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LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA GUÍA DE PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR - AÑO 2018 PARTE I: CLONADO, TRANSFORMACIÓN, PCR, qPCR Problemas de clonado 1) Se desea clonar en el sitio EcoRI del pUC19 un fragmento de ADN de 800 pb cortado con la misma enzima de restricción. Para esto se trata el vector con EcoRI y se realizan las reacciones de ligación correspondientes. Los resultados de las transformaciones se indican a continuación: i- mezcla de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa, vector cortado (100 ng) y el inserto (300 ng): 967 colonias azules y 2 blancas. ii- mezcla de ligación conteniendo buffer, enzima T4 ADN ligasa y sólo vector cortado (100 ng): 962 colonias azules. iii- vector cortado (100 ng): 914 colonias azules. iv- vector sin cortar (2 ng): 1200 colonias azules. v- sin ADN: no se encontraron colonias. En las placas de Petri (todas conteniendo ampicilina, IPTG y X-Gal) se sembraron 100 µL del mL total de células transformadas. a- Indicar qué controles representan los ítems ii-v y qué información se puede obtener de cada uno de ellos. b- Calcular la eficiencia de transformación. c- ¿Por qué se obtuvieron tantas colonias azules en el ítem i? d- Se realiza una minipreparación de plásmidos de una colonia azul y de una blanca obtenidas en la transformación anterior. Los plásmidos son analizados mediante electroforesis en gel de agarosa, obteniéndose el siguiente resultado:

Patrón PM

Col. azul

Col. blanca

450022002000-

- ¿Cómo se explica que la diferencia en la migración de los plásmidos no sea 800 pb? - ¿Cómo haría para estar seguro de que clonó el fragmento de ADN correcto?

2) Usted desea clonar un fragmento de ADN de 800 pb cortado en un extremo con la enzima BamHI y en el otro con BglII. Con tal motivo, realiza una ligación del mismo con una determinada cantidad de vector pUC19 cortado con la enzima BamHI, y transforma células competentes de E. coli con una alícuota de la mezcla de ligación. Al observar las placas de Petri luego de incubarlas una noche a 37°C, Ud. descubre que algo no anduvo bien. Como Ud. no se da por vencido fácilmente, intenta nuevamente el clonado, claro que con algunas modificaciones. Indique cuál, a su juicio, puede haber sido el problema durante el primer intento, si el resultado obtenido fue: a) No se obtuvieron colonias. b) Todas las colonias obtenidas eran azules. c) Todas las colonias obtenidas eran blancas. También eran blancas todas las colonias obtenidas al utilizar para transformar una ligación control en la que el inserto fue omitido. d) Ídem (c), otra alternativa. e) Se obtiene una gran cantidad de colonias blancas; también en el control de transformación al que no se agrega ADN. f) No se obtuvieron colonias. El control de transformación con plásmido no cortado dio una cantidad adecuada de colonias azules.

3) Usted desea clonar un fragmento de 1 kb proveniente de digerir un clon de ADNc con las enzimas SalI y BamHI. Para ello, efectuó reacciones de ligación utilizando el plásmido pBluescript KS+ cortado con las mismas enzimas, seguidas de transformación de una cepa adecuada de E. coli, según se describe: i- la mitad de la reacción de ligación que contiene buffer, enzima T4 ADN ligasa, 100 ng de inserto y 20 ng de plásmido. ii- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa y 20 ng de plásmido. iii- 2 ng de plásmido sin cortar. iv- sin ADN. La mitad de cada transformación fue sembrada en medio LB con ampicilina, X-gal e IPTG. Suponga que obtuvo una eficiencia de transformación de 0,9 106 UFC/g de ADN. a- ¿Qué número de colonias blancas y azules obtendrá en cada placa si el corte con ambas enzimas tuvo una eficiencia del 100 % y sólo un 1 % del vector utilizado en la reacción de ligación se ligó al inserto? b- Qué habría obtenido (no dé números, sólo indique presencia o ausencia de colonias azules o blancas en cada placa) si: b1. La reacción de ligación no funcionó. b2. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pGEX-3X. b3. Las células utilizadas para la transformación habían perdido el F’. b4. Una de las soluciones de transformación estaba contaminada con pUC119. b5. El corte con las enzimas de restricción fue poco eficiente.

4) Para complementar una mutante en el gen birA de E. coli usted diseña una estrategia de clonado en la cual se inserta la región codificante del gen birA en el sitio EcoRI del vector pBluescript SK. Para ello efectúa la reacción de ligación con el vector e inserto digeridos con dicha enzima. A continuación realiza las siguientes transformaciones con células competentes de E. coli: i- la mitad de la siguiente reacción de ligación: buffer, enzima T4 ADN ligasa, 400 ng de inserto y 40 ng del plásmido tratado previamente con la enzima fosfatasa alcalina (4 colonias azules y 136 colonias blancas).

ii- la mitad de una reacción de ligación compuesta por buffer, enzima T4 ADN ligasa y 40 ng de plásmido tratado con fosfatasa alcalina (5 colonias azules). iii- ídem al anterior pero sin el tratamiento con fosfatasa alcalina (48 colonias azules). iv- 10 ng de plásmido sin cortar (330 colonias azules). v- sin ADN (no se obtienen colonias). a- Explique qué indican los resultados y para qué se hace cada una de las placas. b- Calcule la eficiencia de transformación. c- Se eligieron 10 colonias blancas y se hizo minipreparación para obtener plásmidos. ¿Qué pasos le faltaría seguir para corroborar que las colonias seleccionadas respondan a la inducción con IPTG?

5) El siguiente fragmento de 2000 pb codifica para un factor de transcripción humano. Se muestra el mapa de restricción del mismo (descartar la presencia de otros sitios). /·············2000pb················/ EcoRI SmaI NcoI EcoRI

ADN

PROT.

