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FUNDAMENTOS Y MICROBIOLOGIA DEL YOGUR Erick ESTRADA1

Según las normas técnicas del INDECOPI y EL Codex, el yogur es: “Producto lácteo coagulado obtenido por fermentación láctica mediante la acción de Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus a partir de leche pasteurizada, leche concentrada pasteurizada, leche en polvo entera, semidescremada o descremada, proteínas de leche y/u otros productos precedentes del fraccionamiento de la leche.”

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Licenciado en Biología, Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”. Maestrante en Ciencias con mención en Ingeniería Ambiental. EPG. UNPRG. Lambayeque. Correo- e: [email protected]. Tel. Cel. (074978876178). Av. Arequipa 217 José Olaya .Chiclayo.

INTRODUCCION Aunque no disponemos de ningún documento en el que se complete el origen del yogur, durante mucho tiempo diversas civilizaciones han creído en sus efectos beneficiosos sobre la salud y la nutrición humana. Según la tradición persa, la fecundidad y la longevidad de Abraham se dijeron por el consumo de yogur. Mas recientemente se sostuvo que el emperador francisco I de Francia se recupero de la enfermedad debilitante gracias al consumo de yogur de leche de cabra (Rosll, 1932). Sin embargo el yogur es probablemente originario de oriente medio y la evolución de este producto fermentado a lo largo de los años se puede atribuir a las habilidades culinarias de los pueblos nómades de esta parte del mundo. La fermentación debida a las bacterias no lácticas dan a lugar a un producto insípido y desagradable, que presenta un coagulo irregular, con gas y una notable tendencia a la sinéresis.por el contrario, la acción de las bacterias lácticas, sobre la leche da lugar a un producto fermentado de aroma y sabor agradable, que se puede comer o beber siendo denominado en este ultimo caso “LECHE FERMENTADA ACIDIFICADA”. Poco a poco nuevas comunidades aprendieron este sencillo tratamiento de conservación y uno de los productos obtenidos se denominó” yogur”, vocablo derivado del termino turco “JUGURT”.

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FUNDAMENTOS DEL PROCESO DE ELABORACION DE YOGUR El proceso de elaboración del yogur es un arte muy antiguo que data de hace miles de años, siendo posiblemente anterior a la domesticación de vacas, ovejas, y cabras, pero hasta el siglo XIX apenas se conocían los fundamentos de las distintas fases de la producción. No obstante, en las últimas décadas este proceso se ha racionalizado mucho, principalmente debido a los descubrimiento y avances en diversas disciplinas, como por ejemplo Microbiología y Enzimología, Física e Ingeniería, Química y Bioquímica, pero incluso con la actual tecnología industrial el proceso de elaboración continua siendo una completa compleja combinación de “Ciencia y Arte”. Sin embargo, para comprender los principios básicos del proceso de elaboración del yogur resulta de gran utilidad estudiar independientemente las distintas etapas del mismo y sus efectos sobre la calidad del producto final. Tanto los dos métodos de elaboración, el tradicional y el mejorado son consecuencia del otro, pero se puede comprobar que el primero de ellos presenta inconvenientes como :

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(a) las repetidas siembras de estárter tienden a estabilizar la relación tienden a estabilizar la relación entre Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus, o pueden dar lugar a mutaciones hacia la 15-20º resiembra. (b)

la baja temperatura de incubación, temperatura ambiente, determina una lenta aci-

dificación de la leche (18 horas o más) en comparación con las 2,5-3 horas en las que este proceso tiene lugar en condiciones óptimas a temperatura de 40-45 °C; La lenta acidificación puede tener efectos secundarios no deseables, como por ejemplo una exudación de suero, los cuales pueden influir negativamente sobre la calidad del yogur; El proceso tradicional no permite controlar la concentración de ácido láctico producida durante la fase de fermentación. No obstante, a pesar de sus inconvenientes, es obvio que el proceso tradicional ha sido la base fundamental para la actual producción industrial de yogur. Las modificaciones básicas se basan principalmente en: (a)

la pureza de los cultivos estárter de yogur obtenido a partir de casas comerciales, de

«bancos» de estárter, o de centros de investigación; (b)

la capacidad de las personas que trabajan en las industrias lácteas para sembrar la

leche esterilizada con estos cultivos en condiciones asépticas, consiguiendo así estárter realmente activos; (c)

la posibilidad de controlar con precisión la temperatura de incubación, pudiendo

prever con antelación la velocidad de la acidificación y la duración del proceso; (d)

la posibilidad de refrigerar rápidamente el yogur una vez alcanzada la acidez re-

querida, permitiendo una mayor uniformidad en la calidad del producto final; (e)

la disponibilidad de métodos sencillos para determinar el desarrollo de la acidez en la

leche (utilizado pH metros o acidómetros) que permiten controlar el proceso incluso por operarios poco preparados. TRATAMIENTO PRELIMINAR DE LA MEZCLA BASE 1

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A. La leche como materia prima Para la producción de yogur se ha utilizado leche de distintas especies animales. Se presentan las principales diferencias en la composición de la leche de distintas especies. (Por esta razón, en función del tipo de leche utilizado, se pueden presentar variaciones en la calidad del yogur. Por ejemplo, las leches con un elevado contenido en grasa (como la de oveja, búfala o rena) dan lugar a un yogur «rico» y «cremoso», con un excelente «cuerpo», en comparación con el yogur elaborado a partir de leches de bajo contenido en grasa o de leches desnatadas. La lactosa de la leche es la fuente de energía para los microorganismos estárter del yogur, pero las proteínas desempeñan un importante papel en la formación del coágulo y por tanto la consistencia y viscosidad del producto es directamente proporcional a la concentración de proteína presente. El yogur elaborado a partir de leche de yegua o burra no enriquecida es menos viscoso que el elaborado a partir de leche de oveja o rena.

Aunque el flavor del yogur es resaltado de complejas reacciones bioquímicas debidas a la actividad de los microorganismos, el flavor de la leche varía de unas especies a otras, lo cual se refleja en el producto final. No obstante, puesto que la mayor parte de los países disponen de grandes cantidades de leche de vaca se hará un especial énfasis en la utilización de esta para la elaboración de yogur. Sin embargo, también existen grandes diferencias en la composición de la leche de vaca. Los principales constituyentes de la leche son: agua, grasa, proteína, lactosa y minerales (cenizas). 1

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Inevitablemente, la composición de la leche fresca varía dentro de una misma raza en función de diversos factores, como la selección animal, la fase de lactación, la edad del individuo, el estado sanitario de la ubre, las infecciones, la alimentación, las condiciones climáticas, la estación del año o, incluso, el tiempo transcurrido entre los ordeños. Para evitar los efectos de estas variaciones intrínsecas de la composición de la leche es preciso recurrir a la estandarización normalización y/o enriquecimiento de la misma con objeto de: (a) cumplir las especificaciones exigidas por las normas legales de composición de yogur, es decir, el contenido mínimo en grasa y/o extracto seco magro; (b) estandarizar la calidad del yogur, es decir la acidez, la suavidad y la consistencia/viscosidad del coágulo, para satisfacer las exigencias de los consumidores. Los dos primeros factores pueden ser controlados durante las distintas fases de producción, pero la consistencia/viscosidad del yogur está condicionada por la concentración de proteínas en la leche, por lo que el enriquecimiento de la misma con extracto seco magro es un factor de importancia fundamental. B. Eliminación de las células y contaminantes presentes en la leche La leche puede contener células epiteliales o leucocitos procedentes de la glándula mamaria de la vaca y, en algunos casos, debido a la falta de cuidado durante la obtención de la leche, esta queda expuesta a una ulterior contaminación por paja, hojas, pelos, semillas excrementos, etc. 1

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El objetivo principal de los productores de leche es eliminar estos contaminantes para garantizar una máxima calidad de los productos elaborados, aunque en las vaquerías e industrias lácteas se emplean diversos métodos, el sistema más generalizado para esta depuración física es la filtración. A pesar de todo, este sistema tiene algunas limitaciones, entre otras que sólo permite eliminar las impurezas macroscópicas presentes en la leche. La utilización de separadores «bactófugos» en el proceso de elaboración del yogur no es estrictamente necesaria, ya que el tratamiento térmico al que es sometida la mezcla base (como se ve más adelante) es suficiente para eliminar o, como mínimo, reducir notablemente el número de microorganismos esporulados presentes en la leche destinada a la fabricación de yogur y, en cualquier caso, los microorganismos de este tipo que pudieran quedar no son causa de importantes problemas en la industria del yogur. Por tanto, el uso de tamices de tela para filtrar la leche cruda resulta más que suficiente, aunque en algunas ocasiones, cuando se utilizan productos lácteos en polvo para aumentar el contenido en extracto seco de la leche, es preciso utilizar tamices de tela metálica que permitan además separar las partículas de leche en polvo aglomeradas y no disueltas. C.

