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FOSFATASA ALCALINA

PROCEDIMIENTO:

Curva Curvadedecalibración calibración Tomar 5 tubos y preparar con disoluciones indicadas en la tabla # 1.

A cada tubo. Adicionar 1 ml de sln fosfato 0,5 M y 0,5 ml de sln ZnCl2 0,00060M

Preparar blanco(4ml buffer glicina, 0,5ml sln zinc y 1ml fosfato )

INICIO

Determinación Kmy yVm Vm Determinación Km

Inhibidor

Tomar 5 tubos y prepara con disoluciones. ver tabla #2

Tomar 5 tubos y prepara con disoluciones. ver tabla #2

Preparar blanco (0,5 zinc, 5ml glicina y 1 ml fosfato).

Calentar a 37°C por 5 minutos igual tratamiento suero fetal

Dejar en reposo 5 minutos.

Calentar a 37°C por 5 minutos igual tratamiento suero fetal ½

Agregar 0,5ml enzima dejar reacción por 15 minutos a 37°C

Agregar 0,5ml enzima dejar reacción por 15 minutos a 37°C Detener reacción con 1 ml NaHPo4 0,5M

Detener reacción con 1 ml NaHPo4 0,5M

Seleccionar longitud de onda 410nm. Y registrar datos.

Calcular [PNP] y realice RESULTADOS grafico.

Construir tabla # 4

FINAL

Construir tabla # 6 y determinar tipo de inhibidor.

RESULTADOS: Tabla #1 Curva de calibración. Tubo Dilución PNP Buffer de glicina Fosfato de sodio 0,5 M Sln se ZnCl2 M Absorbencia Concentración PNP mol/L

1 4 mL 0 1 0,5 0,968

2 1/2 2 1 0,5 0,487

3 1/4 2 1 0,5 0,255

4 1/8 2 1 0,5 0,122

5 1/16 3 1 0,5 0,081

1,00E-04 5,00E-05 2,50E-05 1,25E-05 6,25E-06

Grafica #1

CURVA DE CALIBRACION 1.2 y = 9535.9x + 0.0131 R² = 0.9996

ABSORBANCIA

1 0.8

CURVA DE CALIBRACION

0.6 0.4

Linear (CURVA DE CALIBRACION)

0.2 0 0.00E+00

5.00E-05

1.00E-04

1.50E-04

CONCENTRACION PNP(mol/litro)

Tabla # 2 Determinación de parámetros cinéticos Km y Vm.

Tubo

1

2

3

4

5

PNPP

4 ml

1/2

1/4

1/8

1/16

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

absorbancias 1,263 1,149 1,077 0,809 concentración PNP mol/L 1,31E-04 1,19E-04 1,12E-04 8,35E-05 Moles de PNP 5,24E-07 4,76E-07 4,48E-07 3,34E-07

0,396

sln ZnCl2 0,0006 M

4,02E-05 1,61E-07

Grafica # 2

A B S O R B A N C I A

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.00E+00

y = 9541.1x + 0.0127 R² = 1 Km/Vm Linear (Km/Vm)

5.00E-05

1.00E-04

1.50E-04

concentracion PNP (mol/litro)

Tabla # 3 PARAMETROS CINETICOS

[PNPP]

ABSORBANCIA [PNP]

V0=[PNP]/min

1/[PNPP] 1/V0

5,00E-03 2,50E-03 1,25E-03 6,25E-04 3,13E-04

1,263 1,149 1,077 0,809 0,396

8,73E-06 7,93E-06 7,46E-06 5,56E-06 2,68E-06

200 400 800 1600 3194,9

1,31E-04 1,19E-04 1,12E-04 8,347E-05 4,016E-05

Grafica # 3 parámetros enzimáticos Km y Vm

INVERSOS 400000 350000 y = 86.159x + 78789 R² = 0.9481

300000 1/V0

250000 200000

1/V0

150000

Linear (1/V0)

100000 50000 0 0

1000

2000 (1/[PNPP] M/L)

3000

4000

114547,5 126103,4 134048,2 179856,1 373134,2

Tabla # 4 determinación de inhibidor. Absorbancias Concentración PNP mol/L PNP Mol

0,567

0,566

0,419

5,81E-05 2,61E-07

5,80E-05 2,61E-07

4,26E-05 1,91E-07

0,288

0,181

2,88E-05 1,76E-05 1,29E-07 7,92E-08

Grafica # 4

0.7

A

Absorbancia VS [PNP]

0.6

y = 9527.5x + 0.0134 R² = 1

0.5 0.4 0.3

INHIBIDOR

0.2

Linear (INHIBIDOR)