200

1500

300

H2 N

COOH

66kDa

Se desea obtener la proteína recombinante en E. coli como parte de un trabajo práctico. Los alumnos deducen que al cortar el fragmento con EcoRI y ligarlo en el sitio correspondiente del vector pUC9, previamente tratado con fosfatasa alcalina, la proteína queda en fase. Realizan entonces los siguientes pasos: Paso 1: Transformación de E. coli i- Mezcla de ligación: vector cortado + inserto, 200 colonias blancas y 40 azules. ii- Mezcla de ligación: vector cortado, 50 colonias azules. iii- sin ADN, 0 colonias. Paso 2: Chequeo del plásmido. Se tomaron dos colonias blancas (1 y 2) y una azul, y se realizaron minipreparaciones de plásmidos. Los vectores obtenidos fueron tratados con EcoRI, y visualizados en un gel de agarosa: Colonia: Azul

1

2

PM - 3000 pb -2000 pb

Paso 3: Inducción de la proteína recombinante. Se realiza el experimento de manera similar al TP, obteniéndose el siguiente esquema de Western blot.

IPTG:

/······Azul·····/·······1·······/······2········/ + + +

PM

-100 kDa

-70 kDa -50 kDa

Responder: a- ¿Qué control faltó realizar en el paso 1 y qué función cumple? ¿Hubiese sido de valor teniendo en cuenta los resultados obtenidos? b- En el Western blot se observó una banda presente en todas las calles. ¿Cómo podría explicar estos resultados? c- ¿Cómo explica las diferencias obtenidas entre las colonias 1 y 2? d- ¿Qué modificación haría en el paso 2 para poder diferenciar entre las colonias 1 y 2? Esquematice un gel de agarosa ilustrando los posibles resultados de su experimento.

Problemas de clonado en fase 1) Se desea expresar un gen de superóxido dismutasa (SOD) de plantas para aislar suficiente cantidad de proteína, con el objeto de obtener anticuerpos mediante la inmunización de conejos. Se dispone de un plásmido que contiene la secuencia de ~1 kb de dicho gen bajo el control de un promotor de plantas (CaMV35S), insertada en los sitios EcoRI/PstI. Ud. desea expresar el gen bajo el control de un promotor bacteriano, como una proteína de fusión a fin de poder purificarla. A continuación se dan las secuencias de las regiones 5' y 3' del gen sod en donde están señalados los sitios de restricción y se encuentran subrayados los codones de iniciación y terminación de la traducción. El número entre paréntesis indica la posición de la base adyacente.

1kbp Eco RI

5' 35SCaMV 3'

Sma I Eco RI Pst I

EcoRI 5' AAA CCA GAT CGT GGG AAT TCA ATG ACT ATT (30) ....................

SmaI (900) CCC GGG CTC CTG CTT CCG CGT GAA ATC CTG ATC CAG AAA GAT

CTG AAT TCG TAA CTG CAG CCC 3' EcoRI PstI

a- En el laboratorio se dispone de vectores del tipo pGEX. Diseñe una estrategia de clonado para expresar dicho gen en Escherichia coli y poder purificar la proteína de fusión. b- Se realiza la transformación con la mezcla de ligación conteniendo pGEX más inserto, digeridos con las enzimas de restricción que Ud. eligió. ¿De qué manera puede comprobar si las colonias obtenidas en la transformación tienen el plásmido con inserto? Indique cuáles de las construcciones obtenidas permitirán expresar la SOD. Exprese los tamaños de los fragmentos de restricción con números aproximados.

2) Usted desea expresar el gen de la catalasa 2 de cebada como producto de fusión con polihistidina. Para ello dispone de un ADNc de 1800 pb cuyos extremos presentan las siguientes secuencias: 5' GGCTTAGATGGATCCCTGCAAGTTCTGC--------------- 1800 nt ------------------------------AGGTCGACGGTAACCGCAGCGCATATAAAAAA 3'

Los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación, respectivamente. a- Diseñe una estrategia de clonado en un vector adecuado, sin emplear PCR. b- ¿Qué controles debe efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado?

3) Usted desea producir la ferredoxina plastídica madura utilizando un vector de expresión que permita su purificación en una única etapa por cromatografía de afinidad. En el laboratorio donde Ud. trabaja se encuentran disponibles resinas de glutatión-agarosa y de Ni2+-Sepharosa. El ADNc que Ud. posee está clonado en el vector pUC9 en el sitio único EcoRI. El fragmento, de 542 pb en total, incluye una secuencia 5´ no codificante, un marco abierto de lectura y un fragmento 3´ no codificante. Las secuencias relevantes se muestran a continuación:

1

11

21

31

41

51

61

5´···GAATTCATAT TGTTatggtt gggatccagt tcaaacctaa gtttagcctg cagcgcccaC TACTG 71

81

91

101

111

TGTCC CGGGTCGTAG GATCCTGTAG TCGTAGCGAG CTCCCATTGG CTACG-511

521

531

541

------389 nt------ GTGACT GATGACTAGT CTAAATGTAC TGAATTGAAT TC···3'

Los tripletes subrayados indican los codones de iniciación y terminación respectivamente, y el fragmento en minúsculas corresponde al péptido tránsito. a- Diseñe una estrategia de clonado utilizando los vectores que usted conoce. No utilice adaptadores ni PCR en la estrategia de clonado. b- ¿Qué controles debería efectuar sobre el fragmento antes de proceder al clonado? c- ¿Qué controles debería efectuar para verificar que su clonado fue realizado correctamente para obtener el producto deseado?