Estandarización o normalización del contenido en grasa de la leche

El contenido en grasa de los distintos tipos de yogur elaborados en distintas partes del mundo varía de un 0,1 a un 10 %, siendo necesario estandarizar la composición de la leche para cumplir las especificaciones fijadas por las normas legales o recomendadas de composición del yogur. Por ejemplo, en Reino Unido el contenido medio en grasa de la leche oscila de un 3,8 a un 4,2 % y el contenido en grasa del yogur comercial es de un 1,5 % aproximadamente en yogur entero y un 0,5 % en yogur desnata-do. (Los métodos empleados para la estandarización de la leche incluyen: (i) eliminación de parte de la grasa de la leche; (ii) mezcla de leche- entera y leche desnatada; (iii) adición de nata a leche entera o desnatada; (iv)

utilización de una combinación de los métodos (i) y (iii) es decir, utilización de

centrífugas para la estandarización.

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La cantidad de cada uno de los componentes necesarios para la estandarización de la leche mediante alguno de los métodos anteriores puede ser fácilmente calculada por el método de Pearson. D.-Estandarización del extracto seco magro de la leche El porcentaje de extracto seco magro de la leche destinada a la elaboración del yogur (que incluye principalmente lactosa, proteínas y sales minerales) viene regulado bien directamente por las normas legales de cada país. Cuando existen normas legales el extracto seco magro mínimo fijado oscila del 8.2 -8.6% el establecimiento de estos valores mínimos tienen por objeto la protección de los consumidores, garantizando el mantenimiento de un valor de extracto seco magro semejante al de la leche. El aumento del extracto seco de la mezcla destinada a la elaboración del yogur se puede lograr por diversos métodos, entre los que incluye: 1.- METODO TRADICIONAL: El método de concentración de la leche mas utilizado tradicionalmente ha sido el calentamiento de la misma. Este consiste en mantener la leche en ebullición hasta reducir el volumen al 2/3 del valor inicial y, aunque el objetivo principal es el aumento del extracto seco total de la leche, determina otras muchas modificaciones físico-químicas. 2.- ADICION DE LECHE EN POLVO: En la industria es muy frecuente la utilización de leche en polvo entera o desnatada, para el enriquecimiento de la leche destinada a la elaboración de yogur, de consistencia espesa y suave.

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3.- ADICION DE MAZADA EN POLVO: Se trata de un subproducto de la elaboración de mantequilla dulce aunque también puede obtenerse un tipo de mazada acida si se parte de nata madurada para la elaboración de mantequilla. La importancia para la industria Láctea y alimentaría en general de este producto en polvo

en alto contenido en grasas, se debe a su elevado contenido en

fosfolípidos, que le confiere una importantes propiedades emulsionantes. 4.- ADICION DE SUERO DE LECHE EN POLVO: Este producto se obtiene como subproducto de la elaboración de queso y su aprovechamiento en las industrias lácteas y otras industrias alimentarias ha sido revisado por Robinsón Y Tamime (1978). En el mercado existen muchos tipos diferentes de suero de leche procedentes de la elaboración de queso cuyas características dependen del procesado de los mismo, previos a la deshidratación, es decir desmineralización, eliminación de la lactosa, concentración de las proteínas, deshidratación directa, etc. El porcentaje de acción recomendado de cualquier tipo de suero de quesería para la elaboraron de yogur es del 1-2% ya que concentraciones superiores pueden originar una desagradable “FLAVOR A SUERO”. 5.- ADICION DE CASEINA EN POLVO: Se pueden elaborar distintos tipos de caseína en polvo a partir de leches desnatadas cuyas propiedades dependen de la técnica utilizada para la precipitación de la misma. Los principales tipo son: Caseína acida precipitada por adición de acido láctico, clorhídrico, o sulfúrico; Caseína coprecipitada o Caseína precipitada con quimosina. La caseína en polvo como su propio nombre los indica contiene principalmente caseína y su adición a la, mezcla base destinada a la elaboración del yogur supone un aumento de la concentración de proteínas en el producto y de su viscosidad. 1

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6.- CONCENTRACION POR EVAPORACION: La cantidad de agua eliminada oscila de un 10-25%, lo que equivale a un incremento del extracto seco total de 2-4%. Otras ventajas del proceso de evaporización son: 1.- la eliminación del agua de la leche y se hace al vacío, lo que permite además arrastrar el aire retenido, mejorando la estabilidad del coagulo y reduciendo la síntesis durante el almacenamiento del producto final. 2.- durante la elaboración del yogur de leche de cabra el proceso de evaporación mejora la consistencia que reduce el “flavor a cabra” del producto final. 7.- CONCENTRACIÓN POR FILTRACIÓN POR MEMBRANA: La filtración a través de membrana es un proceso desarrollado para concentrar y/o separa los sólidos de una mezcla acuosa, siendo los tipos mas comunes de filtración por membranas LA OSMOSIS INVERSA (OI), en ocasiones denominada hiperfiltracion y la ultrafiltracion(UF). Las diferentes aploicaciones de la OI y UF en las industrias lacteas han sido revisadas recientemente por Glover, et al 1978; siendo las principales diferencias entre estos dos sistemas los siguientes: a.- El proceso de OI separa los solutos de bajo peso molecular, inferior a 500 dejando pasar unicamente atraves de la membrana las moléculas de agua. b.- El proceso de UF simplemente filtra o tamiza la leche, de modo que las membranas solo retiene los compuestos de peso molecular elevado, superiores a 1000. El material que atraviesa la membrana se conoce como permeato. Durante el procesado de la leche (entera o desnatada) y/o del suero, la diferencias principal entre los permeatos obtenidos por ambos sistemas de filtración es que el permeato de los procesos e OI es únicamente agua, mientras que el permeato del proceso de UF contiene además lactosa, sales y vitaminas.

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D. Adición de estabilizantes/emulsionantes Para la elaboración de diversos productos lácteos, incluido el yogur, se emplean estabilizantes y/o emulsionantes, cuya utilización está regulada por la legislación vigente en la mayoría de los países. A nivel internacional, la FAO/OMS (1976) ha elaborado una lista de compuestos y de las concentraciones a las que estos pueden ser adicionados al yogur. En Reino Unido se han adoptado unas recomendaciones semejantes. La clasificación de estos estabilizantes/emulsionantes alimentarios ha representado siempre un problema, habiendo sido sugeridos distintos esquemas, por ejemplo: (a) inclusión de todos ellos como polisacáridos; (b) clasificación en función de su origen botánico; (c)

clasificación según su origen: animal, vegetal o sintético;

(d) clasificación según su naturaleza química. Esta última clasificación ha sido modificada recientemente por Glicksman (1969,1979), quien propone su clasificación en función de la técnica de procesado empleada, es decir: (a) gomas naturales (las que se encuentran como tales en la naturaleza); (b) gomas naturales modificadas o semisintéticas (es decir, gomas naturales químicamente modificadas o materiales semejantes a las gomas); (c) gomas sintéticas (obtenidas por síntesis química).

