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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Practica No.1 “Factores que influyen en las separaciones cromatográficas” Fecha de realización: 31 de agosto de 2017 Equipo No.5: Pineda Blanco Alan David, INTRODUCCIÓN La cromatografía se define como la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución entre dos fases, una de las cuales es estacionaria y la otra una fase móvil. Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En general, los componentes más afines a la fase estacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menos retenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa o papel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla, logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química.

El factor de retención (Rf) es la distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación/distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente. Nos permite identificar diferentes analitos en un sistema cromatográfico. En ocasiones se ven afectados los valores de Rf por la composición de la fase móvil y características de la fase estacionaria. OBJETIVO GENERAL: Analizar la influencia de algunos factores que afectan las separaciones cromatográficas. OBJETIVOS PARTICULARES: Demostrar el efecto de la polaridad del disolvente. Demostrar el efecto del volumen de muestra aplicada. Demostrar el efecto de concentración de la muestra. Demostrar el efecto de la naturaleza del disolvente de la muestra. Analizar la presencia de otros analitos.

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Practica No.1 “Factores que influyen en las separaciones cromatográficas” Fecha de realización: 31 de agosto de 2017 Equipo No.5: Pineda Blanco Alan David (2013500238), RESULTADOS

NaCl: 2.0/3.9= 0.512 Sacarosa: 1.8/3.9=0.461 Original: 2.1/3.9=0.538 DISCUSIÓN

CÁLCULOS DE Rf Exp. 1. Polaridad del disolvente Rojo de metilo: AcOEt: 3.2/4.0=0.800 AcOEt:Hex. (1:1): 1.8/4.2=0.428

Figura 1. Placas cromatográficas con solución de rojo de metilo y Sudán I a una concentración de 1mg/mL en CH3CN en diferentes sistemas de elución (de izq. a der. AcOEt, AcOEt:Hex. (1:1) y AcOEt:Hex (3:7)

AcOEt:Hex. (3:7): 1.2/4.4=0.272 Sudán: AcOEt: 3.9/4.0=0.975 AcOEt:Hex. (1:1): 4.1/4.2=0.976

Experimento 1. Efecto de la polaridad del disolvente

AcOEt:Hex. (3:7): 4.2/4.4=0.954 Exp. 4a. Efecto de matriz:

Se utilizó como fase móvil 3 disolventes. Se puede observar en la figura 1 que el AcOEt es el disolvente más polar de los 3 y al ir agregando hexano en cantidades de (1:1) y (3:7) la fase móvil va perdiendo polaridad. Nos arrojan los resultados que al ir modificando la polaridad del disolvente (baja la polaridad), los Rf van disminuyendo haciéndose más notable en el rojo que el de sudan,

CH3CN: 1.7/4.1=0.414 MeOH: 1.7/4.1=0.414 Agua: 1.7/4.1=0.414 Exp. 4b. Otros analitos:

Polaridad del disolvente

Disolvente

Rf Rojo De Metilo

Rf Sudan

AcOEt

0.800

AcOEt:hexano (1:1) AcOEt:hexano (3:7)

Volumen de la muestra

Concentración de la muestra

Efecto de matriz

μL

Ancho de banda (mm)

μg/ mL

Asimetría (Si ó no)

Disolvente

Rf

Otros Analitos

Rf

0.975

1

5

1

NO

CH3CN

0.414

NaCl

0.512

0.428

0.976

2

5

5

SI

MeOH

0.414

Sacarosa

0.461

0.272

0.954

4

5

10

SI

H2O

0.414

Original

0.538

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Practica No.1 “Factores que influyen en las separaciones cromatográficas” Fecha de realización: 31 de agosto de 2017 Equipo No.5: Pineda Blanco Alan David (2013500238),

