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GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO

GUÍA DE MANEJO Y ENSAYOS DE ANIMALES DE LABORATORIO CABALLO Y RANA En el proceso de investigación científica, en el área de las ciencias de salud, desde la antigüedad se emplean animales de laboratorio. Quienes casi siempre con el sacrificio de sus vidas han dado su aporte a la generación de nuevo conocimiento para ser aplicado al mejoramiento de la salud de los seres humanos y otros animales. Es importante tener presente una serie de conceptos básicos para el uso y manejo de animales de laboratorio, ya que el desconocimiento de estos factores pueden incidir negativamente en el resultado de los datos obtenidos en el laboratorio, lo cual causaría imprecisiones en el conocimiento y además elevación de costos. El uso de los animales para investigación esta constituido en un tema ético controversial, hay quienes consideran que los animales son y siguen siendo necesarios e irremplazables, y otros que consideran que no deben ser utilizados como modelos de investigación, debiéndose utilizar otras alternativas. Animal de laboratorio Es cualquier especie animal utilizada en experimentación con fines científicos, es decir, mantenido bajo determinadas condiciones y utilizado como instrumento de medida. Este al ser sometido a una experimentación, proporciona datos, los cuales son utilizados como información para los resultados. Como ejemplo de esos animales tenemos al ratón, la rata, el hámster, el conejo, el perro o el mono. Otra definición que se toma es “modelo animal”: Un modelo animal es aquel que emplea animales de especies distintas a la humana, seleccionados por sus características específicas, para ser utilizados en investigación o docencia. En el diseño de los mismos las claves son la elección de la especie animal y la viabilidad de extrapolación de los datos obtenidos a la especie en que se vayan a aplicar los resultados obtenidos. Factores a considerar en la selección de un modelo de experimentación animal Se plantean factores que deben tener en cuenta, al diseñar un modelo experimentalanimal: • • • • • • • •

Costo y cuidado del animal. Disponibilidad. Tolerancia a la cautividad. Facilidad de Enjaular. Pocos cuidados de mantenimiento. Resistencia a Infecciones y a Enfermedades. Homogeneidad. Características biológicas análogas al hombre.

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Tamaño adecuado para realizar el experimento. Tolerancia a procedimientos quirúrgicos. INFORMACIÓN Y CONOCIMIENTO DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL ANIMAL

CABALLO El caballo es un mamífero cuadrúpedo, perisodáctilo, perteneciente a la familia de los équidos. Sus principales características físicas son: un gran porte, aproximadamente mide 1,5 m de altura, sus patas terminan en un solo dedo que tiene una uña llamada casco, la cabeza es alargada, las orejas relativamente pequeñas, su cola es larga y presenta crin en el cuello. El tamaño de los caballos varía considerablemente entre las diferentes razas y también en ello mucho tendrá que ver la nutrición. Existen tres tipos: pesados o de tiro (entre 163 y 183 cm), ligeros o de silla (entre 142 y 163 cm) y ponis y razas miniatura (no superan los 147 cm). La reproducción, ambos sexos alcanzan la madurez sexual a los dos años; sin embargo, no se emplean con fines reproductivos hasta los 3 años. El periodo de gestación dura unos once meses (337 a 344 días) y la hembra pare una única cría; el nacimiento de gemelos es algo excepcional, así como los partos de tres o más potros. La vida adulta puede extenderse hasta los 30 años. RANA Las ranas son animales de piel lisa y suave, ojos saltones que pueden ver casi en cualquier dirección y tímpanos auditivos externos. Los adultos carecen de cola. La mayoría de ellas tienen patas traseras largas, que les permiten dar grandes saltos, y pies palmeados que las convierten en excelentes nadadoras. Los sistemas internos de la rana son típicos de la mayoría de los anfibios; de hecho, éstos eran llamados en su origen, batracios, del griego antiguo batrachus, que significa rana. La mayoría de las ranas, en especial los machos, emiten sonidos. Al expulsar el aire de los pulmones, éste hace vibrar las cuerdas vocales de la laringe, produciendo sonidos característicos de las diferentes especies. Los machos de las especies que poseen un saco resonador que se hincha enormemente cuando la rana emite sonidos para atraer a su pareja producen un sonido mucho más intenso. La lengua de la rana está fijada en la parte anterior de la boca en vez de en la parte posterior, y está cubierta de una sustancia pegajosa que la convierte en una trampa eficaz para cazar insectos. Durante su vida la rana experimenta una metamorfosis completa, que atraviesa las fases de huevo, una fase larvaria similar aun pez y al final la fase de adulto. Ponen sus huevos en el agua, donde dan lugar a renacuajos (larvas de cuerpo corto), a principios de la primavera o el verano, fase en la que

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO presentan branquias y cola. Al irse desarrollando, el renacuajo pierde la cola, desarrolla las patas y, finalmente, sale del agua en forma de rana adulta.

TAXONOMÍA En esta parte se explicara la taxonomía de los dos animales de los cuales hablaremos: Taxonomía del caballo:

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Reino: Subreino: Rama: Grado: Serie: Phylum: Subphylum: Superclase: Clase: Subclase: Superorden: Orden: Familia: Género: Especie:

Metazoa Eumetazoa Bilateria Coelomata Deuterostomia Chordata Gnathostomata Tetrapoda Mammalia Eutheria Laurasiatheria Perissodactyla Equidae Equus caballus

Taxonomía de la rana:               

Reino: Subreino: Rama: Grado: Serie: Phylum: Subphylum: Superclase: Clase: Orden: Suborden: Superfamilia: Familia: Género: Especie:

Metazoa Eumetazoa Bilateria Coelomata Deuterostomia Chordata Gnathostomata Tetrapoda Amphibia Anura Neobatrachia Ranoidea Ranidae Pelophylax perezi

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CONSIDERACIONES FUNDAMENTALES EN EL USO DE ANIMALES DE LABORATORIO Es sumamente importante que todos los investigadores que vayan a utilizar animales de laboratorio para sus investigaciones o lasprácticasdocentesdediquenespecialatencióna:  