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F. Adición de azúcares y/o agentes edulcorantes Normalmente en la elaboración de yogur con frutas, yogur con sabor a frutas y, en algunos casos, de yogur natural azucarado o edulcorado, producto de limitada demanda, se suelen adicionar azúcares o agentes edulcorantes. La principal finalidad de la adición de azúcares o agentes edulcorantes es atenuar la acidez del producto. La cantidad de azúcar o edulcorante añadido depende de: -^ (i) el tipo de agente edulcorante o azúcar utilizado; (ii) las preferencias de los consumidores; (iii) la fruta utilizada; (iv) los posibles efectos inhibidores sobre los microorganismos estárter del yogur; (v) las limitaciones legales; (vi) consideraciones económicas. El yogur de frutas y el yogur aromatizado contienen por término medio hasta un 20 % de carbohidratos, los cuales proceden de: (a) la leche (lactosa, galactosa, glucosa), cuya concentración varía en función del extracto seco de la mezcla base y del método empleado para lograr el incremento del mismo; (b) los azúcares presentes en las frutas añadidas (sacarosa, fructosa, glucosa y maltosa); (c) los azúcares añadidos por los fabricantes de yogur o de las mezclas de frutas. 1

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Albaricoque Cerezas Grosella negra Mandarina Melocotón Pina Frambuesa Fresa

7,5 % 12,0 % 6,6 % 14,2 % 9,0 % 11,6 % 5,6 % 6,2 %

Sacarosa Este carbohidrato es muy abundante en el reino vegetal y se conoce vulgarmente como «azúcar». Su fórmula empírica es C12H22O11. El azúcar refinado se obtiene comercialmente a partir de la caña de azúcar o de la remolacha azucarera. Se utiliza mucho en la industria alimentaría como edulcorante, pudiendo ser obtenido en forma cristalizada o como jarabe. Es aconsejable añadir el azúcar antes de proceder al tratamiento térmico, ya que así se garantiza la destrucción de las formas vegetativas de los microorganismos contaminantes, mohos y levaduras osmófilas e incluso de algunos esporos. No obstante, si es preciso añadir el azúcar después de la formación del coágulo tienen que adoptarse las medidas necesarias para evitar la distribución heterogénea del mismo y una excesiva disminución de la consistencia del producto. 1

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2.

Azúcar invertido

Este carbohidrato se obtiene por «inversión» de un azúcar con actividad dextrorrotatoria, dando lugar a uno con actividad levorrotatoria o viceversa. Los distintos tipos de azúcar invertido dependen del producto de partida e incluyen: (a) Jarabe de sacarosa invertido. Este jarabe se obtiene por hidrólisis acida de la sacarosa a elevada temperatura, pudiendo oscilar el grado de inversión de un 10 a un 90%

3. Fructosa (Levulosa) La fructosa (azúcar de las frutas) tiene la misma fórmula empírica que la glucosa, C6H12O6, y como se puede ver en la Tabla 2.10, es más dulce que la sacarosa y la glucosa. Comercialmente la fructosa se obtiene principalmente por conversión del almidón. 4.

Glucosa (Dextrosa)

La fórmula empírica de la glucosa es igual a la de la fructosa y se obtiene comercialmente por hidrólisis del almidón de maíz. 5. Jarabe de glucosa/galactosa Este tipo de jarabe se obtiene a partir de suero de leche, subproducto de la industria quesera, de la obtención de caseínas y, en menor proporción, del permeato resultante de la concentración de la leche por ultrafiltración.¿La cantidad de lactosa presente en el suero es normalmente del 5 °/o pero, tal y como se muestra en la Tabla 2.7, el poder edulcorante relativo de la lactosa en comparación con el de la sacarosa es de 0,3, por lo que tiene que ser hidrolizada en sus monómeros componentes —glucosa y galactosa— para poder impartir sabor dulce (véase Tabla 2.7). La hidrólisis de la lactosa puede ser acida o enzimática.

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6.

Otros edulcorantes

El sorbitol es un alcohol obtenido comercialmente a partir de la glucosa por un proceso de reducción por el cual el grupo aldehído de la molécula de glucosa (—CHO) es convertido en un grupo alcohol (CH2OH). Aunque el poder edulcorante relativo del sorbitol es de 0,5 con respecto al de la sacarosa , tiene gran aplicación en la fabricación de yogur de frutas o aromatizado para diabéticos, ya que la absorción del sorbitol en el tracto intestinal es más lenta que la de la glucosa, por lo que tiene poco efecto sobre la concentración sanguínea de azúcar. No obstante, no se recomienda consumirlo diariamente, ya que la ingestión de grandes cantidades del mismo causa diarreas. (Davidson et al, 1979). La sacarina y el ciclamato son agentes edulcorantes artificiales con un poder edulcorante de 240 a 350 y de 30 a 80 veces superior al de la sacarosa respectivamente. Sin embargo, debido a su posible toxicidad, el ciclamato ha sido prohibido como aditivo alimentario en muchos países-y, aunque la sacarina aún está permitida, su utilización está siendo muy controlada por las autoridades sanitarias de casi todo el mundo. Por tanto, la utilización de estos edulcorantes en la industria alimentaria está limitada y en este texto se comprobará que se dispone de poca información relativa al efecto de los mismos sobre la actividad de los estárters del yogur. G. Adición de otros ingredientes Algunos fabricantes de yogur añaden determinadas sustancias a la leche durante el proceso de elaboración con la finalidad de conseguir unos objetivos específicos. A continuación se incluyen algunos ejemplos de dichos aditivos. 1.

Penicilinas

La inyección vía intramamaria de antibióticos es un tratamiento ampliamente difundido frente a las mastitis del ganado vacuno, pudiendo los residuos de los antibióticos administrados inhibir el crecimiento de S. thermophilus y L. bulgaricus. Aunque se han establecido normas legales en los distintos países limitando la concentración de estas sustancias inhibidoras en la leche estas pueden, incluso a las concentraciones permitidas, reducir la actividad de los cultivos estárter del yogur. Como 1

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consecuencia de ello se han buscado métodos para inactivar los distintos antibióticos, habiéndose logrado bastante éxito en el caso de la penicilina. La inactivación de la penicilina se consigue utilizando una enzima, la penicilinasa (βlactamasa) contenida en el filtrado de cultivos de distintas especies del género Bacillus, existiendo una preparación comercial conocida como Bactopenasa (Anón., 1971). La (β -lactamasa hidroliza específicamente las amidas cíclicas, es decir el anillo(βlactámico de la penicilina, dando lugar a un compuesto que carece de actividad antibiótica.

2.

Conservantes

En la industria alimentaria, incluyendo la del procesado de frutas, se utilizan distintos tipos de conservantes para inhibir el crecimiento de mohos y levaduras. El ácido sórbico se puede obtener comercialmente en polvo, tanto como ácido (CH3. CH—CH.CH—CH.COOH) como en forma de sal sódica o potásica (CH3.CH—CH.CH — CH.COOK o Na) es decir, como sórbalo sódico o potásico. 1

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Las sales son más utilizadas que el ácido y su actividad antimicótica se manifiesta a valores de pH bajos (inferiores a 6,5, a los que la sal se encuentra disociada como ácido libre (Anón., 1974, 1981b). Debe tenerse en cuenta que la actividad inhibidora de los sorbatos sódico y potásico equivale sólo a un 75 % de la del ácido sórbico. Un 0,13 % de sorbato sódico o potásico tiene una actividad equivalente a la de un 0,1 °h de ácido sórbico (1.000 pprn). El ácido sórbico es un agente micostático, es decir, no destruye los mohos o levaduras presentes en el producto, sino que simplemente inhibe su actividad, probablemente por interferencia con sus deshidrogenasas. Hamdan, Deane y Kunsman (1971) han estudiado el efecto del sorbato potásico sobre la actividad de los cultivos estárter del yogur, observando una disminución del crecimiento, del desarrollo de la acidez y de la producción de acetaldehído. Las cantidades de sorbato potásico añadidas en el estudio fueron de un 0,05 y un 0,1 % en peso, lo que equivale a 375 y 750 ppm de ácido sórbico libre respectivamente. HOMOGENIZACIÓN La homogeneización consiste literalmente en la formación de una emulsión homogénea de 2 líquidos inmiscibles, esto es, aceite-grasa y agua. Entre los productos lácteos exis-tí 1 distintos tipos de emulsiones que se pueden englobar en dos categorías: (a) Emulsiones de aceite en agua, en las que las gotas de aceite o grasa se encuentran dispersas en la fase acuosa. En esta categoría se incluyen la mayoría de los productos lácteos homogeneizados. (b) Emulsiones de agua en aceite, en las que las gotitas de agua se encuentran dispersas en la fase oleosa, siendo la mantequilla el ejemplo más característico. A.