4) Se desea expresar el gen de ferredoxina de espinaca como producto de fusión con un hexámero de histidinas. Se dispone de un vector que contiene el ADNc de ~500 pb y de los vectores de la serie pQE30/31/32. Los sitios de corte para las enzimas de restricción presentes en el ADN que codifica para la ferredoxina se muestran resaltados y los sitios de iniciación y terminación de la traducción se encuentran subrayados. Además, el ADNc posee sitios internos para las enzimas SalI, PstI y KpnI. Considere que no existen otros sitios de corte. SacI

5' ......AGT CGA GCT CAG GCC ATG AAA GGG ........

SmaI

HindIII

.........ATG CCC GGG GGT ATC GAG TAA AGC AAG CTT CCC... 3' a- Realice el clonado en el vector adecuado para obtener la proteína unida a una cola de histidinas, y esquematice la zona de unión. b- ¿Qué características del vector pQE resultan interesantes para la expresión de proteínas recombinantes?

5) La gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPN) es una enzima que se encuentra en tejidos de plantas superiores y cuya secuencia se conoce en maíz y tabaco, entre otras plantas. Para investigar la presencia de GAPN en trigo, se realizó un Southern blot con ADN genómico de trigo usando como sonda un fragmento del gen gapN de maíz que contiene 200 nt de la porción 5'. a- El Southern blot se realizó con ADN proveniente de hojas de trigo, digerido con EcoRI, BamHI y HindIII, y la hibridización se realizó en condiciones tales que los genes con similitud de secuencia pudieran ser detectados. La foto muestra el resultado obtenido en el Southern blot. ¿Qué conclusión puede sacar del mismo?

b- Usando oligonucleótidos degenerados de una región altamente conservada de la enzima de maíz se obtuvo por PCR un fragmento probable de gapN de trigo, con el cual se aisló el clon conteniendo el ADNc de longitud completa y se secuenció. A continuación se muestra la secuencia de las regiones 5’ y 3’ del ADNc gapN de trigo; donde se encuentran resaltados los sitios de inicio y terminación de la traducción y las posiciones de los sitios de restricción para las enzimas que se disponen en el laboratorio. 5’gcaatcccagatctttatggcggggacgggggtgttcgcggacgtgctgga (1421 nt) taaacctcccatctccgtcctacaccatgggctgagcggatcccgattcacagccgtaatc 3’ BamHI: G´GATCC BglII: A´GATCT EcoRI: G´AATTC HindIII: A´AGCTT SalI: G' TCGAC

(1459) (9) (no posee) (no posee) (300)

Proponga una estrategia para expresar la GAPN de trigo en el vector pET28 (a, b o c) con una cola de histidina amino terminal, realizando el clonado sólo con las enzimas de restricción que están disponibles (sin usar PCR, ni linkers). c- ¿Cómo proseguiría el análisis de las bacterias transformadas con el plásmido diseñado para asegurarse de que las mismas expresen GAPN?

Problemas de PCR 1) En un tubo adecuado para utilizar en un termociclador, usted posee ADN genómico que contiene entre otras la siguiente secuencia (se expresa según la convención 5'-3’): 5730

ACGTTTGCACGGATCCGATT-------345 nt----------AAACAGTACG TGCAAACGTGCCTAGGCTAA-----------------------TTTGTCATGC

6105

TAGTCACAC--------234 nt----------------------TAGCCCACACA ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGT

6359

TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 nt---------ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-----------------------

6821

AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTA-----70 nt-------CTG TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCAT-----------------GAC

6930

CATGCATGCACCAATGGCCA----------------504 nt-------CCGGTCAC GTACGTACGTGGTTACCGGT-----------------------------GGCCAGTG

7462

ACATGTGTCGCACGCACTACTA TGTACACAGCGTGCGTGATGAT

El ADN se encuentra en una concentración de 0,1 ng/mL. Este tubo contiene además un buffer adecuado para la Taq polimerasa, 2 mM Mg2+, dNTPs (400 µM c/u), 2U de Taq polimerasa y los oligonucleótidos que se encuentran subrayados en la secuencia. Usted realiza la amplificación con un programa que desnaturaliza a 94 °C por 1 minuto, anilla a 55 °C por 1 minuto y medio, y extiende a 72 °C por 2 minutos. a- ¿Cuáles son los productos que obtendrá luego de 30 ciclos con este programa? b- ¿Qué sucederá si cambia la temperatura de desnaturalización a 97 °C? c- ¿Qué obtendrá si el tiempo de desnaturalización se extiende a 2 minutos? d- ¿Qué productos y de qué tamaños obtendrá si la temperatura de anillado se eleva en 5 °C? ¿Y si se eleva en 15 °C? e- Ídem d si la temperatura se disminuye en 8 °C. f- ¿Qué productos y de qué tamaño obtendrá si la elongación se extiende 1 min adicional? g- ¿Qué productos obtendrá si la temperatura de elongación se aumenta en 5 °C? h- ¿Qué condiciones debería utilizar si quisiera obtener todos los productos posibles? En todos los casos indique los productos, sus tamaños y con qué oligonucleótidos se originarían.