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Revisar previamente sus procedimientos experimentales y evaluar la idoneidad del protocolo a ser utilizado, con respecto a los objetivos del estudio. Estudiar y considerar las posibles estrategias experimentales alternativas a la utilización de animales de laboratorio y garantizar que los objetivos no pueden ser alcanzados por dichos procedimientos. (Reemplazar) Utilizar el menor número de animales posibles para la consecución de los objetivos, consultando a este respecto a expertos en estadística. (Reducir) Velar para que los animales no sufran innecesariamente y proporcionarles, cuando sea necesario, analgésicos, anestésicos y otras sustancias apropiadas. (Refinar) Controlar que los métodos eutanásicos empleados sean adecuados a la especie (consideración ética importante) Controlar que el personal que participa en los procedimientos esté debidamente acreditado y entrenado para desempeñar las tareas que les corresponda. Existe prohibición del uso de animales en los experimentos que se utilicen especies considerados en peligro de extinción, a menos, que los objetivos del experimento sean: la investigación tendente a la protección de las estas especies o cuando se compruebe que estas son excepcionalmente las únicas indicadas a tal fin. En ningún caso podrá utilizarse un animal más de una vez en experimentos que conlleven dolor, estrés o sufrimiento intensos.

PERSONAL El personal que trabaja en un bioterio de producción o de experimentación debe ser lo suficientemente capacitado, de acuerdo con las características de las instalaciones, número de animales mantenidos y la naturaleza de la investigación que se va a realizar. Es responsable de la atención y mantenimiento correcto de los animales asignados. Normas de seguridad y Protección del Personal El personal debe adoptar normas y formas de protección, para brindar buenas condiciones de mantenimiento y salud a los ratones. Para ello deberá contar con procedimientos e instrucciones normalizados como: 

Procedimiento de higiene de personal.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO        

Uso de la vestimenta completa. Procedimiento de ingreso al bioterio de producción o bioterio de experimentación. Procedimientos de limpieza de ambientes, con programas de limpieza y rotación de desinfectantes, efectivo. Procedimientos de limpieza y desinfección de materiales. Procedimiento de eliminación de desechos. Programa de control de plagas. Programa de capacitación al personal. Flujo de personal y materiales por las zonas indicadas, para evitar diseminación de material contaminado en zonas limpias.

Entre las normas de higiene y de seguridad más importantes tenemos:          

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Uso de una vestimenta completa y de uso exclusivo en el bioterio. Todo animal encontrado en la sala, libre, debe ser eliminado y no devuelto a la colonia. Se debe trabajar con el menor ruido posible y en forma de reducir el estrés ocasionado a los animales. Uso de gafas de seguridad cuando el procedimiento de investigación lo requiera. Tener conocimiento de la localización del botiquín de primeros auxilios y rutas de evacuación ante una emergencia Utilizar guantes quirúrgicos para el manejo de los animales. No llevar nada a la boca mientras se esté en el bioterio. Mantener el área limpia. Uso de equipos en buenas condiciones. Eliminación de desechos en la forma correcta. Uso de bolsas rojas para material biológico contaminado y bolsas de color negro para material sucio o desechos no contaminados. Rotular correctamente las jaulas, especialmente en las salas de reproductores monogámicos. Restringir el acceso a personal extraño, permitir sólo el acceso apersonas autorizadas. Informar inmediatamente al jefe o coordinador, cualquier accidente. Si tiene problemas respiratorios (asma), neurológicos o alergias infórmelo por escrito a su jefe inmediato. No debe permitirse al personal comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en las salas de animales. El uso de los elementos de protección del personal (mascarilla, guantes,gorros, etc.), los procedimientos normalizados de limpieza y desinfección de materiales e instalaciones conjuntamente con los flujos adecuados de personal y material, constituyen una verdadera barrera sanitaria, que se recomienda mantenerla vigente a pesar de las limitaciones en equipamiento e infraestructura.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO ENTRENAMIENTO Y CAPACITACION DEL PERSONAL El grado y los requisitos del personal requerido para conducir y apoyar el programa de cuidado y uso de animales, depende de varios factores que incluyen: el tamaño y tipo de institución, la estructura administrativa para suministrar un cuidado animal adecuado, las características de las instalaciones, el número de animales mantenidos y la naturaleza de la investigación científica, las pruebas de laboratorio y las actividades educativas. El personal que cuida a los animales debe estar entrenado apropiadamente y la institución debe ofrecer capacitación formal o entrenamiento durante el desempeño del trabajo, para facilitar la implementación eficaz del programa y el cuidado y uso humanitarios de los animales. La necesidad de personal experto en otras disciplinas, tales como: crianza animal, administración, medicina y patología de los animales de laboratorio, salud y seguridad ocupacional, manejo de conducta, manejo genético y otros aspectos varios de apoyo a la investigación científica, será acorde con los alcances del programa. El personal que use o cuide a los animales debe participar regularmente en actividades de educación continua relevantes para sus responsabilidades. Se espera una participación activa del personal en reuniones locales y nacionales de organizaciones afines. El entrenamiento durante el desempeño de sus labores debe ser parte del trabajo de todos los técnicos y debe ser complementado con discusiones auspiciadas por la institución, programas de entrenamiento y con materiales bibliográficos aplicables a su trabajo y a las especies con las cuales laboran. RIESGOS DE EXPERIMENTACIÓN CON ANIMALES Al seleccionar los dispositivos de seguridad específicos para la experimentación con agentes peligrosos en animales se debe prestar especial atención a los procedimientos de cuidado y alojamiento de animales, almacenamiento, distribución de los agentes, preparación y administración de dosis, manejo de fluidos y tejidos corporales, disposición de los desperdicios y cadáveres y protección del personal. El equipo especial de seguridad se debe usar en combinación con las prácticas de seguridad y manejo apropiados. Como regla general, la seguridad depende del personal entrenado que observa rigurosamente las prácticas de seguridad. Son necesarias instalaciones y equipo especiales de seguridad para proteger al personal encargado del cuidado animal y de la investigación, a otros ocupantes del edificio, al público, los animales y el medio ambiente, de la exposición a agentes peligrosos físicos, químicos y biológicos usados en experimentación animal. Las instalaciones empleadas en experimentación animal con agentes peligrosos deben estar separadas de otras áreas de alojamiento animal, áreas de apoyo, de los laboratorios de investigación y clínicos, así como de las áreas para la atención de los pacientes y deben estar identificadas apropiadamente; el acceso a ellas estará limitado al personal autorizado. Tales instalaciones deberán estar diseñadas y construidas para facilitar la limpieza y el mantenimiento de sistemas mecánicos. Un diseño de doble corredor correctamente administrado y usado o un sistema de barrera con entrada controlada son medios efectivos para reducir la contaminación cruzada. Los drenajes del piso siempre deben contener líquidos o sellarse eficazmente por otros medios. Se pueden colocar trampas de llenado automático para asegurar que siempre permanezcan llenas de líquido.

