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• Wendy Sandoval Quiroz

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UN IVER SIDAD NACIONA L D E M IS ION ES FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, QUÍMICAS Y NATURALES

ELECTROFORESIS PARTE I FUNDAMENTOS: GELES DE AGAROSA

I. GENERALIDADES La electroforesis en agarosa o geles de poliacrilamida es el método standard utilizado para la separación, identificación y purificación de fragmentos de ADN. La técnica es simple y rápida de realizar; es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse adecuadamente por otros métodos, tales como la centrifugación en un gradiente de densidad. Además, la localización del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones del colorante fluorescente intercalar: Bromuro de Etidio (BrEt); las bandas que contengan tan sólo de 1-10ng de ADN no podrán detectarse por examen directo del gel bajo luz UV. (Sharp et al.,1973). Si resulta necesario las bandas pueden, asimismo, recuperarse del gel y utilizarse posteriormente con otros propósitos. Los geles de agarosa y poliacrilamida pueden confeccionarse de varias formas, tamaños y porosidad, y pueden correr en un número diferente de configuraciones. La elección dentro de estos parámetros depende principalmente del tamaño de los fragmentos que se desean separar. Los geles de poliacrilamida son más efectivos para separar fragmentos pequeños de ADN (5-500pb); su poder de resolución es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren en apenas 1pb. Aunque este tipo de geles corre rápidamente y en comparación a los geles de agarosa, pueden acomodarse un número mayor de muestras, poseen la desventaja de ser más difíciles de preparar y manejar que aquellos, y como característica distintiva los de poliacrilamida se corren verticalmente en un campo eléctrico constante. Los geles de agarosa poseen un poder resolutivo menor respecto de los de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separación. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 hasta aproximadamente 500kb de longitud. Este tipo de geles usualmente se corren en configuración horizontal, en un campo eléctrico de fuerza y dirección constante. Fragmentos de longitud mayor, hasta 10.000 kb, pueden separarse mediante electroforesis de campo pulsante, en la cual la dirección del flujo eléctrico cambia periódicamente.

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I.1.- ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA La agarosa es un polímero lineal, extraído de un alga marina, cuya estructura básica se muestra en la Fig. 1. Tiempo atrás, la agarosa disponible comercialmente no

O HO

CH2OH O

HO O

O

O O

HO D-galactosa

3,6-anhidro L-galactosa

Fig. 1: estructura básica de la agarosa. era completamente pura, generalmente contenía contaminantes tales como: otros polisacáridos, sales y proteínas. La cantidad de contaminantes variaba de lote a lote y de proveedor a proveedor. Estas diferencias afectan tanto a la migración del ADN, como a la habilidad de recuperarlo del gel para utilizarlo posteriormente, como sustrato en reacciones enzimáticas. Actualmente se disponen de agarosas especiales, de alta pureza, en donde se ha verificado la ausencia de inhibidores, nucleasas y en las cuales se ha logrado obtener un fondo mínimo (“background”) de fluorescencia luego de la tinción con BrEt. Asimismo, hoy existen formas de agarosa químicamente modificadas que funden y gelifican a bajas temperaturas sin que esto ocasione ningún deterioro en la fuerza y dureza del gel (agarosas “low-melting”). Este tipo de geles se pueden utilizar para analizar fragmentos de ADN muy pequeños (10-500pb), con lo que adquieren un poder resolutivo mayor respecto a los geles preparados con agarosas comunes, no obstante nunca comparables con el poder resolutivo de los geles de poliacrilamida.