Efectos sobre la grasa

El diámetro de los glóbulos grasos de la leche varía de 1 a 10 u con un valor medio de 3,5 u. Esta variación en el tamaño de los glóbulos grasos depende directamente de los mismos factores que influyen sobre la composición química de la leche, es decir: —Raza. —Fase de lactación. —Edad y estado sanitario de la vaca. —Alimentación, etc. 1

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En cualquier caso la homogeneización supone: (i) Una disminución del diámetro medio de los glóbulos grasos hasta un valor inferior a 2 u); (ii)

Evita la formación de grumos de glóbulos grasos y la tendencia de la grasa acu-

mularse en la superficie; (iii) Disminuye la aglutinación y la fuerza ascensional efectiva debido a la adsorción de micelas y submicelas de caseína. B.

Efectos sobre las proteínas de la leche

Las proteínas de la leche (la caseína y las proteínas del lactosuero) pueden experimentar una o varias de las siguientes modificaciones: (a) desnaturalización de las proteínas del lactosuero; (b)

interacciones entre la caseína y las proteínas del lactosuero como resultado de la

desnaturalización de las últimas y/o de una modificación del equilibrio salino; (c)

producción de compuestos sulfhidrilo a partir de las proteínas del lactosuero

desnaturalizadas. C. Efectos sobre otros constituyentes de la leche Estos efectos y/o modificaciones se presentan en la Tabla 2.10 Los efectos deseables de la homogeneización sólo pueden lograrse si se mantienen determinadas condiciones durante el proceso, principalmente: (i) concentración de grasa apropiada en la mezcla tratada; (ii)

presión de homogeneización correcta;

(iii)

temperatura de homogeneización adecuada.

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TRATAMIENTO TÉRMICO Aunque el calentamiento de la leche por ebullición ha sido utilizado en el proceso de elaboración de yogur como método para conseguir incrementar la concentración de extracto seco lácteo en la mezcla base, los efectos del tratamiento térmico se pueden resumir fundamentalmente en los siguientes: (a)

destrucción y/o eliminación de microorganismos patógenos y otros microorganis-

mos indeseables; (b) producción de factores estimulantes o inhibidores de los cultivos estárter del yogur; (c) cambios en las propiedades fisicoquímicas de los componen ¡es de la leche. A. Destrucción de microorganismos patógenos El tratamiento térmico al que es sometida la leche destinada a la producción de yogur es suficiente para destruir la mayor parte, si no todas, las formas vegetativas de los microorganismos presentes en la leche cruda (Gilmour y Rowe, 1981), pero algunos microorganismos esporulados y algunas enzimas termoestables pueden resistir estos tratamientos Una elevada contaminación por bacterias psicrófilas puede implicar una degradación de la caseína (β y ∞Sj (DeBenkellar et al., 1977) y de los constituyentes de la grasa de la leche. La degradación de la caseína puede dar lugar a un coágulo frágil y a la subsiguiente separación del suero y el enranciamiento político a la aparición de aromas extraños (Cousin 1977; Cousin y Martle, 1977a, b). Otro aspecto importante a destacar es que las enzimas (peptidasas y lipasas) de algunas especies de Pseudomonas son termoestables, siendo necesario recurrir a tratamientos térmicos extremadamente intensos, por ejemplo de 150 °C para lograr su inactivación (Mayerhofer et al, 1973; Adams y Brawley, 1981). Afortunadamente, la presencia de estas enzimas no representa un problema significativo en la industria del yogur (Cogan, 1977). B.

Producción de factores estimulantes e inhibidores

El calentamiento de la leche puede determinar la producción de ciertos factores que pueden estimular o inhibir la actividad de los cultivos estárter láctico. El trabajo de Greene y Jezeski (1957) resume el conjunto de estos fenómenos del modo siguiente: 1

Licenciado en Biología, Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”. Maestrante en Ciencias con mención en Ingeniería Ambiental. EPG. UNPRG. Lambayeque. Correo- e: [email protected]. Tel. Cel. (074978876178). Av. Arequipa 217 José Olaya .Chiclayo.

(1) estimulación de los cultivos estárter en leche sometida a un tratamiento térmico de 62 °C/30 minutos o de 72 °C/40 minutos; (2) inhibición de los cultivos estárter en leche sometida a un calentamiento entre 72 °C durante 45 minutos, 82 °C durante 10-120 minutos o 90 °C durante 1-45 minutos(3) estimulación de los cultivos estárter en leche sometida a un tratamiento térmico de 90 °C durante 60-80 minutos o a 120 °C durante 15-30 minutos; (4)

inhibición de los cultivos estárter en leche sometida a tratamiento en autoclave

(120 °C) durante más de 30 minutos. C.

Cambios en las propiedades físico-químicas de la leche

La leche presenta una estructura muy compleja siendo sus constituyentes principales agua, carbohidratos, grasa, proteínas y minerales. 1.

Efecto sobre las proteínas

Cheeseman (1975), Whitney et al. (1976) y Banks, Dalgleish y Rook (1981) han estudiado en profundidad las proteínas de la leche de vaca. La fracción proteica de la leche de vaca comprende:

Las caseínas constituyen la fracción mayoritaria de las proteínas de la leche de vaca, jugando un papel primordial durante la elaboración de determinados productos lácteos, como el yogur o el queso. Aunque la estructura de estas proteínas no ha sido completamente definida se han propuesto diversos modelos, pero en general se admite que se encuentran formando micelas o agregados de submicelas constituidas básicamente por caseínas (∞Sj y (β estabilizadas por caseína K, asociadas con calcio y fosfato de calcio (Banks, Dalgleish y Rook, loe. cit.). 1

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(a) Las propiedades hidrofílicas óptimas de las proteínas y por tanto la coagulación de la mezcla del yogur se manifiestan tras el calentamiento de la leche a 85 °C durante 30 minutos (Grigorov, 1966b, c). (b) El efecto del calor sobre las proteínas, de acuerdo con Parry (1974), tiene lugar en dos etapas. En primer lugar se produce una alteración de la estructura, causando la desnaturalización y, en segundo lugar, una agregación seguida de coagulación, dependiendo de la intensidad y duración del calentamiento. Como resultado del tratamiento térmico los grupos —SH de la (β -Lg se activan (Jenness y Patton, loe. cit.) Los agregados formados son de dos tamaños dependiendo de los grupos reactivos involucrados: agregados pequeños de (β -Lg (3,7 S) con grupos —SH libres y agregados de (β -Lg de mayor tamaño (29 S) en los que hay un importante número de puentes disulfuro (S-S) (Sawyer, 1969; Lyster, loe. cit.; McKenzie, 1971). Los datos publicados sobre la desnaturalización de la (β -lactoglobulina por el calor reconocen la interacción entre la (β -Lg y la K-caseína. No obstante, las últimas investigaciones de Elfagm y Wheelock (1977, 1978a,b) sugieren que la a-La también está implicada. La reacción puede esquematizarse del modo siguiente:

2. Efecto sobre otros componentes de la leche Aunque resulta evidente que los componentes de la leche más afectados por el tratamiento térmico a las temperaturas normalmente aplicadas durante la fabricación de yogur son las proteínas, también pueden tener lugar otros cambios como consecuencia del calentamiento, incluyendo entre los más significativos los siguientes. (a)

La mayor superficie de los glóbulos de grasa resultante de la homogeneización a

temperaturas de 60 °C o superiores es ocupada parcialmente por material de membrana 1

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y en parte por componentes tensoactivos, como caseínas o proteínas del lactosuero desnaturalizadas. Lyster (loc.cit.) ha propuesto que es más probable que sean las proteínas del lactosuero, ya que a estas temperaturas solo tiene lugar una ligera modificación/desnaturalización de las mismas. (b)

El calentamiento de la leche puede afectar al estado de las sales en la leche, espe-

cialmente al del calcio, fosfato, citrato y magnesio. Estas sales se encuentran en la leche en forma soluble o en estado coloidal, formando parte de las micelas de caseína. El calentamiento de la leche a 85 cC/30 minutos puede dar lugar a un paso del 16 % del calcio soluble a la fase coloidal (Kannan y Jenness, 1961).

