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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIRIQUÍ FACULTAD DE MEDICINA LABORATORIO #6 “DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA Y EL PH ÓPTIMO DE LA α-AMILASA”

Integrantes: De Gracia, Pamela González, Mabelis Pardo, Claudia Saldaña, Ashley.

4 – 776 – 1767 9 – 746 – 993 9 – 746 – 2252 4 – 782 – 1856

Fecha de entrega: 07/09/2016

RESUMEN: La experiencia se realizó con la finalidad de determinar la temperatura óptima y el pH óptimo de la acción de la α-amilasa sobre el almidón, ya que la misma se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. Para medir la actividad enzimática de la α-amilasa, se utilizó el método colorimétrico que detecta el almidón. Para ello se contó con una solución de Lugol (ioduro de potasio), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica; soluciones de almidón pH 4 con amortiguador pH 4, almidón pH 6.6 con amortiguador pH 6.6, almidón pH 8 con amortiguador pH 8 todas con NaCl y disolución αamilasa a 37°C. El efecto del pH en la actividad enzimática dio positivo a la presencia de polisacáridos (almidón) a pH 4 cambiando de color azulado violeta, pero indicando que no hay actividad enzimática. A pH 6.6 y pH 8 la prueba de lugol dio negativa indicando la no presencia de polisacáridos (almidón), pero si hay actividad enzimática en la enzima. Para el efecto de la temperatura se uso solamente la solución de almidón a pH 6.6, amortiguador pH 6.6 más NaCl con disolución de α-amilasa a diferentes temperaturas. En esta se obtuvo positivo para la presencia de polisacáridos con la solución de lugol a temperaturas de 80°C y -5°C, pero negativo a la actividad enzimática, indicando que se desnaturalizo. Para la temperatura de 37°C la solución fue incolora dando negativo para la presencia de polisacáridos y positivo en su actividad enzimática. En conclusión, el pH óptimo y la temperatura optima a la que se obtiene una máxima actividad enzimática dependerá de las condiciones estables de la enzima y que no se de una desnaturalización. OBJETIVOS:  Determinar la temperatura óptima para la reacción entre el almidón y la α amilasa.  Determinar el pH óptimo para la acción de la alfa amilasa sobre el almidón.  Aplicar un método colorimétrico para la determinación de parámetros enzimáticos.

MARCO TEÓRICO: El almidón es el polisacárido de reserva más abundante en vegetales y constituye la principal fuente de nutrición glucídica para la humanidad. Los almidones están constituidos por una mezcla de dos componentes: la amilosa de cadena lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por enlaces α (1,4) y la amilopectina cadena lineal de Dglucosas unidas por enlaces tipo α (1,4) con numerosas ramificaciones α (1,6). El polímero contiene unas 1000 unidades de glucosa. La α-amilosa se disuelve fácilmente en agua, adquiriendo una estructura secundaria característica, de forma helicoidal, en la que cada vuelta de hélice comprende seis unidades glucosa. Esta estructura secundaria, en la que los grupos hidroxilo quedan hacia afuera, permite que el iodo, al penetrar en el interior del helicoide, confiera a la disolución una coloración azul violácea intensa característica que permite la identificación positiva de trazas de almidón. Como esta coloración no es resultado de ninguna interacción covalente, el calentamiento origina la desestabilización del helicoide y la pérdida de color, que se recupera al enfriar lentamente la disolución. La variación en el pH tiene un efecto análogo. (Nelson y Cox, 2009). La alfa amilasa, esta es una enzima hidrolasa, pues la reacción química que acelera es la hidrólisis. Como se mencionó, las enzimas son específicas respecto a sus sustratos. La alfa amilasa salival tiene como sustrato al almidón y al glucógeno que son polisacáridos, macromoléculas compuestas por largas cadenas de carbohidratos. (Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David; Scrimgeour, Gary. 2001). La actividad enzimática es afectada por una serie de factores externos e internos que pueden ser físicos, químicos y biológicos: temperatura, pH, fuerza iónica, concentración del sustrato, de la enzima, del producto e inhibidores. Estos efectos son tan importantes in vivo como en condiciones de laboratorio. Las enzimas a temperaturas bajas muestran un aumento de su actividad al incrementar la temperatura, pero a altas temperaturas la enzima sufre desnaturalización térmica y la velocidad de la reacción disminuye. Por ser proteínas, las enzimas poseen un punto isoeléctrico en el que su carga eléctrica es cero; el pH del punto isoeléctrico, sin embargo, no es el pH de máxima actividad de la enzima (pH óptimo). Los cambios de pH afectan profundamente el carácter iónico de los grupos funcionales de la enzima y, por lo tanto, alteran la conformación de la proteína y con ello, el sitio catalítico. Además de los efectos puramente iónicos, los valores altos o bajos de pH (ácidos o alcalinos) provocan desnaturalización de la enzima. (Pacheco, 2001).