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Los agentes peligrosos deben ser confinados al medio ambiente en donde se realice el estudio. El control de flujo de aire (tal como el uso de gabinete de seguridad biológica) que reduce al mínimo el escape de contaminantes es una barrera primaria utilizada para la manipulación y administración de agentes peligrosos y para llevar a cabo necropsias de animales contaminados. Las barreras secundarias tales como los vestíbulos ventilados, la presión de aire negativa, los filtros de aire y el equipo mecánico de respaldo con encendido automático, están dirigidos a evitar la liberación accidental de los peligros fuera del medio ambiente de trabajo y de la instalación. Se debe limitar la exposición a los gases sobrantes de la anestesia, esto generalmente se logra utilizando varias técnicas de purificación-expulsión. Si se usa éter se debe asegurarse al personal mediante el uso apropiado de letreros, equipos y procedimientos que reduzcan al mínimo los riesgos asociados con su explosividad. PROTOCOLO PARA EL CUIDADO Y USO DE LOS ANIMALES Se deben considerar los siguientes puntos para la elaboración y revisión de los protocolos para el cuidado y uso de los animales.           

Razón y objetivos propuestos para el uso de los animales. Justificación de la especie y número de animales requeridos. Siempre que sea posible, el número de animales que se requieren deberá justificarse estadísticamente. La calidad del entrenamiento y experiencia del personal involucrado en los procedimientos usados Requisitos de crianza, alojamiento y manejo no usuales. Anestesia, analgesia y sedación apropiadas, (las escalas de dolor y daño pueden ayudar en el diseño y revisión de los protocolos). La duplicación innecesaria de experimentos. La realización de varias intervenciones quirúrgicas mayores, en el mismo animal Criterios y mecanismos para la intervención oportuna, retiro de los animales del experimento o eutanasia, en caso de preveer la ocurrencia de dolor o estrés grave. Cuidados después del procedimiento Métodos de eutanasia y eliminación de los cadáveres. Ambiente laboral seguro para el personal.

Restricción Física La restricción física es el uso de medios manuales o mecánicos para limitar algunos o todos los movimientos normales del animal con el propósito de examinarlo, tomar muestras, administrar medicamentos y otras manipulaciones terapéuticas o experimentales. En la mayoría de las ocasiones en que se aplica, los animales son inmovilizados por lapsos breves, generalmente minutos. Los movimientos del animal pueden ser restringidos brevemente ya sea en forma manual o mediante aparatos de restricción, estos últimos deben ser del tamaño, diseño y operación apropiados para reducir al mínimo la incomodidad o evitar lesiones al animal.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Se debe evitar la restricción prolongada, a menos que sea esencial para lograr los objetivos de la investigación.Los sistemas menos restrictivos que no limitan la capacidad del animal para adoptar sus posturas normales, los puntales en forma de yugo para los animales de granja, deben usarse cuando sean compatibles con los objetivos del protocolo. Cuando se usen aparatos de restricción, éstos deberán estar diseñados específicamente, para lograr las metas de la investigación que sería impráctico o imposible lograr por otro medio, y para evitar lesiones a los animales y al personal. A continuación se enlistan importantes lineamientos para la restricción de movimiento:     

Los aparatos de restricción no deben considerarse como métodos de alojamiento normales. Los aparatos de restricción no deben usarse por simple conveniencia al manipular o manejar animales. El lapso de restricción deberá ser el mínimo requerido para alcanzar los objetivos de la investigación. Deberán tomarse las previsiones para observar al animal a intervalos apropiados. Si se observan lesiones o enfermedades asociadas con la restricción de movimiento se debe brindar atención médico veterinaria. La presencia de lesiones, enfermedades o cambios de conducta severos a menudo necesitan la remoción, temporal o permanente, del animal de la restricción.