2) La siguiente secuencia pertenece al gen citO, el cual es un regulador transcripcional que controla la expresión de los genes del metabolismo de citrato en Enterococcus faecalis. Se desea amplificar la secuencia completa del gen, para ello: a- Diseñe los cebadores necesarios para poder amplificar el gen completo. b- Indique el protocolo de amplificación que va a utilizar y el tamaño del producto amplificado. c- Mencione los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción. 5’AGGAAGAATGTAACAGTGTTTTCAGAAAATGAGGACAAATTCATATTTATAGGAGAAGAACATGAATCCAAC GGTTGAAGCAGTAAAACGGAACTTAGATTTAACCAGCAGTAAACCTCTAAAAATTTGTACCTACGAAGCCTTTA AAAAAACCATTATTTTAGGGGATATTCCTGCGGGTGAACGGATTAACGAAAAAGAATTTTCCGAGCAATTAAAC ATTAGTCGGACGCCCATTCGCTTTGCTTTACAAGAATTGGTCAAAGAACAATTGGTGGAACATATACCTATGGT GGGTATCGTGGTTAAAGGGATTAGTATGAAAGATGCTTATGAAATTTATGATATTCGTAAATCTTTGGACACTT TAGCAACCATTAAAGCCATGGAACTCATGACACCAGAAGATTTTGATGAATTGGAAGCCTTACTTCTCGAAGGA GAACAATACAATAAAAATAACCAAGTAGATGACTTACTACAGAACTTTTCAGATTTTAATTCCTTTATTTATAC TAAGAGTCAGATGCTACGTTTAAAAAAAATTGTGACTGATCTCCATGCTTACTTAATCTATTTCAGAGATATTG CGATTCGTGCCTCAGAACGTCGTAGTATTGCCCTAGAAGAACATTGGTTAATTTTCCGCGGAATGAAAACAAAG AATATTGACCAGATCACACTTTTAACCCATGAACATCTAAATCGTTCGCTTCAATTTATTTTGAAAGAAATGGA ACGTCGGCAAATTGAATAAGAGAAAATTCTACTAGAAATGCAAAAAAGTACAAGAAGAAATCAT 3’

3) La siguiente secuencia obtenida por RT-PCR, corresponde a la región 5´no codificante del ADNc del virus de la hepatitis C (VHC). Se desea desarrollar un protocolo de amplificación por PCR de dicha secuencia que será utilizado para el diagnóstico de infección por VHC. 5´...GTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTAT.....180.......GC CTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTCGTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCA..3´

a- Diseñe un par de cebadores adecuados (n  22) y un protocolo de PCR que permitan la amplificación de la región de interés. Marque claramente en qué región hibridan los oligonucleótidos diseñados y su TM. b- Indique el tamaño del producto de amplificación obtenido y qué sistema utilizaría para visualizarlo. c- ¿Qué control diseñaría para evaluar la presencia de sustancias inhibitorias en la muestra de un paciente a procesar? d- Realice un esquema de las bandas que visualizaría en un gel (de las características especificadas en el ítem b) en el que se corrieron las siguientes muestras: calle 1: control negativo. calle 2: control positivo. calle 3: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con EDTA). calle 4: muestra de un paciente positivo para VHC (obtenida con heparina). calle 5: marcador de tamaño molecular de tipo Ladder 100 pb.

4) La siguiente es la secuencia de un ARN mensajero que codifica para una proteína de Arabidopsis thaliana. Usted obtuvo la secuencia a partir de una base de datos pero no cuenta con el clon que la contiene (ni lo puede obtener) y le interesa hacer estudios de tipo Northern blot. La idea es construir una sonda a partir de ARN mensajero total (ARNm) de flor, donde usted sabe que este gen es expresado en niveles elevados y de donde fue aislada esta secuencia inicialmente. a- Diseñe un juego de oligonucleótidos y un protocolo que le permita construir una sonda utilizando la reacción en cadena de la polimerasa para estudiar la expresión del gen. b- Indique las condiciones (programa de la PCR) en las cuales realizará la amplificación. c- Se ha encontrado una mutante de esta proteína en donde el codón GCG que está subrayado se convierte en ACA. ¿Qué oligonucleótidos diseñaría si Ud. quisiera diferenciar entre la secuencia normal y la mutada por PCR? Escriba la secuencia en sentido 5’3’. 1 5’-TAAGACCGAGAGTTAAGGTCAGCTGTTGCGAAGTATACGGTTATTTAGGTAGTCTCAAG 60 ATTGCTCGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAAT 119 GGCCATACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACAGCAAGAG 178 TTCATGAAAAAGAGAAAGAAAGGGAAGTTACCCAGGGAGAAGCTCGGTCAACAATTGCT 237 CGACTGGTGGCTCCGTCAACAATTGCTCGACTGGTGGACCAGGCATTACAAATGGCCAT 296 ACCCTTCGGAGGCTCAGAAGCTGGCACTCTCCGAGTCGACAGGACTTGACCAGAAACAG 355 ATAAACAACTGGTTCATTAACCAACGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

En todos los casos indique en la secuencia la región donde hibridarían sus oligonucleótidos.

5) Con el objetivo de investigar la relación antagónica entre la superóxido dismutasa mitocondrial humana (Mn-SOD) y el TNF (tumor necrosis factor) se propone generar una sonda específica que permita su detección en bibliotecas diferenciales. La síntesis de la sonda requiere de una amplificación inicial in vitro, aislamiento y purificación del amplificado y una posterior marca radioactiva utilizando la enzima T4 polinucleótido quinasa. Sobre la secuencia del ADNc que se muestra más abajo:

a- Diseñe cebadores que permitan su amplificación in vitro utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Indique (subraye) la región de hibridación de los cebadores diseñados. b- Diseñe un protocolo para su amplificación (reactivos, tiempos y temperaturas) y calcule el tamaño del producto amplificado. c- Describa cómo procedería para su aislamiento y qué reactivos utiliza para marcar radiactivamente el fragmento. ATGGCTTTCG TCGAAGGAGA AACAAGCTGA ACCTATTGCG AACCATGCGC CTGGAAAAGG GCTGCGGGCG GCGCTGAAGA CTTCTGGGCT GCTTACCTCA