Los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido hasta que se consigue una solución transparente y límpida. Posteriormente la solución se coloca en un molde y se deja solidificar. Una vez que esto sucede, la agarosa forma una matriz, Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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cuya densidad está determinada por la concentración misma de la agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN, cargado negativamente a pH neutro, migra hacia el ánodo. No obstante, existen una serie de factores que afectan o modifican la tasa de migración del ADN en geles de agarosa, a saber:

1. Tamaño de la molécula de ADN: Las moléculas lineales de ADN doble cadena, migran a través de la matriz del gel a tasas que son inversamente proporcionales al log10 del número de pares de bases que contienen (Helling et al., 1974). Las moléculas más grandes migran mucho más lentamente debido a que sufren una gran fricción y resistencia en el avance ya que se arrastran a través de los poros del gel durante la corrida menos eficientemente que las moléculas pequeñas. 2. Concentración de la Agarosa: Un fragmento lineal de ADN de un tamaño dado migra a diferentes tasas a través de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. Existe una relación lineal entre el logaritmo y la movilidad electroforética del ADN () y la concentración del gel (), descripta por la siguiente ecuación: Log  = log 0 -Kr Donde: 0 es la movilidad electroforética libre del ADN y Kr es el coeficiente de retardo, una constante relacionada con las propiedades del gel y al tamaño y forma de las moléculas que migran. Así mediante la utilización de los geles con diferentes concentraciones de agarosa, es posible resolver un amplio rango de tamaños de moléculas de ADN. (Ver Tabla I).

3. Conformación del ADN: Las diferentes formas de ADN circulares superhelicoidales (forma I), circular con “nick” (forma II) y lineales (forma III), del mismo tamaño molecular, migran a través de los geles de agarosa a diferentes tasas (Thorne 1966, 1967). La movilidad relativa de las tres formas depende primeramente de la concentración de la agarosa en el gel, de la fuerza iónica del buffer y en la forma I de la densidad de las torsiones superhelicoidales. (Jonson y Grossman 1997).

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Tabla I: Rango de separación en geles conteniendo diferentes concentraciones de agarosa. Rango de separación Cantidad de agarosa en el gel eficiente de moléculas de (%  p/v ADN lineal (KB)

0.3

5-60

0.6

1-20

0.7

0.8-10

0.9

0.5-7

1.2

0.4-6

1.5

0.2-3

2.0

0.1-2

Una forma ambigua para identificar las diferentes formas conformacionales del ADN es realizar electroforesis en presencia de cantidades crecientes de BrEt. A medida que la concentración de BrEt crece, más colorante se une al ADN. Progresivamente las vueltas superhelicoidales negativas, en la forma I, se remueven, el radio de la molécula incrementa y la tasa de migración decrece. En el punto crítico de concentración de colorante libre, donde no hay vueltas superhelicoidales, la tasa de migración de las moléculas de ADN con forma I alcanza su valor mínimo. Si se sigue agregando BrEt, se generan vueltas superhelicoidales positivas, la molécula de ADN se vuelve más compacta, y su movilidad se incrementa rápidamente. Simultáneamente la movilidad de las formas II y III decrece diferencialmente debido a la neutralización de cargas y la gran rigidez impartida al ADN por el colorante. Para muchas preparaciones de formas I de ADN, la concentración crítica de BrEt libre está en el rango de 0.1g/ml a 0.5g/ml.

4. Voltaje aplicado: A bajo voltaje, la tasa de migración de fragmentos lineales de ADN es proporcional al voltaje aplicado. No obstante, a medida que la fuerza del campo eléctrico se incrementa, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente. Así, el rango efectivo de separación en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa. Para obtener una resolución máxima de fragmentos de ADN mayores a 2Kb, los geles se deben correr a no más de 5 V/cm. La distancia se mide como la vía más corta entre los electrodos, no es simplemente la longitud misma del gel. 5. Dirección del campo eléctrico: Las moléculas de ADN de longitud mayor a 50-100kb migran a la misma tasa a través de geles de agarosa, si la dirección del campo eléctrico se mantiene constante. 6. Composición de bases y temperatura: El comportamiento del ADN en geles de agarosa (a diferencia de lo que ocurre con los geles de poliacrilamida) no está afectado significativamente por su composición de bases ni por la temperatura a la cual se corre el gel. Por tanto en