Múltiples Intervenciones Quirúrgicas Mayores La cirugía mayor penetra o expone una cavidad corporal o produce un menoscabo substancial de la función física o fisiológica. La realización de varias intervenciones quirúrgicas mayores, con recuperación entre ellas, en el mismo animal no está aprobada, pero puede permitirse si el investigador la justifica científicamente. Restricción de Líquido o Alimento Cuando las situaciones experimentales requieran restringir la ingestión de líquido o alimento, deberán brindarse, por lo menos, las cantidades mínimas para permitir el desarrollo de los animales jóvenes y para mantener el bienestar a largo plazo de todos los animales. La restricción debida a propósitos de investigación debe estar justificada científicamente y acompañada de un programa que verifique los parámetros fisiológicos y de conducta e incluya criterios (tales como la pérdida de peso y el estado de hidratación) para el retiro, temporal o permanente, del animal del protocolo experimental. La restricción es usualmente medida como un porcentaje de la ingestión ad libitum o del consumo diario, o como cambio porcentual conforme al peso corporal del animal. En el caso de limitación de líquido se deben tomar precauciones para evitar la deshidratación aguda o crónica, incluyendo el registro diario de la ingestión de líquido y el registro, por lo menos semanal, del peso corporal.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Atención veterinaria Debe brindarse atención veterinaria adecuada, incluyendo a todos los animales para la evaluación de su salud y bienestar. La misión institucional, las metas programáticas y la envergadura del programa animal determinarán la necesidad de tiempo completo, tiempo parcial o servicios de asesoría veterinaria. Las visitas del asesor o del veterinario de tiempo parcial deberán hacerse a intervalos apropiados según las necesidades del programa. Consideraciones éticas, humanitarias y científicas en ocasiones requieren el uso de tranquilizantes, analgésicos o anestésicos en los animales. El veterinario responsable debe asesorar al personal de investigación para asegurar que se cumplan las necesidades humanitarias y que a la vez sean compatibles con los requerimientos científicos. NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL ANIMALARIO Según los parámetros establecidos por la OMS para lo que es ambiente de los animales en laboratorios, se puede agregar lo siguiente: El empleo de animales de laboratorio con fines experimentales y de diagnóstico impone al usuario la obligación moral de adoptar todas las medidas necesarias para evitar que aquéllos padezcan dolores o sufrimientos innecesarios. Hay que proporcionar a los animales un alojamiento cómodo, higiénico y de dimensiones suficientes, así como agua y comida de buena calidad y en cantidad suficiente. Al final del experimento habrá que sacrificarlos con el procedimiento menos cruel posible. Por motivos de seguridad, los animales deben estar alojados en un local independiente, separado del laboratorio. Si se trata de un local contiguo, deberá estar construido de tal modo que sea posible aislarlo de las partes públicas del laboratorio en caso de necesidad, así como para las operaciones de descontaminación y desinfestación. Al igual que todos los laboratorios normales, los animalarios tienen sus niveles de bioseguridad.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO En cuanto a los animales que van a usarse en el laboratorio, los factores que hay que tener en cuenta son los siguientes: 1. El carácter de los animales, es decir, su grado de agresividad y tendencia a morder o arañar. 2. Sus endoparásitos y ectoparásitos naturales. 3. Las zoonosis a las que son susceptibles. 4. La posible diseminación de alérgenos. Como en el caso de los laboratorios, los requisitos relativos a las características de diseño, el equipo y las precauciones son cada vez más estrictos a medida que aumenta el nivel de seguridad. Las directrices son acumulativas; es decir, cada nivel incorpora los requisitos de los niveles inferiores. Animalarios – nivel de bioseguridad 1 Este nivel es el apropiado para mantener a la mayoría de los animales después de la cuarentena (salvo los primates no humanos, respecto de los cuales debe consultarse a las autoridades nacionales) y para los animales que son inoculados deliberadamente con agentes de riesgo. Se necesitan técnicas microbiológicas apropiadas. El director del animalario debe determinar las políticas, procedimientos y protocolos para todas las operaciones, así como para el acceso al animalario. Se instituirá un programa apropiado de vigilancia médica para el personal y se preparará y adoptará un manual de seguridad de las operaciones. Animalarios – nivel de bioseguridad 2 Este nivel es apropiado para el trabajo con animales a los que se inoculan deliberadamente microorganismos del grupo de riesgo 2. Se aplicarán las siguientes precauciones de seguridad: 1. Se cumplirán todos los requisitos de los animalarios del nivel 1. 2. Se colocarán señales de advertencia del peligro biológico en las puertas y otros lugares apropiados. 3. El local estará diseñado de modo que sea fácil de limpiar y mantener. 4. Las puertas deben abrirse hacia dentro y cerrarse solas. 5. La calefacción, la ventilación y la iluminación deben ser apropiadas. 6. Si se instala ventilación mecánica, el flujo de aire debe dirigirse hacia dentro. El aire utilizado se evacuará al exterior y no se reciclará a ninguna otra parte del edificio. 7. El acceso se limitará a las personas autorizadas. 8. No se admitirá ningún animal distinto de los utilizados con fines experimentales. 9. Existirá un programa de lucha contra artrópodos y roedores. 10. Si hay ventanas, estas serán seguras, irrompibles y, si se pueden abrir, llevaránrejillas a prueba de artrópodos. 11. Las superficies de trabajo habrán de ser descontaminadas con desinfectantes eficaces después del trabajo.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO 12. Se dispondrá de CSB (clases I o II) o jaulas aislantes con suministro especial de aire y evacuación de aire a través de filtros HEPA para aquellas tareas que puedan entrañar la generación de aerosoles. 13. Se dispondrá de una autoclave in situ o cerca del animalario. 14. El material de los lechos de los animales se eliminará de modo que se reduzca al mínimo la producción de aerosoles y polvo. 15. Todos los materiales de desecho y de los lechos deben descontaminarse antes de ser eliminados. 16. Se restringirá en lo posible el uso de instrumentos punzantes o cortantes. Éstos se recogerán siempre en recipientes resistentes y a prueba de perforación, provistos de tapa, y serán tratados como material infeccioso. 17. El material destinado al tratamiento con autoclave o a la incineración debe transportarse sin riesgo en recipientes cerrados. 18. Las jaulas de los animales se descontaminarán después de su uso. 19. Los cadáveres de los animales serán incinerados. 20. En el local se utilizará ropa y equipo de protección, que se retirará a la salida. 21. Se instalarán lavabos y el personal se lavará las manos antes de salir del animalario. 22. Todas las lesiones, por leves que sean, deberán ser tratadas de forma apropiada, notificadas y registradas. 23. Estará prohibido comer, beber, fumar y aplicar cosméticos dentro del animalario. 24. Todo el personal deberá recibir capacitación apropiada. Animalarios – nivel de bioseguridad 3 Este nivel es apropiado para trabajar con animales que son inoculados deliberadamente con agentes incluidos en el grupo de riesgo 3, o cuando así lo indique la evaluación del riesgo. Todos los sistemas, prácticas y procedimientos habrán de ser revisados y certificados nuevamente una vez al año. Se aplicarán las siguientes precauciones de seguridad: 1. Deben cumplirse todos los requisitos correspondientes a los animalarios de los niveles de bioseguridad 1 y 2. 2. El acceso debe estar estrictamente controlado. 3. El animalario estará separado de otros locales del laboratorio y destinados a animales por dos puertas que formen un vestíbulo o antesala. 4. En el vestíbulo se instalarán lavabos. 5. En el vestíbulo se instalarán duchas. 6. Habrá que disponer de ventilación mecánica que asegure un flujo continuo de aire en todos los locales. El aire de salida pasará por filtros HEPA antes de ser evacuado a la atmósfera sin ningún tipo de recirculación. El sistema estará diseñado de tal modo que impida el flujo de retorno accidental y que haya una presión positiva en todas partes del animalario. 7. Se dispondrá de una autoclave situada en un lugar cómodo respecto del alojamiento de los animales y donde el riesgo biológico esté contenido. Los residuos infecciosos se tratarán en la autoclave antes de trasladarlos a otros lugares de la instalación. 8. Se dispondrá de un incinerador de fácil acceso en la instalación o se tomarán otras disposiciones al mismo efecto con las autoridades competentes.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO 9. Los animales infectados con microorganismos del grupo de riesgo 3 estarán alojados en jaulas aisladas o en locales con salidas de ventilación situadas detrás de las jaulas. 10. Los lechos de los animales tendrán el mínimo polvo que sea posible. 11. Toda la ropa protectora deberá ser descontaminada antes de enviarla a la lavandería. 12. Las ventanas estarán herméticamente cerradas y serán resistentes a la rotura. 13. Se ofrecerá al personal la posibilidad de inmunizarse, si procede. Animalarios – nivel de bioseguridad 4 El trabajo que se realice en estas instalaciones normalmente guardará relación con el del laboratorio de contención máxima – nivel de bioseguridad 4, y habrá que armonizar las normas y los reglamentos nacionales y locales para aplicarlos a ambos tipos de instalaciones. Para el trabajo en laboratorios que requieren trajes especiales se utilizarán prácticas y procedimientos especiales, además de los que se describen a continuación. 1. Se cumplirán todos los requisitos de los animalarios de los niveles de bioseguridad 1, 2 y 3. 2. El acceso estará estrictamente controlado; sólo tendrá autorización para entrar el personal designado por el director del establecimiento. 3. Ninguna persona deberá trabajar sola: se aplicará la regla de las dos personas. 4. El personal habrá recibido el máximo nivel posible de formación en microbiología y estará familiarizado con los riesgos que entraña su trabajo y las precauciones necesarias. 5. Las zonas en las que se alojen los animales infectados con agentes del grupo de riesgo 4 mantendrán los criterios de contención descritos y aplicados en los laboratorios de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. 6. Se entrará en la instalación por un vestíbulo de cierre hermético cuya parte limpia estará separada de la parte restringida por las instalaciones de cambio de ropa y duchas. 7. El personal deberá quitarse la ropa de calle al entrar y ponerse ropa protectora especial. Después del trabajo se quitará la ropa, la separará para ser tratada en autoclave, y se duchará antes de salir. 8. La instalación estará ventilada por un sistema de evacuación de aire con filtros HEPA que asegure una presión negativa (flujo de aire hacia el interior). 9. El sistema de ventilación estará diseñado de modo que impida el flujo de retorno y la presurización positiva. 10. Para el intercambio de materiales se dispondrá de una autoclave de doble puerta con el extremo limpio situado en una sala exterior a las salas de contención. 11. Para el intercambio de materiales que no puedan ser tratados en la autoclave se dispondrá de una caja de paso con cierre hermético cuyo extremo limpio estará situado fuera de salas de contención. 12. Todas las manipulaciones de animales infectados con agentes del grupo de riesgo4 se realizarán en condiciones de contención máxima – nivel de bioseguridad 4. 13. Todos los animales estarán alojados en aisladores. 14. Todos los desechos y el material de los lechos de los animales se tratarán en la autoclave antes de sacarlos del animalario 15. Se someterá al personal a vigilancia médica.