AACTTCCCGC CGCTCGAGTA TTGCGGGCAC CCGGTGCCGT AGTTCTGGGA CGCTGGTGGA CGGGCCAGTT TCACCAAGAC GCGACGTCTG CGAACTTCCT

CCTTCCCTAT TCACCACGAC CGAATGGGAA GGCGCAATCG AATGATGGGG AAGCTTCGGT CGGCTCGGGC CGAAAACGGC GGAGCACAGC CGACAAGCTG

GCCCATGATG CTGCACCACA GGCAAGTCGG GGGATCTTCA CCGGGCGAAG TCGGTCGCGA TGGGCCTGGC GTCAATCCGC TATTACATCG GTGAACTGGG

CCCTGGCTTC AGGCCTATGT TCGAAGAGAT ACAATGCCTC ACAAGAAGAT AGTTCAAGGA TGGTGAAAGA TCTGCTTCGG ACTTCCGCAA AAAACGTCGC

GCTGGGCATG CGACAACGGC CGTCAAGGGC GCAGCACTGG GCCGGGCGCG GGATTTCGCC CAGCGATGGC GCAGACCGCG CAAGCGCCCG CTCGCGGATG TGA

6) Para la detección del virus del Herpes simplex (HSV) en su laboratorio han diseñado un par de cebadores que permiten amplificar un fragmento del gen de la glicoproteína D. A continuación se muestran subrayadas las regiones de anillado de los oligonucleótidos sobre la secuencia del gen. GTAGGAATCGCAGCGCCAGCGGTTGCAAGGTAAGGCCCCGGCGCGCTCCTTCCTCCTTCTCTGCTGGTCTTTC TTGGCAGAACACAGGTCACACACACTCTGGATCCCGGGGAAACTGAGTCAGGAGGGATGCAGGGCGGATGGCT TAGTTCTGGACTATGATAGCTTTGTACCGAGTTCTAGCCAGATAGAAGGTTACCGGGAGCTGGGGAGCGTTGG ATTTGCTGCTGGGCTGTGCCGGTGCCCAGAAGGCAGGACCTTGCAGAACCAGCCAGGTCCCTGGGAGACTGTC AGACCCACCAACCTGGTGGCATTCGCAGAGCTGAGATGCATTGGAAATTGCCTTGGGCACATCCCCAAAGATC AGGATGTCCCACCCCAGTCTGAAGGAGATAAAGTTGGGGGTAGGAGAGACGCAGATGCAAGTGATCAGTCTCA GTCCCAGACATTGCCTTGCTCTGCGGGTAGGAATTCAGGATTCATTTTCCAGGGAAGTTCCTGACCTCTGAAT GAGAGGGGCTGTGTAAGGCCAATGCCTGGGAGGAAGGCAAGGATGAGTAGAGGTGGGGGGAAACAAGTGTCAG GAAGACTCAAAATCTTCCAGAGAAATTGTGCAGGGTCTTACAGATCTGTCCTCAAAGCCATGCAAATTGCCTT CTTTGCAATGCATACAATGAGGTGTCTCTGGGGGTCAGAACTGGTTATTAGGGAACTTCTAGCCAGGACTGCT AAATACGCGCTGTTGGCCCACCAGGCTCACCTATAGCCTTCCTTCAGTCTGG

a- Escriba los 2 oligonucleótidos en la forma correcta como para poder encargarlos al proveedor. Calcule la TM de ambos y el tamaño del producto amplificado. b- Para la correcta optimización de la detección del virus usted desea conocer la sensibilidad de la técnica de PCR puesta a punto. ¿De qué manera propone estudiarla? c- Una vez que finalizó la puesta a punto de la reacción de PCR, ¿qué controles cree conveniente realizar para una detección confiable del virus en muestras biológicas humanas? ¿Qué pone en evidencia con cada uno de ellos? d- En una oportunidad descubre que aparece una banda del tamaño esperado en el control negativo de la reacción de PCR, ¿cómo procedería a detectar el origen de esa contaminación? ¿Qué medidas cree conveniente tomar para evitarla?

7) Usted desea comprobar si el gen biot se expresa en tejido hepático sometido a una droga mutagénica. Utilizando un programa de computación usted realizó el diseño de cebadores para

amplificar un fragmento del ADNc de longitud entre 100 y 300 pb. La siguiente secuencia de ADN genómico corresponde a una parte del gen biot que incluye un intrón (indicado en letra cursiva, de 282 pb) que abarca desde el nucleótido 2779 al 3061. Los cebadores diseñados por el programa se encuentran subrayados en la secuencia y numerados del 1 al 6 entre paréntesis arriba de la secuencia doble hebra del ADN. 2730 (1) (2) 2788 5´-ACGTTTGCACGGATCCGATTAAACAGTACGAGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCAT 3´-TGCAAACGTGCCTAGGCTAATTTGTCATGCTCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA 2797 3032 3045 TAGTCACAC--------234 pb---------------------TAGCCCACACATAG ATCAGTGTG------------------------------------ATCGGGTGTGTATC (3) 3075 3507 TGCTGCACTCCCGGGATATATTGACACTGC-------432 pb------------AGAT ACGACGTGAGGGCCCTATATAACTGTGACG-------------------------TCTA (4) 3571 AACGTTGACCGTACGGTACCTTGGAACCCATGCGTACTGTGGGCGGCTCTCAGATCATGCA TTGCAACTGGCATGCCATGGAACCTTGGGTACGCATGACACCCGCCGAGAGTCTAGTACGT (5) 3591 (6) CATGCATGCACCAATGACCA----------------204 pb-------CCGGTCACCAT GTACGTACGTGGTTACTGGT-----------------------------GGCCAGTGGTA ACACGTGTCGCACGCACTACTA-3´ TGTGCACAGCGTGCGTGATGAT-5´

a- ¿Qué material de partida utilizaría para realizar el análisis de la expresión? b- ¿Qué método utilizaría para medir la expresión del gen biot? Explique y justifique la metodología. c- ¿Qué controles son necesarios para la interpretación de los resultados de la expresión del gen biot? d- Escriba las secuencias de todos los oligonucleótidos y calcule las TM de los mismos. e- ¿Qué par de cebadores elegiría y cuáles no? Considere todos los pares de cebadores posibles y justifique su elección o no en cada caso. f- Calcule el tamaño del fragmento amplificado con el par de cebadores elegidos y diseñe un programa de PCR adecuado para llevar a cabo la reacción. g- Si su muestra estuviera contaminada con ADN genómico, ¿los cebadores seleccionados le servirían para distinguir esta contaminación? Justifique. h- Proponga la amplificación de un producto que distinga tal situación.

