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• Andrea Salgado Romero

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Genotecas de gDNA: se aisla el Gdna del organismo de interés, se corta con enzimas de restricción para generar fragmentos con extremos complementarios a los del vector de clonación.

Vectores de clonación y expresión

Ya construida la genoteca se rastrea el clon de interés los métodos más frecuentes son: hibridación usando sonda marcada, uso de anticuerpos frente a la proteína de interés y selección de clonas por actividad biológica de la proteína.

Producción de proteínas recombinantes

Aplicaciones de la clonación molecular Es el principal impulsor del desarrollo de la biotecnología y la metodología del DNA recombinante.

Puede emplearse para la producción de proteínas eucariotas en bacterias, como hormonas, antibióticos, vacunas, generación de cultivos transgénico resistentes a plagas o sequias, producción de animales transgénicos capaces de producir en su leche proteínas recombinantes. Y también establecimiento de librerías genómicas que permite secuencias por completo el genoma.

La clonación molecular ha permitido determinar la función de múltiples proteínas y generar proteínas recombinantes que reducen el costo de producción de hormonas o proteínas requeridos en la terapéutica de las cuales se dispone de muy pocas por la escasez de fuentes y la dificultad en su aislamiento o purificación. Estas proteínas se producen en bacterias, levaduras, células de insectos y células de mamíferos. Para maximizar la expresión de proteínas se utilizan promotores fuertes, aunque estos produzcan un gasto metabólico a las células ralentizando su crecimiento

La clonación del DNA, o clonación molecular, es la introducción a un fragmento de DNA denominado inserto dentro de una molécula de DNA denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera. Vectores Un vector se define como una molécula de DNA de doble cadena (dsDNA) con capacidad de albergar un fragmento de DNA exógeno (de otro origen). De acuerdo a su uso, los vértices se clasifican en vectores de clonación y vectores de expresión.

Genoteca: colección de fragmentos de DNA provenientes de genoma de un organismo, clonados en vectores para facilitar su estudio. Genotecas de cDNA: Se construyen a partir de secuencias de mRNA mediante reacción in vitro, se sintetiza la primera cadena (DNA polimerasa con actividad de transcriptasa inversa). El que no se copia es degradado con RNAasa H. La cadena complementaria a la obtenida se sintetiza en una reacción de PCR empleando la cadena sencilla del cDNA como templado. Posteriormente se clona en un vector.

La clonación

Vectores de clonación

Integrantes

Andrea Salgado Constanza Feria Isabella Valencia Yeimi Montenegro

Los vectores de clonación tienen como finalidad el almacenamiento de secuencias y la obtención de grandes cantidades de DNA insertado o la molécula recombinante. Estos pueden ser plásmidos, bacteriófagos, fagemidos, cosmidos y cromosomas artificiales bacterianos o de levadura.

Tipos de Vectores Plásmidos: Son pequeñas moléculas circulares de DNA de pequeño tamaño (2 a 5 kb), presentes en forma libre en el citosol, estos se replican y transmiten independientemente del cromosoma bacteriano y constituyen el material génico móvil de las bacterias, funciona como medio de transporte de genes de unas bacterias a otras. Ejemplo: Puc19, Pbr322 y Pglo Vectores de expresión Los vectores de expresión tienen como objetivo producir un transcrito (RNA) o la proteína producto de este transcrito. Los vectores de expresión pueden ser plásmidos o bacteriófagos Componentes de los vectores de clonación Todos los vectores de clonación poseen como parte de su estructura, los siguientes elementos básicos comunes: A.

Origen de replicación: es una secuencia en el DNA del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que reconocen el sitio de inicio de la replicación (ORI).

B.

Marcador de selección: es un gen que por lo general confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenómeno particular con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector.

C.

Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de DNA que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de DNA.

Componentes de los vectores de expresión En su estructura, los vectores de expresión poseen los elementos básicos presentes en los vectores de clonación (origen de replicación, marcador de selección y sitio de clonación múltiple), además de contar en su secuencia con, por lo menos, un promotor fuerte. Se caracterizan por constituir un sistema de inducción simple y efectivo, tener una baja expresión basal y ser con facilidad transferible a otras cepas. También debe incluir secuencias de terminación de la transcripción. Otro factor importante presente en un vector de expresión es el sitio de unión al ribosoma, que es la secuencia Shine-Dalgarno.