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geles de agarosa la movilidad electroforética relativa de fragmentos de ADN de diferentes tamaños no cambia entre 4ºC y 30ºC. Generalmente los geles de agarosa se corren a temperatura ambiente. No obstante aquellos geles con concentraciones de agarosa por debajo del 0.5% y los geles preparados con agarosa “low melting” son ciertamente frágiles y por tanto es mejor correrlos a 4ºC donde son más fuertes. 7. Presencia de colorantes intercalares: El BrEt, colorante fluorescente, utilizado para detectar ADN en geles de agarosa y poliacrilamida (Sharp et al., 1973), reduce la movilidad electroforética de ADN lineal en un 15%. Este colorante se intercala entre las bases apiladas, extendiendo la longitud del ADN lineal y ADN circular con “nick” tornándolos más rígidos. El BrEt es un agente carcinogénico y debe manipularse con mucho cuidado, utilizando guantes. Todas las soluciones conteniendo BrEt deben decontaminarse antes de ser descartadas.

8.Composición del Buffer de corrida: La movilidad electroforética del ADN es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (p.e. si se omitiera el buffer de corrida por error) la conductividad eléctrica es mínima y el ADN migra, si lo hace, muy lentamente. En buffers con elevada fuerza iónica (p.e. si por error se utiliza el buffer de corrida al 10X) la conductividad eléctrica es muy eficiente generándose calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Existen diferentes Buffers para electroforesis de ADN doble cadena, sus componentes son EDTA (pH 8.0) y Tris-acetato (TAE), Tris-borato (TBE), o Tris-fosfato (TPE) a una concentración aproximada de 50mM (pH 7.5-7.8). Generalmente se preparan soluciones de trabajo concentradas y se conservan a Tº ambiente. El buffer más utilizado generalmente es TAE aunque su capacidad de buffer es un tanto baja y en electroforesis prolongadas tiende a agotarse durante la corrida (el ánodo se vuelve alcalino y el cátodo ácido). TPE y TBE, aunque un poco más caros, poseen una capacidad de buffer significativamente mayor. El buffer comúnmente utilizado para electroforesis de ADN de simple cadena desnaturalizado es 50mM NaOH, 1mM EDTA (buffer para electroforesis alcalina, ver más adelante). Ver Tabla II.

I.1.1- PREPARACIÓN Y SIEMBRA DE GELES DE AGAROSA Antes de efectuar la siembra de los geles, se debe constatar que no hayan quedado burbujas tanto en el cuerpo del gel como entre los dientes del peine. Es conveniente dejar enfriar la solución de agarosa más buffer hasta los 60ºC antes de volcarlo en el molde, el cual debe tener perfectamente obstruidos sus bordes. Nunca debe volcarse el gel muy caliente, ni por debajo de los 60ºC, pues aparecerán Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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ondulaciones debido al enfriamiento desigual que sufre el mismo, que luego provocarán distorsiones en la corrida.

Tabla II: Buffers comúnmente utilizados en Electroforesis Buffer Tri-acetato (TAE) Tris-fosfato (TPE) Tris-borato1 (TBE) Alcalino2

Solución de Trabajo 1X: 0.004 M Tri-acetato 0.001 M EDTA 1X: 0.09M Tris-fosfato 0.002M EDTA

0.5X: 0.045M Trisborato 0.001M EDTA 1X: 50mN NaOH 1 mM EDTA

Solución Stock (por litro) 50X: 242g Tris base 57.1 ml ac. Acético glacial 100ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 10X: 108g Tris base 15.5ml 85% ac. Fosfórico (1.679g/ml) 40ml 0.5M EDTA (pH 8.0) 5X: 54g Tris base 27.5g ac. Bórico 20ml 0.5M EDTA (Ph 8.0) 1X: 5ml 10N NaOH 2ml 0.5M EDTA (Ph 8.0)

1-cuando las soluciones concentradas se guardan por períodos prolongados suelen observarse precipitados. Para evitar problemas, preservar la solución 5X en botellas de vidrio a Tº ambiente y descartarla cuando se observen precipitados. Originalmente el TBE se utilizaba al 1X para electroforesis de geles de agarosa. Aunque una solución al 0.5X provee suficiente poder de buffer. TBE al 1X generalmente se utiliza para geles de poliacrilamida, pues los reservorios para el buffer son pequeños y la cantidad de corriente es considerable, por tanto se requiere un poder de buffer adecuado. 2- el buffer para electroforesis alcalina debe prepararse fresco.