Problemas de clonado en fase empleando PCR 1) La siguiente secuencia corresponde a una parte de la región codificante de una proteína involucrada en la regulación del desarrollo en vegetales. Con el objetivo de hacer estudios funcionales se desea clonar en el vector pGEX-3X la zona comprendida entre los aminoácidos 120 y 450 aproximadamente (nucleótidos 300 a 1350 aproximadamente). Por diversos motivos (secuenciación, clonado de otra regiones, etc.) en su laboratorio se encuentran disponibles los oligonucleótidos que se enumeran más abajo (éstos han sido diseñados con un sitio de restricción, adecuado para el clonado, agregado en el extremo 5´, el cual se muestra subrayado y es en todos los casos el mismo). a- ¿Podría usar algún par de estos oligos para amplificar la región deseada? ¿Cuáles? b- En caso afirmativo, ¿qué tamaño de producto se obtendría? c- ¿Qué protocolo diseñaría para esta reacción de PCR? Indique tiempos y temperatura para cada ciclo. Considere el cambio en TM cuando se comienza a amplificar el sitio de restricción agregado. d- ¿Qué función cumple el MgCl2 en la reacción de PCR? ¿Qué efecto causa su ausencia? ¿Y su exceso? 290

5’ AGTGGTCACATGGGCGGCTCTCAGATCATTCGTAAAGCTCCTGTAGCAGAGA---3’ TCACCAGTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTAAGCATTTCGAGGACATCGTCTCT----

---386 nt----AGAGTTCGTCGTGAGATTACTCGCATGTCCGACAGGGG---533 nt----------------TCTCAAGCAGCACTCTAATGAGCGTACAGGCTGTCCCC------------TTCGATCTAACACTCACGTCTTCACAGTCAGGTCTCGGGAACACTAGAGAT 3’ AAGCTAGATTGTGAGTGCAGAAGTGTCAGTCCAGAGCCCTTGTGATCTCTA 5’

Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo Oligo

1 2 3 4 5 6 7 8

5´ GAATTCACATGCGAGTAATCTCACGA 3' 5’ GAATTCAAGTGCAGAGTCAATGATC 3' 5’ GAATTCGATTACTCGCATGTCCG 3’ 5’ GAATTCGGCTCTCAGATCATTCGT 3’ 5’ GAATTCGGAGCTTTACGAATGA 3' 5’ GAATTCCACAGTCAGGTCTCGGGAA 3’ 5’GAATTCAGACCTGACTGTGAAGA 3' 5’ GAATTCTGTACCCGCCGAGAGTCTAGTA 3’

2) Usted desea amplificar la región codificante de la siguiente secuencia para subclonarla luego en un vector de expresión. Diseñe los oligonucleótidos (y escriba la secuencia de los mismos) para realizar una PCR que permita introducir un sitio para el clonado del fragmento en el plásmido pGEX3X.

Met CAATCTACACATCTTTTATTCAG ATG GAT TTT CAT GGA TTT GCC TCG GTG GAA CAT GCA CTG GAA CTA CGC CTT AGT ACA ACA TCA TCG GTG GCC GAA AAC ACA ACG AAT CCC ATC AAG AAG CCT AGC CCG AGT TCT GAT CAT TGT CTT GAA CCA TCT CTA ACT TTG GCT CTT TCT GGT GAT TCA TGC GGT GGT TCG TCG TTC TCT ATC GCT AGT GCG AAG AGG GAA AGA GAG GTT CCG AGT GAA GAA TCG GAG AGA GGA GGA GAG AAC ACT AGT GGT GAA GAA GAT GAA GAT GGT GGT GTG AAT GGT AAG AAG AAA CTC AGG TTA ACT AAA GCT CAA TCT GGA CTA TTA GAG GAA GCC TTC AAA CTT CAC ACA ACT TTA AAC CCT AAA CAA AAG CAA GAG CTT GCA GCT TGT TGA TAATTGATTTTATATGTGGATTATGTTGCATAAAATTTAAATCACTCAATG TGCACAGCCCCACCCTTTTTTCAGAGTCATGGGCTTATCTAGTGGTGGAAGAAATAATG

3) Usted desea amplificar por PCR un gen bacteriano cuya secuencia se muestra a continuación (se subrayan los sitios de inicio y terminación de la traducción). HindIII 5’ GGT CCC AAG CGA ATG TTC GGT CAG GAA CTG - 582 nt - ACA TAA AAG CTT ATC TTC AGC TGC ATT 3’

Se debe obtener la proteína con todos los aminoácidos, y se la quiere purificar introduciendo una cola de histidinas amino terminal, para lo cual se realizará el clonado en el vector pET-28. En el laboratorio se dispone sólo de las enzimas HindIII, BamHI y EcoRI. Los sitios de restricción para estas enzimas no se encuentran en la secuencia codificante. a- Diseñe los oligonucleótidos que usará, introduciendo sitios de restricción para realizar el clonado en el vector pET28, teniendo en cuenta que tengan temperaturas de anillado similares. b- Especifique cómo se induce la expresión, cuántos aminoácidos tendrá la proteína y cómo puede purificarla. c- ¿Cómo puede eliminar la cola de histidina una vez purificada la proteína?