esto quiere decir que las interacciones cambian y los analitos (colorantes) empiezan a interaccionar más con la fase móvil. También nos indican estos valores que el rojo de metilo es más polar que el sudan ya que se trabaja en una fase estacionaria polar (sílica gel). Por otra parte se puede observar en la tabla de resultados que los valores de Rf fueron disminuyendo conforme se disminuía la polaridad del eluyente, la razón por la cual se puede explicar éste hecho estriba en el poder eluotrópico que presentan las sustancias utilizadas. El acetato de etilo presenta mayor poder eluotrópico que el hexano, ya que éste depende de la polaridad, cuanto mayor sea la polaridad del disolvente, mayor será su capacidad para desalojar y desplazar un compuesto polar de la superficie estacionaria, por lo que al incrementar la concentración del hexano en la mezcla de elución el desplazamiento que presentan las muestras es cada vez menor.

Cómo se puede observar en la tabla de resultados, los valores de ancho de banda no cambiaron a pesar de que el volumen de muestra aplicada fue distinto en cada caso, éste hecho se puede atribuir a que obteniéndose de la relación existente entre la concentración a la cual se encontraba la muestra y el volumen que se aplicó de ésta, en todos los casos la cantidad total de muestra aplicada fue de 1 μL , es decir, químicamente hablando , se añadieron igual número de moléculas del colorante, por lo tanto, éstas interaccionaron de igual manera con los grupos silanoles de la placa cromatográfica, trayendo como consecuencia valores iguales de ancho de banda.

Experimento 3. Efecto de concentración de la muestra

Experimento 2. Efecto del volumen de muestra aplicada

Figura 3. Placa cromatográfica con solución de rojo de metilo en CH3CN a diferentes concentraciones (de izq. a der. 1mg/mL, 5mg/mL y 10mg/mL)

Figura 2. Placa cromatográfica con solución de rojo de metilo en CH3CN a diferentes volúmenes y concentraciones (de izq. a der. 1μL-0.5mg/mL, 2μL1.0mg/mL y 4μL-0.25mg/mL)

En el presente experimento se aplicaron tres muestras sobre una placa de silica gel (SiO2), en las

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cuales hubo una variación en la concentración. En la primer muestra [1mg/ml], en la segunda [5mg/ml] y en la tercera [10mg/ml]. Se puede observar en la figura 3 que en las dos últimas “manchas” hay cierto grado de coleo. En donde está más concentrado se presenta más el fenómeno. Esto es debido que al tener una concentración alta [10mg/ml], se tienen muchas moléculas que interactúan con la silica; entonces se ocupan todos los sitios activos en un área de la silica gel, es decir, los silanoles. Al tener un exceso, las moléculas no se están reteniendo porque los sitios activos ya están ocupados, seguirán eluyendo, haciendo que la mancha sea más larga.

El Rf que se obtuvo para cada mancha fue la misma en los tres casos, de 0.414 como se puede observar en la figura 4. En el caso del CH3CN al ser un disolvente polar se retendrá con mayor fuerza en la silica gel. En el caso del metanol, existen interacciones con los silanoles, puentes de hidrógeno que se pueden formar, esto a su vez implica que se quede más retenido, sin embargo no sucedió esto.

Experimento 4. Efecto de matriz a. Efecto de la naturaleza del disolvente en la muestra Figura 4. Placa cromatográfica con solución rojo de metilo en diferentes disolventes (de izq. a der. CH3CN, MeOH y H2O en una concentración de 1mg/mL)

No se puede utilizar como disolvente agua. Los silanoles, son sitios activos, y el agua bloqueará estos sitios activos por medio de puentes de hidrogeno y por lo tanto no habría retención de analitos. La naturaleza se tiene que tomar en cuenta ya que de este depende la disolución del analito, al tener el mismo analito con la misma concentración y mismo volumen, se analizan los disolventes que en este caso los tres presentan una polaridad parecida, siendo el

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agua la fase móvil en la cual se disuelve más el analito, siendo el agua el más puro. Esto puede influir en la resolución, obteniendo una resolución baja.