Una vez solidificado el gel, éste debe sumergirse en la cuba de electroforesis y el mismo debe quedar cubierto por el buffer de corrida (1mm aproximadamente). Posteriormente se retira el peine, nunca hacerlo antes pues se pueden producir roturas en los pocillos generados por el peine con la consecuente pérdida de la muestra cuando se siembra en esos lugares. Es conveniente dejar que el gel se estabilice con el buffer antes de efectuar la siembra. Utilizando una micropipeta se mezcla la muestra con un buffer de carga o “loading buffer” (Ver Tabla III) y lentamente se introduce la muestra en la muesca (“slot”) del gel sumergido. El volumen máximo de la solución (muestra + buffer de carga) que puede ubicarse en el slot está determinada por las dimensiones de éste, que es consecuencia directa del tipo de peine utilizado en la preparación del gel. No obstante para evitar contaminaciones con las muestras vecinas y en los casos en los que es necesario sembrar un gran volumen de solución es conveniente realizar un gel un poco más grueso o concentrar el ADN por precipitación con etanol, antes que llenar por completo el slot. Generalmente en las corridas es necesario utilizar marcadores de ADN de tamaño conocido (adquiridos, por lo general, comercialmente), que deben incluirse en la Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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siembra a ambos lados (derecho e izquierdo) del gel y muchas veces en el medio del mismo. Esto facilita la determinación del tamaño de los fragmentos de ADN desconocidos, si es que ocurriera cualquier distorsión del gel durante la corrida. Tabla III: diferentes tipos de buffers de carga o “loading buffers” TIPO DE BUFFER 6X BUFFER Tº DE PRSERVACIÓN

I

II

III

IV

V

0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 40% (p/v) sucrosa en agua 0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 15% Ficoll en agua 0.25% azul de bromofenol 0.25% xylen cyanol FF 30% de glicerol en agua 0.25% azul de bromofenol 40% (p/v) sucrosa en agua Loading buffer alcalino 300 mN NaOH 6mM de EDTA 18% Ficoll en agua 0.15% verde de bromocresol 0.25% de xylen cyanol FF

4ºC

Tº ambiente

4ºC

4ºC

4ºC

Los loading tienen tres propósitos: a) Incrementan la densidad de la muestra, b) Aseguran que el ADN caiga directamente dentro de la muesca del gel, c) Otorgan color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo eléctrico migran hacia el ánodo a tasas predecibles. El azul de Bromofenol migra a través de geles de agarosa aproximadamente 2.2 veces más rápido que el xylen cyanol ff, independientemente de la concentración de la agarosa. El 1ro. corre en (TBE 0.5X) aproximadamente a la misma tasa que ADN lineal doble cadena de 300pb de longitud, mientras que el 2do. lo hace comparable a ADN lineal doble cadena de 4Kb de longitud. Cuál de ellos utilizar es una cuestión de elección personal. Empero el verde de bromocresol es el utilizado en geles alcalinos muestra DE una coloración más viva respecto del azul de bromofenol a pH alcalino. 3.- CORRIDA DEpues GELES AGAROSA:

Una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cuba de electroforesis, y a enchufar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado. Así el ADN migrará hacia el ánodo (rojo). El voltaje aplicado será de 1-5V/cm (medida como la distancia entre los electrodos). Si los electrodos se colocaron correctamente, se formarán burbujas en ánodo y cátodo (debido a la electroforesis) y en unos pocos minutos el loading buffer comenzará a migrar desde el “slot o well” hacia el cuerpo del gel. El gel se corre hasta que el frente de corrida (formado por los colorantes del loading) haya migrado una distancia apropiada a través del gel. Si los geles se corrieron en presencia de BrEt (tanto en el buffer como en el gel), éste migra hacia el cátodo (en dirección opuesta a la del ADN). Así, electroforesis prolongadas pueden remover gran parte del BrEt del gel, tornando dificultosa la Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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detección de pequeños fragmentos. Si esto ocurre, es conveniente teñir el gel luego de la corrida en una solución de BrEt (0.5µl/ml) por 30-45m en el mismo buffer o simplemente en agua. La presencia del BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz UV en cualquier momento durante la corrida. No obstante, existen personas que consideran que se obtiene una corrida más fiel de los fragmentos, en ausencia del colorante teniendo en cuenta que éste se intercala con las bases del ADN ocasionando un retardo en la corrida de los mismos. Por tanto en estos casos la corrida se efectúa en ausencia del colorante tanto en el buffer como en gel y una vez finalizada la electroforesis se tiñe el gel como se describió más arriba. I.1.2-TINCIÓN DE GELES DE AGAROSA La forma más conveniente de visualización del ADN en geles de agarosa es teñirlo con el colorante fluorescente BrEt (Sharp et al., 1973). Esta sustancia posee un grupo planar que se intercala entre las bases apiladas del ADN. La posición fija de este grupo y su cercanía a las bases causa la unión del colorante al ADN que muestra una fluorescencia comparable a aquella que posee el colorante libre en solución. La radiación UV a 254nm es absorbida por el ADN y transmitida al colorante, la radiación a 302nm y 366nm es absorbida por el colorante unido. En ambos casos la energía es reemitida a 590nm en la región rojo-naranja del espectro visible. Dado que la fluorescencia impartida por el complejo ADN:BrEt, es mayor a aquella emitida por el colorante libre, es posible detectar pequeñas cantidades de ADN en presencia de BrEt libre en el gel. El BrEt se utiliza para detectar tanto ADN como ARN simple o doble cadena. No obstante la afinidad del colorante por ác. nucleicos simple cadena es menor y por tanto la fluorescencia impartida es más pobre. El BrEt usualmente se prepara como una solución stock de 10mg/ml en agua y se mantiene a temperatura ambiente en botellas oscuras o cubiertas con papel aluminio. El colorante generalmente se incorpora al buffer de corrida a una concentración de 0.5g/ml. No obstante, la movilidad electroforética de las moléculas de ADN doble cadena lineal se reduce aproximadamente un 15% en presencia del colorante, pero resulta muy ventajosa la posibilidad de examinar el gel bajo luz UV en cualquier momento de la corrida. Empero, el gel puede correrse en ausencia del colorante y Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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teñirse posteriormente, una vez que se completa la electroforesis. En este caso el gel se sumerge en el mismo buffer de corrida o en agua conteniendo BrEt (0.5g/ml) por 3045 minutos a temperatura ambiente. Normalmente no se destiñe el gel, pero la visualización de cantidades muy pequeñas de ADN (10ng) se facilita si se reduce el “background” fluorescente originado por el BrEt no asociado al ADN y esto se consigue sumergiendo el gel en agua o en 1mM MgSO4 por 20min a temperatura ambiente.

I.1.3-FOTOGRAFIADO DE GELES DE AGAROSA: El fotografiado de geles puede efectuarse utilizando luz ultravioleta incidente o transmitida. Muchas de las fuentes de UV disponibles comercialmente emiten luz UV a 302nm. La fluorescencia emitida por el complejo ADN:BrEt es considerablemente más alta a esa longitud de onda que a 366nm y ligeramente menor a 254nm. No obstante, la cantidad de roturas o “nicks” en el ADN es mucho menor a 302nm que a 254nm (Brunk y Simpson 1977). El film más sensible y el más utilizado es el Polaroid tipo 57 o 667 (ASA 3000), y una exposición de apenas unos pocos segundos es suficiente para obtener imágenes de bandas conteniendo hasta 10ng de ADN. Con exposiciones más prolongadas y con una buena fuente de luz UV, se podrá fotografiar la fluorescencia emitida por tan sólo un 1ng de ADN. PRECAUCIÓN!!!!: la radiación ultravioleta es peligrosa, particularmente para los ojos. Para minimizar la exposición se debe asegurar que la longitud de onda de la lámpara es la adecuada y se deben utilizar lentes o máscaras protectoras que bloqueen eficientemente la UV.