4) En su laboratorio desean clonar la enzima beta-lactamasa de Acinetobacter baumannii como proteína recombinante en cepas de E. coli. La región codificante se encuentra detallada a continuación (los codones de inicio y terminación están subrayados, en minúscula se encuentra señalado el sitio de corte de la enzima BamHI, la secuencia no cuenta con ningún otro sitio de corte). GCGTGCTTAGGCAGGGCTAGATATTTCTTATTCGAAATTCAAGATGAAGCATTCTTCAGGACCAAAG AGGggatccTCATCAGCAAAACGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGCTTCTTTACTCGCCTTTATCGGC CCTCACTCAAGGATGTATTGTGGTTATGCGTTATATTCGCCTGTGTATTATCTCCCTGTTTCCCACC CTGCCGCTG---------------------------------100pb-------------------GCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTTCCCAGCCAGCGTCTTCGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCT GCTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTTCTCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGG ATTATCGTCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGA ATTCCAAAG

Reactivos y materiales con los que cuenta en su laboratorio: - Kit de pGEM-T Easy - E. coli JM109 (endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F' traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15] hsdR17(rK-mK+) - E. coli BL21 (DE3) pLysS (F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)) - Enzimas de restricción: EcoRI, BamHI - Reactivos para PCR: Taq polimerasa, dNTPs, MgCl2, etc. - Cebadores que hibridan en las regiones resaltadas con negrita en la secuencia del gen. - Vectores de la serie pET-28. a- Primero realiza una amplificación de la región codificante utilizando los cebadores indicados en la secuencia. a1- ¿Cuál es el tamaño del producto amplificado? a2- ¿Qué vector (de los que dispone) utilizaría para clonar el fragmento amplificado por PCR? Justifique. A continuación incuba vector e inserto en una mezcla de ligación, transforma una cepa de E. coli y siembra sobre placas de LB-agar suplementadas con Amp e IPTG. Como resultado al día siguiente observa que sólo hay colonias blancas en las placas (inclusive en el control positivo en el que transformó las células con plásmido cerrado). No hubo desarrollo bacteriano en el control negativo. a3- ¿Qué cepa de E. coli (de las que dispone) usó para este propósito? Justifique. a4- ¿A qué se puede deber que no haya al menos algunas colonias azules? b- Posteriormente, una vez solucionado el inconveniente de la transformación, procede al subclonado del fragmento de interés en otro vector, liberándolo con la enzima EcoRI. b1- ¿En qué vector de los disponibles lo clonaría para expresar la beta-lactamasa? b2- ¿Qué cepa de E. coli usaría para la inducción de la expresión? Cuando realiza la transformación de esta cepa con el vector de expresión conteniendo el inserto obtiene numerosas colonias blancas en placas de LB-agar. Toma algunas de éstas, las inocula en medio fresco e induce la expresión con un inductor apropiado. Al chequear en gel de poliacrilamida el resultado de la expresión observa que en algunos casos no se logró la sobreexpresión de la proteína. b3- ¿A qué puede deberse esta falla? Explique cómo debería resolverla.

5) En el laboratorio donde Ud. trabaja se plantea estudiar la expresión de la proteína pilina de Pseudomonas aeruginosa (codificada por el gen pilA) durante el proceso de infección de células humanas. Para ello Ud. debe obtener anticuerpos específicos contra dicha proteína mediante sobreexpresión del gen pilA en células de E. coli, purificación de la proteína recombinante a través de un método cromatográfico y posterior inoculación en conejo. Diseñe una estrategia de clonado que le permita llevar adelante este objetivo, teniendo en cuenta que las pilinas son normalmente sintetizadas como precursores y posteriormente procesadas en su extremo amino-terminal por endopeptidasas que remueven el péptido señal produciendo la proteína madura. A continuación se muestra la secuencia del gen pilA de P. aeruginosa, en la cual se encuentra subrayado el único sitio de restricción que posee (correspondiente a la enzima NheI).

ATGAAGTCGATGCGTCATCTCAACAAGCGTGTCCAGAAGGGTTTCACGCTGATCGAACTGATGATCG TGGTCGCGATCGTCGGTATTCTGGCTGCGATTGCCATTCCGGCCTATCAGGACTACACGGTTCGTGC ACGCGTGACGGAAGGTCTGTCGCTGGCTGCGCAAGCCAAGGCGCTGGTGTCGGAAAACGCTGCCAAT GCACAGTCTGACCTGTCGGTGGGTTCGTCGGTGTTCACGCCCACCAAGAACGTTGCCAACTTGACGA TTGCTGGTACGGGTACTGTTCCGGGTCAGATCACCGTCACCTATACGACGGCAGCTGGCGGCGGCAC GCTGGCTCTGGTTCCGACTGCGGCTGGTACTGCACTGCCGGTTAGCTCGGCACCGTCGGGCCCGATC ATGTGGACCTGCTACGCTCAGAATAAGGCTCAGGCTGCTAGCAGCGTTGCTCCGAGCGGTACGATGT CGCTGGCAGCGAAGTATGTTCAGCAGAATGTCGCTAA

6) La siguiente es la secuencia del ADNc que codifica para una proteína que actúa como factor de transcripción en plantas. Se encuentran subrayados los codones de iniciación y terminación de la traducción. a- Diseñe un par de oligonucleótidos que le permitan amplificar la secuencia codificante completa para clonarla y expresarla en el vector pGEX-3X en los sitios BamHI y EcoRI. b- Indique en qué región de la secuencia hibridan los oligonucleótidos diseñados y el tamaño que tendrá el fragmento amplificado. c- Indique las condiciones experimentales en las cuales va a hacer funcionar el termociclador. 1 5’-TGTAATATTT 61 ACATAAAGGC 121 TCCACTTCAT 181 AGTTTGAGCT 241 TGGAACGACC 301 GTGAACCGTT 361 AGCACGGTTT 421 GACACAGACA 481 AGAAAGAAAC 541 CACAACACTC 601 AGACAAGTGG