0.1 0 0.00E+00 2.00E-05 4.00E-05 6.00E-05 8.00E-05

[PNP]

Tabla # 5 parámetros cinéticos con inhibidor

[PNPP] 5,00E-03 2,50E-03 1,25E-03 6,25E-04 3,13E-04

ABSORBANCIA 0,567 0,566 0,419 0,288 0,181

[PNP]

V0=[PNP]/min 1/[PNPP] 1/V0

5,81E-05 5,80E-05 4,26E-05 2,88E-05 1,76E-05

3,87E-06 3,86E-06 2,84E-06 1,92E-06 1,17E-06

200 400 800 1600 3194

258397 259067 352112 520833 854700

Grafica # 5 inversos inhibidor Km y Vm

inversos Inhibidor 900000 800000 700000 600000 500000 1/V0 400000 300000 200000 100000 0

y = 205.62x + 194304 R² = 0.9964

inversos Linear (inversos)

0

2000

4000

(1/[PNP])

Modelo de cálculo: 

Concentración PNP curva de calibración=



Concentración PNP parámetros enzimático e inhibidor = y = 9535,9x + 0,013

x= 

Concentración PNPP =



V0= [PNP]/min=



1/[PNPP] =



1/V0 =



Moles de PNP =



Moles de PNP Inhibidor =

=200 =114547

=

FOSFATASA ALCALINA Determinar la cinética química de la fosfatasa de acuerdo a la reacción de inhibición, y a los parámetros de VMAX y Km. OBJETIVO: 



Identificar y aplicar métodos diferentes para la determinación de la actividad enzimática de la Fosfatasa alcalina; de acuerdo a sus propiedades físicas y químicas, Determinar si el inhibidor (fosfato) actúa sobre la enzima (fosfatasa); como un inhibidor competitivo o no competitivo.

Nota: el blanco contenía fosfato

CONSULTA: ¿Cuál es la importancia clínica de la fosfatasa alcalina? R// Las fosfatasas alcalinas son enzimas que se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta su presencia en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tiene importancia clínica tanto su aumento como su disminución de los niveles en plasma. Causas más probables de aumento del nivel de FAL:     

Enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos osteomalacia.

Causas más probables de disminución del nivel de FAL:  

Cretinismo. déficit de vitamina C1, 5,6.

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio. [2] ¿En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto? R// El fosfato se comportó como un inhibidor de tipo no competitivo. [1],[3]. ¿Sería posible revertir la inhibición provocada por el fosfato aumentando la concentración de PNPP? R// Las velocidades iníciales en presencia del inhibidor disminuyen. La diferencia entre las velocidades en presencia del inhibidor se hace cada vez menores con respecto a una reacción cinética sin él. En pocas palabras, la velocidad se incrementa en cantidades discretas en tanto más sustrato se adicione. [1]

DISCUSIÓN: 

El Inhibidor en esta práctica fue un inhibidor no competitivo la Km permaneció constante (1/[PNPP]) y la velocidad disminuyo de la enzima actuando sola, al actuar bajo el efecto del inhibidor. [3]



Consideramos que la práctica de laboratorio fue bien realizada, ya que los porcentajes de error estuvieron en el rango previsto y además, obtuvimos una sincronización a nivel grupal muy buena en el laboratorio; pero se nos presento algunos inconvenientes al determinar el tipo de inhibidor, lo cual consideramos que es por falta de claridad en los conceptos.



Se deben utilizar cantidades de sustrato mas altas ya que con las utilizadas no se alcanzo la velocidad máxima, o por lo menos no la logramos identificar en nuestros gráficos.

CONCLUSIONES: 

La enzima fosfatasa alcalina es de gran importancia en medicina, ya que permite diagnosticar enfermedades, por medio de un examen de sangre para medir el nivel de la misma.



Conocer la actividad de un determinado inhibidor es de gran importancia, tanto desde el punto de vista biológico como médico.



para concluir el tipo de inhibidor utilizado en una reacción enzimática se debe tener muy claro los conceptos de inhibición, ya que se presta para múltiples confusiones.

RESEÑA BIBLIOGRAFICA [1] El portal de la salud, consultado el 4 de septiembre del 2011 disponible en linea en: www.elportaldelasalud.com/index.php?option=com_content&task=view&i d=123&Itemid=147&limit=1&limitstart=2 [2] Ingeniería de diagnostico clínico, consultado el 4 de septiembre 2011, disponible en línea en: /www.idcca.com/images/enzimas/fosfatasaalcalina2.pdf [3] LEHNINGER. Albert L, Bioquímica. Las bases moleculares de la estructura y función celular, 2aedición, Ediciones Omega S.A. 1995. pág. 203-209.