PROCESO DE FERMENTACIÓN La formación del gel que constituye el yogur es el resultado de las siguientes modificaciones físicas y químicas de la leche: (a) Los estárters del yogur metabolizan la lactosa presente en la leche para cubrir sus necesidades energéticas, dando lugar a la formación de ácido láctico y de otros compuestos importantes. (b) La producción gradual de ácido láctico comienza a desestabilizar los complejos de caseína-proteínas del lactosuero desnaturalizadas, por solubilización del fosfato calcico y de los citratos. (c)

Los agregados de micelas de caseína y/o las micelas aisladas se van asociando y coalescen parcialmente a medida que el pH se aproxima a su punto isoeléctrico, es decir, 4,6-4,7.

(d)

Es probable que la interacción de la a-La/j3-Lg con la /c-caseína a través de los grupos SH con la formación de puentes disulfuro proteja parcialmente a las micelas frente a una compleja desestabilización o ruptura, por lo que la red del gel o matriz queda formada por una estructura regular que atrapa en su interior al resto de los componentes de la mezcla base, incluyendo la fase acuosa.

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ENFRIAMIENTO La elaboración de yogur es un proceso biológico, siendo la refrigeración uno de los métodos tradicionales más empleados para controlar la actividad metabólica de los cultivos estárter y sus enzimas. Debido a la escasa actividad de los microrganismos del yogur a temperaturas de 10 °C aproximadamente, el objetivo básico del enfriamiento es disminuir la temperatura del coágulo de 30-45 °C a menos de 10 °C (preferiblemente a unos 5 °C) tan rápidamente como sea posible, para así controlar la acidez final del producto. El proceso de enfriamiento puede llevarse a cabo de las siguientes formas: A. Enfriamiento en una sola fase En este proceso el coágulo se enfría directamente desde la temperatura de incubación hasta temperaturas inferiores a 10 °C antes de proceder a la adición de los agentes aromatizantes y al envasado del producto. El fundamento de este método es que el coágulo es más estable a bajas temperaturas que a temperaturas superiores a 20 °C, por lo que tienen lugar menos alteraciones durante las etapas posteriores, es decir, durante las manipulaciones necesarias para la adición de frutas y aromas o durante el envasado para la posterior comercialización. B. Enfriamiento de dos fases Durante la primera fase del proceso se reduce la temperatura del coágulo de 30-45 °C a 15-20 °C, antes de la adición de los aromatizantes y del envasado. La segunda fase de enfriamiento se realiza en cámaras de refrigeración en las que el yogur se enfría hasta temperaturas inferiores a 10 °C. El enfriamiento final tiene lugar por tanto en el envase de comercialización, mejorando notablemente la viscosidad del producto tras 1-2 días de almacenamiento en reposo.

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ADICIÓN DE AROMATIZANTES Y COLORANTES A. Frutas Se pueden utilizar frutas frescas, pero el carácter estacional de la producción de las mismas y la variabilidad de su calidad limita considerablemente su utilización en la industria, siendo más populares las conservas de frutas, especialmente por la posibilidad de estandarizar la mezcla de frutas con objeto de cubrir las especificaciones requeridas por los consumidores. Estos tipos de frutas se pueden clasificar del modo siguiente: 1.

Confituras de frutas

Las frutas son procesadas con pequeñas cantidades de jarabes de azúcares para dar lugar a un producto final que contiene un 70 % de fruta y un 30 % de agua.- Este producto se puede denominar como «puro o natural», ya que no lleva añadidos conservantes ni colorantes. Dependiendo de la técnica empleada, el producto puede ser notablemente aromático, pero los colores naturales de las frutas se vuelven pálidos debido al efecto del tratamiento térmico. Es también importante señalar que estos productos resultan caros, razón principal de su limitada demanda por la industria. 2. Frutas en conserva Este tipo de frutas es similar al anterior, pero en estas conservas está permitida la adición de algunos aditivos, como por ejemplo: (a) colorantes que contrarresten la pérdida del color natural de las frutas. (b) estabilizantes que conserven la estructura de la fruta procesada y mejoren la viscosidad del producto. (c) aromatizantes que mejoren la aceptación del producto final por los consumidores. 3. Frutas congeladas Algunas frutas pueden congelarse a temperaturas de —20 °C para su posterior utilización. Cuando este tipo de producto va a ser utilizado se procede a su descongelación, se le añade agua y finalmente se somete a calentamiento. 4. 1

Otros productos

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(a) Purés de frutas. En este tipo de preparados las frutas son homogeneizadas hasta dar lugar a una pasta en la que se pierde la forma de las frutas y de la que puede eliminarse la fibra. (b) Jarabes de frutas. Se trata de productos claros libres de sólidos a los que se adiciona un azúcar o agente edulcorante. (c)

Mermeladas. Las mermeladas sólo se utilizan para la fabricación de determinados

tipos de yogur tradicional o cuando no se dispone de otro tipo de conserva de fruta. B.

Aromatizantes

El tratamiento térmico de los preparados de frutas puede originar una disminución de la intensidad del aroma, por lo que frecuentemente se adicionan agentes aromatizantes para compensar estas pérdidas. Los aromatizantes se dividen en función de su origen en tres grupos: (i) Aromas y aromatizantes naturales origen botánico; (ii) sustancias aromatizantes idénticas a las naturales,-(iii)

sustancias aromatizantes sintéticas o artificiales, (origen

químico). C.

Otros agentes aromatizantes

Para la elaboración de yogur aromatizado se utilizan distintos productos alimenticios y alimentarios, incluyendo bebidas alcohólicas (véase Tabla 2.17), por ejemplo: (i)

productos dulces (miel, jarabe de arce, caramelo de azúcar con mantequilla),

(ii)

frutos secos (coco, avellana, nueces, nueces del Brasil),

(iii)

cereales .

(iv)

hortalizas (pepino, tomate, apio),

(v)

otros (café, moka, especias, pimentón, vainilla).

La adición de colorantes a los yogures de frutas o aromatizados persigue aumentar el atractivo del producto. 'Las sustancias utilizadas pueden ser colorantes naturales o sintéticos. La lista de colorantes autorizados como aditivos alimentarios en Reino Unido incluye unos 39 compuestos y su inclusión es apoyada por la Food And Drugs Act, 1973 (modificaciones de 1975, 1976 y 1978). En otros países existen listas similares, pero hay que resaltar que los colorantes autorizados no son los mismos en todos los países. 1

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No obstante, la FAO/OMS (1976) ha establecido unas orientaciones sobre los colorantes y las concentraciones a las que pueden ser utilizados en el yogur, suponiendo que estos agentes provienen directamente de las frutas o aromatizantes (véase Tabla 2.18).

ENVASADO El envasado es una etapa muy importante del proceso de elaboración del yogur. Paine (1967) definió el objetivo del envasado de alimentos del siguiente modo: «El envasado es una forma de asegurar la distribución del producto hasta el consumidor final en adecuadas condiciones y con un mínimo costo».

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BIOQUIMICA DE LA FERMENTACIÓN Los microorganismos mantienen sus ciclos vitales mediante un gran número de complejas e interrelacionadas rutas metabólicas, con funciones biosinteticas y energéticas. Cada ruta metabólica comprende múltiples reacciones reguladas por diferentes sistemas enzimáticos, por lo que es la síntesis y la actividad de la enzima la que mantienen y controla las funciones de la célula microbiana. (Stanier, Doudoroff, 1971) METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS A.- Rutas metabólicas: Los microorganismos cubren sus necesidades energéticas por diferentes vías, por ejemplo el sistema citocromo de transporte de electrones, las enzimas de las rutas anapleróticas, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos o la fermentación. Las bacterias ácido lácticas no poseen ninguno de los tres primeros sistemas mencionados, por lo que sólo pueden obtener la energía a través de la fermentación de los carbohidratos (Lawrence, Thomas & Terzaghi, 1976); siendo la lactosa el único azúcar presente en la leche y utilizado para este fin por los microorganismos del yogur. El catabolismo de la lactosa por S. thermophilus y L. bulgaricus tiene lugar en el interior de la célula microbiana, por lo que el paso inicial es el transporte de las moléculas de lactosa a través de la pared celular. En los estreptococos homofermentativos del grupo N, el transporte de lactosa a través de la pared celular implica la participación del sistema fosfotransferasa (SPT); dependiente del fosfoenolpiruvato (PEP), siendo fosforilada la lactosa a glucosil; β-(l, 4)-galactosa-6P (Lactosa-P) durante esta incorporación. Una vez en el interior de la célula la lactosa-P es hidrolizada hasta D-glucosa y galactosa-6P por acción de la enzima β -D-fosfogalactosidasa (β -P gal). La glucosa es metabolizada hasta piruvato por la vía de Embden Meyerhof (EMP) y el piruvato convertido en ácido láctico por la lactato deshidrogenasa; los pasos iniciales corresponden a los de la ruta glucolítica normal. El metabolismo de la galactosa-6P se diferencia del de la glucosa en que, en primer lugar, es convertida en gliceraldehído-3P por la ruta D-tagatosa-6P y, en segundo lugar, el 1