MATERIALES

Descripción

Cantidad

Capacidad

Vaso químico

2

250 mL

Gotero

3

1 mL

Tubo de ensayo

15

10 mL

Gradilla

2

10 tubos de ensayo

Plancha

1

-

Probeta

1

10 mL

Baño de agua

2

-

termómetro

1

Vaso de fon

2

8 onzas

REACTIVOS

NOMBRE

Lugol Hidróxido de Sodio

FÓRMULA

CONCENTRACIÓN

20 gotas

KI

NaOH

CANTIDAD

2M

10mL

GRADO DE TOXICIDAD Esta sustancia no se considera toxica persistente. Vómitos irritación en los ojos, Problemas gastrointestinales.

-

Amilasa diluida

Almidón

La amilasa salival es una enzima presente en la saliva que rompe el almidón en maltosa, glucosa y oligosacáridos. La saliva también estimula la secreción de enzimas digestivas y lubrica la boca y el esófago para permitir el paso de sólidos. El almidón está compuesto fundamentalmente por 5 mg/mL glucosa. Aunque puede contener una serie de constituyentes en cantidades

Fosfato de sodio

Na2HPO4

Cloruro de Sodio

NaCl

Hielo

H2O

pH = 4,0 pH= 6,6 pH =8,0

-

PROCEDIMIENTOS: PREPARACIÓN DE LA DISOLUCIÓN Α –AMILASA (ENZIMA)

mínimas. Químicamente es una mezcla de dos polisacáridos muy similares, la amilosa y la amilopectina; contienen regiones cristalinas y no cristalinas en capas alternadas. Irritación y ardor en los ojos. Daños 50mL gastrointestinales. Irritación en vías respiratorias 10mg

Irritación de nariz y garganta Por su temperatura en gran cantidad puede causar daño.

EFECTO DEL pH:

DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA ÓPTIMA:

RESULTADOS: Parte I. Efecto del pH.

Tubo

1 2 3 4

Tabla1. pH y Temperatura Óptimos de la Alfa-amilasa pH Almidón Amortiguador NaCl Temperatura Activia pH a pH dad de Enzima 4 4 10 gotas 37°C 6.6 6.6 10 gotas 37°C √ 8 8 10 gotas 37°C √ Patrón 6.6 6.6 10 gotas 37°C IMAGEN1. PRUEBA DE LUGOL En los tubos 2 y 3 mediante el color observado podemos decir que la prueba dio negativa, indicando que no hay presencia de polisacáridos, por efecto de la α-amilasa; en cambio en el tubo 1 se puede observar que no hubo actividad catalítica debido a que la prueba dio positiva al tornarse de violeta oscuro, indicando la presencia de polisacáridos, ya que la α-amilasa no estaba presente en el tubo 1 podemos decir que se desnaturalizó por efecto de la temperatura.

Discusión: El fin de la experiencia de laboratorio era determinar el pH y temperatura óptima para la α-amilasa. La α-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradación del almidón, que es un polisacárido de reserva vegetal. El almidón está formado por 2 tipos de moléculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacáridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosa unidas por enlaces alfa-C1-C4, mientras que la amilopectina tiene, además de estos últimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La alfa amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacáridos) como productos (Morales, 2001). Debido a su naturaleza proteica tanto los cambios de pH como en la temperatura pueden provocar su desnaturalización.