GTGGGGTAAA ATGATTGAAC AGTCACAACT TCCCTCTCCT CTATTTTCAC TACCTTCTGT CTAGCGTCAG GAGCTTGTTC TTAGACTCTC TTAACCCCAA AGGTGTGGTT

AGCCATGATT TCTCCACTCC AGAGATGACG CTCCTCTTCT TTCTTCAGGT GGTTGATTGC TGGAAAGCGC CAGAGGCATC CAAAGATCAG GCAAAAGTTG CCAGAACAGA

CAGATAATTG TTTCTTTATA GTTCAAAAGG CCTTCCAGCC GAAGCTGGAT GAAGAGGAAG AGCGAGAGGG ATCAGCGACG TCAATTGTCC GCACTGGCGA CGGAGGAAAA

GGGCTTGCTG ATGGGTACCA ATCCCTTCCA CACGCACTTC AAGATTTGGG CTTGAGTCTA ACAACCCTCA GAAACCCTCT CATTCCTCCG CGGAATCGAT CAGGTGTTTC ATCTCCAAAC AAACCAATGG AGAAGAAAAC AAGAAGATGC TGAAACCTCT TGGAAGAGAG CTTCAAAGAA AACAGCTGGG TCTTCGAGCG AAAAAAAA-3’

Problemas de real time PCR (Cuantificación absoluta) 1) En un estudio de cuantificación de carga viral de ADN de un virus por real-time PCR, se preparó una curva estándar usando el plásmido pV48 que contiene el genoma del virus clonado en el vector pGEM-T. La concentración del plásmido fue determinada espectrofotométricamente y expresada en Nº de copias/mL. Se prepararon diluciones seriadas desde 1 x 1011 a 1 x 104 copias/mL. Se realizó la qPCR de cada muestra por triplicado obteniendo los Ct promedio correspondientes (Tabla) para generar la curva estándar. Mediante una regresión lineal de la misma, se obtuvo la ecuación a partir de la cual se pueden cuantificar muestras desconocidas (Figura). Se corrieron dos muestras incógnitas en la misma placa y se obtuvieron los Ct (Tabla). a) Usando los datos que surgen de la curva estándar, ¿cuál es el Nº de copias de ADN del virus en las muestras 1 y 2? b) ¿Cuál es la eficiencia de la PCR que surge de esa curva? Mencione algunas causas que afectan la eficiencia de la PCR.

Estándar Nº copias/mL 2,86 x 1011

Log10

Ct

11,46

9,29

2,86 x 1010

10,46

12,97

40 35 30 25 Ct

9

2,86 x 10

9,46

17,89

2,86 x 108

8,46

21,53

2,86 x 107

7,46

25,04

5

2,86 x 106

6,46

28,12

0

2,86 x 105

5,46

33,01

2,86 x 104

4,46

37,69

Muestra 1

¿?

29,25

Muestra 2

¿?

37,24

20 15

y = -3,9667x + 54,753

10

R 2 = 0,9969

2

4

6

8

10

12

Log Nº copias iniciales/mL

2) La cuantificación por real-time PCR de ADN del virus de hepatitis B (HBV) es muy importante en el diagnóstico y pronóstico de la infección. Con el fin de cuantificar en forma absoluta ADN de HBV, se realizó una curva patrón usando como molde un estándar biológico comercial, con el que se hicieron diluciones seriadas, y la cantidad del mismo fue expresada en Unidades Internacionales/mL (UI, 1 UI equivale a 6 copias del virus). Para la qPCR, se usaron oligonucleótidos específicos contra un segmento del gen S que codifica para el antígeno de superficie, y una sonda específica Taqman. Junto con los estándares se corrieron las muestras incógnitas, obteniendo los correspondientes Ct (Tabla). Concentración inicial estándar (UI/mL) 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 C (control sin molde) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4

Log10 7 6 5 4 3 2

Ct (promedio de triplicados) 10,81 13,99 17,55 21,01 24,65 28,04 34,60

30

25

20

Ct

y = -3,474x + 34,975 2 R = 0,9997

15

10

5

0

34,73

0

1

2

3

4

5

6

Log cantidad inicial ADN virus (UI/mL)

16,10 17,13 17,08 15,00

7

8

a) Determine la concentración en UI/mL de las muestras incógnitas a partir de la curva estándar b) La muestra estándar que contiene 10 UI/mL no se incluyó en la curva patrón. ¿Cuál fue el motivo? Según los resultados obtenidos, ¿cuál sería el límite de detección para este ensayo?

3) Se dispone de un plásmido que tiene la secuencia del HBV clonada y cuyo peso molecular es de 3,8 kb. Se usará este plásmido para preparar la curva de calibración estándar necesaria en la determinación de hepatitis B mediante cuantificación absoluta por qPCR. La concentración del plásmido es de 10 ng/μL. La curva será realizada con concentraciones que van desde 10 9 a 102 copias/mL. ¿Qué cantidad de plásmido debo tomar para preparar la concentración equivalente a 109 copias?

4) En la figura se muestran gráficos de amplificación representativos de un experimento de realtime PCR para investigar la presencia de la bacteria Legionella pneumofila. Se está probando la eficiencia de un par de oligonucleótidos y el fluoróforo usado fue SYBR Green. Paralelamente, se corrió el control sin molde (NTC, no-template control). Además, en la figura se muestra la línea que corresponde al umbral (Threshold). 1) De acuerdo a lo observado, complete los cuadros en blanco con el Ct (threshold cycle) aproximado para cada una de las determinaciones y fundamente el resultado obtenido. 2) Ud. no está conforme con el resultado del NTC ya que considera que arroja un alto valor de Ct. ¿Cómo comprueba la especificidad de la reacción y la eficiencia de los cebadores?

Edición 2018, confeccionado por los docentes del Área Biología Molecular, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario.

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