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ENSAYOS REALIZADOS EN ANFIBIOS Uno de los Phylum más utilizados como modelos experimentales es el grupo Amphibia, ya que éstos presentan unas enormes ventajas entre las que se incluyen un buen conocimiento de su fisiología, gran diversidad taxonómica, tolerancia a grandes variaciones en el ambiente, fácil mantenimiento en cautividad y mayor similitud con los humanos en comparación con otras especies animales utilizadas en experimentación. Todas estas ventajas han hecho que los anfibios constituyan un tercio de los modelos animales, siendo utilizados por varios investigadores galardonados con el Premio Nobel.

Tabla1: Utilización de modelos animales con anfibios en las investigaciones de Premios Nobel.

Fecha

Galardonados

1920

A. Krogh

1922

A.V. Hill O.F. Meyerhof

1935 1936

H. Spermann H. Dale O. Loewi

1947

B.A. Houssay

1963

J.C. Eccles A.L. Hodgkin A.F. Huxley

1991

E. Neher B. Sakmann

Campos de estudio

Especies utilizadas

Regulación capilar

Rana esculenta Rana temporaria

Metabolismo muscular

Rana temporaria Tritoncristalus Tritonlaeniatus

Centros orgánicos Bases químicas en la transmisión nerviosa Regulación del metabolismo de carbohidratos Base de los iones en los potenciales de acción

Rana esculenta Butoarenarum Rana pipiens Rana esculenta Rana temporaria

Función de los canales iónicos

Rana esculenta

Características especiales de los anfibios de interés como modelos animales Los anfibios son uno de los modelos de elección por las siguientes razones: Fisiología básica Existen una gran cantidad de estudios que describen y explican las características anatómicas, fisiológicas y ecológicas de los anfibios. En muchos de ellos el objetivo es el conocimiento de

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO los anfibios perse, ya que estos animales despiertan un gran interés por su posición clave en la escala evolutiva. Sin embargo, los resultados aportados pueden ser utilizados en la creación de modelos animales, extrapolables incluso a animales mamíferos.