Si bien es cierto, las enzimas actúan sobre un determinado sustrato: en este caso nuestro sustrato fue el almidón. En la tabla 1, se evalúa la actividad enzimática de cada tubo de ensayo tomando en cuenta la temperatura observándose que en los tubos 2 y 3 la coloración amarilla que indica que la enzima actuó sobre el sustrato (almidón), rompiendo los enlaces del almidón para agregar una molécula de agua y convertirlo en un monosacárido (glucosa). A estas muestras se le hicieron leves cambios de pH por lo que se debió afectar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo de la enzima, modificando su sitio catalítico y su conformación, por lo que en el tubos 1 no hubo reacción enzimática puesto que el mismo estaba a pH 4 el cual no es óptimo para que la enzima reaccione. A los pH de 6.6 y 8 se les considera pH dentro del rango óptimo para que la enzima reaccione; sin embargo estos cambios de pH no fueron los suficientemente drásticos como para alterar la estabilidad de la enzima amilasa y evitar que ejerzan su función catalítica. Por otro lado el tubo 1 y 4 (patrón) reaccionaron positivamente, con la prueba de Lugol, esto se hizo evidente por la formación de un color violeta intenso en estas muestras, lo que indica que la amilasa fue desnaturalizada, demostrando que no hubo actividad catalítica y que las condiciones (temperatura) alteradas para estas muestras desnaturalizaron la enzima, debido a que la misma presenta alta sensibilidad a los cambios de temperatura, debido a su naturaleza proteica, la desnaturalización es causada por la elevación o descenso de la temperatura que hace que disminuya su concentración efectiva y por lo tanto la velocidad de la reacción. (De León, 2015). El Lugol es una solución de Ioduro de potasio, en la que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración azulada característica. Su explicación física nos dice que el iodo se coloca en el interior de la hélice que forma la amilosa (regiones hidrofóbicas), formando un complejo de color azul. Cuando la alfa-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y por tanto en presencia de Lugol ya no da una coloración azul. (Méndez, 2001).

Parte II. Efecto de la temperatura.

Tubo

1 2 3 4

Tabla2. pH y Temperatura Óptimos de la Alfa-amilasa Temperatura Almidón Amortiguador NaCl Temperatura Activia pH a pH dad de Enzima 6,6 6,6 10 gotas 80°C 6.6 6.6 10 gotas -5°C . 6,6 6,6 10 gotas 37°C √ Patrón 6.6 6.6 10 gotas 37°C -

IMAGEN2. PRUEBA DE LUGOL En el tubo 3 mediante el color observado podemos decir que la prueba dio negativa, indicando que no hay presencia de polisacáridos, porque hubo efecto de la α-amilasa, es decir que hubo actividad enzimática; en cambio en el tubo 1 y tenuemente en el 2 se puede observar que no hubo actividad catalítica debido a que la prueba dio positiva al tornarse de violeta oscuro y lila respectivamente, indicando la presencia de polisacáridos.

DISCUSIÓN: La amilasa, como otras enzimas funciona como catalizador; es decir, cataliza la hidrólisis del almidón. Es necesario siempre recordar que una enzima aumenta la velocidad de reacción, interviene en la misma pero se obtiene intacta al final; además cualquier cambio en su temperatura o pH optimo (generalmente un rango muy estrecho) hace que la enzima pierda su estructura tridimensional y por consiguiente su función (Werner , 2008). En este experimento cualitativo demostramos lo anteriormente explicado utilizando la prueba de lugol (solución yodurada de yodo); es decir, confirmamos la ausencia o presencia del almidón. En general, un violeta confirma la presencia de almidón. La razón del uso del NaCl es que la alfa amilasa salival humana necesita los iones Cl para su actividad; es decir, que la presencia de estos iones forma parte de sus condiciones óptimas de funcionalidad. Para la determinación de la temperatura óptima utilizamos los tubos de ensayo 1, 2 y 3. En este punto es importante establecer que la concentración de la enzima, el sustrato y el pH se mantuvieron constantes y lo que varió fue la temperatura. En el tubo 3 que tenía pH= 6,6 y buffer también a pH 6,6 , enzima con temperatura de 37 C; no observamos una coloración lo que indica reacción negativa para lugol. Esto nos dice que la enzima pudo funcionar correctamente a esa temperatura y fue capaz de catalizar la hidrólisis del almidón. En los tubos 1 y 2 cuyas temperaturas fueron 80 C y -5 C, observamos una coloración violeta en ambas que indica presencia de almidón. El color que dan los polisacáridos con el lugol (solución de I2 y de IK) se debe a que el I2 ocupa espacios vacíos