I.2.-GELES DE AGAROSA ALCALINOS: Los geles de agarosa alcalinos (Mc Donell et al. 1977) se utilizan para el análisis de ADN simple cadena. Particularmente y entre los muchos propósitos se emplean para: a) Análisis del tamaño del ADNc en los híbridos ADN:ARN resistentes a la nucleasa S1. b) Para verificar el tamaño de la primera y segunda cadena en la síntesis de ADNc mediante transcriptasa reversa. c) Para verificar la actividad de corte en preparaciones enzimáticas utilizadas para clonado molecular. Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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d) Para calibrar los reactivos utilizados en el “nick translation” del ADN. Debido a que la adición de NaOH a una solución caliente de agarosa provoca la hidrólisis de los polisacáridos, la agarosa se funde en una solución neutra en ausencia de buffer (usualmente agua) y se equilibra en buffer de electroforesis alcalino antes que el gel se vierta en el molde. No se utilizan ni formamida mi urea como desnaturalizantes debido que provocan un cambio en la agarosa tornándola gomosa. Una vez que la agarosa se disolvió perfectamente en agua, luego de ser calentada, se deja enfriar la solución hasta los 60ºC y se le agrega NaOH 50mM y EDTA (pH 8.0) a 1mM, y posteriormente se vuelca el gel, como en el caso de geles de agarosa. Una vez solidificado el gel se coloca en la cuba de electroforesis y se le agrega el buffer correspondiente al 1X hasta que el gel quede debidamente cubierto. El BrEt se omite en este tipo de geles pues el mismo, no se une al ADN a pH elevados. Los geles alcalinos conducen mayor corriente que los geles de agarosa neutros a voltajes comparables, y se calientan durante la corrida. Por tanto éstas últimas deben efectuarse a un voltaje < 0.25 V/cm.

I.3- RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN EN GELES DE AGAROSA: Se han desarrollado numerosos métodos tendientes a recuperar ADN a partir de geles, pero ninguno ha resultado enteramente satisfactorio. Entre los problemas que se citan podemos resaltar:  Presencia de inhibidores para reacciones enzimáticas: antiguamente muchas de las agarosas presentaban contaminaciones con polisacáridos pobremente descriptos, los cuales eran extraídos del gel conjuntamente con el ADN. Estas sustancias son inhibidores potentes de muchas de las enzimas utilizadas comúnmente en los pasos subsecuentes de clonación. No obstante, con el advenimiento de agarosas de alta pureza se ha reducido considerablemente este inconveniente, pero pueden aún existir ocasiones en las que el ADN recuperado se encuentre en forma no reactiva.  Recuperación ineficiente de fragmentos grandes de ADN: la eficiencia de recuperación de fragmentos de ADN a partir de agarosa está en función de su peso molecular. Aunque muchos de los métodos dan un rendimiento razonable Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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para fragmentos de ADN que son menores a 5Kb de longitud (>50%), ninguno es enteramente satisfactorio para fragmentos mayores. A medida que el tamaño del fragmento de ADN se incrementa el rendimiento decrece progresivamente, especialmente cuando la recuperación del ADN involucra métodos de unión a una matriz sólida, tales como DEAE-Sefacel o DEAE-membrana de celulosa. Los fragmentos grandes se unen fuertemente a tales soportes y posteriormente es muy difícil eluirlos.  Recuperación ineficiente de pequeñas cantidades de ADN: cuanto más pequeña es la cantidad de ADN colocada en el gel, menor será su rendimiento en la purificación. En ciertas ocasiones la pérdida es tan grande que no se justifica intentar la recuperación de bandas que contienen menos de 500ng de ADN.  Imposibilidad de recuperar simultáneamente varios fragmentos: muchas de las técnicas son laboriosas y consisten en varias manipulaciones individuales. Por tanto es limitada la cantidad de fragmentos que pueden recuperarse.