Facilidad de mantenimiento en cautividad Los anfibios utilizados en experimentación presentan una talla media comprendida entre 1 y 20 cm, por lo que requieren espacios relativamente pequeños para su confinamiento en jaulas; se estima que las necesidades medias son de 80 L por animal. Sí es importante realizar un perfecto mantenimiento de las condiciones de humedad (que ha de ser elevada) y ventilación, para asegurar el buen estado físico de los individuos y evitar la proliferación de microorganismos. Prolificidad elevada Algunas especies exóticas son poco prolíficas porque tienen que llevar los huevos o renacuajos en la espalda, en bolsas de la piel, o incluso en el estómago durante una gran parte de su juventud. Sin embargo, la mayoría de las especies del género Rana cría a principio de la primavera alcanzando los 20.000 huevos por puesta. Hay también dos especies de sapos, y algunas salamandras y cecilias que paren crías vivas que tienen una conformación corporal similar a la de sus progenitores. Elevado número de especies Existen 3.140 especies de anfibios conocidas que se han dividido en tres ordenes: Anura o Salientia (2660 especies de ranas terrestres y arborícolas y de sapos), Urodela, o Caudata (320 especies de salamandras) y Apoda, o Gymnophiona (160 especies de cecilias). Esta gran diversidad de especies permite realizar estudios comparativos con facilidad. Gran diversidad de hábitats La diversidad de especies, a su vez se traduce en una amplia distribución geográfica y gran capacidad de adaptación a distintos medios naturales. Así, podemos encontrar anfibios en muy diversos hábitats, adquiriendo morfologías distintas y mostrando diversas adaptaciones fisiológicas al ambiente. Algunos, como Xenopus laevis, son completamente acuáticos aunque tengan la capacidad de respirar aire directamente, lo que hace que predomine un tipo de respiración cutánea no habiendo perdido la forma de respiración pulmonar. Otra clase de anfibios han sido encontrados a más de 4000 metros de altitud (Rana sauteri en Taiwan) con una gran capacidad de resistencia a las bajas temperaturas y a la concentración reducida de oxígeno en el aire. También es conocida la capacidad de sapos encontrados en altas latitudes de resistir la congelación completa de su cuerpo. Otras especies (Rana cancrivora, o rana comedora de cangrejos), incluso han desarrollado la capacidad de hacer inmersiones en agua salada de mar consiguiendo resolver los problemas osmoreguladores que se presentan en este medio.

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Modelos animales con anfibios Para su exposición hemos clasificado algunos ejemplos de modelos animales que utilizan distintas especies de anfibios en función del campo experimental en el que se resultan de aplicación, explicando brevemente su aplicabilidad al método experimental. Tabla 2: Resumen de los modelos experimentales realizados con anfibios. Área científica Fisiología cardiovascular Fisiología del músculo esquelético Función renal

Fisiología sensorial Fisiología respiratoria Fisiología reproductiva Fisiología evolutiva Fisiología ambiental

Experimentos Desarrollo cardiaco Reparación del daño tras infarto Permeabilidad vascular Relación con el comportamiento Metabolismo celular Corrientes de activación de calcio Canales de membrana

Especie anfibia Ajolote (Ambystoma mexicanum) Tritón (Notophthalmus viridescens) Rana africana de uñas (Xenopus laevis) Anuros en general Rana africana de uñas (Xenopus laevis) Sapo de las Montañas Rocosas (Bufo woodhousei) Rana leopardo (Rana pipiens)

Ajolotes (Ambystoma mexicanum, Ambystoma tigrinum) Sapo marino (Bufo marinus)

Cinética de alta velocidad Desarrollo del riñón Canales iónicos y conexiones neuronales Salamandra tigre (Ambystoma tigrinum) Evaluación del sentido del gusto Sapo moteado (Bufo punctatus) Coquí común (Eleutherodactylus coqui) Salamandra olm (Proteus anguinus) Neurofisiología del oído interno Desarrollo del sistema respiratorio Salamandras (fam. Plethodontidae) Desarrollo embrionario Coquí común (Eleutherodactylus coqui) Evolución del aparato reproductor Cecilias (Gymnophiona) Adaptación a la terrestrialidad Indicadores de la calidad ambiental Ambientes extremos Criogenización

Tritón vientre de fuego chino (Cynops orientalis) Rana de bosque (Rana sylvatica) Rana leopardo (Rana pipiens) Rana africana de uñas (X. laevis)

Fisiología del músculo esquelético Muchos de los estudios iniciales sobre inervación y actividad muscular fueron realizados en anfibios, con protocolos de trabajo que hoy todavía se emplean, con ciertas modificaciones, en laboratorios para docencia. La forma y la función del músculo esquelético de los anfibios continúan siendo un campo muy fértil, aplicando nuevos protocolos y técnicas científicas, para el estudio de procesos básicos de metabolismo celular, corrientes de activación de calcio, cinética de canales de

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO membrana, y otros procesos más específicos como los estudios de la cinética de alta velocidad responsable de los movimientos de la lengua. Una de las últimas revisiones sobre la activación muscular por calcio enfatiza el papel clave de los anfibios en la comprensión de la fisiología muscular. Estudios del sistema cardiovascular En la actualidad el ajolote (Ambystoma mexicanum) se emplea frecuentemente en investigaciones sobre el desarrollo cardiaco, ya que existen individuos que sufren una mutación que les produce una carencia de corazón; realmente, éste se desarrolla a lo largo de la vida del animal, si bien nunca llega a latir ya que sus miofibrillas están mal organizadas. En otros vertebrados se produce también esta mutación que resulta letal en estadios iniciales del desarrollo; sin embargo, el ajolote es capaz de sobrevivir y continuar su desarrollo durante varios días. Otra característica interesante de algunos anfibios es su capacidad para “regenerar” miocitos, a diferencia de los mamíferos; esta característica se está utilizando en modelos para el estudio de la recuperación miocardial tras un infarto. Realmente los miocitos de los anfibios no se regeneran sino que tienen capacidad potencial para dividirse y “repoblar” la zona cardiaca dañada. Dentro de la investigación microvascular se utilizan anfibios en el desarrollo de nuevas técnicas para estudiar la permeabilidad vascular, basándose en el gran desarrollo de su sistema linfático, que incluye incluso un corazón linfático pulsátil. Por último el estudio de la relación entre el comportamiento y la función cardiovascular en anuros es de gran interés ya que son el único grupo de animales terrestres cuya hidratación no depende de la ingesta de agua o de su producción a partir del metabolismo; estos animales absorben agua a través de una zona en la piel y, mediante cambios posturales, pueden conducirla al sistema circulatorio y regular así su volumen sanguíneo. Función renal Para una adecuada filtración renal en mamíferos es necesario el desarrollo del riñón desde pronefros hasta el metanefros, pero el pronefros no es funcional en estadios iniciales del desarrollo y es difícil estudiar su funcionalidad “in útero”. En los anfibios el pronefros es funcional en estadios iniciales y sirve de órgano filtrador de sangre, lo que nos permite estudiar más fácilmente el desarrollo de este órgano. Fisiología sensorial Los anfibios han sido el modelo animal de elección en estudios sobre visión durante años, y se siguen empleando en la actualidad. Las células retinianas de los anfibios tienen un gran tamaño, lo que hace que sean el modelo ideal para estudiar la actividad de los canales y la conexión neuronal. La investigación de otros sistemas sensoriales también se ha beneficiado