en las hélices de la cadena de unidades de glucosa, formando un compuesto de inclusión que altera las propiedades físicas del polisacárido, especialmente la absorción lumínica. En estas dos condiciones de temperatura la enzima no pudo reaccionar correctamente ya que se había desnaturalizado. Estos resultados nos dicen que la temperatura óptima para la amilasa es 37 C que corresponde a la temperatura normal interna del organismo. Para explicar esto, debemos hablar en términos de velocidad de reacción. En una reacción que no está catalizada, la velocidad de reacción es proporcional a la temperatura, es decir que si la temperatura aumenta la velocidad de reacción también. Esto no es cierto para una reacción catalizada como la de nuestro experimento. Lo que ocurriría se puede explicar mediante la siguiente gráfica: Según Voet & Voet (2006), en esta gráfica observamos que al empezar con una baja temperatura y luego ir aumentando también va aumentando la velocidad de reacción. Sin embargo, las conformaciones de una proteína son muy sensibles a los cambios de temperatura, por esto al llegar a la temperatura óptima cualquier aumento subsiguiente de la misma alterará la conformación de la enzima. Esto significa que el sustrato no encajará en el sitio activo de la proteína (en la superficie de la enzima) por lo que la velocidad de reacción disminuye. Un pequeño cambio de la temperatura no afecta drásticamente la enzima ya que entre un rango muy estrecho este proceso es reversible y la proteína puede volver a la conformación que tenía antes. Al salir de este rango indudablemente la enzima sufrirá desnaturalización, la cual es irreversible. Esto significa que la enzima quedará completamente inactiva. Este mismo principio es el que se aplica en la preservación de alimentos a bajas temperaturas por medio refrigeración. CONCLUSIONES: Se conoció que la temperatura juega un papel importante para el desarrollo de las reacciones enzimáticas dentro del organismo, las temperaturas extremas desnaturalizan las enzimas (80 y 5°C), sin embargo, la temperatura entre el rango fisiológico tiende a aumentar la velocidad de sus reacciones. El pH y temperatura óptimos para la función catalítica de la α-Amilasa en la reacción hidrolítica del almidón fueron análogas a las condiciones en el cuerpo humano; temperatura de 37ºC y pH 7 (6,6). Todas las enzimas difieren en cuanto a resistencia de pH y temperatura. En el organismo la exposición a procesos febriles puede llevar a una falla en la estructura de las enzimas y por ende a

una falla sistémica generalizada, pues el 95% de nuestras células dependen de las reacciones enzimáticas.

CUESTIONARIO: 1. Investigue las características bioquímicas y el pH para las siguientes enzimas: - Papaína: pH óptimo para su actividad es de 5.0 – 7.0 Es una enzima de la hidrolasa de la proteasa de la cisteína presente en la papaya. Fue la primera proteína vegetal que se le pudo elucidar su estructura cristalina consta de 212 aminoácidos, 34 de los cuales están ionizados. Esta enzima posee un gran poder de hidrolisis, mayor que cualquier otra enzima proteolítica, es muy activa en la hidrólisis de amidas y ésteres. Además, tiene poca especificidad, puede hidrolizar sustratos sintéticos los cuales son generalmente considerados como sustratos de tripsina, quimiotripsinas o pepsinas. La papaína ha de ser útil como biocatalizador en reacciones de esterificación y como biocatalizador especifico en la esterificación de ácidos grasos con l-butanol. - Lipasa ácida: el pH óptimo para su actividad es de 4,5 La lipasa ácida es una enzima fundamental en el metabolismo de los triglicéridos y del colesterol, los cuales se acumulan en los tejidos.

- Ureasa: el pH óptimo para su actividad es de 7.0 La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el principal producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los ácidos nucleicos, el cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno (como el amoniaco) porque es soluble en agua y menos tóxico. 2. ¿Cuáles son las hidrolasas que junto con las amilasas son responsables del catabolismo del almidón? Las hidrolasas que actúan en el catabolismo del almidón junto con la amilasa es: - Glicosil hidrolasa - ADPG hidrolasa - Almidón fosforilasa - Α-amilasa 3. ¿Qué efecto tiene la temperatura sobre la actividad enzimática? Las reacciones enzimáticas presentan sensibilidad a los cambios de temperatura. Debido a su naturaleza proteica, la desnaturalización de las enzimas, causada por elevación de la temperatura hace que disminuya su concentración efectiva y por tanto la velocidad de reacción. A temperatura mayores de 55°C se destruye la

función catalítica. Es por esta razón que todas las enzimas tienen una temperatura óptima en la cual pueden desempeñar sus funciones.