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gliceraldehído-3P es catabolizado hasta piruvato y ácido láctico por el ciclo glucolítico (Lawrence, Thomas & Terzaghi, loe. cit.; Law & Sharpe, 1978; Lawrence & Thomas, 1979). Si estas rutas metabólicas y de transporte son las que tienen lugar en los microorganismos del yogur es un hecho que todavía no se conoce con seguridad. Resulta más probable que el transporte de la lactosa a través de la pared celular de S.thermophilus y L. bulgaricus este mediado por la acción de una galactosa-permeasa. Estos microorganismos poseen (β -D-galactosidasa), enzima que hidroliza la lactosa en el interior de la célula hasta D-glucosa y β-D-galactosa. La D glucosa es metabolizada, tanto en el caso de S.thermophilus como en el de L. bulgaricus, hasta ácido láctico, como ocurre en los estreptococos lácticos del grupo N, pero el catabolismo de la galactosa por los microorganismos de la flora del yogur no se conoce con certeza. La evidencia del acumulo de galactosa en el yogur (Goodemough & Kleyn, 1976; O'Leary & Woychikm 1976a, b: Tamine, 1977a, b) indica que este monosacárido no es intensamente metabolizado y pasa al medio a través de la membrana celular. Sin embargo, se ha señalado la presencia de una segunda enzima, la |3-Pgal (también presente en los cultivos estárter de los quesos) tanto en L. bulgaricus (Permi, Sandine & Elliker, 1972) como en S. thermophilus (Somku-ti & Steinberg, 1978, 1979a; Farrow, 1980), estando indicadas las actividades relativas de la β -gal y la β –P gal en los microorganismos del yogur, presentando normalmente una mayor actividad la primera. No obstante, es posible que la actividad de la β –P gal aumente en ciertas condiciones, es decir, en medios sintéticos, en los que la galactosa es metabolizada por algunas cepas de L. bulgaricus (Snelí, Kitai & Hoff-Jorgensen, 1948) y S. themophilus (Reddy, Williams & Reinbold, 1973; Somkuti & Steinberg, 1979b; ). La presencia de las enzimas β -gal y β Pgal en los microorganismos del yogur determina que la hidrólisis intracelular de la lactosa de lugar a D-glucosa, β -D-galactosa y/o galactosa-6P. En vista de que algunas bacterias del yogur son capaces de fermentar la galactosa, es posible que la galactosa-6P sea cataboliza la hasta ácido láctico por la misma vía D-tagatosa-6P presente en los estreptococos del grupo N.

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B. Producción de ácido láctico El catabolismo de la lactosa-por S. thermophilus y L. bulgaricus determina principalmente la producción de ácido láctico y, aunque el proceso comprende muchas reacciones bioquímicas, puede simplificarse en la siguiente ecuación;

La importancia del ácido láctico en la elaboración del yogur se debe a las siguientes razones: en primer lugar contribuye a la desestabilización de las micelas de caseína mediante el paso del fosfato y del calcio de un estado coloidal (en las micelas) a una forma soluble, que difunde en la fracción acuosa de la leche, lo que determina una progresiva deplección de 1

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calcio de las micelas que conduce a la precipitación de la caseína a valores de pH de 4,6 a 4,7, dando lugar a la formación del gel que constituye el yogur. Una vez alcanzada esta condición, se forma láctato calcico soluble y, de acuerdo con Dyatchenko (1971), la reacción de desestabilización puede resumirse como sigue:

En segundo lugar, el ácido láctico proporciona al yogur su sabor característico, es decir ácido, pudiendo también contribuir o acentuar el «flavor» a nuez y/o aromático del producto. Las bacterias acido-lácticas poseen la enzima lacticodeshidrogenasa (LDH), que cataliza la síntesis de lactato a partir del ácido pirúvico Lactato, es decir, ácido láctico, es una voz de origen latino empleada para designar el ácido procedente de la leche. Se pueden producir distintos isómeros de ácido láctico, l( + ), d(-) y d(±), los cuales difieren en la configuración del segundo átomo de carbono, siendo las siguientes:

En los cultivos estárter de yogur, S. thermophilus produce principalmente ácido l(+) láctico (Garvie, 1978; Hemme, Nardi & Wahl, 1981), mientras que L. bulgaricus produce ácido d(-) láctico (Gasser, 1970; Gasser & Gasser, 1971; véase también la revisión de Tamine & Deeth, 1980). La LDH se localiza en el citoplasma de la célula bacteriana y, de acuerdo con Garvie (1980), la actividad de esta enzima depende, en los microorganismos de la flora del yogur, del NAD (nicotín adenín dinucleótido)/NADH (forma reducida del NAD). La primera coenzima se regenera a partir del NADH durante la conversión del ácido pirúvico en ácido láctico. Sin embargo, algunas cepas de S. thermophilus contienen una forma de LDH que es activada por 1

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la fructosa 1,6-difosfato (FDP) (Wolin, 1964; Garvie, 1980), siendo tales enzimas completamente dependientes de la FDP a valores de pH fisiológicos. La reacción es prácticamente irreversible y la enzima reacciona débilmente con ácido láctico y NAD. Durante la elaboración del yogur el crecimiento de S. thermophilus es más rápido que el de L. bulgaricus, por lo que se produce en primer lugar ácido L(+) láctico y a continuación ácido D(-) láctico, siendo el porcentaje entre estos isómeros indicativo de los siguientes hechos: (a)

Si el yogur contiene más de un 70 % de ácido l(+) láctico ello indica que ha sido

inoculado con un cultivo estárter consistente principalmente en S. thermophilus (Kunath & Kandler, 1980), que la fermentación se ha desarrollado a temperaturas inferiores a 40 °C o, si el yogur contiene un 0,8 °Io o menos de ácido láctico, que ha sido refrigerado cuando presentaba una acidez «baja», (b) Si el yogur contiene más ácido d(-) láctico que l(+) láctico, ello indica: que ha sido incubado a una temperatura demasiado alta, es decir, de 45 °C o superior, que ha sido incubado durante mucho tiempo, por lo que el producto ha alcanzado una acidez muy alta, que ha sido almacenado por un período de tiempo prolongado, que el inoculo de estárter fue superior al 3 %, o bien que el cultivo estárter empleado contenía más bacilos que cocos. El yogur contiene normalmente un 45-60 % de ácido l(+) lático y un 40-55 % de ácido d(-) láctico (Puhan, Banhegyi y Flüler, 1973; Puhan, Flüler y Banhegyi, 1973, 1974; Vanderpoorten y Renterghem, 1974; Kielwein & Daun, 1980; Aleksieva, Girginova y Kondratenko, 1981), pudiendo emplearse la relación entre el contenido en las formas l(+) y D(-) como control de calidad del producto. No obstante, Puhan, Flüler y Banhegyi (1973, 1974) analizaron 269 muestras de yogur comercial encontrando que la relación l(+):d(-) oscilaba de 0,34 (en los productos muy ácidos) a 8,28 (es decir, con un claro predominio de la forma l(+). Blummenhal y Helbling (1974) han propuesto que para un «yogur de buena calidad» el valor del cociente debería ser de 2. Sin embargo, estas aproximaciones serían de mayor validez en los casos en los que la calidad del producto (es decir, dulce o de baja acidez o ácido o de elevada acidez) tenga que modificarse para cubrir las demandas de los consumidores, es decir, que el yogur ácido deberá presentar una relación l(+):d(-) baja y viceversa. C. Producción de los compuestos responsables del «Flavor» 1

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Los cultivos estárter son los principales responsables de la producción de los compuestos que contribuyen al aroma del yogur, los cuales pueden ser agrupados en cuatro categorías: —ácidos no volátiles, como el láctico, pirúvico, oxálico o succínico; —ácidos volátiles, como el fórmico, acético, propiónico o butírico; —compuestos con grupos carbonilo, como acetaldehído, acetona, acetoína o diacetilo; —un grupo heterogéneo de sustancias, entre las que se incluyen algunos aminoácidos y/u otros compuestos formados por degradación de las proteínas, la grasa o la lactosa por acción de la temperatura.