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO de algunas de las características fisiológicas de los anfibios, ya que los anfibios (como las aves) tienen la capacidad de regenerar las células ciliadas del oído interno, a diferencia de los mamíferos, una de las principales causas de sordera en humanos. Además, Bufo punctatus ha sido empleado para evaluar el sentido del gusto en humana, ya que este sapo que habita en zonas desérticas tiene una zona especial de la piel capaz de absorber agua y posee unos sensores que detectan la salinidad de dicho agua (para poder regular su osmolaridad). Fisiología respiratoria La fisiología respiratoria de estos animales concede un amplio campo de estudio. Los individuos adultos intercambian gases a través de los pulmones y la piel, aunque existe un grupo de salamandras que carecen de pulmones y cuya respiración es completamente cutánea. Las branquias están presentes normalmente durante el desarrollo larvario y se mantienen en ciertos casos durante las fases adultas. El paso de una respiración branquial a pulmonar se lleva a cabo durante el proceso de metamorfosis, que es sumamente interesante para el estudio del control respiratorio desde el punto de vista de la fisiología de la evolución, fisiología del desarrollo y fisiología ambiental.

ENSAYOS REALIZADOS EN CABALLOS Antes de mencionar los ensayos realizados en los caballos, explicaremos a grandes rasgos los cuidados o pautas necesarias para mantener a este animal en instalaciones adecuadas. Esto quiere justificar que a simples rasgos los caballos son animales de gran tamaño con respecto a otros animales que se utilizan comúnmente en los laboratorios por lo cual el alojamiento o crianza de este animal tiene que seguir algunas recomendaciones para que así los resultados obtenidos nos sean mas factible y verídicos. Estas son las pautas más resaltantes en el manejo de caballos: Confinamiento o encierro primario Una caballeriza bien iluminada y con acceso a un corral de ejercicio es deseable para que los caballos se mantengan en condiciones óptimas de salud y tono muscular. El alojamiento debe permitir un espacio adecuado en los pasillos para permitir el movimiento seguro de los caballos y sus cuidadores. En las caballerizas no debe existir ningún objeto saliente que pueda lastimar a los animales. Las paredes deberán ser lo suficientemente altas para prevenir las interacciones con los caballos alojados a los lados. Es importante que las puertas tengan un ancho (1.25 m) y alto (2.25 m) adecuados para facilitar el movimiento de los animales, sin riesgo ni lesiones. Los techos también deberán tener una altura adecuada, de 3 m para permitir al caballo asumir una postura normal y evitar lesiones en la cabeza. Los pisos deberán tener una superficie durable, no resbalosa. Bajo condiciones de laboratorio o en instituciones educativas, se deberá proporcionar un cuarto o área separada de la zona de las caballerizas para realizar procedimientos de preferencia con una manga de manejo.

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Temperatura Los caballos pueden tolerar bajas temperaturas siempre y cuando exista suficiente protección de los vientos y lluvias extremas. De igual manera pueden tolerar temperaturas altas siempre y cuando se les proporcione sombra en praderas y una ventilación y humedad apropiadas en las caballerizas. Debe existir suficiente agua potable y fresca disponible en todo momento., especialmente en climas calurosos. La temperatura óptima se encuentra entre 10 y 15ºC, aunque pueden tolerar de -7 a 29ºC si se alojan en caballerizas secas y libres de corrientes de aire. Ventilación La capacidad de ventilación debe ser de por lo menos 2.8 m3 /min. por 450 Kg de caballo a temperaturas de -1 a 10ºC y deberá incrementarse a medida que aumente la temperatura. Densidad de población Idealmente los caballos deberán alojarse en caballerizas individuales de por lo menos 3.5 x 3.5 m, y tener acceso a un corral de ejercicio de 10 x 27.5 m ó mayor. Después del destete es conveniente que cada animal tenga una caballeriza separada. En el corral de ejercicio se debe mantener una separación por edad y compatibilidad. Cama Se debe proporcionar suficiente cama en la forma de aserrín, paja o algún otro material adecuado. Deberá existir un drenaje adecuado para evitar problemas en los cascos y que el animal se ensucie innecesariamente. El estiércol y la cama mojada deberán retirarse diariamente para mantener a los caballos limpios y secos, y el medio ambiente libre de olores. Los animales no deberán tener acceso al estercolero para evitar infestaciones de parásitos. Se recomienda el cepillado diario, especialmente si los caballos están alojados en caballerizas que limitan sus movimientos.

Salud Animal Los caballos sanos están activos, alertas y responden cuando se acerca alguien. La cabeza la traen en alto y las orejas erguidas. El pelaje está brillante y corto en el verano y grueso y suave en el invierno, especialmente si se encuentran al aire libre. Los caballos sanos comen con gusto cuando se les acerca alimento y generalmente toman agua después de comer. Defecan heces consistentes varias veces al día y orinan cada 2 a 4 horas.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Alimento y Agua Los caballos en confinamiento deben ser alimentados por lo menos dos veces al día. Cuando no tienen acceso al pastoreo se les debe proporcionar forraje en la forma de paja u otros materiales fibrosos para disminuir la incidencia de cólicos y problemas de comportamiento tales como morder la puerta o el borde del pesebre, masticar madera o comerse su cama. Los caballos deben ser alimentados para que no estén ni bajos ni altos de peso. El agua debe estar siempre limpia y disponible a libre acceso o proporcionárselas por lo menos dos veces al día. Los requerimientos de agua dependen de varios factores, tales como la temperatura ambiental, la función del animal y la composición de la dieta. Sin embargo un caballo en general requiere de 2 a 4 L de agua por cada Kg. de materia seca. Un caballo con dieta de mantenimiento en un ambiente termoneutral puede requerir de 15 a 35 L, pero uno que está trabajando y sudando o lactando puede requerir de 50 a 80 L.