b. Presencia de otros analitos. Figura 5. Placa cromatográfica con solución de rojo de metilo más diferentes muestras (de izq. a der. NaCl, Sacarosa y sol. Original) CONCLUSIONES

A mayor polaridad de disolvente o fase móvil, se tendrá un mayor valor en Rf Cuanto más concentrada esta la muestra presentara una mayor interacción con la fase estacionaria por lo puede presentar una asimetría (coleo). La naturaleza de disolvente afecta directamente el Rf ya que de este depende la interacción del analitofase estacionaria y analito-fase móvil. La presencia de otros analitos puede afectar nuestras interacciones ya que puede influir en la polaridad de nuestro analito y así en las interacciones con fase móvil y fase estacionaria.

CUESTIONARIO

Defina brevemente los siguientes términos:

La presencia de sacarosa y NaCl podría modificar el Rf gracias a la afinidad que estos tienen por la fase estacionaria, la sacarosa y el NaCl son analitos de tipo polar por lo cual tendrán un comportamiento similar, se observó en sacarosa (figura 5) una mancha más tenue lo que nos indicaría que la sacarosa es mas a fin a la fase móvil que el rojo con NaCl. Tipos de interacciones moleculares: El estudio de las interacciones intermoleculares consideraremos dos grupos: 1) Interacciones de naturaleza electrostática: Fuerzas de Van der Waals, dipolo-dipolo, Fuerzas de London o de dispersión, dipolodipolo inducido 2) Enlace de hidrógeno

Resolución: Es el parámetro que expresa el grado de separación que se puede obtener en un sistema cromatográfico para dos componentes dados. Coeficiente de partición: cociente entre la concentración de componente presente en la fase

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estacionaria y la concentración de componente presente en la fase móvil: Asimetría de pico: des variación en los picos debidos a un gran número de factores como lo son presencia de puntos de gran actividad en las fases estacionarias, reacciones químicas del compuesto en la columna, volúmenes muertos en el sistema cromatográfico etc. Aplicaciones de la cromatografía en capa fina en el área farmacéutica Cromatografía en capa fina (TLC) ofrece un método rápido, barato y reproducible para la detección de materiales de plantas medicinales. No hay tal abundancia de material vegetal para evaluar y probar todavía para la actividad biológica y esperemos que sean útil propiedades medicinales. Tal material vegetal sigue desempeñando un papel en la identificación de los compuestos de plomo para la industria farmacéutica. Como las tuberías de drogas en las compañías farmacéuticas empiezan a "funcionar en seco" protegidas por patentes éxito compuestos una vez más hay una reincorporación a la planta química medicinal de la cabeza en la estructura novedosa química. Mecanismo de separación cromatográfica en capa fina: Separación por adsorción: diferente afinidad de los componentes de la muestra sobre la superficie de un

sólido activo (componentes polaridad baja o media)

con

Separación por reparto: deferente solubilidad en fases estacionaria y móvil (componentes con polaridad media o alta) Separación por tamaño molecular: las moléculas más grandes pasan por los espacios intersticiales de la fase estacionaria la cual retiene los analitos de tamaño pequeño Separación por intercambio iónico: se basa principalmente en la diferente afinidad para el intercambio de iones de los componentes de la muestra. BIBLIOGRAFÍA

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1.-D.A. Skoog, J.J. Leary, “Análisis Instrumental”, McGraw-Hill, Madrid (1996) 2.-H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., “Métodos Instrumentales de análisis”, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V., México(1991).

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Harris, D. (2007)." Análisis químico cuantitativo". España: Editorial Reverté. p.p 357-360.

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M., V. (1988)." Técnicas analíticas de separación". España: Editorial Reverté.p.p 557-559.

Direcciones URL: 

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http://www.uib.es/depart/dqu/d quo/pau/Cromatograf %92a/chrom10/chrom/GC/con cept/main.htm http://www.relaq.mx/RLQ/tutori ales/cromatografia/Gas,htm