BIBLIOGRAFÍA: -

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Nelson, David L.; Cox, Michael M. (2009) Lehninger: Principios de la Bioquímica. (5ta. ed.). OMEGA: Barcelona, España. Horton, Robert; Moran, Laurence; Ochs, Raymond; Rawn, David; Scrimgeour, Gary. (2001). Bioquímica. (1era. ed.). Prentice Hall: México. Pacheco, D. (2001). Bioquímica Estructural y Aplicada a la Medicina. 1ra Edición. Instituto Politécnico Nacional: México. Voet, D., & Voet, J. G. (2006). Bioquímica. Buenos Aires: Ed. Médica Panamericana. Werner , M.-E. (2008). Bioquímica. Fundamentos para Medicina y Ciencias de la Vida. España: Reverte. Morales. Actividad enzimática, 2001 (documento en línea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016. Disponible en: http://academisc.uprm.edu/-jvelezg/labmoleculas.pdf De León, Enzimas, 2015 (documento en línea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016. Disponible en: http://www.euroschool.Iu/prof.montilla/ficheroactivi/actividadesbio4_6/PROTEINAS Méndez, Función catalítica, 2001 (documento en línea) Internet, Fecha de consulta 10 de septiembre de 2016. Disponible en: http://www.monografías.com/trabajos-pdf900/actividad-enzimaticaamilasa/actividad-enzimatica-amilasa.pdf Fuentes., E. (12 de octubre de 2013). GLOBALHEALINGCENTER. Recuperado el 13 de 9 de 16, de globalhealingcenter: http://www.globalhealingcenter.net/saludnatural/amilasa-beneficios.html

ANEXOS:

BENEFICIOS PARA LA SALUD DE LA AMILASA Publicado el 12 de October de 2013 por Dr. Edward F. Group III, DC, ND, DACBN, DABFM

La amilasa es una de las principales enzimas que digieren el almidón secretadas en el cuerpo por ende bajo su pH y temperatura óptima vemos un funcionamiento importante.

1. PUEDE AYUDAR A DISMINUIR LAS RESPUESTAS AUTOINMUNES E INFLAMATORIAS: Un estudio de las enzimas digestivas y las enfermedades autoinmunes mostró que estas enzimas podrían ayudar a retardar la agrupación de antígenos (moléculas que desencadenan las respuestas inmunes), así como el daño en los tejidos resultante de la elevada conglomeración de anticuerpos (proteínas del sistema inmune que neutralizan las células extrañas). Algunos científicos están investigando la posibilidad de que las enzimas como la amilasa puedan desempeñar un papel en el impulso de la actividad inmunomoduladora para detener estos fuertes estados inmunes. 2. RESISTENTE A LA INFLAMACIÓN: Muchos grupos de investigación europeos están estudiando activamente las enzimas como la amilasa. Las enzimas orales están incluso siendo utilizadas en los países europeos en lugar de los medicamentos

antiinflamatorios. Los estudios muestran que las enzimas orales pueden ser muy eficaces en la reducción de la inflamación asociada con afecciones tales como la osteoartritis, la artritis reumatoide, así como otros desequilibrios causados por la inflamación. Varios estudios comparativos controlados con placebo descubrieron que los pacientes con enfermedades reumáticas que consumían enzimas experimentaron algunos efectos analgésicos y antiinflamatorios. Estos estudios confirman que los preparados de enzimas puede ser tan eficaces como los medicamentos antiinflamatorios comúnmente prescritos no esteroideos, sin muchos de los dañinos efectos secundarios. 3. APOYA A LA SALUD INMUNODEPRIMIDA: La terapia enzimática está incluso siendo estudiada en Suiza para su uso como un tratamiento de apoyo para el cáncer. La enzima amilasa en particular se encontró que muestra capacidades sorprendentes en la inhibición del crecimiento de células tumorales con posibilidades de metástasis. “La enzimoterapia puede reducir los efectos adversos causados por la radioterapia y la quimioterapia. Existen también evidencias de que, en algunos tipos de tumores, la supervivencia puede prolongarse. El efecto beneficioso de la terapia enzimática sistémica parece basarse en su potencial antiinflamatorio”. 4. DISMINUYE LOS EFECTOS DEL ENVEJECIMIENTO: Aunque muchos científicos discrepan de la cuestión de si la producción de enzimas disminuye o no a medida que envejecemos, un estudio de laboratorio descubrió que la amilasa pancreática disminuyó el 41% en ratas envejecidas. Del mismo modo, un estudio en humanos realizado en Argentina encontró que la secreción de amilasa y lipasa disminuyó en las mujeres mayores de 45 años, pero que está en realidad aumentó en los hombres de la misma edad.