Bacteriófagos: Son virus que infectan de forma natura a bacterias y se comportan como parásitos intracelulares obligados que se multiplican haciendo uso de la maquinaria biosintética de las bacterias. Ya que infectan, se consigue una alta eficiencia en la clonación, empleándose como vector de virus modificado. El bacteriófago ʎ es el fago más usado, este tiene sitios cos donde se une la proteína ʎNu1, y la proteína A para dirigir el empaquetamiento del DNA en las cabezas proteicas del fago. Cosmidos: Son vectores híbridos en los que se combina el DNA de un plásmido con el de un bacteriófago. El plásmido le da el gen de resistencia a los antibióticos, sitio ORI. El bacteriófago, le da los sitios COS para empaquetar DNA de manera circular. Estos también se replican de independientemente del genoma bacteriano. Fagemidos: Están compuestos de un plásmido al que contiene un origen de replicación de un fago como el F1, que le da la capacidad de producir DNA monocatenario. El fagemido puede usar el sitio ORI del plásmido y producir dsDNA, o el ORI del fago y producir ssDNA. Ejemplo: Bluescript Cromosomas Artificiales BAC: Son vectores sintéticos derivados del plásmido F, estos aceptan grandes insertos de DNA, entre 150 y 500 kb, son similares a un plásmido pero su transformación la hacen por electoporacion. YAC: Son cromosomas artificiales que contienen telomeros, centrómeros, origen de replicación y marcadores de selección que permiten la replicación del YAC y la segregación de las células hijas durante la división celular. Estos son útiles para clonar grandes fragmentos de DNA de 100 kb hasta 1000 kb

Clonación Molecular La clonación de cualquier fragmento de ADN involucra los siguientes pasos: 1. PREPARACIÓN DEL INSERTO DE ADN QUE SE VA A CLONAR

Involucra la digestión con enzimas de restricción para liberar el fragmento de interés de la molécula de ADN completa. El inserto, producto de la digestión enzimática, se purifica y separa de la molécula de ADN de la cual proviene, mediante una electroforesis en gel de agarosa. 2. PREPARACIÓN DEL VECTOR PARA LA CLONACIÓN a) Corte con la misma enzima de restricción con que se digirió el inserto y obtener un ADN lineal b) Desfosforilación del vector con la finalidad de impedir la autoligación del vector. (fosfatasa alcalina bovina – CIP , fosfatasa bacteriana- BAP) c) Purificación del vector empleando columnas de resinas y sales caotrópicas. 3. LIGACIÓN DEL INSERTO Y EL VECTOR Involucra la formación de enlaces fosfodiéster entre los residuos fosfatos que se localizan en los extremos 5’ de la cadena de ADN y los residuos hidroxilo 3’. Actúa enzima ligasa (in vitro): -Ligasa de E.coli -T4 ligasa de bacteriófagos 4. PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES Se utiliza la E.coli que carece de un mecanismo natural para la incorporación de ADN exógeno. Estado de competencia se induce por diferentes métodos de laboratorio: Solución de CaCl2, glicerol al 10% Se requiere que las células se encuentren en la fase logarítmica de crecimiento (OD entre 0.5 y 0.7) = 5x107 cel/mL (densidad). 5. TRANSFORMACIÓN CELULAR Transformación: introducción de material genético a las bacterias, hongos, algas o plantas. Métodos: a) Transformación química: las células y el ADN plasmídico se incuban en una solución hipotónica de CaCl2 Se aplica choque térmico a 42°C por 90 s. b) Transformación por electroporación: Aplicación de pulsos eléctricos de alto voltaje a las células receptoras Utilizada en células eucariotas y procariotas.

6. IDENTIFICACIÓN DE LAS COLONIAS CELULARES QUE CONTIENEN EL VECTOR RECOMBINANTE Se utilizan marcadores de selección presentes en los vectores: Genes de resistencia a antibióticos Moléculas fluorescentes o de enzimas Bacterias se siembran en cajas petri con agar suplementado con el antibiótico