Manejo y Transporte Los caballos deben manejarse utilizando almartigones y cuerdas. Se puede obtener un mayor control pasando la cadena de la cuerda delalmartigón o ronzal sobre la nariz del caballo, esto en caballos enteros. Se puede flexionar un miembro anterior (mano) para tener un mayor control. En caballos más difíciles de manejar se puede utilizar el arcial, pero siempre con cuidado y nunca por más de cinco minutos a la vez. Las barreras físicas pueden ser de gran ayuda. La inmovilización química es efectiva siempre que se administre por parte de una persona calificada. Drogas como acepromazina y xilazina son las más utilizadas. Se deben utilizar analgésicos o anestésicos en el caso de procedimientos que provoquen dolor. ENSAYO REALIZADO Producción de suero antiofídico El proceso de producción del suero antiofídico antibothrops bivalente, para uso terapéutico. El suero, proveniente de equinos inmunizados con dosis crecientes de venenos bothropicos activos, fue purificado mediante precipitaciones salinas, acción enzimática y calor. De esta forma se obtiene una inmunoglobulina hipotóxica e hiperinmune, capaz de neutralizar específicamente la acción de los venenos de Bothrops neuwiedi y alternates. Animales El primer lote de diez equinos fue proporcionado por el MSP. Los animales eran sanos. Jóvenes entre 2 y 5 anos y de mas de 500 quilos de peso. Para las pruebas de potencia y seguridad, se utilizaron ratones blancos de 18 a 20 g de peso (Mus musculus) de ambos sexos, y libres de patógenos específicos. Para las pruebas de inocuidad y seguridad se utilizaron cobayos machos de 300 a 350 g de peso y libres de patógenos específicos.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Disponibilidad de antígenos Como se carecía de producción local de veneno, en el comienzo se utilizaron venenos de Bothrops neuwiedi, y B. alternatus.

Caracterización de los venenos Se siguió la metodología aconsejada por la OPS/OMS para la elaboración de sueros heterólogos, según se aplica en el Instituto Malbran. Antes de comenzar la inmunización se determino la potencia de cada uno de los venenos, utilizando ratones de 18 a 20 g, para calcular la dosis letal 50 (DL50) aplicando métodos estadísticos. La misma estuvo en menos de 4 ug/ml para el veneno de B. alternatus y menos de 10 J.g/ml para B. neuwiedi. Animales seroproductores Los equinos fueron controlados por un médico veterinario, realizándosele, a cada uno, su ficha sanitaria en la cual se anotaron las características de su pelaje, identificación, sexo, numero, estado de las mucosas, dentadura y peso. Fueron numerados del 21 al 30. Se los vacuno contra tétanos y se desparasitaron. Antígenos Se preparo una solución madre de venenos de B. alternatus y B. neuwiedi a una concentración de 10 mg/ml, utilizando venenos completos y secos, reconstituidos. Se corrigió su pH a 7,2. Se los filtro clariesterilizante por membranas Millipor de diametro 47 mm y poros 0,8 y 0,22 (i. Se controlo la esterilidad, seleccionando medios que desarrollaran gérmenes aerobios y anaerobios según lo pautado por la OMS. Se realizaron las diluciones del veneno siguiendo el protocolo y usando como adyuvante el de Freund complete (AFC), (AFI), y solución salina tamponada (SSB). Los mismos fueron completamente homogeneizados y conservados a 5°C. Para tal fin, se idearon frascos estériles que contengan una barra magnética en su interior y cerrados herméticamente. Los componentes estériles, fueron mezclados asépticamente dentro de estos recipientes, los cuales una vez cerrados, se colocaron sobre un agitador magnético obteniéndose así una correcta homogenización de los antígenos con los adyuvantes y evitando la contaminación. Se mantuvieron a 5°C hasta su inoculación. En todas estas etapas el personal técnico uso de bata, gorro, guantes y tapabocas estériles. Obtención del suero Sangría La sangría exploratoria se realizo el día 161 de la reinmunización, por punción de la vena yugular del equino. El suero obtenido se tituló para cada veneno por separado, mediante la técnica de seroneutralización in vivo, utilizando como animal de experimentación el ratón que fue inoculado por vía intravenosa en vena de la cola. Cada ratón recibió 0,5 ml i/v de veneno a una concentración 1/1000, mezclado con cantidades variables del suero de prueba. Se los

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO observo durante 72 horas, al cabo de las cuales se procedió a la lectura y a realizar los cálculos estadísticos correspondientes. De los 10 equinos inmunizados, 9 tenían títulos neutralizantes aceptables (más de 900 µg/ml). Un caballo, el numero 21, mostro una neutralización incompleta para el componente neuwiedi. A los diez días de la última inoculación se realizaron dos sangrías definitivas, separadas por 48 horas, a los 9 equinos que tenían buena respuesta inmune. No se repuso el paquete globular por falta de estandarización de la técnica. Sin embargo, el procedimiento fue muy bien tolerado por los animales. Se extrajeron 8 litros de plasma de cada uno. Dicho plasma se recogió en damajuanas estériles de diez litros conteniendo citrato de sodio a 33%. El mismo día de la sangría se separo el paquete globular por decantación y se obtuvo un total de 79 litros de plasma sobrenadante. Control de sueros El control de los sueros se lleva a cabo mediante diversas pruebas: de neutralización en ratones blancos, de pirogenicidad en conejos, de seguridad en cobayos y ratones, de esterilidad según recomendaciones del National Institute of Health de E.U.A. (NJH); también incluye determinación de fenol y proteínas, así como una inspección visual por materiales en suspensión. Una vez que los animales inmunizados han alcanzado un título de neutralización adecuado el cual, de acuerdo con los estándares adoptados por los autores, es de 1 a 2 mg de veneno neutralizado por ml de suero para crotalinae y de 0.250 mg para Micrurus (3) se sangran en un cepo con un equipo diseñado para tal efecto. Normalmente se obtienen ocho litros diarios de sangre de cada caballo durante cuatro días, con reinoculación de los eritrocitos al día siguiente. Este sistema proporciona alrededor de 16 litros de plasma citratado por caballo, el cual se so mete al mismo proceso 3 6 4 veces al ano. Con objeto de mantener niveles elevados de anticuerpos, los animales reciben tres dosis de refuerzo de veneno entre cada sangría.

GUÍA DE MANEJO DE ANIMALES DE LABORATORIO Con respecto al suero crudo preparado en carneros, su actividad neutralizante frente a los venenos utilizados en el proceso de inmunización. Resta aun comprobar su eficacia contra otros venenos de serpientes del género Bothrops y en pruebas de campo.