Otros compuestos posiblemente relacionados, quizás indirectamente, con el aumento del flavor característico o que podrían actuar como precursores de los principales responsables del aroma del yogur son: Ácidos grasos volátiles: ac. acético, ac. propiónico, ac. butírico, ac. isovalérico, ac. caproico, ac. caprílico y ac. cáprico (Turic, Rasic y Canic, 1969; Dumont & Adda, 1973) Aminoácidos: serina, ac. glutámico, prolina, valína, leucina, isoleucina y tirosina (Groux, 1976), Productos procedentes de la degradación por acción del calor, de determinados constituyentes de la leche, a temperaturas de 80-90 °C durante 15-30 minutos (Viani & Horman, 1976), como son: (a)

Procedentes de la degradación de la grasa:

(i)

Ceto-ácidos (acetona, butanona, hexanona). (ii)

caprolactona, 5-caprilactona). (iii)

Hidroxiácidos (v-valerolactona, 5-

misceláneos (2-heptanona, 2-nonanona, 2-undecanona,

pentano). (b)

Procedentes de la degradación de la lactosa (furfural, furfuril- alcohol, 5-

metilfurfural, 2-pentilfurano). 1

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(c)

Procedentes de la grasa y/o la lactosa (Alcohol bencélico, benzaldehído,

metilbenzoato). (d)

Procedentes de la degradación de las proteínas:

(i)

metionina (dimetilsulfhídrico). (ii)

valina (isobutiraldehído). (iii)

fenilalanina

(fenilacetaldehído). n-pentaldehído y 2 heptanona producidos por L. bulgaricus (Yu & Nakaniski, 1975a, b; Gronx & Moinas, 1974).

El trabajo publicado por Lees & Jago (1976a,b) confirma la formación de acetaldehído y etanol a partir de la glucosa por acción de S. thermophüus y L. bulgaricus, estando catalizada la reacción por la aldehido deshidroge-nasa y la alcohol deshidrogenasa. La primera de estas enzimas está presente en ambas especies microbianas pero la segunda, es decir, la alcohol deshidrogenasa, sólo se encontró en 3 de 4 cepas de S. thermophylus . La síntesis de acetaldehído por la aldehido deshidrogenasa supone la reducción del acetilCoA o del acetato y la alcohol deshidrogenasa reduce el acetaldehído a etanol (Lees & Jago, 1978a). La enzima principalmente relacionada, dentro de este contexto, con el metabolismo de la treonina es la treonin- aldolasa, que la presentan tanto S.thermophilus como L. bulgari-cus. No obstante la treoninaldolasa de los lactobacilos es más activa que la de los estreptococos 1

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(Lees y Jago, 1976a, b, 1977) y, de acuerdo con Lees y Jago (1978a) la reacción de degradación es la siguiente:

Otro amino ácido, la metionina, puede determinar también un aumento en la concentración de acetaldehído en un medio de cultivo sembrado únicamente con S. íhermophilus (Shankar, 1977). Sharkar observó que enriqueciendo el medio de cultivo con 100-400 mg/ml de metionina, la concentración de acetaldehído tras 20 horas de incubación se incrementaba de 1 ppm en el control a 10 y 14 ppm respectivamente en los cultivos estudiados. La conversión propuesta de la metionina en acetaldehído y glicina .

Finalmente, Lees & Jago (1977) detectaron actividad desoxirriboaldolasa en una de cuatro cepas de S. thermophilus estudiadas, pero esta actividad enzimática no se detectaba en L. bulgaricus Esta enzima, junto con la timidina fosforilasa y la desoxi-rribomutasa, degrada el DNA hasta 2-desoxirribosa-5-fosfato, que es posteriormente hi-drolizado rindiendo acetaldehído y gliceraldehído. Por tanto puede observarse, que la producción de acetaldehído por S. thermophilus y L. bulgaricus implica varias rutas metabólicas diferentes.

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METABOLISMO PROTEICO Aunque los cultivos estárter del yogur sólo son débilmente proteolíticos, S. thermophilus y L. bulgaricus pueden provocar durante la fermentación un significativo grado de proteolisis, actividad importante por las siguientes razones: (a)

La proteolisis enzimática de las proteínas de la leche determina la liberación de

péptidos de tamaño variable y de aminoácidos libres y estos cambios afectan a la estructura física del yogur. (b)

Como ya se ha estudiado, la liberación de aminoácidos en la leche resulta esencial

para el crecimiento de S. thermophilus. (c)

Aunque los aminoácidos y peptidos no contribuyen directamente al desarrollo del

flavor del yogur, actúan como precursores de multitud de reacciones que conducen a la formación de compuestos responsables del mismo (véase Goux, loe. cit.; Viani y Horman, loe. cit.).

1. Constituyentes de las proteínas lácteas La fracción nitrogenada de la leche está constituida por la caseína, las proteínas del suero y los compuestos nitrogenados no proteicos. Aunque las moléculas proteicas son muy complejas, es importante describir brevemente la estructura de las mismas e indicar l0 puntos en los que puede tener lugar la proteolisis. Los constituyentes esenciales de las proteínas son los aminoácidos, habiendo sido identificados unos 19-20 distintos en las proteínas lácteas, siendo su estructura la siguiente:

Cada aminoácido consta de uno o más grupos amino (NH3+) y uno o más grupos carboxilo. Todos los aminoácidos, a excepción de la glicina, presentan el carbono-a (al que están unidos el grupo amino y el grupo carboxilo) asimétrico. La nomenclatura de los aminoácidos es similar a la de los carbohidratos, es decir D y L indican la configuración del carbono-a. 1

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Algunos aminoácidos, como la prolina, que es considerada como un iminoácido, aunque su estructura es similar a la de los ∞-aminoácidos, son cíclicos. Los aminoácidos son las unidades básicas de las moléculas proteicas, estando constituidas las cadenas polipeptídicas por distintas secuencias aminoacídicas. La estructura dé la cadena responde a la siguiente fórmula:

La formación de una cadena polipeptídica supone la pérdida de una molécula de agua por cada unión de dos aminoácidos. Los enlaces entre aminoácidos se conocen como enlaces peptídicos: —NH.CO—. Además, las cadenas polipeptídicas se mantienen unidas unas a otras por distintos tipos de enlaces, como puentes de hidrógeno, enlaces covalentes y enlaces no covalentes, conduciendo su agregación a la formación de la molécula proteica. 2. Enzimas proteolíticas Estas enzimas, como su propio nombre indica, tienen una acción específica, siendo su función catalizar la hidrólisis de los enlaces peptídicos que mantienen el esqueleto de la molécula proteica. La acción de las enzimas proteolíticas sobre los enlaces peptídicos sé puede representar del modo siguiente:

Es posible que este sistema sea ampliamente aceptado, por lo que en este texto se denominaran las peptidasas y proteasas de acuerdo con el mismo. La hidrólisis de las proteínas hasta aminoácidos tiene lugar principalmente en dos etapas:

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A. Péptido hidrolasas de los microorganismos del yogur Los datos recopilados por Tamine y Deeth (loe. cit.) sobre la actividad proteolítica de S. thermophilus y L. bulgaricus indican que ambos microorganismos poseen diversas peptidasas y proteasas. La actividad peptidasa de los primeros es superior a la de L. bulgaricus, pero sólo presentan una débil actividad proteásica mientras que la capacidad de L. bulgaricus para hidrolizar la caseína confirma una actividad proteasa muy superior en los lactobacilos. Este modelo de hidrólisis peptídica por parte de los microorganismos del yogur evidencia la relación simbiótica existente entre S. thermophilus y L. bulgaricus. Por tanto, la actividad proteásica de L. bulgaricus hidroliza las caseínas, dando lugar a polipéptidos que son degradados por las peptidasas de S. thermophilus hasta la liberación de los aminoácidos constituyentes. De acuerdo con los datos obtenidos por Tamine y Deeth (loe. cit.J la actividad peptidásica de los microroganismos del yogur parece alcanzar su máximo bajo las siguientes condiciones: (a)

la actividad es más intensa durante la fase logarítmica de crecimiento;

