina se debe a la presencia del grupo α–NH2 en los mismos. Cabe hacer una excepción con la prolina, la cual no tiene dicho grupo libre, sino –NH- ya que forma parte del anillo de pirrolidina, y al reaccionar con ninhidrina se forma un color amarillo, dado por esto, la prolina no produce amonio en el momento de su reacción con esta. Las pruebas para identificar aminoácidos, como la cromatografía, se basan en características propias de cada aminoácido, como es su punto isoeléctrico y su Rf. Mediante un buen uso de la técnica de cromatografía, se puede separar una mezcla compleja de aminoácidos. CUESTIONARIO 1. Cuando la mezcla de aminoácidos es muy compleja se emplea el método de “cromatografía de dos dimensiones”. Explique en qué consiste dicho método. La cromatografía en papel de dos dimensiones consiste en desarrollar el cromatograma en un disolvente, girar el papel 90º y desarrollar el cromatograma en un disolvente diferente. Es útil para separar mezclas complejas de compuestos similares. Actualmente, la cromatografía en papel se utiliza poco y ha sido ampliamente reemplazada por la cromatografía en capa fina. No obstante, todavía se utiliza como una poderosa herramienta pedagógica. 2. ¿Cuáles son los aminoácidos más fáciles de identificar? El triptófano y Glicina ¿Por qué́ ? En el momento de la fase estacionaria de la cromatografía en papel fueron los que mostraban con más facilidad se separaba la mezcla homogénea y con mayor rango.

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3. Dibuja la estructura del aminoácido que se identificó.

TRATAMIENTO Y DISPOSICIÓN DE RESIDUOS

Figura 1. Cromatografía R1 = Papel filtro + disolución de aminoácidos. Desechar contenedores de materia inorgánica.

ANEXOS

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Se hizo un corte de una tira de papel Whatman de 8 × 16 cm con el uso de un par de guantes de hule

Se trazo con un lápiz una línea de 2 cm de la base de rectángulo de papel. Sobre la línea marque los puntos cada 3 cm.

En los puntos marcados, se colocó una gota de capilar de cada una de las disoluciones de aminoácidos patrón que supone contiene el problema, se colocó además una gota capilar de su problema en uno de los puntos centrales de la hoja de papel.

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Se enrollo la hoja formando un cilindro, deteniendo los extremos con clips inoxidables; luego se introdujo el cilindro en la cámara, saturándola con la mezcla de disolventes, al durante media hora.

Se extiendo la hoja, se colgó de los extremos y con la ayuda de un atomizador, se rocío con la disolución reveladora (ninhidrina), sin que ésta escurra por el papel.

Se saco el cilindro de papel, se marcó la altura a donde llegaron los disolventes y se dejó sacar al aire.

Se dejo secar al aire el exceso de reactivo y luego se colocó la hoja de papel sobre una placa de calentamiento recubierta en papel de aluminio, hasta que se observaran las manchas claramente delineadas

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BIBLIOGRAFÍA -Albert L. Lehninger. 1995. Bioquímica Lehninger. Ediciones Omega, S.A. Barcelona. Páginas: 89-90-91.

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