Actualmente muchas de estas dificultades están siendo superadas por la aparición de Kits comerciales o resinas, que garantizan la eficiencia de recuperación y purificación de los fragmentos. De los muchos métodos existentes sólo se mencionará la recuperación de fragmentos de ADN a partir de agarosas de bajo punto de fusión. Este método posee la ventaja de que ciertas reacciones enzimáticas (p.e. digestión con enzimas de restricción y ligación) pueden efectuarse directamente en el gel fundido. I.3.1- Recuperación de ADN a partir de Agarosas “low-melting”: Existen un gran número de agarosas en las cuales se ha introducido un grupo hydroxietilen a la cadena de polisacárido. Esta sustitución provoca que la agarosa gelifique aproximadamente a los 30ºC y se funda aproximadamente a los 65ºC -por debajo de la temperatura de fusión del ADN doble cadena-. Estas propiedades han sido explotadas para el desarrollo de una técnica simple tendiente a la recuperación de fragmentos de ADN del gel (Wieslander 1979; Parker and Seed 1980). Así, una vez que se efectúa la electroforesis con estos tipos de agarosa (generalmente la misma se lleva a cabo a 4ºC, para preservar al gel de fundirse durante la corrida), se coloca el gel sobre la Cátedra Genética Molecular – Trabajos Prácticos

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UV y se corta la banda de interés utilizando una hoja de afeitar o un bisturí, tratando de evitar la mayor cantidad posible de agarosa para reducir la cantidad de contaminantes que actuarían posteriormente como inhibidores (recordar que los fragmentos de ADN de un tamaño dado corren ligeramente más rápido en este tipo de geles respecto de aquellos con agarosas convencionales). Es conveniente fotografiar el gel después de efectuar el corte para registrar cuál fue la banda eluída. La lonja de agarosa conteniendo el ADN de interés se coloca en un tubo y se prosigue con el protocolo de recuperación recomendado por el proveedor. Debido a que la agarosa “low melting” permanece en estado fluido a 37ºC, se pueden efectuar reacciones enzimáticas tales como: ligación, síntesis de sondas radioactivas, y digestiones con enzimas de restricción, simplemente agregando porciones de la agarosa fundida, conteniendo el fragmento de interés, a la mezcla de reacción. Actualmente existen métodos alternativos que permiten recuperar fragmentos de ADN de alto peso molecular a partir de estos tipos de agarosa (Burmeister and Lehrach 1989).

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II- BIBLIOGRAFÍA: Burmeister, M. and Lehrach, H. 1986. Long-range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene. Nature 324:582.Brunk, C. R. and Simpson, L. 1977. Comparison of various ultraviolet sources for fluorescent detection of ethidium bromide-DNA complexes in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 82: 455. Helling R.B.; Goodman H.M. y Boyer H.W. 1974 Analysis of R. Eco RI fragments of AND from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J. Virol. 14: 1235.Jonson, P.H. and Grossman, L.I. 1997. Electrophoresis of DNA in agarose gels. Optimizing separations of

conformational isomers of double- and single stranded DNAs.

Biochemistry 16: 4217. Mc Donell, M.W., Simon, M.N. and Studier, F.W. 1977. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J.Mol. Biol. 110: 119. Parker, R. C. and Seed B. 1980. Two-dimensional agarose gel electrophoresis “SeaPlaque” agarose dimensions. Methods Enzymol. 65:358 Sharp, P. A.; Sugden B. and Sambrook, J. 1973 Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochemistry 12:3055 Thorne, H.V. 1966. Electrophoretic separation of polyoma virus DNA from host cell DNA. Virology 29: 234. Thorne, H.V. 1967. Electophoretic characterization and fractionation of polyoma virus DNA. J.Mol. Biol. 24:203. Wieslander, L. 1979. A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels. Anal. Biochem. 98:305.

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