(b)

la tasa de proteolisis disminuye durante el almacenamiento o después de alcanzar la

fase estacionaria; (c)

la concentración de aminoácidos en el yogur depende de la relación entre S. ther-

mophilus y L. bulgaricus en los cultivos estárter. (d)

en el yogur (tras 24 horas de incubación) el espectro de aminoácidos varía en función

de la relación cocos:bacilos. A una relación de 1:1 el 56 % de los aminoácidos corresponden a tirosina, fenilalanina y leucina, pero para una relación de 3:1, la prolina representa el 7,1 % los aminoácidos libres; (e)

la hidrólisis de las proteínas del suero de la leche da lugar a concentraciones inferiores

de NNP a medida que disminuye la relación de L. bulgaricus a S. thermophilus; (f)

los ácidos grasos libres, por ejemplo el ácido cáprico y en menor grado el ácido

oleico, pueden reducir la actividad proteolítica de los cultivos estárter, afectando a la textura del coágulo; (g)

durante la elaboración del yogur de lactosa hidrolizada se observó un aumento de la

actividad proteolítica, debido tal vez a la presencia de residuos de proteasa en las preparaciones de β -D-galactosidasa (Hemme et al., 1979); 1

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(h)

en la leche preincubada con bacterias psicótrofas antes de la elaboración del yogur se

observa un aumento de la actividad proteolítica, pero el producto presenta aromas desagradables; (i)

el sabor amargo del yogur se atribuye normalmente a la formación de péptidos

amargos como consecuencia de la actividad proteolítica de L. bulgaricus. Sin embargo, la fermentación de la leche a temperaturas de 44 °C da lugar a un producto con menos probabilidades de resultar amargo que los productos incubados a temperaturas de 38 °C. B. Productos de la proteolisis El perfil de compuestos nitrogenados del yogur cambia, en comparación con el de la leche de partida, como consecuencia de la actividad proteolítica de S. thermophilus y L. bulgaricus, tanto durante la fermentación como durante el almacenamiento del producto en refrigeración, aunque algo menos en este último caso. El cambio básicamente supone un aumento en la concentración de compuestos nitrogenados solubles, que incluye así mismo la liberación de péptidos y aminoácidos a partir de las proteínas. 1.

Compuestos nitrogenados solubles

El estudio más completo realizado en este campo se debe a Miller y Kandler (1967a, b). Estas cifras muestran que las distintas cepas de microrganismos del yogur difieren en su actividad proteolítica y las cantidades de nitrógeno dializable liberadas por L. bulgaricus y S. thermophilus (490 y 302 mg/1) confirman que el primero de estos microorganismos es más proteolítico que S. thermophilus. Esta misma tendencia se observa en relación con las cantidades de aminoácidos, urea y péptidos pero la capacidad de S. thermophilus para aumentar la concentración de amoniaco en las leches incubadas se debe a su capacidad para degradar la urea. 2. Liberación de aminoácidos El espectro de aminoácidos libres presentes en la leche y el yogur (véase Tabla 7.10) depende de diversas variables, como son: (a)

Tipo de leche: la leche de las distintas especies de mamíferos (vaca, oveja y cabra)

presenta distintas concentraciones de aminoácidos, ^ 10, 3,78 y 20,6 mg/100 mi 1

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respectivamente y, además, la leche de cabra presenta niveles muy superiores de alanina, glicina, ácido glutámico y treonina, en relación con la del resto de las especies. (b)

Método de fabricación: cuando la fermentación se realiza a 42 °C durante 2-3 horas

se obtienen concentraciones ligeramente superiores de aminoácidos que cuando esta tiene lugar a 42 °C durante 1 hora, seguida de un período de 5-6 horas a 30-32 °C, siendo el contenido total de aminoácidos en dichos productos de 23,6 y 19,4 mg/100 ml respectivamente (Rasic, Stojslavljevic y Curcic, 1971; Rasic et ai, 1971, Stosjslavljevic, Rasic y Curcic, 1971). (c)

Relación cocos: bacilos: puesto que L. bulgaricus presenta una actividad proteolítica

superior a la de, S. thermophilus, cuanto mayor es la relación bacilos : cocos en el cultivo estárter, mayor es la concentración de aminoácidos en el yogur. (d)

Condiciones de almacenamiento: la temperatura de almacenamiento del yogur

condiciona la concentración de aminoácidos libres en el producto. Cuanto mayor es la temperatura de conservación mayor es la concentración de aminoácidos libres. Ottogali et al. (1974) almacenaron yogur y yogur desnatado (con un 1 % de materia grasa) a temperaturas de 4 y 20 °C durante 60 días, obteniendo en estos productos incrementos en la concentración de aminoácidos de 2,36 y 1,00 mg/100 ml a 4 °C y 7,57 y 14,65 mg/100 ml a 20 °C respectivamente. (e)

Concentración de ácido láctico: El contenido en aminoácidos del yogur depende de la

acidez titulable del producto. De acuerdo con Luca (1974) yogures con un 1,9 y un 1,72-1,73 % de ácido láctico presentaban concentraciones de aminoácidos totales de 70 y 41-50 mg/lOOg respectivamente. La cifra de 70 mg/lOOg de yogur es el máximo valor citado en la literatura y podría pensarse que si esta elevada acidez fuese resultado de una incubación prolongada, el contenido en aminoácidos sería reflejo de la prolongación de la actividad metabólica del cultivo estárter.

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3. Liberación de péptidos Como ya se ha señalado, algunas enzimas proteolíticas de las bacterias del yogur liberan péptidos en el producto final. METABOLISMO LIPIDICO Los acilgliceroles representan el 96-98 % de los lípidos de la leche, estando constituido el resto de esta fracción por fosfolípidos, esteróles, vitaminas liposolubles (A, D, E y K), ácidos grasos, ceras y escualeno. Los lípidos de la leche se encuentran formando los glóbulos grasos, como constituyentes de las membranas de los mismos o bien en el suero de la leche, variando las proporciones presentes en las distintas formas en función de diversos factores, como especie animal, raza, fase de la lactación y alimentación (Jennes y Patton, 1959; Kurtz, 1974). Los acilgliceroles presentes en la leche están consituidos por una molécula de glicerol esterificada en 1, 2 ó 3 de sus radicales con ácidos grasos (mono-, di- y triacilglicéridos (triglicéridos) respectivamente). Por tanto, de modo general, la hidrólisis enzimática de los lípidos de la leche tiene lugar a nivel de los enlaces éster, rindiendo ácidos grasos libres y glicerol. Las enzimas se conocen como lipasas y su acción puede ser específica sobre 1

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determinados enlaces ester del glicerol, de modo similar a los que ocurre con las péptidohidrolasas. La hidrólisis de los lípidos se puede esquematizar del modo siguiente:

Las lipasas del yogur pueden proceder del cultivo estárter o de los microorganismos contaminantes que resistan el tratamiento térmico de la leche. Las lipasas propias de la leche se inactivan a las temperaturas de pasterización (Deeth y Fitzgerald, 1976). Por tanto, cualquier disminución en el porcentaje de grasa, aumento de la concentración de ácidos grasos (libres o esterificados) o incremento en la concentración de ácidos grasos volátiles en el yogur, puede atribuirse al metabolismo lipídico de los microorganismos, incluyendo L. bulgaricus y S. thermophilus. No obstante, antes de evaluar el papel de las distintas lipasas de los microorganismos, es necesario estudiar algunos de los factores que pueden condicionar la intensidad de la lipolisis. 1. Contenido en grasa del yogur El contenido en grasa del yogur varía según los países en función de las normas legales establecidas para la composición del producto o en relación con los tipos de yogur (véase Tabla 10.4). De estos datos se deduce que pueden existir los siguientes tipos básicos: (i)

1 y 3 y